JPH10511652A

JPH10511652A - 炎症性疾患の予防および／または治療に対するｍｈｃ−ｉｉ結合および／またはｍｈｃ−ｉｉ模倣分子の使用

Info

Publication number: JPH10511652A
Application number: JP8520220A
Authority: JP
Inventors: ロエネル，ロジェ・パスカル
Original assignee: ラボラトワール・オン・ソシエテ・アノニム; ドイチェ・オム・アルツナイミッテル・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1994-12-23
Filing date: 1995-12-27
Publication date: 1998-11-10
Also published as: AU4347696A; CA2208233A1; HUT77468A; WO1996020215A3; BR9510554A; PL320922A1; EP0800534A2; WO1996020215A2; CN1171117A; SK80697A3; CZ186897A3

Abstract

(57)【要約】この発明は、食細胞のようなＭＨＣ−ＩＩ保有細胞の活性化刺激薬と細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子間の相互作用、リポ多糖体（ＬＰＳ）またはＣＤ１４もしくはＬＰＢのような他の分子との複合体中のＬＰＳと、細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子との間の相互作用、またはグラム陽性菌の生産物またはグラム陽性菌の生産物とＣＤ１４のような分子との複合体と、細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子との間の相互作用の干渉に使用するためのＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子に関するものである。ＭＨＣ−ＩＩ結合分子は、任意の抗ＭＨＣ−ＩＩ抗体もしくはそのフラグメント、またはヒト化、２特異性もしくはその他の操作分子などのようなこの抗体から由来する任意の分子でありうる。ＭＨＣ−ＩＩ結合分子は、ＣＤ１４、そのフラグメント、その修飾体またはＭＨＣ−ＩＩ結合性を有するペプチドからなる群から選ぶことができる。

Description

【発明の詳細な説明】炎症性疾患の予防および／または治療に対するＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子の使用この発明は、単独または、ＣＤ１４およびＬＢＰの如き、他の分子との複合体としてのリポ多糖体（ＬＰＳ）のようなトキシン類とその伝達分子間の相互作用に干渉するための、特定分子の使用に関するものである。さらに、この発明は、敗血性ショックのような炎症性疾患の予防および治療におけるこれらの分子の使用に関するものである。リポ多糖体（ＬＰＳ）は、グラム陰性菌の細胞壁の１成分である。グラム陰性菌の感染により生命が危険になる疾患がもたらされうるが、これは、結合によって活性化され腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびその他の炎症メディエーターを含む種々のサイトカイン類を分泌する、単球、マクロファージおよび顆粒球のような食細胞に対するＬＰＳの特異的結合により起こるものである。これらの物質は、直接または第２メディエーターによる活性化によって、現象のカスケードを開始させ、凝固システムの異常、血管拡張、多臓器不全および最後に敗血性ショックをもたらす（４、５）。一般に、多数の炎症メディエーターの分泌をもたらす食細胞の顕著な活性化は、全身性炎症性反応症候群（ＳＩＲＳ）と称される症状の発生機序における中心的現象である。ＬＰＳによる活性化の外に、ＳＩＲＳは、細菌またはウイルスによる感染、外傷、熱傷、膵炎、移植片宿主相関病および宿主移植片相関病、食血さらにそのほか多数のもののような種々の他の臨床的症状の結果としても出現しうる。グラム陽性菌からのぶどう球菌トキシンＡのような外毒素により起こる中毒性ショックは、炎症性疾患の一例である。超抗原としても知られるその他の外毒素には、ぶどう球菌トキシンＢおよび連鎖球菌トキシン類がある。ＬＰＳは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−固定単球抗原Ｃ１４に結合することが明らかにされた。ＣＤ１４は、単球、マクロファージおよび顆粒球の表面に存在するが、健常な個人の血清中にＧＰＩアンカーなしの可溶性形態でも見出される。さらに、ＬＰＳによる単球の活性化は、抗ＣＤ１４モノクローナル抗体で阻害されうることが明らかにされた。従って、ＣＤ１４がＬＰＳのレセプターとして作用し（１）、細胞質に対するＬＰＳの作用を仲介することが示唆された。しかし、ＣＤ１４陰性細胞もまたＬＰＳに応答しうる（２、７、８）。さらに、ＣＤ１４は膜通過領域および細胞質領域を欠くグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−固定分子であることがわかってきた（９）。すなわち、ＣＤ１４はシグナルを細胞質に伝達することができない。ＧＰＩ−結合蛋白質がシグナル伝達に膜通過分子の付随を必要とすることは、広く承認された仮説である。すなわち、ＬＰＳおよびおそらくはその他のＳＩＲＳ刺激薬に関する真の伝達分子は、まだ確認されていない。ＬＰＳによる細胞活性化の場合、ＬＰＳによる細胞活性化を説明するためにはＣＤ１４以外の分子を持ち出さなければならない（１０）。ＬＰＳが膜結合または可溶性ＣＤ１４およびＬＰＳ結合蛋白質（ＬＢＰ）と複合体を形成するとの考えが提出された。その他の血清由来分子も、この複合体に関与することがありうる。複合体は、細胞表面上のまだ確認されない分子と相互作用して、細胞の活性化に導く。ＣＤ１４は、グラム陽性およびグラム陰性生物の細菌性エンベロープ産物による細胞活性化の開始に決定的役割を演ずるものとして報告されてきた（１３）。ここでも、その他の膜結合または血清由来分子が、細胞活性化を導く細胞表面分子との相互作用に関与する可能性がある。この発明によると、レセプターとしておよび／またはＬＰＳとＣＤ１４およびＬＢＰのような分子との分子複合体のシグナル伝達要素として作用するＬＰＳによる細胞活性化に、主要組織適合複合体ＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）分子が必要であることがここに見出された。ヒトでは、ＭＨＣは白血球抗体（ＨＬＡ）として知られている。ＬＰＳ反応性は、細胞膜の表面上におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の発現に依存することが示された。本書中で「ＴＨＰ−１^MHC+」と称する細胞系は、ツチヤらによりＴＨＰ−１として報告された、ＭＨＣクラスＩＩ発現単球細胞系である（３）。本書中で「ＴＨＰ−１．６^MHC-」と称する第２の細胞系は、自然突然変異によりＴＨＰ−１^MHC+から誘導されたＭＨＣクラスＩＩ陰性単球細胞系である。ＴＨＰ−１^MHC+細胞はＬＰＳに応答してサイトカインを分泌するが、ＴＨＰ−１．６^MHC-細胞はそうでない。ＣＤ１４陰性、ＭＨＣ−ＩＩ陰性ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）もまたＬＰＳに反応しない。ＭＨＣクラスＩＩ発現およびＬＰＳ反応性は、細胞表面上におけるＭＨＣ−ＩＩ分子の発現に必要な核因子を暗号化するｃＤＮＡであるＣＩＩＴＡをＴＨＰ−１．６^MHC-細胞にトランスフェクションすることにより復活させることができる。細胞に対する他のＳＩＲＳ薬刺激の伝達もまた、ＭＨＣ−ＩＩ分子により仲介される可能性がある。以前、外毒素もまた細胞表面上のＭＨＣ−ＩＩ分子に結合することが既に明らかにされている。その他のグラム陽性菌生産物は、少なくとも一部はＣＤ１４により仲介され、従ってこれらの産物とＣＤ１４との複合体もまたＭＨＣ−ＩＩ分子と相互作用して細胞を活性化するようである。したがって、全身性炎症性反応症候群の予防および／または治療は、ＬＰＳとＣＤ１４およびＬＢＰのような他の分子との複合体（以下、本書中では「ＣＤ１４／ＬＰＳ／ＬＢＰ複合体」として示す）および細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ間の相互作用に干渉することにより、実施されうる。この発明によると、この干渉は２種の異なる方法により実施することができる。第１に、細胞結合ＭＨＣ−ＩＩに対するＣＤ１４／ＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の結合は、抗ＭＨＣ−ＩＩ抗体、ＣＤ１４またはそれらから誘導されるペプチドのようなＭＨＣ−ＩＩ結合分子により遮断しうる。この型の分子は、ＣＤ１４／ＬＰＳ／ＬＢＰ複合体と競合し、したがって複合体の結合を妨害するが、そのもの自体はＭＨＣ−ＩＩを活性化しない。それ故ＭＨＣ−ＩＩの伝達体機能は遮断される。第２に、循環ＬＰＳまたはＣＤ１４／ＬＰＳ／ＬＢＰ複合体は、ＭＨＣ−ＩＩ模倣分子により捕獲されうる。可溶性ＭＨＣ−ＩＩまたはＭＨＣ−ＩＩ類似分子に結合している複合体は、もはや細胞結合ＭＨＣ−ＩＩに結合することができない。したがって、細胞の活性化が防止される。ＭＨＣ−ＩＩ結合分子は、ＭＨＣ−ＩＩに対するＬＰＳまたはＣＤ１４／ＬＰＳ／ＬＢＰ複合体の結合を遮断する能力をもつあらゆる分子を包含する。特に、これは、細胞のＣＤ１４／ＬＰＳまたはＬＰＳ結合部位を指向するモノクローナルおよびポリクローナルの両抗ＭＨＣ−ＩＩ抗体を包含する。抗体フラグメントもまたＭＨＣ−ＩＩ結合分子として適当である。ＭＨＣ−ＩＩ模倣分子は、可溶性ＭＨＣ−ＩＩ分子自体およびLＰＳまたはＣＤ１４／ＬＰＳ複合体上のＭＨＣ−ＩＩ結合部位を遮断する能力をもつ他のあらゆる分子を包含するものとする。この型の分子は、完全なＭＨＣ−ＩＩ分子またはそのフラグメントもしくはサブユニットを含みうる。さらに、ＭＨＣ−ＩＩを活性化することなくＬＰＳまたはＬＰＳ／ＣＤ１４／ＬＰＢ複合体と結合する能力をもつペプチドも有用でありうる。このようなペプチドは、少なくともＭＨＣ −ＩＩの同族体であり、ペプチドに拮抗体的性質をもたらす適当なＤ−アミノ酸を含むものでありうる。これらの分子は、可溶性形態であるか、または単体の表面に結合されうる。本書中に示した情報に基づいて、当業者は、適当な結合および／または模倣分子を確認できると思われる。この型の分子は、ヒトまたはその他の適当な資源から由来するものであってよく、ＭＨＣ−ＩＩ陽性細胞の細胞培養の上清または細胞溶解物からの分離のような、種々の手段により製造することができる。特に好ましい分離方法は、イムノアフィニティークロマトグラフィーである。また、適当な分子は、遺伝子技術、蛋白質化学的方法またはその他の任意の適当な方法により、製造することができる。この発明によると、これらの２つの型の分子は、敗血性ショックのような炎症性疾患、骨髄移植のような臓器移植後の移植片宿主相関病、移植片拒絶反応、熱傷、事故、膵臓の感染などにより生ずる炎症反応の予防および／または治療に使用することができる。またこの発明は、毛細管漏洩症候群のような、例えば術後に起こるその他の炎症反応、アレルギー性疾患、紅斑性狼そう（ＬＥ）およびその派生形、浮腫性強皮症およびその派生形、好酸球性筋膜炎、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎、ウエジナー肉芽腫、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋炎などのような自己免疫疾患、リューマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、フェルティー症候群、カプラン症候群、強直性脊椎炎（マリー・ストリュンペル・ベクテレフ病）、乾せん、ライター症候群、ベーチェット症候群のようなリウマチ様疾患の予防および／または治療に適当である。この発明により処置することができ少なくとも部分的に自己免疫機構により生ずるその他の疾患は、なかんずく、真性糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、消化管潰瘍、糸球体腎炎および腎炎のような腎感染症、動脈硬化性疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、甲状腺機能昂進、甲状腺機能低減である。またこの発明は、白血病、血球がん、がん腫、繊維腫、肉腫および種々の型の組織球増加症のような腫瘍学的疾患をもった１種以上のヒトの臓器における炎症反応に使用することができる。またこの発明は、エイズのようなウイルス疾患の予防および／または治療に使用することができる。ＬＰＳ刺激は、細胞内のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製を増加することが知られている。したがって、この発明のＭＨＣ−ＩＩ結合および／または模倣分子によりＬＰＳによる刺激を遮断すると、この複製刺激が除かれる。それ故、この発明のＭＨＣ−ＩＩ結合および／または模倣分子は、細胞活性化刺激薬によるウイルス複製の刺激の防止により、ＨＩＶ感染細胞に対して保護作用を付与するために使用することができる。実施例に示すデータに基づくと、下記のＬＰＳによる細胞活性化モデルが考えられる。一方では、ＬＰＳは膜結合ＣＤ１４（ｍＣＤ１４）に結合でき、相互作用がリポ多糖体結合蛋白質ＬＢＰにより加速される（１４）。次いでＬＰＳとＧＰＩ固定ｍＣＤ１４およびおそらくＬＢＰの複合体が膜通過ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用し、シグナル伝達をもたらす。この状況を図３Ａに示す。他方では、ＬＰＳはＬＢＰと一緒に血清中に存在する可溶性ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）に結合することができ、次いでこの複合体がＣＤ１４陰性細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して、ＣＤ１４陰性であるがＭＨＣクラスＩＩ陽性の細胞の活性化をもたらす。この状況を図３Ｂに示す。ＣＤ１４とＭＨＣ−ＩＩの接触を示したが、ＬＢＰとＬＰＳも他のまだ未確認の分子と同様にこの相互作用に関与することができる。また、この場合のＬＢＰの役割はまだ決定されていないが、活性化刺激薬はグラム陽性菌の構成成分でもありうる。ある種の活性化が、ＣＤ１４またはＬＢＰとの複合体を形成することなく直接ＭＨＣ−ＩＩ分子に作用する可能性はこれにより除外されていない。ここに、刺激がＭＨＣ−ＩＩ分子により仲介されることが確認された。したがって、これらの分子の遮断または模倣により、活性化刺激薬の伝達が防止されるはずである。さらに、この発明は、ＭＨＣ−ＩＩ結合分子、ＭＨＣ−ＩＩ模倣分子および一方または両方の型の分子を含む医薬組成物に関するものである。食細胞のようなＭＨＣ−ＩＩ分子発現細胞に対するＬＰＳのような活性化刺激薬と細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子との間の相互作用に対する干渉のための有効成分として、１種以上のＭＨＣ−ＩＩ結合分子および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子を含む医薬組成物は、散剤、けんだく剤、液剤、噴射剤、乳剤、注入剤、吸入剤組成物、軟膏剤またはクリーム剤の形をもち、局所適用、鼻内、直腸、膣および経口、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、くも膜下など）または経皮投与、吸入による投与などに使用することができる。この発明の医薬組成物は、活性化合物（類）と、（水性または非水性溶媒、安定剤、乳化剤、界面活性剤、添加剤のような）中立的性格を有し医薬的に許容される賦形剤、さらに必要に応じて着色剤および着香剤を配合すること（すなわち混合、溶解することなど）により、製造することができる。医薬組成物中の有効成分の濃度は、処置の種類および投与方法に応じて０．００１％ないし１００％の間で変化しうる。投与される有効成分の用量も、具体的用途および投与経路により異なるが、例えば体重１ｋｇ当たり０．０１μｇないし１ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１μｇないし１００μｇの間で変化しうる。この発明を以下に示す実施例に基づいて説明するが、これらはこの発明の範囲を制限するものではない。実施例実施例１緒論ＭＨＣ−ＩＩが、ＬＰＳ、ＣＤ１４、ＬＢＰおよびおそらく他の分子がＬＰＳによる食細胞の活性化における伝達体および／またはレセプターであるという仮説を、ＬＰＳによる刺激時におけるＭＨＣクラスＩＩ陽性（ＨＬＡ−ＤＲ）およびＭＨＣクラスＩＩ陰性細胞系によるサイトカイン分泌を比較することにより試験した。サイトカインの分泌は、細胞活性化の指標である。材料および方法ＴＨＰ−１^MHC+は、ヒト由来のＣＤ−４陰性、ＭＨＣクラスＩＩ陽性単球細胞系である（３）。ＴＨＰ−１．６^MHC-は、反復限界希釈法によりクローン化した、ＴＨＰ−１^MHC+の自然発生ＭＨＣクラスＩＩ陰性突然変異である。ＨＬＡ−ＤＲの発現は、ＴＨＰ−１．６^MHC-細胞をＣＩＩＴＡ（クラスＩＩトランスアクティベーター；ＭＨＣクラスＩＩ蛋白質の発現に必要な核蛋白質（１２））でトランスフェクションすることにより再構成した。ＴＨＰ−１^MHC+細胞（野生型）、ＴＨＰ−１．６^MHC-細胞（突然変異細胞系）およびＴＨＰ−１．６^MHC-ＣＩＩＴＡ（ＣＩＩＴＡでトランスフェクションしたＴＨＰ−１．６^MHC-細胞）表面上のＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ１８の発現は、フローサイトメトリーで評価した。種々の細胞系を、１０％ウシ胎児血清を補足し用量０、１、１０、１００ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した培地中において、１０⁶細胞／ｍｌで培養した。２４時間後、上清を採取し、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−８含量について酵素免疫吸着測定法により評価した。結果および検討細胞の生存率は、ＬＰＳ処理により低下しなかった。トリパンブルー染色が示すところでは、９５％以上の細胞が生存した。ＣＤ１８の発現は３種の細胞系で類似しているが、ＴＨＰ−１．６^MHC-細胞はＴＨＰ−１^MHC+細胞より顕著に低い濃度のＨＬＡ−ＤＲしか発現しなかった。ＴＨＰ−１^MHC+細胞をＬＰＳで刺激すると、細胞はＴＮＦ−αおよびＩＬ−８分泌の応答を行った（図１）。反対に、ＨＬＡ−ＤＲ陰性細胞系であるＴＨＰ− １．６^MHC-は、高用量のＬＰＳを用いた場合でもＬＰＳの刺激によりＴＮＦ−α およびＩＬ−８の分泌を誘導しなかった。しかし、ＣＩＩＴＡでのトランスフェクションにより、ＨＬＡ−ＤＲ発現とＬＰＳ反応性は共に復活した。ＨＬＡ−ＤＲ分子の発現は、ＬＰＳによる単球細胞の活性化に必要であったと結論された。実施例２緒論実施例１の知見を確認するため、細胞系システムで得られた結果を、小児初期に重症複合型免疫不全症候群として現れるまれな遺伝性疾患であるＭＨＣクラスＩＩ欠乏症患者から得た細胞を用いて証明した。これらの患者では、ＣＤ１４の発現に影響はなかった。ＭＨＣクラスＩＩ欠乏症患者および対照のヒトのＰＢＭＣを、用量を次第に増加させたＬＰＳの存在下に培養し、これら培養物の上清中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−８の濃度を測定した。材料および方法末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を、ＭＨＣ−ＩＩ欠乏症患者および健常な対照から採取した。患者（図２の左駒、ハッチングした分布図）および健常対照（灰色の分布図）の両ＰＢＭＣの表面上のＨＬＡ−ＤＲ発現を、直接免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーで評価した。患者（太線）および対照（細線）のＰＢＭＣを、１０％正常ヒトＡＢ陽性血清を補足し０、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した培地中において、１０⁶細胞／ｍｌで培養した。２４時間後、上清を採取し、ＴＮＦ−α含量について酵素免疫吸着測定法により評価した。結果および検討健常なヒトからのＰＢＭＣは、予想通りＬＰＳの刺激に応答してＴＮＦ−αおよびＩＬ−１を分泌した。しかし、患者のＭＨＣクラスＩＩ欠乏ＰＢＭＣは、意味をもつレベルのサイトカインをＬＰＳに応答して分泌しなかった（図２）。すなわち、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現のための要件は、ＴＨＰ−１^MHC+群の細胞系に限定されないことが示された。データは、膜結合ＣＤ１４がＬＰＳによる細胞の活性化に必要ではなく（ＴＨＰ−１^MHC+細胞がＣＤ１４を発現しない）、また充分でもない（ＭＨＣクラスＩＩ欠乏症患者のＰＢＭＣが正常レベルのＣＤ１４を発現する）ことを示す。しかし、上に概略を述べた実験は、可溶性ＣＤ１４の役割を扱うものではない。これらすべての実験において、可溶性ＣＤ１４を含む血清を補足した培地を使用した。それ故、ＴＨＰ−１^MHC+、ＴＨＰ−１．６^MHC-およびＴＨＰ−１．６^MH ^- ＣＩＩＴＡ細胞を無血清培地で培養することにより実験を繰り返した。ＬＰＳの用量を次第に増加させて処理しても、意味をもつレベルでのＴＮＦ−αの分泌は生じなかった。この結果は、ＭＨＣクラスＩＩ分子がＬＰＳ反応性に決定的に関与していることを示す。ＨＬＡ−ＤＲ陰性細胞は、ＬＰＳによる刺激でサイトカインを分泌できなかった。ＬＰＳ反応の欠如は、ＬＰＳ反応性の低下を起こすＭＨＣクラスＩＩ発現欠如それ自体ではなく、ＭＨＣクラスＩＩに密接に関連しＣＩＩＴＡによっても調節される因子に関係があるとの反論が出るかも知れない。しかし、ＴＮＦ−α並びにＩＬ−１およびＩＬ−８の分泌も低下したのであるから、ＬＰＳに対する応答による欠陥は、サイトカイン１種のみの分泌に限定されるものではない。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ以外に、ＣＩＩＴＡにより調節される分子は、広範な研究にもかかわらず今日まで発見されていない。最後に、患者の疾患はＣＩＩＴＡに関連した欠陥によるものではない。この患者からのエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞のトランスフェクションにより、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は復活しなかった。実施例３緒論ＭＨＣクラスＩＩ分子とＣＤ１４の物理的相互作用を３種の異なる方法により明らかにした。第１に、ＭＨＣ−ＩＩ陽性およびＭＨＣ−ＩＩ陰性細胞系の細胞溶解物を、ＭＨＣ−ＩＩ特異的または対照抗体および放射性ＣＤ１４（ＣＤ１４*）または放射性対照分子とインキュベートした。ＭＨＣ−ＩＩとＣＤ１４*の複合体は、プロテインＡ・アガロースおよびＭＨＣ−ＩＩ特異的抗体の相互作用によってのみ沈降できる。対照分子または対照抗体を使用する場合には、沈降物に放射能は見られないはずである。ＭＨＣ−ＩＩが存在しないなら、沈降物に放射能は見られないであろう。第２に、ＭＨＣ−ＩＩを放射性ＣＤ１４とインキュベートした。おそらく、ＭＨＣ−ＩＩ／ＣＤ１４*複合体が形成される。理論的には、これらの複合体は複合体中の２種の相手およびプロテインＡ・アガロースの何れかに特異的な抗体により沈降させることができる。第３に、抗ＣＤ１４抗体がＭＨＣ−ＩＩとＣＤ１４*の相互作用を遮断できるか否かを試験した。これらの実験の原理を、さらに図４に示す。方法１．放射性ＣＤ１４の製造 ³⁵Ｓメチオニンの存在下、製造元（プロメガ、スイス国）のプロトコルにしたがって、ＴＮＴＴ７結合網状赤血球溶解物システムを用いてＰＣＲ法で製造し、ヌクレオチド配列を確認した全長ＣＤ１４ｃＤＮＡのインビトロ転写／翻訳により、組み替え体ＣＤ１４を製造した。対照としては、同一のシステムを使用したインビトロ転写／翻訳により、放射能標識したルシフェラーゼを製造した。２．細胞溶解物の製造いわゆる２９３細胞は、ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）で形質変換したヒト胎児腎に由来する。野生型２９３細胞は、蛍光活性化細胞分取装置で分析したところ、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない。これらをＭＨＣ−ＩＩ陰性細胞とした。ヒトＭＨＣクラスＩＩのα、βおよび非変異（ｉ）鎖のｃＤＮＡでトランスフェクションした２９３細胞は、アムステルダム、ネザーランズ・カンサー・インスティテュートのジャック・ネフィエス博士から入手した。これらは、ＭＨＣクラスＩＩを発現し、したがってＭＨＣ−ＩＩ陽性細胞として使用する。ＭＨＣクラスＩＩ陽性およびＭＨＣクラスＩＩ陰性細胞系の溶解物は、次のように製造した。５×１０⁶個の細胞をペトリ皿中で１ｍｌの溶解用緩衝液（ベーリンガー・マンハイム製、細胞標識および免疫沈降用キット）中に溶解した。３０分後、溶解した細胞を採取し、超音波処理し（３×１５秒）、次いで３０分間氷上でインキュベートし遠心分離した。上清を、下記のように免疫沈降に付した。３．実験１における免疫沈降ベーリンガー・マンハイム（スイス国）の「細胞標識および免疫沈降用キット」の試薬を用い、そのプロトコルにしたがって免疫沈降を実施した。略述すると、プロテインＡ・アガロースけんだく液５０μｌを用いて試料を予備清澄化した。遠心分離でこのプロテインＡ・アガロースを除去した後、上清を下記の抗体とインキュベートした：Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲＮＡＴＣＣ番号ＨＢ５５）；１Ｂ５（抗ＭＨＣクラスＩＩ、アムステルダム、ネザーランズ・カンサー・インスティテュートのジャック・ネフィエス博士から入手）；および抗ＣＤ３（ファーミンゲン、アメリカ合衆国サンディエゴ／ＡＭＳバイオテクノロジー、スイス国）。１時間後、プロテインＡ・アガロース５０μｌを加え、試料を３時間インキュベートし、その後６回洗浄した。次いでペレットを緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＰＭＳＦ）３０μｌに再けんだくし、放射能標識ＣＤ１４含有インビトロ転写／翻訳反応で得た溶液５μｌを加え、この混合物を室温で３０分間インキュベートした。遠心分離後、ペレットを洗浄用緩衝液＃２で２回、次いで洗浄用緩衝液＃３で２回洗浄した（緩衝液＃２および＃３はベーリンガー・マンハイム、スイス国、の細胞標識および免疫沈降用キットに由来）。次いで、ペレットを標準ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動仕込み緩衝液に溶解して煮沸し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでゲル電気泳動し、その後オートラジオグラフィーに付した。４．ＭＨＣクラスＩＩ分子の精製ゴルガら（１５）の記載法を僅かに変更してＴＨＰ−１細胞からＭＨＣクラスＩＩ分子を抽出し精製した。Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ、ＡＴＣＣ番号ＨＢ５５）を、ピメルイミド酸ジメチルで架橋することによりプロテインＡ・アガロース４Ｂカラム上に固定した。ＴＨＰ−１細胞を、氷上で、０．１ｍＭＰＭＳＦ含有トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解した。以下の操作はすべて４℃で行った。溶解物を３０００×ｇで遠心分離し、ペレットを上清が澄明になるまで洗浄した。上清を集めて１６００００×ｇで４０分間遠心分離し、ペレットに最終濃度４％のノニデットＰ４０を加えて再溶解した。１６００００×ｇで２時間遠心後、上清を下記の順序で一連のカラム処理に付した：セファロース４Ｂ（１０ｍｌ）、正常家兎血清アフィゲル（１０ｍｌ）、プロテインＡ・セファロース４Ｂ（２ｍｌ）、Ｌ２４３・セファロース４Ｂ（１２ｍｌ）。カラムを、１０ｍＭトリス・ＨＣｌ／０．１％ノニデットＰ４０、ｐＨ８．０（５容量）；１０ｍＭＭＯＰＳ／１４０ｍＭＮａＣｌ／０．１％デオキシコール酸、ｐＨ８．０（２容量）；１０ｍＭトリス・ＨＣｌ／０．１％デオキシコール酸、ｐＨ８．０（４容量）で洗浄した。次いでＬ２４３カラムを他のカラムから外し、５０ｍＭグリシン／０．１％デオキシコール酸、ｐＨ１１．５で手早く溶離させた。１０ｍｌづつのフラクションを集め、溶離され次第２Ｍグリシン、ｐＨ２．０でｐＨ７．０ないし８．０に調整した。溶離したＨＬＡ−ＤＲ分子を、３０キロダルトン分別膜で限外濾過することにより濃縮した。トリス・ＨＣｌ／０．１％デオキシコール酸、ｐＨ８．０で３回洗浄後、蛋白質を同じ緩衝液中に再希釈した。５．実験２における免疫沈降インビトロ転写／翻訳反応で得た放射能標識ＣＤ１４を含有する溶液５０μｌを、約１０ｎｇのＭＨＣクラスＩＩ分子を含む溶液１μｌと混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、抗体を加え、試料を４℃で１時間インキュベートした。プロテインＡ・アガロース５０μｌを添加後、試料を４℃でさらに３時間インキュベートした。遠心分離し、ペレットを洗浄用緩衝液＃２で２回、次いで洗浄用緩衝液＃３で２回洗浄した（ベーリンガー・マンハイム、スイス国、の細胞標識および免疫沈降用キット）。次いで、ペレットを標準ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動用仕込み緩衝液に溶解して煮沸し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでゲル電気泳動し、その後オートラジオグラフィーに付した。６．実験３における免疫沈降他の免疫沈降実験について記載したように放射能標識ＣＤ１４を免疫沈降試料に加える前に、ＣＤ１４含有溶液を抗ＣＤ１４抗体のカクテルと室温で１０分間インキュベートした。カクテルは、下記抗ＣＤ１４抗体：ＲＭＯ５２（イムノテック、スイス国）；ＬｅｕＭ３（ベックトン・アンド・ディッキンソン、スイス国）；ＭＹ４（クールター、スイス国）；Ｔｕｋ４（ダコ、スイス国）；それぞれ１０μｇ、および下記抗ＣＤ１４ハイブリドーマ：３Ｃ１０、６３Ｄ３（共にＡＴＣＣから入手）の上清１００μｇからなるものであった。対照として、抗体カクテルの容量と同用量のＰＢＳを、放射能標識したＣＤ１４含有溶液５μｌに加えた。免疫沈降に用いた抗体は、ＭＹ４（抗ＣＤ１４）およびＬ２４３（抗ＭＨＣ− ＩＩ）であった。結果実験１ＭＨＣクラスＩＩ陽性およびＭＨＣクラスＩＩ陰性細胞溶解物を用いるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＣＤ１４の共同沈降の実証この実験の結果を図５に示す。図の左側はＭＨＣクラスＩＩでトランスフェクションした（すなわちＭＨＣクラスＩＩのα、βおよびｉ−鎖で同時トランスフェクションした）２９３細胞の溶解物を用いて実施した実験の結果を図示するもので、右側にはＭＨＣクラスＩＩ陰性２９３野生型細胞の溶解物を用いた結果が見られる。レーン１および２では、おそらく放射性ＣＤ１４（レーン１）およびルシフェラーゼ（レーン２）にそれぞれ対応する微かなバンドが、対照抗体抗ＣＤ３により非特異的に沈降しているだけである。放射能標識したＣＤ１４（ＣＤ１４*）に対応するバンドはレーン３およびレーン５に明確に見られる。ＭＨＣクラスＩＩ分子を認識する２種の異なる抗体（レーン３：Ｌ２４３；レーン５：１Ｂ５）は、ＣＤ１４*を（共同）沈降している。意味をもつ量の放射能標識した対照蛋白質（ルシフェラーゼ）がこれらの抗体で共同沈降していないので（レーン４および６）、これらの抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体の共同沈降作用はＣＤ１４に特異的である。ＭＨＣクラスＩＩ分子の不存在下（ＭＨＣクラスＩＩ陰性２９３細胞溶解物を使用、レーン７−９）では抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体によるＣＤ１４の沈降がないので、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体によるＣＤ１４の共同沈降はＭＨＣクラスＩＩ分子の存在に依存している。実験２イムノアフィニティーカラムで精製したＭＨＣクラスＩＩ分子を用いるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＣＤ１４の共同沈降の実証結果を図６に示す。図の左側は精製ＭＨＣクラスＩＩ分子の存在下で実施した免疫沈降実験の結果を図示するもので、右側には精製ＭＨＣクラスＩＩ分子の不存在下すなわち陰性対照としての緩衝液を用いた実験の結果が見られる。レーン１および４では、対照抗体（抗ＣＤ３）により非特異的に沈降したＣＤ１４に対応する微かなバンドがみられる。レーン３には、ＣＤ１４に対応するバンドが抗ＣＤ１４抗体による沈降で出現している。この実験では沈降を抗ＭＨＣクラスＩＩ分子で行っているが、レーン２では、ＣＤ１４に対応するバンドはレーン３より強度が大きい。精製ＭＨＣクラスＩＩ分子の不存在下では、ＣＤ１４は抗ＣＤ１４抗体で強く沈降するが（レーン６）、他方抗ＭＨＣクラス抗体によるＣＤ１４の共同沈降は背景レベルを超えない（レーン５）。実験３ＣＤ１４とＭＨＣクラスＩＩ分子間の物理的相互作用は、抗ＣＤ１４抗体により阻害することができる結果を図７に示す。レーン１および５は、抗ＣＤ１４抗体ＭＹ４が、ＭＨＣクラスＩＩ分子の存在（レーン１）または不存在（レーン５）（対照）と無関係に、インビトロ転写／翻訳で製造した放射能標識ＣＤ１４を沈降させることを示す。ＣＤ１４は、ＭＨＣクラスＩＩ分子が存在するなら（レーン２）抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体であるＬ２４３により強く沈降するが、ＭＨＣクラスＩＩ分子の不存在下では（レーン６）背景量しかしない。もしＣＤ１４を先ずあらかじめＭＨＣ − ＩＩ分子含有細胞溶解物と混合した抗ＣＤ１４抗体のカクテルで処理するなら、ＣＤ１４は抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体で沈降され得ない。レーン４は、緩衝液（対照）が、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体によるＣＤ１４の共同沈降に作用をもたないことを示す。レーン７および８は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の不存在下で実施したレーン３および４と同一実験の結果を示す。実施例４緒論インビボの細胞活性化におけるＭＨＣ−ＩＩの役割を明らかにするため、ＭＨＣクラスＩＩノックアウトマウスを使用した。もしＭＨＣ−ＩＩがＬＰＳによる活性化機構に関与しているなら、ＭＨＣ−ＩＩを欠くマウスはＬＰＳ刺激による通常の生理学的効果を示さないはずである。同一マウスの血液を使用して、同様な実験をインビトロで実施した。方法インビボ実験では、ＬＰＳ（エシエリキア・コリ０１１１：Ｂ４、滅菌０．９％ＮａＣｌで希釈）１００μｇを野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびＢ６−Ａａ⁰／Ａａ⁰ＭＨＣクラスＩＩノックアウトマウス（ホフマン−ラーロッシュ）に静脈注射した。２時間後、マウスを無菌放血により殺した。血液を室温で放置して凝固させ、１３．０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで血清を除去した。食細胞活性化のマーカーであるＴＮＦ−αの含量を血清中酵素免疫吸着測定法（バイオソース）で測定した。図８は結果を示す。インビトロ実験では、野生型ＭＨＣ−ＩＩ陽性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（図９の黒丸）およびＭＨＣクラスＩＩ遺伝子Ａａ¹の標的破壊によりＭＨＣクラスＩＩの発現が欠如したＢ６−Ａａ⁰／Ａａ⁰マウス（白丸）のヘパリン処理した全血を、ＬＰＳ０、０．１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの存在下にインキュベートした。インキュベーション４時間後、ＴＮＦ−αのレベルを血漿中酵素免疫吸着測定法（バイオソース）で評価した。図９に結果を示す。ＴＮＦ−αの分泌は、ＭＨＣクラスＩＩ発現マウスまたは細胞で明らかに高い。実施例５緒論ＭＨＣ−ＩＩ結合およびＭＨＣ−ＩＩ模倣分子のインビボ効果を、次のようにして評価した。方法野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスを別個に秤量し、予備実験で決定したＬＤ５０を注射した。ＬＰＳ注射前に、マウスを以下のもので予備処理した：１群：１μｇないし１ｍｇ／体重ｋｇの用量範囲における可溶性ＭＨＣクラスＩＩ分子。２群：同じ用量範囲における抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体。３群：食塩水のみ（対照群）。対照として、別に３種の群に可溶性ＭＨＣクラスＩＩ、抗ＭＨＣ−ＩＩまたは食塩水をそれぞれ与え、その後のＬＰＳ処置は行わなかった。生存率を７日間調べた。マウスをはじめの４８時間通常の方法で観察して症状を記録した。ＬＰＳ誘導致死が起こる前に１群のマウスを殺して放血させ、これらの血清ＴＮＦ−α濃度を酵素免疫吸着測定法により測定した。結果死亡率および血清ＴＮＦ−α濃度は、比較した可溶性ＭＨＣクラスＩＩ分子または抗ＭＨＣ−ＩＩ抗体で処理したマウス群で顕著に減少した(結果は図示せず) 。ＭＨＣクラスＩＩ分子または抗ＭＨＣ−ＩＩ抗体で処理したがＬＰＳでの処理をしなかった対照群は、食塩水で処理しＬＰＳで処理しなかったマウスと顕著な差を示さなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＢＸＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦＡＣＪＡＢＧＡＤＡＡＡＢＡＤＰＡＢＸＡＤＵＡＣＪＡＤＹＡＤＡ 39/395 ＡＢＥＡＤＰＣ０７Ｋ 14/705 ＡＤＵ 16/28 ＡＤＹＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロエネル，ロジェ・パスカルスイス、ツェーハー−8128ヒンテレック、マイエンライン

Claims

【特許請求の範囲】１．ＭＨＣ−ＩＩ保有細胞の活性化刺激薬と細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子間の相互作用の干渉に使用するためのＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子。２．食細胞の活性化刺激薬と細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子間の相互作用の干渉に使用するためのＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子。３．リポ多糖体（ＬＰＳ）またはＣＤ１４もしくはＬＰＢのような他の分子との複合体中のＬＰＳと、細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子との間の相互作用の干渉に使用するためのＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子。４．グラム陽性菌の生産物またはグラム陽性菌の生産物とＣＤ１４のような分子との複合体と、細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子との間の相互作用の干渉に使用するためのＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子。５．ＭＨＣ−ＩＩ結合分子が、抗ＭＨＣ−ＩＩ抗体もしくはそのフラグメント、またはヒト化、２特異性もしくはその他の操作分子などのようなこの抗体から由来する任意の分子である、請求項１−４の何れか１項記載のＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子。６．ＭＨＣ−ＩＩ結合分子が、ＣＤ１４、そのフラグメント、その修飾体またはＭＨＣ−ＩＩ結合性を有するペプチドからなる群から選ばれる、請求項１−４の何れか１項記載のＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子。７．ＭＨＣ−ＩＩ結合分子が、可溶性完全ＭＨＣ−ＩＩ、１種以上のＭＨＣ− ＩＩの可溶性サブユニット、可溶性完全ＭＨＣ−ＩＩまたはそのサブユニットのフラグメント、完全ＭＨＣ−ＩＩもしくはそのサブユニットの修飾体、またはＭＨＣ−ＩＩもしくはそのサブユニットのＬＰＳもしくはＬＰＳ／ＣＤ１４／ＬＢＰ結合性を有するペプチドからなる群から選ばれる、請求項１、２、３または４記載のＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子。８．ＭＨＣ−ＩＩ模倣分子が担体に結合している、請求項１、２、３、４または７記載のＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子。９．炎症性疾患；敗血性ショック；骨髄移植のような臓器移植後の移植片宿主相関病；移植片拒絶反応；成人型呼吸窮迫症候群などのような熱傷、事故、膵臓の感染などにより生ずる１種以上のヒトの臓器における炎症反応；毛細管漏洩症候群のような、術後に１種以上のヒトの臓器で起こる炎症反応；１種以上のヒトの臓器におけるアレルギー性疾患；紅斑性狼そう（ＬＥ）およびその派生形、浮腫性強皮症およびその派生形、好酸球性筋膜炎、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎、ウエジナー肉芽腫、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋炎などのような自己免疫疾患を伴う１種以上のヒトの臓器における炎症反応；リューマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、フェルティー症候群、カプラン症候群、強直性脊椎炎（マリー・ストリュンペル・ベクテレフ病）、乾せん、ライター症候群、ベーチェット症候群のようなリウマチ様疾患を伴う１種以上のヒトの臓器における炎症反応；真性糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、消化管潰瘍、糸球体腎炎および腎炎のような腎感染症、動脈硬化性疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、甲状腺機能昂進、甲状腺機能低減のような少なくとも部分的に自己免疫機構により生ずる疾患を伴う１種以上のヒトの臓器における炎症反応；白血病、血球がん、がん腫、繊維腫、肉腫および種々の型の組織球増加症のような腫瘍学的疾患を伴う１種以上のヒトの臓器における炎症反応；並びにエイズのようなウイルス疾患の予防および／または治療に使用するためのものである、請求項１ないし８の何れか１項記載のＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子。１０．ＭＨＣ−ＩＩ結合分子。１１．ＭＨＣ−ＩＩ模倣分子。１２．有効成分としてＭＨＣ−ＩＩ結合または模倣分子を適当な賦形剤と共に含む、医薬組成物。１３．ＭＨＣ−ＩＩ保有細胞の活性化刺激薬と細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子間の相互作用の干渉用医薬組成物の製造におけるＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子の使用。１４．食細胞の活性化刺激薬と細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子間の相互作用の干渉用医薬組成物の製造におけるＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子の使用。１５．リポ多糖体（ＬＰＳ）またはＣＤ１４もしくはＬＰＢのような他の分子との複合体中のＬＰＳと細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子間の相互作用の干渉用医薬組成物の製造におけるＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子の使用。１６．グラム陽性菌の生産物またはグラム陽性菌の生産物とＣＤ１４のような分子との複合体と細胞結合ＭＨＣ−ＩＩ分子間の相互作用の干渉用医薬組成物の製造におけるＭＨＣ−ＩＩ結合および／またはＭＨＣ−ＩＩ模倣分子の使用。