JPH10511958A

JPH10511958A - アンドロゲン過剰症の治療

Info

Publication number: JPH10511958A
Application number: JP8521289A
Authority: JP
Inventors: ブル，ハーブ・ジー; ハリス，ジヨージアナ・エス
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1995-01-04
Filing date: 1996-01-02
Publication date: 1998-11-17
Also published as: WO1996020713A1; US5962442A; CA2208687A1; EP0800396A4; AU705789B2; EP0800396A1; AU4656796A; US5656613A

Abstract

(57)【要約】この発明は、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイド、及び５α−レダクターゼ酵素のピリジン−ヌクレオチド補酵素（ＮＡＤＰＨ）から、機構に基づく新規な不可逆的ヒト５α−レダクターゼ酵素阻害剤を形成することによる、ヒトのアンドロゲン過剰症の治療に関する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称アンドロゲン過剰症の治療発明の要旨本発明は、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイド、及び５α−レダクターゼ酵素のピリジン−ヌクレオチド補酵素（ＮＡＤＰＨ）から、機構に基づく新規な不可逆的ヒト５α−レダクターゼ酵素阻害剤を形成することによる、ヒトのアンドロゲン過剰症(ｈｙｐｅｒａｎｄｒｏｇｅｎｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ)の治療に関する。本発明はさらに、単離された阻害剤−補酵素複合体に関する。発明の背景尋常性アクネ、脂漏症、女性の多毛症、女性及び男性のパターン禿頭症を含む男性ホルモン性脱毛症、並びに良性の前立腺過形成のようなある種の望ましくない生理現象は、代謝系におけるテストステロン（「Ｔ」）又はそれに類似の男性ホルモンの過剰な蓄積に起因するアンドロゲン過剰刺激により生じる。男性ホルモン性脱毛症は雄核発生性脱毛症としても知られている。アンドロゲン過剰による有害な結果に対抗する化学療法剤を提供しようとする初期の試みにより、それ自体望ましくないホルモン活性を有する数種のステロイド系抗男性モルホン物質が見出された。例えば、エストロゲンは、アンドロゲンの作用を抑制するだけでなく、女性化作用をも有する。非ステロイド系抗男性ホルモン物質、例えば、４′−ニトロ−３′−トリフルオロメチル−イソブチルアニリドも開発された〔Ｎｅｒｉら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９７２，９１（２）参照〕。しかし、これらの生成物は、ホルモン作用を欠いているとはいえ、レセプター部位に対して全ての天然アンドロゲンと競合し、それによって、男性宿主、若しくは女性宿主の男性胎児、を女性化したり、及び／又は精巣の過剰刺激を起こすフィードバック作用を開始させたりする傾向がある。ある種の標的臓器例えば前立腺における男性ホルモン活性の主要メディエーターは、テストステロン−５α−レダクターゼの作用により標的臓器で局所的に形成される５α−ジヒドロテストステロン（「ＤＨＴ」）である。テストステロン −５α−レダクターゼ阻害剤は、これらの臓器におけるアンドロゲン過剰刺激の症状を防止又は軽減する働きをする。酵素５α−レダタターゼは、以下に示されているように、テストステロンからより強力なアンドロゲンであるジヒドロテストステロンへの還元を触媒する：以下に示されているフィナステライド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）〔１７β− （Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）−３−オキソ−４−アザ−５α−アンドロスト −１−エン−３−オン〕は、ヒト前立腺酵素の強力な阻害剤である。アンドロゲン過剰症の治療に有用であることが知られている（例えば、ＵＳＰ４，７６０，０７１号参照）。現在、フィナステライドは、５５歳以上の男性の殆どがある程度罹患している良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）の治療用に処方されている。男性ホルモン性脱毛症及び前立腺ガンの治療におけるフィナステライドの有用性は以下の文献にも開示されている：１９８８年１０月５日公開のＥＰ０，２８５，３８２号；１９８８年１０月５日公開のＥＰ０２８５，３８３号；カナダ特許第１，３０２，２７７号；及びカナダ特許第１，３０２，２７６号。ヒト５α−レダクターゼには２種のアイソザイムが存在する。１方のアイソザイム（１型）は顔や皮膚の組織の皮脂腺に多く、フィナステライドに対して比較的非感受性であるが、他方（２型）は前立腺に多く、フィナステライドによって強力に阻害される。フィナステライドは、当初、ヒト前立腺酵素の単純で迅速に作用する可逆的阻害剤（Ｋ_i＝２６ｎＭ）であると考えられていたが、臨床試験において、フィナステライドの効能は、前立腺酵素に対して認知されていたその効力に基づく予測をはるかに超えるものであった。例えば、このＫ_iと同程度の循環濃度のフィナステライドは、実際にジヒドロテストステロンのレベルを前立腺アイソザイムを欠く個体に一般に認められるものに近い値まで低下させ、フィナステライドを中断した後でジヒドロステロンが基準レベルに戻るまでには少なくとも２週間を要した〔Ｓｔｏｎｅｒ，Ｊ．，Ｓｔｅｒｏｉｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３７：３７５−３７８（１９９０）及びＧｏｒｍｌｅｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ．７０：１１３６ −１１４１（１９９０）〕。フィナステライドとヒト前立腺（２型）アイソザイムの相互作用をより厳密に評価することにより、フィナステライド及びその特定のアナログは、それらの効力が標準的な固定時間アッセイでは誤って過小評価されてしまうほど遅結合性（ｓｌｏｗ−ｂｉｎｄｉｎｇ）の阻害剤であることが判明した〔Ｈａｒｒｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：１０７８７−１０７９１（１９９２）〕。Ｆａｌｌｅｒらも独自に不整合性を認めた。最近、Ｆａｌｌｅｒらは、フィナステライドの遅結合性挙動を詳細に記載しており、その中で、フィナステライドがヒト前立腺アイソザイムに２．７×１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1の速度定数で結合して、Ｋ_i＜＜１ｎＭの実質的に不可逆的な酵素−阻害剤複合体を形成するとの結論を得たと述べている〔Ｆａｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２：５７０５−５７１０（１９９３）〕。フィナステライドは、ＢＰＨの治療に用いられる用量ではヒト皮膚（１型）アイソザイムの有効な阻害剤ではないが、該アイソザイムと比較的高親和性の複合体をゆっくり形成する。Ｔｉａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：２２９１−２２９６（１９９４）により測定されたように、この複合体形成の二次速度定数は４．０×１０³Ｍ^-1ｓ^-1であり、これは前立腺アイソザイムに対する速度定数の約１％である。Ｔｉａｎらは、見かけの不可逆的阻害及び構造−活性の考察に基づき、フィナステライドがマイケル受容体として酵素に共有結合すると述べている。本発明は、当業界における予測とは対照的に、フィナステライド及び１，２− 二重結合を有する他の３−オキソ−４−アザステロイドが５α−レダタターゼの機構に基づく新規な不可逆的阻害剤であることを証明する。１，２−二重結合を有するこれらの３−オキソ−４−アザステロイドは、ヒト５α−レダクターゼの１型及び２型酵素により基質として認識され、酵素的還元の間に、ピリジン−ヌクレオチド補酵素（ＮＡＤＰＨ）との共有結合付加物を形成する。ジヒドロフィナステライドカチオンと酸化ニコチンアミド補酵素とにより形成された阻害剤−補酵素複合体は、Ｋ_i＜３×１０^-13Ｍの強力な集取生成物阻害剤(ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)として前記酵素と結合する。Ｋａｐｌａｎら〔Ｅｖｅｒｓｅら，ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃＣｈｅｍ．１：２０７−２３３（１９７１）〕は、ピリジン−ヌクレオチド結合デヒドロケナーゼを用いた実験で、数種のピリジン−ヌクレオチド結合デヒドロゲナーゼ、特に乳酸デヒドロゲナーゼにより自発的に（逆方向で）形成された類似の高親和性不全性三元複合体を同定した。乳酸デヒドロゲナーゼは、誤ってＮＤＡ⁺にピルビン酸を付加し、以下に示す阻害剤を形成する：〔式中、Ｂ^-は酵素活性部位上の塩基性基を表し、ＡＤＰＲはアデノシン−ジホスホ−リボースを表す〕。１，２−二重結合をステロイドアナログに挿入する方法は、米国特許第５，０８４，５７４号及び同第５，０２１，５７１号に記載されている。１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドの製造は、以下の刊行物に記載されている：Ｒａｓｍｕｓｓｏｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９：２２９８−２３１５（１９８６）。発明の詳細な説明機構に基づく新規な不可逆的ヒト５α−レダクターゼ阻害剤は、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイド、及び５α−レダクターゼ酵素のピリジン−ヌクレオチド補酵素（ＮＡＤＰＨ）から形成される。実質的に純粋な形態で単離された共有結合ＮＡＤＰ−阻害剤複合体の構造を、以下に構造式（Ｉ）として表す：〔式中、（Ｐ）ＡＤＰＲは２−ホスホ−アデノシン−ジホスホ−リボースを表す〕。当業者には公知のように、構造式（Ｉ）の共有結合付加物は、４−窒素での置換が存在せず且つ３−オキソ位置が保護されている限り、任意に修飾し得る。特に好ましいのは、アザステロイド環の以下の位置のいずれかで置換された化合物である：ヒトに投与される１，２−二重結合を有する３− オキソ−４−アザステロイドの構造に応じて、７、１５、１６及び１７位。５α−レダクターゼ酵素の阻害機構を図式１に示す。天然基質のテストステロンの還元と、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドの還元とは極めて類似している。というのは、どちらもほぼ同一の高エネルギーエノラートを介して進められるからである。テストステロンの場合、水素化物イオンがＣ−５に移動することにより３，４−エノラートが得られ、プロトンがＣ−４に移動することにより還元が完了してジヒドロテストステロンへの互変異性化が可能になる。１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイド阻害剤の場合には、水素化物イオンがＣ−１に移動することにより代わりに２，３−エノラートが得られる。この水素化物の移動は、実質的に高親和性の複合体を形成して完了する。というのは、酵素−阻害剤複合体が変性すると、１，２−二重結合を有する非転換３−オキソ−４−アザステロイド阻害剤は回収されないからである。この時点で酵素は捕獲状態になり、プロトンをＣ−２に移動させて還元を完了させる用意ができない。エノラート／カルバニオンは、プロトンを見つけることができずに、正電荷のピリジニウムイオンをアタックして、酵素が強固に結合した共有結合付加物を生成する。酵素−阻害剤複合体は、約１ヶ月の半減期で自発的に分解し、回収されるのは、ジヒドロ−３−オキソ−４−アザステロイド阻害剤のみである。図式１：〔式中、ＡＨ及びＢＨは、酵素活性部位におけるプロトン供与体を表し、（Ｐ）ＡＤＰＲは、２−ホスホ−アデノシン−ジホスホ−リボースを表す〕。１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイド（△¹ＮＨ−アザステロイドとも称される）は、酵素５α−レダクターゼにより選択的に活性化され、構造式（Ｉ）の、補酵素ＮＡＤＰＨとの新規な共有結合付加物を形成する。本発明に有用な特に好ましい１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドは、以下の構造式（II）の化合物である：１，２−二重結合を３−オキソ−４−アザステロイドに挿入する方法は、米国特許第５，０８４，５７４号及び同第５，０２１，５７１号に記載されている。構造式（II）のアザステロイドは任意に置換し得る。特に、構造式（II）のアザステロイドは、１７位で、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２３０４０号に記載のようにエーテル若しくはチオエーテルで；例えばＰＣＴ公開ＷＯ９４／０７８６１号に記載のようにアニリドで；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２３０３８号、同ＷＯ９３／２３０５１号、同ＷＯ９３／２３４２０号及び米国特許第４，２２０，７７５号、同第４，７６０，０７１号、同第４，８４５，１０４号、同第５，２３７，０６７号、同第５，０９１，３８０号、同第５，０６１，８０１号、同第５，２１５，８９４号に記載のように非置換、モノ置換若しくはジ置換アミドで；米国特許第４，２２０，７７５号、同第４，３７７，５８４号に記載のようにオキソで；米国特許第４，２２０，７７５号及び同第４，３７７，５８４号に記載のようにヒドロキシで；米国特許第４，２２０，７７５号に記載のようにシアノで；米国特許第４，２２０，７７５号に記載のようにテトラゾリルで；米国特許第４，３７７，５８４号に記載のようにアリールアルキルカルボニルオキシアルキルで；米国特許第４，３７７，５８４号に記載のようにシクロアルキルアリールカルボニルオキシアルキルで；米国特許第４，３７７，５８４号に記載のようにベンゾイルオキシアルキルで；米国特許第５，０４９，５６２号、同第５，１３８，０６３号、同第５，１５１，４２９号、同第５，２３７，０６１号、同第５，１２０，７４２号、同第５，１６２，３３２号、同第５，０６１，８０２号、同第５，０９８，９０８号、同第５，１９６，４１１号、同第５，０７５，４５０号、同第５，０６１，８０３号、同第５，３２４，７３４号に記載のように置換若しくは非置換アシルで；米国特許第５，１５１，４３０号に記載のようにチオベンゾイルで；米国特許第５，１６２，３２２号に記載のようにポリアロイルで；米国特許第５，０９１，５３４号及びＰＣＴ公開ＷＯ９３／２３０４１号、同ＷＯ９３／２３０４０号に記載のようにエステルで；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２３０５０号、同ＷＯ９３／２３４１９号、同ＷＯ９３／２３０５１号に記載のように置換若しくは非置換アルキルで；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２３０４８号に記載のように尿素、チオ尿素、カルバメート若しくはチオカルバメートで；又はＰＣＴ公開ＷＯ９３／２３０４１号、同ＷＯ９３／２３０４０号に記載のようにチオエステルで任意（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）に置換し得る。さらに構造式（II）のアザステロイドは、１６位で、ＰＣＴ公開９３／２３０３９号及び米国特許第５，０４９，５６２号、同第５，１３８，０６３号、同第５，２７８，１５９号及び同第４，３７７，５８４号に記載のように低級アルキルで；又は米国特許第５，２７８，１５９号及び同第４，３７７，５８４号に記載のようにヒドロキシルで任意に置換し得る。構造式（II）のアザステロイドは、さらに、１５位で、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１０４号に記載のようにアルキルオキシ、アルキル又はシアノで任意に置換し得る。さらに、構造式（II）のアザステロイドは、米国特許第４，２２０，７７５号に記載のように、７位を低級アルキル基で置換し得る。７−β結合の形成は、米国特許第５，２３７，０６４号に記載されている。当業界では公知のように、別の置換を含み得ないＡ環を除き、アザステロイド上では別の置換も許容される。５α−レダクターゼ２型酵素との結合を促進するためには、１７位を疎水基で置換するのが好ましい。特に好ましいのは、１７位にアミド又はアニリド置換を有する化合物である。５α−レダクターゼ１型酵素に対して選択されるアザステロイドは、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２３４２０号に記載されている。５α−レダクターゼ１型及び２型酵素のどちらに対しても選択されるアザステロイドは、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２３０５０号に記載されている。より特定的に言えば、本発明は、ヒト５α−レダクターゼ酵素を共有結合により修飾せずにヒト５α−レダクターゼ酵素を不可逆的に阻害することにより、アンドロゲン過剰症の治療を要するヒトの該症状を治療する方法に関する。該方法は、そのような治療を要するヒトに、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４ −アザステロイドを投与することを含む。１，２−二重結合を有する３−オキソ −４−アザステロイドを５α−レダタターゼにより選択的に活性化して構造式（Ｉ）の補酵素ＮＡＤＰＨとの共有結合付加物を生成させる。この共有結合付加物は、５α−レダクターゼ酵素から極めてゆっくり遊離するので、該酵素の阻害は実施的に不可逆的となる。本発明の方法は、酵素を共有結合により修飾せずに自殺阻害剤特性を示す阻害剤を提供する。一般に「自殺阻害剤」とは、酵素タンパク質を共有結合修飾して酵素を失活させる阻害剤である。そのような「自殺阻害剤」は医薬としては好ましくない。何故ならば、共有結合修飾された酵素は、治療を受ける生物の免疫系により異物として認識され、望ましくない免疫応答を引き起こし得るからである。本発明の非タンパク質結合付加物は、そのような望ましくない免疫応答の可能性を排除する。本発明の持続性酵素結合３−オキソ−４−アザステロイド−ＮＡＤＰ付加物は、臨床面でさらなる利点を提供する。本発明の方法は、投薬計画が中断されたり、患者が薬剤を服用しそこなったりして１，２−二重結合を有する３−オキソ− ４−アサステロイド剤のレベルが低下したときでさえ、５α−レダクターゼを持続的に阻害する。この投薬中断の場合、それまで阻害されていた５α−レダクターゼは阻害状態から回復することはできず、新たに患者によって合成された５α−レダクターゼを阻害するためだけに追加の薬剤が必要となる。本発明の方法により治療し得るアンドロゲン過剰症には、良性の前立腺過形成、男性ホルモン性脱毛症、尋常性アクネ、脂漏症、女性の多毛症及び前立腺ガンが含まれる。本発明に有用な１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドは、典型的には、意図する投与形態、即ち、経口投与用の錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関して適当に選択された適当な医薬稀釈剤、賦形剤又は担体（本明細書では総称して「担体」物質という）と混合し、慣用の医薬実施に従って、経口投与又は静脈若しくは筋肉注射により全身的に、あるいは局所的に投与し得る。例えば、錠剤又はカプセル剤の形態で経口投与する場合、有効薬剤成分は、エタノール、グリセロール、水などのような経口の医薬上許容し得る無毒性の不活性担体と組み合わせることができる。本発明の生成物を含むカプセル剤は、本発明の有効成分をラクトース及びステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、スターチ、タルク又は他の担体と混合し、混合物をゼラチンカプセルに入れることにより製造し得る。錠剤は、有効成分を、リン酸カルシウム、ラクトース、コーンスターチ又はステアリン酸マグネシウムのような慣用の錠剤化成分と混合することにより製造し得る。さらに、所望又は必要なら、混合物に、適当な結合剤、滑沢剤、崩壊剤及び着色剤を混和してもよい。適当な結合剤には、スターチ、ゼラチン、天然糖類（例えば、グルコース又はβ−ラクトース）、コーン甘味剤、天然及び合成ガム類(例えば、アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム)、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ろうなどが含まれる。これらの剤形に用いられる滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤には、スターチ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれるが、それらには限定されない。液剤は、合成及び天然ガム類、例えば、トラガカント、アカシア、メチルセルロースなどのような適当に着香した懸濁剤又は分散剤中で形成する。用い得る他の分散剤にはグリセリンなどが含まれる。非経口投与には、滅菌懸濁剤及び溶剤が望ましい。静脈内投与が望ましい場合には、一般に適当な保存剤を含む等張製剤を用いる。局所用医薬組成物は、例えば、皮膚に適用するように適合された、溶剤、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、シャンプー又はエアゾール剤の形態であってよい。本発明の治療法に有用な局所用医薬組成物は、医薬上許容し得る担体と混合した、約０．００１〜０．１％の有効成分を含み得る。有効薬剤成分を含む局所用製剤は、当業界で周知の多様な担体物質、例えば、アルコール類、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱油、プロピレングリコール、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどと混合して、例えば、アルコール溶液、局所用洗浄剤、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローション、及びクリーム又はゲル状シャンプー剤を形成することができる（例えば、ＥＰ０２８５３８２号参照）。本発明の化合物は、小型の単ラメラ小胞、大型の単ラメラ小胞及び多重ラメラ小胞のようなリポソーム送達系形態で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンのような多様なリン脂質から形成し得る。本発明の化合物は、化合物分子が結合した個別の担体としてモノクローナル抗体を用いて送達することもできる。本発明の化合物は、標的薬剤担体として可溶性ポリマーと結合させてもよい。そのようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミド−フェノール、又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシン、を包含し得る。さらに、本発明の化合物は、薬剤の制御放出に有用な生分解性ポリマー群、例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、及びヒドロゲルの架橋若しくは両親媒性ブロックコポリマー、に結合し得る。本発明の有効物質は、１日当たり１回の投薬、又は１日当たりの全用量を１日に２、３及び４回に分割して投薬するのが有利である。本発明の化合物は、適当な経鼻ビヒクルを局所的に使用して経鼻投与するか、又は当業者には周知の経皮パッチ形態を用いて経皮経路で投与することができる。経皮送達系形態で投与するためには、投薬計画を通して間欠的にではなく連続的に投薬を行うのは当然である。本発明の化合物は、ココアバター、グリセリン処理のゼラチン、水素化植物油、種々の分子量のポリエチレングリコールの混合物及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルのような基材を用いて座薬として送達してもよい。本発明の化合物を用いる投薬計画は、患者の体型、人種、年齢、体重、性別及び医学的症状；治療を受ける症状の重篤度；投与経路；患者の腎臓及び肝臓機能；並びに用いられる特定の化合物を含む多様な要素に応じて選択する。通常の技術を有する医師又は獣医であれば、症状の進行を予防、抑制、阻止又は好転させるのに必要な薬剤の有効量を容易に決定・処方し得るであろう。最適な精度で毒性なしに効能を生じる範囲内の薬剤濃度を得るには、標的部位に対する薬剤利用性の動力学に基づく投薬計画が必要である。これには、薬剤の分布、平衡及び排泄についての考慮も含まれる。本発明の方法に有用な、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドの用量は、１日当たり０．０１〜５０ｍｇの範囲が好ましく、本発明の利点として示されているように、うっかり服用し損なうことがあっても治療効果が弱まることはない。１日当たり０．１〜１０ｍｇの用量範囲が最も好ましい。本発明の３−オキソ−４−アザステロイドは周期的な投薬計画に基づいて投与し得る。効果的な投薬計画の詳細は、投与される特定の３−オキソ−４−アザステロイドに依存する。フィナステライドのような物質の場合、クリアランスのｔ_1/2 が４時間であるのに対して酵素の再貯留のｔ_1/2が恐らく２日（１０倍の長さ）であるとすれば、該物質は、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイド以外の同じクリアランス能力を有する古典的薬剤の１０倍も有利である。「古典的薬剤」という用語は、不可逆的阻害剤としては機能しない医薬上有効な物質を指す。本発明の１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドは、医薬上許容し得る塩の形態で投与し得る。「医薬上許容し得る塩」という用語は、溶解度若しくは加水分解度を変えるための剤形として用い得るか、又は徐放製剤若しくはプロドラッグ製剤として用い得る、塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、パノ酸塩（ｐａｎｏａｔｅ）などのような許容し得る塩を全て包含するものとする。１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドの動力学モデルフィナステライドとヒト５α−レダクターゼとの相互作用を適切に説明する、機構に基づく阻害の動力学モデルを以下に示す。公式の動力学機構は、二分子（ｂｉ）、二分子（ｂｉ）に規律されていることが示されており、テストステロンの付加は二次であり、ジヒドロテストステロンの離脱は一次である。簡明にするために、ニコチンアミド補酵素は省いた。該モデルは、競合的阻害剤が迅速且つ可逆的に基質のミカエリス複合体に類似した酵素との弱い複合体を形成することを提示している。酵素は触媒作用を開始し、そのプロセス中に高親和性酵素−阻害剤複合体（ＥＸ）を形成する反応性中間体を生成する。結局、この複合体が代謝回転して、転換された阻害剤（Ｉ^*）が遊離するか、又は（少なくとも変性して）共有結合中間体（Ｘ）が遊離し、該中間体が溶液中でゆっくりＩ^*に分解する。高親和性酵素−阻害剤複合体の形成（ｋ₂）及び代謝回転（ｋ₄）は実質的に不可逆的であると考えられる。実際、酵素−阻害剤複合体の半減期は非常に長いので、阻害は事実上不可逆的であり、阻害剤の遊離は、触媒作用によりコンピテント酵素を再生させる代謝回転によるよりも酵素の死によって起こると考えられる。該モデルは、多くの態様において、遅結合性可逆的阻害剤にも機構に基づく不可逆的阻害剤にも適用される。標準的アッセイ条件下では、テストステロンに対するバキュロウイルス発現酵素のＫ_m は、ｐＨ７．２、３７℃では２４．６±０．７ｎＭであることが知見された。このＫ_m値は、中性ｐＨでの天然ヒト前立腺酵素ついてＦａｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２：５７０５−５７１０（１９９３）によって測定された値（Ｋ_m＝２０±３ｎＭ）と一致する。ＮＡＤＰＨのＫ_mは、該アッセイ条件及び１０×Ｋ_mテストステロン下には〜１μＭであることが知見された。代謝回転数は、フィナステライドを用いた滴定により測定すると、ｐＨ７．２、３７℃で、ｋ_cat＝０．０７５±０．００６ｓ^-1であった。これらの動力学定数から、ｋ_c _at ／Ｋ_m＝２．９９±０．３２×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1である。［³Ｈ］フィナステライドを用いた以下の実験において、これらの触媒定数から計算した酵素濃度を用いて化学量論量を予測したが、概して首尾一貫した結果が得られることが知見された。構造−活性相関遅結合性で且つ（推論による）機構に基づく阻害を付与する、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドの構造特性は、実施例８のデータに示されている。これらのデータを古いものから順に検討することにより、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドが機構に基づく阻害剤であり得るという最初の示唆が得られた。フィナステライドの次の３種の修飾：Δ^1,2二重結合の還元、３−オキソ−４−アザ基のメチル化及び１７位での置換を検討した。遅結合性であると知見された阻害剤について二次速度定数を得、古典的な可逆的阻害剤であると確認されたものについてのｋ₁値を得る。結論は明らかであり、即ち：（１）１，２−二重結合は機構に基づく阻害に不可欠であり；（２）４−ＮＨ− 基を４−Ｎ（ＣＨ₃）−に変換すると機構に基づく阻害は無効になり；（３）機構に基づく阻害剤では、シクロヘキシル−又はアダマンチル−のような大きな疎水性置換基が二次速度定数ｋ_inac／Ｋ_iをテストステロンの代謝回転のｋ_cat／Ｋ_m に近いレベルに増大させる。機構に基づかないアナログでは、これらの基は可逆的結合のＫ_iを平行減少させるが、これは、機構に基づく系において該基が結合には影響を及ぼすが触媒作用には影響を及ぼさないことを示している。一般法標識［１，２−³Ｈ］フィナステライドは比活性が２３．３５ｄｐｍ／ｆｍｏｌ（１０．５２Ｃｉ／ｍｍｏｌ）であり；［ｔ−ブチル−¹⁴ Ｃ］フィナステライドは、比活性が２５．６６ｄｐｍ／ｐｍｏｌ（１１．５６Ｃｉ／ｍｏｌ）であり、（¹⁴Ｃ）−１−ブタノールから調製した。逆相高速液体クロマトグラフィーにかけて調べると、放射性標識した化合物はどちらも＞９７％の純度を有していた。基質（７−³Ｈ）テストステロンは、２４．６Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性を有し、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒから購入した。アッセイ標準アッセイは、総容量１００μｌ中、０．１ＭＭＯＰＳ、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．１％ＢＳＡからなる緩衝液中の２５ｎＭ［³Ｈ］テストステロン（１３９，０００ｄｐｍ、無担体）及び５００μＭＮＡＤＰＨの溶液に、ｐＨ７．２０、３７℃で懸濁した１００ｐＭ膜結合酵素を含んでいた。阻害剤導入用のビヒクルとして１％の最終濃度のエタノールを含んでいた。［³Ｈ］ジヒドロテストステロンの生成速度は、２時間まで又は基質を１０％消費するまではほぼ一定であった。酵素活性単位は、１ｐｍｏｌの生成物／分と定義され、これらの条件下では４４４ｆｍｏｌ酵素に等しかった。１％トリフルオロ酢酸を含む等量又はそれ以上の水を加えて反応をクエンチした後、反応体を、（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）４０％水及び６０％メタノールからなる等張系中１ｍｌ／分で稼働する逆相Ｃ−１８カラム（Ｖｙｄａｃ，４．６×２５０ｍｍ，３００Å，５ミクロン）上に直接注入して、［³Ｈ］ジヒドロテストステロンを分離した。組織抽出物が酵素源である場合、分析前に、クエンチした反応体を１０，０００×ｇで遠心して清澄化した。保持時間はテストステロンの場合は〜１３分、ジヒドロテストステロンの場合は〜２０分であった。［³Ｈ］ジヒドロテストステロンピーク（６ｍｌ）を含む流出液を液体シンチレーションバイアルに補集し、効率０．３０９のＡＱＵＡＳＯＬ２（１４ｍｌ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）を用いて計数した。ＺＹＭＡＲＫロボット及び付属装置にインターフェースしたＳＵＮＳＰＡＲＫＳＴＡＴＩＯＮ２コンピューターを用い、アッセイを完全に自動化した。指示された場合には、この酵素について、より伝統的に用いられている条件、ｐＨ５．５０及び３７℃下での測定も行った。酵素の調製天然のヒト酵素は、前立腺（２型）又は頭皮（１型）組織由来であり、組換えヒト酵素は、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎらのバキュロウイルス発現系(Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｋ．，Ｇｅｉｓｓｌｅｒ，Ｗ．Ｍ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｓ．，ＳｅｘＨｏｒｍｏｎｅｓａｎｄＡｎｔｉｈｏｒｍｏｎｅｓｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｅＤｅｐｅｎｄｅｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ：ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ，Ｍ．Ｍｏｔｔａ及びＭ．Ｓｅｒｉｏ編，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，１９９４)により産生させた。最近、同じようなバキュロウイルス発現系がＴｉａｎらによって、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：２２９１−２２９６（１９９４）にも記載された。酵素濃度は、フィナステライド又は［³Ｈ］フィナステライドを用いた滴定によるか、又は後述のようなｋ_cat及びＫ_m値を用いる触媒活性から測定した。分子量は、酵素純度の予測から約３０，０００であると判明した。酵素は、粗細胞ホモジネートとしてそのまま用いるか、あるいは、分画遠心法によりミクロソーム懸濁液として分離した。一般に、組織又は細胞のペレットは、等量の緩衝液と合わせ、高せん断力ホモジナイザー（ＰＯＬＹＴＲＯＮ，高速）を用い、１０℃以下の氷浴中に数分間分散させた。この手順は、均一に分散された調製液を得るのに効果的であり、ホモジナイゼーションを延長（１０分）しても酵素活性に悪影響を与えなかった。酵素安定性を高めるために、通常、飽和レベルの補因子が含まれた。組換え前立腺（２型）アイソザイムを用いて得られた以下の結果は典型的なものであった。バキュロウイルス発現系から、１〜２μＭの酵素を含む細胞ペレットを得たが、そのうち、酵素は全タンパク質の〜０．２％を占めていたた。金属キレート剤の不在下に３７℃では、濃縮ホモジネート中の酵素の半減期は数分の長さであったので、強力なメタロプロテアーゼによる汚染があると考えられた。核エンベロープと結合した天然５α−レダクターゼが膜中に局在化するという報告に符合して、該酵素は、広範囲の遠心力にわたって沈降した。例えば、０．１ＭＭＯＰＳ、１Ｍスクロース、１０ｍＭＥＤＴＡ及び１００μＭＮＡＤＰＨからなる等量の緩衝液中、ｐＨ７．２で細胞ペレットを破壊して、１，４３６単位の酵素／ｍｌ及び１０．５ｍｇのタンパク質／ｍｌを含む懸濁液を得た。この懸濁液を分別して、以下のように分配された酵素を得た:活性の２５％は１，０００ｇ×３０分で、１６％は１０，０００ｇ×３０分で、１５％は１００，０００ｇ×３０分で沈降し、８％は１００，０００ｇ×６０分では懸濁したままであった。ホモジネート中の活性の約３６％は遠心後に計測されなかった。１，０００〜１００，０００×ｇで沈降した最も比活性の高い画分は比活性が２倍未満増大していた。従って、個々の実験に要求される条件に応じて、種々の画分を変更可能に用いた。これらの濃縮懸濁液中で、酵素は、−８０℃で凍結しても安定であり、凍結−解凍を繰り返しても、酵素活性の損失は極くわずかであった。酵素源この実験にはヒトアイソザイムのみを用いた。天然アイソザイムは頭皮（１型）又は前立腺（２型）組織由来であり、組換え形態は、バキュロウイルス発現系により産生させた。特に明記されていない限り、全てのデータは、フィナステライドの主要標的である前立腺（２型）アイソザイムに関する。本明細書に記載されている全ての実験については、平行実験として又は確認のために、組換え１型アイソザイムを用いた実験も行った。方法及び結果は動力学及び阻害定数値以外は同一であったので、混乱や反復を避けるために詳細な記載は省く。天然及び組換え酵素は、テストステロンのＫｍ値及びフィナステライドによる阻害の二次速度定数については同等の値を有するようであり、交換可能であると判断された。酵素は、精製処理しにくいことが証明されているので、膜に結合した粗調製物として用いた。後述するように、フィナステライドを用いた滴定によれば、酵素は、天然のヒト前立腺組織調製物中のタンパク質の〜０．０００１％を構成し、バキュロウイルス中では平均〜０．１％を構成していた。実施例１酵素−阻害剤複合体の解離速度定数酵素−阻害剤複合体の解離速度定数は、１００倍過剰の非標識フィナステライドの存在下の酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体からの放射能の放出速度から決定した。酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体は、総容量３．５０ｍｌ中、ｐＨ７．２、３７℃で、０．１ＭＭＯＰＳ、０．１％ＢＳＡ及び１０ｍＭＥＤＴＡからなる緩衝液中の過剰な酵素：２１．９ｎＭ酵素（比較的ホモジニアスな１００，０００×ｇ上清画分から得た、〜０．０４％純度の６ｍｇのタンパク質）、９．３３ｎＭ［³Ｈ］フィナステライド（０．３４３ｕＣｉ）及び４６６μＭＮＡＤＰＨを含む溶液中で形成した。これらの条件下の［³Ｈ］フィナステライドの消費について予測された初期半減期は２分であり、反応は１時間で完了するものと予測された（３６％阻害）。２時間後、（１％エタノールを含む）非標識フィナステライドの９３３ｎＭ溶液を調製して交換を開始した。溶液をアリコート（１００μｌ）に分け、これを３７℃でインキュベートし、毎日試料を取り出して、次ステップの結合及び遊離阻害剤の測定のために−８０℃で凍結した。実施例２結合及び遊離阻害剤の測定４℃で数時間遠心した、１０，０００Ｄａカットオフ膜（ＡＭＩＣＯＮ，Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０）上の限外濾過により、結合及び遊離放射能の濃度を測定した。典型的には、限外濾過の前に、１００μｌの試料を水で１ｍｌに稀釈し、総溶液と濾液の一部分を、１部の水性試料から２０部のＡｑｕａｓｏｌ２（効率＝０．４９４）までを含むカクテル中で計数した。これらの測定値の標準誤差は± ５％であった。添加順序を逆にし、先ず酵素を添加する前に酵素を過剰な非標識阻害剤でブロックし、非特異的結合を評価した。これらの対照は、１６±２％の見かけ（非特異的）結合を示した。あるいは、上記の酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体を熱変性させて、１３±２％という匹敵し得る値の見かけ残留結合を得たが、これは、添加酵素の不在下に認められた［³Ｈ］フィナステライドの非特異的結合１２±２％と実質的に同一であった。これらの対照を基にして、観察された遊離濃度を、１６％非特異的結合について式ｆｒｅｅ＝ｆｒｅｅ_obs／（１−０．１６）に従って補正した。非特異的結合（±２％）は、７Ｍ塩酸グアニジンを用いた変性実験で生起した。この低分子量のリガンドの遊離を確認する方法の証拠として、７Ｍ塩酸グアニジン中の炭酸脱水素酵素（３０，０００Ｄａ）及びシトクロムｃ（１２,４００Ｄａ）の各溶液は、これらの膜上で＞９６％の保持率を示し続けた。実施例３ジヒドロフィナステライドの精製質量スペクトルの分析に十分な転換阻害剤を得るために、１，０００〜１００，０００×ｇで沈降する全てのタンパク質からなるバキュロウイルス発現酵素調製物を用いた。総容量１３．１ｍｌ中、０．１ＭＭＯＰＳ、１Ｍスクロース及び１０ｍＭＥＤＴＡからなる緩衝液中１.３９μＭ酵素（４１，０００単位、１４１ｍｇタンパク質）、１.１４μＭ非標識フィナステライド(１５.０ｎｍｏｌ)、０．０１１３ μＭトレーサー［³Ｈ］フィナステライド（１．５６μＣｉ）及び５７３μＭＮＡＤＰＨを含む溶液中、ｐＨ７．２０で、酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体を形成した。ダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）（ホモジナイザー）により該溶液に酵素を分散し、４５分間攪拌して室温に温め、７３％阻害を得た。次いで、１４，０００Ｄａのカットオフ透析チューブ(ＳＰＥＣＴＲＡＰＯＲ２)中、１ｍＭＭＯＰＳ及び１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２０を含む４Ｌの水を２回変え、溶液を４℃で一晩透析し、放射能の８８％を得た。（透析によって損失した放射能をクロマトグラフィーにかけて分析すると、６２％が［³Ｈ］ジヒドロフィナステライドとして分離し、残りは［³Ｈ］フィナステライドであった。これは、［³Ｈ］ジヒドロフィナステライドとしての全出発放射能の８％の損失に相当し、この場合、１．０８の分配比を意味する。）沸騰水浴中で２０分間熱変性させて酵素−阻害剤複合体から結合放射能を放出させ、１００，０００×ｇで９０分間遠心して沈降したタンパク質を除去し、上清中で結合放射能の９０％を回収した。この溶液を１０，０００Ｄａのカットオフ膜（ＡＭＩＣＯＮ，ＹＭ−１０）を介した限外濾過によりさらに清澄化し、放射能の８４％を回収した。次いで、逆相高速液体クロマトグラフィーにより放射性種を精製した。５ｍｌ試料ループを用いる多重注入により、０．１％トリフルオロ酢酸を含む水で平衡にしておいた、アッセイに用いたものと同じ分析用Ｃ−１８カラム（ＶＹＤＡＣ、４．６×２５０ｍｍ、３００Å、５ミクロン、流速＝１ｍｌ／分）上に溶液（２１．８ｍｌ）をロードした。適用中及びその後水で２０分間洗浄している間に流出液中に１％未満の適用放射能が検出された。次いで、４０分かけて０→１００％の線形勾配のメタノールで溶離し、９３％メタノールの公称濃度で表れた単一のシャープなピークとして放射性成分を得た。適用放射能の回収率はわずか３７％であり（その理由は後で明らかになった）、全回収率は、透析した酵素−阻害剤複合体中の³Ｈ含量の２８％であった。この調製物に関する質量スペクトルを記録した。実施例４ジヒドロフィナステライドの同定酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体（〜１ｐｍｏｌ，２５，０００ｄｐｍ）を沸騰水浴中で変性させ、０．５当量の新鮮な［³Ｈ］フィナステライドと合わせ、酵素アッセイの場合と同じ条件下に逆相カラム上のクロマトグラフィーにかけた。これと、類似のクロマトグラムからのデータとから、酵素−阻害剤複合体から１種の放射性標識化合物が遊離し（回収率：〜４５％）、該化合物が［³ Ｈ］フィナステライドとは異なることが示された。Ａ₂₁₀でモニターして非標識フィナステライド混合物（３ｍｍｏｌ）と標準ジヒドロフィナステライド（１０ｍｍｏｌ）の保持時間を比較し、未知物質を暫定的にジヒドロフィナステライドと同定した。実施例５ＮＡＤＰ−ジヒドロフィナステライド付加物の精製酵素−阻害剤複合体を調製するために、（２μＭ組換えヒト前立腺５α−レダクターゼを含む）バキュロウイルス発現系からの凍結細胞ペレット２２．５ｇを０．１ＭＭＯＰＳ緩衝液とｐＨ７．２０で合わせ、１００μＭＮＡＤＰＨ及び２μＭ（¹⁴ Ｃ）フィナステライド（２．８４×１０⁶ｄｐｍ，酵素の２倍過剰）を含む懸濁液を調製した。この溶液を上述のようにホモジナイズし、次いで、室温で〜２時間攪拌した。複合体が形成された後、ＳＰＥＣＴＲＡＰＯＲ−２透析チューブ（１４，０００Ｄａカットオフ）中の２×４，０００ｍｌの０．００１ＭＭＯＰＳ、０．００１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２に対して４℃で３日間透析して過剰な［¹⁴Ｃ］フィナステライドを除去した。４４２ｎＭ酵素［¹⁴Ｃ］阻害剤複合体を含む１００．６ｍｌが回収されたが、これは、全放射性標識の４０％に相当した。この後で、Ｒｙｅｒｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１：１１４４− １１５１（１９８２）により［４−³Ｈ］ＮＡＤＨの製造に用いられた方法に従い、重炭酸アンモニウムを含む全溶液をアンモニア水でｐＨ９に調整して遊離付加物を緩衝化した。透析した酵素−［¹⁴Ｃ］フィナステライド複合体（９５．６ｍｌ，１．０８５×１０⁶ｄｐｍ）を、２ｍｌの１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０を含む９５．６ｍｌの９５％エタノールと混合して変性させた。懸濁液を室温で３０分間攪拌し、次いで、１０，０００×ｇで４５分間遠心して、殆どの不溶性物質を除去した。上清は９３％の放射能を含んでいた。ＰｈａｒｍａｃｉａＦａｓｔＱ−５０アニオン交換マトリックス（５ｍｌカラム容量，１５０×７ｍｍ）上、室温で予備精製を行った。遠心したエタノール水溶液（１．００７×１０⁶ｄｐｍ又は２２４ｎＭ［¹⁴Ｃ］付加物を含む１７５ｍｌ）をカラム（０．０１Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐＨ９に平衡にしたＨＣＯ₃ ^- 形）にかけ、０．０５Ｍで出発し、０．０５Ｍずつ段階的に増大させて０．３５Ｍが最終となる増大濃度の重炭酸アンモニウム(ｐＨ９．０)５０ｍｌずつを用いてカラムを展開させた。付加物を、０．２０Ｍ及び０.２５Ｍ重炭酸アンモニウム画分中で溶離し、適用した¹⁴Ｃ−標識の６８％を得た。素通り（ｆｌｏｗ− ｔｈｒｏｕｇｈ）画分は放射性標識の３％を含み、他の画分はそれぞれ≦０．５％を含んでいたが、残りのものは溶出しなかった。０．２０Ｍと０．２５Ｍの重炭酸アンモニウム画分をプールし、暗所で一晩凍結乾燥し、白い羽毛状のタンパク質残留物を２．０ｍｌの０．０１Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ９）に溶解した。この時点までの回収率は、透析した酵素−阻害剤複合体の¹⁴Ｃ含量の６３％であった。溶液を遠心し、リンスして、ＰｈａｒｍａｃｉａＭｏｎｏＱアニオン交換カラム（０．０１Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐＨ９、及び５０％メタノールに平衡にしたＨＣＯ₃ ^-形）にかけた。付加物を、１ｍｌ／分の流速で、５０分かけて、０→０．５Ｍ勾配の重炭酸アンモニウム(ｐＨ９)で溶離した。メタノール含量は常に５０％に保持した。０．２６６Ｍ重炭酸塩の公称濃度で単一のシャープなピークとして付加物が溶出したが、これは適用した放射能の９８％であった。ピーク¹⁴Ｃ画分をプールし、メタノールをアルゴンで吹き飛ばし、次いで、溶液を暗所で凍結乾燥して透明なガラス体を得た。精製した付加物（６７２，０００ｄｐｍ）を４００μｌの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐＨ９に溶解し、透析した酵素−阻害剤複合体からの６２％という総回収率にあたる６５．４μＭ溶液を得た。この溶液のスペクトルを記録した。該付加物は、そのＮＡＤ−ピルビン酸対応物よりも酸化に対してより安定なようであり、解離に対しては確実により安定である。［¹⁴Ｃ］−ジヒドロフィナステライドを形成する能力と定義される、ＮＡＤＰ−［¹⁴Ｃ］ジヒドロフィナステライド付加物の完全性を、６０％水性メタノール中の逆相カラム（ＶＹＤＡＣ，４．６×２５０ｍｍ，３００Å，５ミクロン，流速＝１ｍｌ／分）上の高速液体クロマトグラフィーにかけて測定した。同時注入して測定すると、保持時間は約１４分であり、［³Ｈ］フィナステライドより常に１．４分長かった。反応は酸触媒性であることが知見された。０．１Ｍギ酸アンモニウム緩衝液中、ｐＨ４．００、１００℃での分解の半減期は〜１分であり、これらの条件下に無限時間での［¹⁴Ｃ］−ジヒドロフィナステライドへの転換率は８８％であった。このように分析すると、付加物は、重炭酸アンモニウム緩衝液中、ｐＨ９、− ７５℃で貯蔵（又は該緩衝液から凍結乾燥）した数ヶ月の間安定なようであった。陽性対照として、０.００１Ｍメト硫酸フェナジンで、中性、室温下に１時間酸化すると、［¹⁴Ｃ］−ジヒドロフィナステライドへの解離能が完全になくなった。該付加物は、その両親媒性構造を示すものとして、いくつかのクロマトグラフマトリックス上で異常な挙動を示す。酸性条件下の６０％水性メタノール中の逆相クロマトグラフィーでは［¹⁴Ｃ］−ジヒドロフィナステライドのみが溶出し、中性条件下には、付加物は貫流交換容量（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｖｏｌｕｍｅ）で溶出し、次いで正常時間に［¹⁴Ｃ］−ジヒドロフィナステライドが溶出する。また、５０％メタノールの不在下の任意の重炭酸塩濃度のＭｏｎｏＱカラムからは付加物が全く溶出しないであろう。全ての証拠は、阻害剤と補酵素の共有結合付加物を示唆している。（１）吸収及び蛍光スペクトルは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＮＡＤ−ピルビン酸複合体及びアナログ、並びにＫａｐｌａｎらにより記載されたＮＡＤ−シアン化物付加複合体のものと類似している。（２）加熱すると、該化合物は、水中、中性ｐＨ及び１００ ℃で〜６×１０^-4ｓ^-1の速度定数及び２０分の半減期で(¹⁴Ｃ)ジヒドロフィナステライドに分解する（これで、上述の熱変性実験におけるジヒドロフィナステライドの回収率の理由が明らかになる）。（３）ジヒドロピリジン環の選択的酸化剤であるメト硫酸ピラジンで処理すると［¹⁴Ｃ］ジヒドロフィナステライドに分解されなくなった。（４）その質量スペクトルにおける最も大きな親イオンピークが、１１１６Ｄａという正しい電荷／質量比を有していたことで、該付加物の同定が確実になった。質量分析法加熱ネブライザーインターフェース及び正イオン検出器を用い、ＳＣＩＥＸＡＰＩ III質量分析計上のＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、熱変性させた酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体から精製した［³Ｈ］ジヒドロフィナステライドの質量スペクトルを記録した。５ｍＭ酢酸アンモニウム及び０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％水性アセトニトリルの移動相に試料を直接注入して分析を行った。２，０００Ｄａまでのスキャン中に、３７５Ｄａにたった１つの顕著な分子イオン（Ｍ＋１）が検出され、該イオンから、以下の図７に示されているような、標準ジヒドロフィナステライドと同じ娘イオンスペクトルを得た。標準としてジヒドロフィナステライドを用いた定量分析により、娘イオンのピーク強度は、出発［³Ｈ］フィナステライドの比放射能から予測されたものと同じか、又はそれより強い（１８０％）ものであることが示されたが、これは、［³Ｈ］ジヒドロフィナステライドが未知試料中では唯一の有意な成分であったことを示唆している。該付加物の吸収及び蛍光スペクトルをＮＡＤＰＨと比較した。該付加物は、¹⁴ Ｃ−含量に基づく最大吸収が２６０ｎｍ及び３２５ｎｍであり、吸光係数がそれぞれ３．１３×１０⁴及び５．８８×１０³Ｍ^-1ｃｍ^-1であり、最大蛍光放出は４４１ｎｍであった。０．１Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐＨ９中でスペクトルを得たが、蛍光は、個々の長波長の吸収最大のところで励起した。２６０ｎｍでの異常に高い吸光係数は、調製物中の残留不純物により生じたものと思われる。熱変性させた酵素−阻害剤複合体から遊離した推定［³Ｈ］フィナステライドを２８％の総回収率で精製した。質量分析法により分析すると、（Ｍ＋１）＝３７５の単一の顕著な分子イオンが示され、これは、ジヒドロフィナステライドと一致した。この分子イオンにも、標準ジヒドロフィナステライドの分子イオンにも同一の娘イオンフラグメンテイションパターンが認められ、帰属が確実になった。計算ＦＯＲＴＲＡＮ７７コンピュータープログラムの最小二乗Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムを用い、非線形回帰により、データを適切なモデル及び速度式に当てはめた。遅結合性阻害のデータを、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６１：２０１−３０１（１９８８）により検討された方法で分析した。動力学モデルは発明の詳細な説明に示されている。Ａが生成物濃度、ｖ₀ が初速度、ｖ_sが無限時間速度、ｋ_obsが２つの平衡状態間の酵素の一次反応速度定数である、積分一次反応速度式（式１）に時間経過を当てはめた。無限時間における速度は実質的にゼロであった。Ａ＝ｖ_sｔ＋(ｖ₀−ｖ_s)(１−ｅ^-kｏｂｓ^t)／ｋ_obs＋Ａｏ式1 固定時間アッセイを用い、フィナステライドがテストステロンと競合することは既に証明されているので、この態様は記載せず、単にテストステロン濃度（Ｓ）をＫ_mで一定に保った。式２に当てはめて計算した初速度ｖ₀の非線形回帰により、弱い可逆性酵素−阻害剤複合体の定常解離定数Ｋ_iを得た。その関係は、古典的競合阻害剤について予測されたものと同一である。ｖ₀＝ｋ_cat(Ｅ) (Ｓ)／(Ｋ_m(1＋(１／Ｋ_i))＋Ｓ) 式2 これもＫ_iの関数である式３への非線形回帰により、低親和性複合体から高親和性複合体への転換の速度定数ｋ₂を得た。該式は、代謝回転はしないがフィナステライドに最も類似した可逆的で機構に基づかない阻害剤にぴったり当てはまる。酵素−阻害剤複合体から検出可能な［³Ｈ］フィナステライドの交換が不在であることから、高親和性複合体の形成は不可逆的であると考えられるので、逆反応速度定数ｋ_-2はゼロとした。ｋ_obs＝ｋ_-2＋ｋ₂[(Ｉ／Ｋ_i)／(１＋(Ｓ／Ｋ_m)＋(Ｉ／Ｋ_i)] 式3 フィナステライドによる前立腺（２型）アイソザイムの阻害の場合、これらの適合（ｆｉｔ）が分母項のＩ／Ｋ_iに比較的影響を受けないということは、この複合体のＫ_iがアクセス可能な阻害剤濃度範囲より大きいことを示している。従って、二次速度定数（ｋ₂／Ｋ_i）のみが確実にわかる。これは、この複合体が動力学的に有意であり、Ｋ_i＝３６０ｎＭ（Ｔｉａｎら，前掲）を有していた皮膚（１型）アイソザイムには当てはまらない。非共有結合高親和性複合体は、フィナステライドと酵素との共有結合は含まないようである。このことは、結合体と遊離体とを定義付けるための、１０,０００Ｄａ膜上の限外濾過を用いる、いくつかの酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体の変性法により証明される。該方法のうち、沸騰水浴中で２分間熱変性させると放射性標識の＞９６％が遊離し、４５％エタノール水溶液に懸濁すると＞７７％が遊離し、７Ｍ塩酸グアニジンに溶解すると＞９９％が遊離した。ジヒドロフィナステライドの同定酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体から自発的に放出された放射性種を、逆相カラム上の同時クロマトグラフィーにより、暫定的に還元生成物、［³Ｈ］ −１，２−ジヒドロフィナステライドと同定した。参照標準としての[³Ｈ]フィナステライド（１当量）と熱変性させた［³Ｈ］フィナステライド−酵素複合体（２当量）の溶液とを同時注入すると、このラジオクロマトグラムが認められた。最初に示したように、基準の非標識化合物の保持時間と比較して、未知のピークを暫定的に１，２−ジヒドロフィナステライドと同定した。実施例６フィナステライドとの酵素−阻害剤複合体形成の速度定数フィナステライドの効力は、フィナステライドの最低実質濃度（２ｎＭ）においてさえ見られた無限時間でのほぼ完全な活性の抑制から明らかである。これは、全平衡定数（Ｋ_i ^*）が＜１００ｐＭであることを意味している。天然酵素の場合、遅結合性阻害の時間経過は、ｐＨ５．５、３７℃での伝統的なアッセイ条件下に測定した遊離酵素及び阻害剤からの高親和性複合体形成の二次速度定数、ｋ_on＝ｋ₂／Ｋ_i＝２．５３±０．０３×１０⁵Ｍ^-1 ｓ^-1に対応する。組換え酵素を用い、ｐＨ７．２、３７℃の標準アッセイ条件下に、実質的に同じ速度定数、ｋ_on＝３×１０⁵ｍ^-1ｓ^-1を得た。理論線（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌｉｎｅ）の初速度はフィナステライドの濃度とは無関係であり、これは、酵素が有意なモル分率でこの濃度範囲では初期複合体(ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｃｏｍｐｌｅｘ)として存在しないことを示している。同様に、時間経過を示す一次速度定数は、動力学的に有意な初期複合体の不在下に予測されたように、阻害剤濃度にほぼ線形に依存していた。該理論線は、初期複合体についてはＫ_i＝１００ｎＭに対応し、これは、アクセス可能な阻害剤濃度範囲を十分上回るものである。Ｋ_iがこの最小値であるとすれば、提示されたゆるい可逆的複合体から高親和性複合体への転換は速度定数ｋ₂＞＝０．０２５ｓ^-1で生起し、半減期は≦３０秒である。これらの結論及び動力学定数は、ｋ_on＝２．７×１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1であり、フィナステライドによる天然ヒト前立腺酵素の阻害の解離定数（Ｋ_i）がｐＨ７．０では１５０ｎＭより大きいとの結論を下した最近のＦａｌｌｅｒらの研究（１０）と一致する。実施例７酵素−フィナステライド複合体の解離速度定数及び分配比の測定阻害進行の時間経過は、稀釈、透析又はテストステロンとの競合により起こり得る酵素−阻害剤複合体の解離を酵素活性の回収とみなすのは馬鹿げたことであることを証明した。Ｋ_i ^*＜１００ｐＭとすると、結合の速度定数から、酵素−阻害剤複合体の解離（又は代謝回転）の半減期は３７℃で＞６時間であると予測される。これは、補酵素の不在下には３７℃で４．６６±０．４１時間であったこれらの粗膜調製物中の遊離酵素の半減期より長い。従って、活性酵素は、解離中には蓄積されないと考えられるし、実際にフィナステライドによる阻害は不可逆的なようである。酵素−阻害剤複合体の安定性は、予想される交換を推進する非標識フィナステライドの存在下に測定された、予備形成された酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体からの［³Ｈ］阻害剤の遊離速度から測定した。交換溶液は、９．３３ｎＭ予備形成膜結合酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体及び１００倍過剰の非標識フィナステライドを含み、解離はｐＨ７．２、３７℃でモニターした。一般法の章に記載したように、結合及び遊離放射性標識の濃度は、１０，０００Ｄａカットオフ膜を介した限外濾過により測定した。遊離［³Ｈ］阻害剤の出現の時間経過を３週間にわたって測定した。これらのデータは、酵素−阻害剤複合体の一次崩壊は、３１．２±０．４日の半減期に相当する、速度定数ｋ_off＝２．５７±０．０３×１０^-7ｓ^-1で生起することを示している。粗な膜結合状態の酵素であるとすれば、酵素と膜のゆっくりした分解は部分的に又は全体的に、観察された遊離速度に十分影響し得、酵素−阻害剤複合体の真の解離速度定数はこの値より小さい可能性さえある。分配比機構に基づく阻害剤の特性は、該阻害剤が、いったん酵素により活性化されると、遊離溶液への無害な解離と、酵素の致死的失活という２つの道に分配され得ることである。Ｗａｌｓｈ（１３）により示されたように、失活の速度定数に対する全消費の速度定数の比、即ち分配比は、そのような阻害剤の効率の重要な尺度となる。即ち、分配比が小さければ小さいほど、標的酵素の阻害に必要な薬剤分子が少なくなる。フィナステライドの分配比は、＜＝１．０７であると考えられる。これは、オフレイト（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）実験（上述）及び一般法の章に記載した酵素−阻害剤複合体の調製から証明される。この基準からすれば、フィナステライドは、機構に基づく格別に有効な阻害剤である。解離速度定数の測定中の１ヶ月間に蓄積された遊離［³Ｈ］阻害剤の場合、［³ Ｈ］Ｈ₂Ｏは全く認められず、［³Ｈ］−１，２−ジヒドロフィナステライドの回収率は、［³Ｈ］フィナステライド−酵素複合体から放出された遊離トリチウムの＞９５％にのぼった。非標識フィナステライドプールとの逆交換の可能性にも拘わらず、非転換［³Ｈ］フィナステライドが全く検出されなかったということは、高親和性酵素−阻害剤複合体の形成が実質的に不可逆的であることを示唆している。１，２−［³Ｈ］ジヒドロフィナステライドとして転換された阻害剤の帰属を質量分析法で確認した。精製については一般法の章に詳細に記載されている。膜に結合した酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体から阻害剤を遊離させるには熱変性を用い、遠心（回収率９０％）、限外濾過(回収率８４％)及び逆相高速液体クロマトグラフィー(回収率３７％)により放射性成分を精製した。精製された放射性成分から、ジヒドロフィナステライドと合致する３７５Ｄａの主要分子イオンを得た。その娘イオンスペクトルを標準ジヒドロフィナステライドのものと比較して、帰属についての明白な証拠を得た。共有結合中間体結局、ジヒドロフィナステライドは、酵素−阻害剤複合体の変性により遊離する中間生成物ではないことが明らかになった。いくつかの証拠から、はるかに極性の［³Ｈ］標識成分が遊離することが示された。なかでも、逆相カラム上での［³Ｈ］ジヒドロフィナステライドの回収率は、熱変性させた酵素−阻害剤複合体から遊離した放射能の３５〜４５％に過ぎず、残りは（酸性条件下には）決して溶出されないという事実には当惑させられた。さらに、塩酸グアニジンを用いた変性により遊離した放射能の＜５％は、極性が［³Ｈ］ジヒドロフィナステライドと全く異なるクロロホルムに分配されることが知見された。この極性中間体は、いずれの変性法によっても遊離する放射能の殆ど又は全てを占め、クロマトグラフィーでは異常な挙動を示し、熱変性中に不可逆的に［³Ｈ］ジヒドロフィナステライドに転換されることは明らかである。ＮＡＤＰ−ジヒドロフィナステライド付加物の分解酵素動力学定数に用いたものと同じ条件下に、共有結合中間体からＮＡＤＰ⁺ 及びジヒドロフィナステライドへの非酵素的分解の速度定数を測定した。実施例５参照。ｐＨ７．２、３７℃での定数ｋ_x＝７．２１＋０．２７×１０^-7ｓ^-1及び１１．１±０．４日の半減期を計算した。［¹⁴Ｃ］ジヒドロフィナステライドの形成は無限時間では７５％完了したが、これは恐らくジヒドロピリジン環の酸化のような競合する副反応によるものと考えられる。対照的に、ＮＡＤ−ピルビン酸付加物は、非常に不安定なために正常な反応速度測定ができない。実施例８ＮＡＤＰ−ジヒドロフィナステライド付加物による５α−レダクターゼの阻害遊離ＮＡＤＰ−ジヒドロフィナステライド複合体と酵素との結合の速度定数を、フィナステライドによる遅結合性阻害について記載したものと類似の時間経過から測定した。１，２−二重結合を有するこの３−オキソ−４−アザステロイド阻害剤の場合、結合は第１基質（ＮＡＤＰＨ）と競合的であり、第２基質（テストステロン）の飽和濃度には無関係であった。このパターンは、酵素のＥ−ＮＡＤＰ⁺形態及び遊離Ｅ形態の両方との阻害剤の結合と一致し、集取生成物阻害剤について予想されたパターンと合致する。ｋ＝ｋ_obs ^*（１＋（ＮＡＤＰＨ）／Ｋ_m）であるから、ゼロのピリジン −クレオチド補酵素濃度に対して外挿すると、付加物と遊離酵素との結合の速度定数は、ｋ_-3＝〜１×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1となる。これは、フィナステライドが正方向で高親和性複合体を形成する速度定数よりわずかに速く、該酵素によるテストステロンの全代謝回転の二次速度定数ｋ_cat／Ｋ_mに近い。正方向では、コンピテント酵素からの（無傷又は恐らく遊離ジヒドロフィナステライドとしての）付加物の遊離速度定数は、酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体の［³Ｈ］ジヒドロフィナステライドへの崩壊に認められる速度定数（３ ×１０^-7ｓ^-1）以下でなければならない。従って、これらの速度定数の比から、酵素からのＮＡＤＰ−ジヒドロフィナステライド複合体の解離定数は、Ｋ_i ^x＜３×１０^-13Ｍとなる。単離された複合体のＮＡＤＰ⁺及び［¹⁴Ｃ］ジヒドロフィナステライドへの崩壊を時間の関数として測定し、ＮＡＤＰ−ジヒドロフィナステライドの非酵素的分解の速度定数を決定した。該複合体（２３５ｎＭ）を、０．１ＭＭＯＰＳ、０．１％ＢＳＡ及び１ｍＭＥＤＴＡ中、ｐＨ７．２、３７℃でインキュベートし、毎日、画分を取り出し、−７５℃で貯蔵した。該画分を後で、逆相クロマトグラフィーにより、６０％メタノールの中性等張系を用いるアッセイ（この場合、［¹⁴Ｃ］ジヒドロフィナステライドの保持時間は１４分である）について記載の方法で分析した。ｙ軸は、注入された各試料（２，４１０ｄｐｍ）中の総¹⁴Ｃ −標識に関して表した。１００℃で加熱して測定すると、反応は、無限時間で０．７５３完了した。非線形回帰により測定すると、該結果は一次崩壊に一致し、速度定数はｋ_x＝７．２１＋０．２７×１０^-7ｓ^-1、無限時間での転化率は０．７５４±０．０１５である。実施例９ＮＡＤＰ−ステロイド付加物形成の構造要件フィナステライドに対する３種の構造的変化の置き換えを、時間依存性阻害を無効にするフィナステライドの能力についてテストした。全化合物をｐＨ５．５、３７℃での該化合物の見かけＩＣ₅₀値でテストした。遅結合性阻害を示すものは、上記フィナステライドについて記載のように測定したｋ_on値により同定する。時間依存性阻害が検出されなかったものは見かけＫ_i値により同定する。該データは、１，２−不飽和及び遊離−４−ＮＨ−部分が遅結合性で且つ（推論により）類似のＮＡＤＰ−ステロイド複合体の形成を介した高親和性の阻害に不可欠であることを示している。これらの結果は、３−オキソ−４−アザステロイドによる時間依存性阻害には、Ａ環の不飽和が必要ではあるが十分ではないことを証明している。この阻害機構は、Ａ環の不飽和とＮＨ−アザステロイドの両方を必要とする。実施例１０ヒト皮膚アイソザイムの阻害組換えヒト皮膚（１型）アイソザイムを用いた平行実験により、フィナステライド及び１，２−二重結合を有する他の３−オキソ−４−アザステロイドは、該酵素に対して同じ阻害機構を有するが、特にフィナステライドは、はるかに小さい二次速度定数、ｋ_on＝〜３×１０³Ｍ^-1ｓ^-1で結合することが示される。この速度定数は、前立腺（２型）アイソザイムに対しては〜１％であり、そのために前立腺形態に対してはフィナステライドが選択される。付加物の形成は、それより効率が低く、〜２の分配比で生起する。酵素−［³Ｈ］フィナステライド複合体を変性させると、同じ共有結合ＮＡＤＰＨ−［³Ｈ］ジヒドロフィナステライド付加物が遊離した。［³Ｈ］阻害剤（組成は測定せず）がこの複合体の膜結合調製物から自発的に遊離する速度定数は、３７℃でｋ_off＝〜６×１０^-7ｓ^-1であり、これは、酵素−阻害剤複合体の２週間の半減期に対応する。これらの速度定数の比から≦２００ｐＭという定常状態のＫ_i ^*が予測される。実施例１１１型及び２型ヒト酵素の阻害活性の比較実施例９の手順に従い、以下の化合物をそれぞれヒト１型及び２型酵素でテストした。結果を以下に示す。表２及び表３に示されているデータによれば、該化合物は以下の選択性を有している：本明細書は本発明の原理を教示し、実施例は例示のために提供されているが、本発明の実施には、本明細書に記載されている手順及びプロトコルについて、以下の請求の範囲及びその均等物の範囲内のその時々の変更、適合、改変、削除又は追加の全てが包含されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハリス，ジヨージアナ・エスアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．５α−レダクターゼ酵素により１，２−二重結合を有する３−オキソ−４ −アザステロイドを活性化することにより１，２−二重結合を有する３−オキソ −４−アザステロイド及び補酵素ＮＡＤＰＨから形成された共有結合付加物である化合物であって、但し、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドが：ではない前記化合物。２．１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドが：（ここで、ＲはＨ又は低級アルキルであり、Ａｒは任意に置換されたアリール又はヘテロアリールである）、又は（ここで、Ｒ₁及びＲ₂は独立にＨ及び低級アルキルから選択される）ではない、請求項１に記載の化合物。３．構造式（Ｉ）：（ここで、該化合物のステロイド部分は１７、１６、１５及び７位の１つ以上の位置で任意に置換される）を有する、請求項１に記載の化合物。４．構造式（Ｉ）：（ここで、該化合物のステロイド部分は、１７、１６、１５及び７位の１つ以上の位置で任意に置換される）を有する、実質的に純粋な形態の化合物。５．以下の構造式：を有する、請求項４に記載の化合物。６．５α−レダクターゼ酵素により１，２−二重結合を有する３−オキソ−４ −アザステロイドを活性化することにより１，２−二重結合を有する３−オキソ −４−アザステロイド及び補酵素ＮＡＤＰＨから形成された共有結合付加物である化合物を含む医薬組成物。７．共有結合付加物が、構造式（Ｉ）：を有する、請求項６に記載の医薬組成物。８．共有結合付加物が、以下の構造式：を有する、請求項６に記載の医薬組成物。９．ヒト５α−レダクターゼ酵素を共有結合により修飾せずに該５α−レダクターゼ酵素を不可逆的に阻害することによりヒトのアンドロゲン過剰症を治療するのに有用な医薬品を製造するための、１，２−二重結合を有する３−オキソ− ４−アザステロイドの使用であって、但し、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドが：ではない前記使用。１０．ヒト５α−レダクターゼ酵素を共有結合により修飾せずに該５α−レダクターゼ酵素を不可逆的に阻害することによりヒトのアンドロゲン過剰症を治療するのに有用な医薬品を製造するための、１，２−二重結合を有する３−オキソ −４−アザステロイドの使用であって、但し、１，２−二重結合を有する３−オキソ−４−アザステロイドが：（ここで、ＲはＨ又は低級アルキルであり、Ａｒは任意に置換されたアリール又はヘテロアリールである）、又は（ここで、Ｒ₁及びＲ₂は独立にＨ及び低級アルキルから選択される）ではない前記使用。