JPH10511987A - 汎用スペーサー／エネルギー遷移染料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 活性ヒドロキシル基を含まない糖ホスフェート・モノマー単位、特にリボシル・ホスフェート・モノマー単位を含むスペーサーにより共に結合された、エネルギー・アブソーバー／ドナー成分とエネルギー・アクセプター／フルオレッサー成分を使用する蛍光標識を提供する。特に、エネルギー遷移成分は、上記スペーサー鎖の５′位で置換され、一方、他のエネルギー遷移成分は、上記標識の３′末端リボシル基の１′位で置換され、いずれかの組成をもつ核酸配列への連結のためのETカセットを形成する。ET成分と、共通エネルギー・アブソーバー／ドナー及び異なる蛍光団との組合せ物を使用することにより、いずれかの標的分子にタグ付けられることができ、そして単一波長において励起され、かつ、より大きなStokesシフトをもって異なる波長において蛍光を発することができる標識ファミリーを提供することができる。本化合物は、配列決定において特に利用される。

Description

【発明の詳細な説明】 汎用スペーサー／エネルギー遷移染料 技術分野 本発明の技術分野は、蛍光標識である。 背景 混合成分を同定し、かつ、定量することができることについての要求が増して いる。混合物が複雑になればなる程、多数の存在する成分を同時に検出すること ができることの重要性が増す。この状況の例として、DNA 配列決定があり、ここ では、多数の別個の波長における蛍光シグナル発光を提供しながら、単一波長に おけるレーザー源を用いて１〜４の蛍光タグ付成分を効率的に励起させることが 望ましい。この状況において、異なる標識は、それらが付着されるところの配列 の電気泳動易動性に悪影響を及ぼすべきではない。 最近、自動DNA 配列決定のために使用される４つの方法がある：（１）DNA 断 片を１の蛍光団(fluorophore)で標識し、そして次にそれら断片を隣接配列決定 レーン内で走らせる（Ansorge et al.，Nacleic Acids Res．15 : 4593-4602(19 87)）；（２）DNA 断片を４つの異なる蛍光団で標識し、そしてそれらの断片の すべてを電気泳動により分離し、そして単一のレーン内で検出する（Smith et a l.，Nature 321 : 674-679(1986)）;（３）終結反応におけるジデオキシヌクレ オチドの各々を異なる蛍光団で標識し、そして４セットの断片を同一のレーン内 で走らせる(Prober et al.，Science 238 : 336-341(1986)); 又は（４）DNA 断 片のセットを２つの異なる蛍光団で及びその染料比でコードされたDNA 配列で標 識する(Hu ang et al.，Anal．Chem．64 : 2149-2154(1992))。 これらの技術のすべてが、重大な欠点をもつ。方法１は、易動性におけるレー ン間の変動の潜在的問題並びに低処理量の問題をもつ。方法２，３と４は、それ らの染料が、１のレーザー源によりよく励起されること、そしてそれらが明確異 なる発光スペクトルをもつことを要求する。実際、単一のレーザーで効率的に励 起されることができ、そしてよく分離された蛍光シグナルを発光する２以上の染 色を見つけることはひじょうに難しい。明確に赤にシフトした発光スペクトルを もつ染料を選んだとき、それらの最大吸収も、赤に移動するであろうし、そして 染色のすべてが、もはや同一のレーザー源により効率的に励起されることはでき ない。また、より相違する染料が選ばれるとき、それらが標識された分子の同の 易動性を引き起こすように全ての染料を選ぶことがより困難になる。 それ故、多数の成分が同一システム及び単一ラン内で測定されることができる ように、サンプルの多重送信（multiplexing）を許容する改良された方法を提供 することに実質的な興味がある。各標識が、共通波長において強い吸収をもつこ と、蛍光について高い量子収率(quantum yield)をもつこと、その励起の大きなS tokesシフトをもつこと、各発光が明確に区別されること、そして標識が同一の 移動シフトを導くことも望ましい。単一染料で上記分子を単に標識付けすること により上記相反する目標を達成することは難しい。 関連文献 Ju et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92 : 4347-4351（1995）及びJu et al.，Anal．Biochem.，in Press(1995)は、DNA 配列決定のための蛍光エネルギ ー遷移(energy-transfer(ET))プライマーについて記載している。PCR 産物標識 付け及び検出のためのETプ ライマーの使用について記載するWang et al.，Anal．Chem．67 : 1197-1203(19 95)も重要である。 本発明の要約 蛍光標識化合物(Fluorescent label compositions)であって、エネルギー・ア ブソーバー／ドナー成分と、プリン塩基とピリミジン塩基を含まないリン酸化糖 を含むスペーサーに結合されたエネルギー・アクセプター／フルオレッサー成分 を含んで成るものが提供され、ETカセットが形成される。同一のアブソーバー／ ドナー及び異なるエネルギー・アクセプター／フルオレッサー成分をもつ、多数 の蛍光染料化合物を提供することにより、いずれかの配列により標識分子を標識 することができ、そして同一波長において励起されることができる蛍光染料化合 物（ETカセット）のファミリーは、異なる核酸と会合したとき、広く離れた波長 において発光し、そして電気泳動における易動性に対し同一の効果を提供する。 また、本化合物は、慣用のポリヌクレオチド合成化学を使用して容易に合成され ることができる。 図面の簡単な説明 図１は、４つのエネルギー遷位（ET）プライマーの蛍光発光強度の比較を示す 。 図２は、ETプライマーFS₆F，FS₆J，FS₆T，FS₆R及びSequenase 2.0 を使用した M13mp18 DNA のDNA 配列決定プロフィールの４色分析データの一部(ヌクレオチ ド10〜230)を示す。プライマー濃度：0.4pモル；DNA 鋳型：1.6 μｇ（各塩基伸 長について0.4 μｇ）。CE配列決定プロトコールは、記載されたものに似たもの であった(Juet al.，Anal．Biochem.，in Press(1995))。 特定の態様の説明 新規蛍光化合物、その化合物を含むキット、及び使用方法を提供する。本化合 物は、糖、例えば、リン酸リボシル・リンクであってその１′−位のヒドロキシ ルが水素で置換されているか又はエーテル化されているものを含むスペーサーに より互いに連結された、エネルギー・アブソーバー／ドナー成分とエネルギー・ アクセプター／フルオレッサー成分を含む。この蛍光化合物は、特に核酸との会 合において、標識として有用である。共通のエネルギー・アブソーバー／ドナー 成分と共通のスペーサーを共有するが、そのエネルギー・アクセプター／フルオ レッサー成分に関しては変動する多数の成分を使用することにより、同一波長に おいて励起されることができ、かつ、広く離れた発光波長を提供することができ る蛍光標識のファミリーを提供することができる。これらの化合物ファミリーは 、特に核酸配列決定により例示される電気泳動により分離される予定の核酸を標 識付けするために特に利用される。 本標識は、少なくとも３つのリン酸糖(sugar-phosphate)単位をもつスペーサ ーに結合されたエネルギー・アブソーバー／ドナー成分並びに少なくとも３つの リン酸糖単位によりそのドナー成分から分離されたスペーサーに結合されたエネ ルギー・アクセプター／フルオレッサー成分をもつことを特徴とするであろう。 上記スペーサーは、上記ドナーとアクセプターが付着されて、いずれかの標的分 子にタグを付けるために使用されることができるETカセットを形成する。標識の １端は、特にヌクレオシド又はヌクレオチドのホスフェート又はヒドロキシルと 反応するための官能基、通常、反応に利用されることができる唯一の官能基をも つであろう。一般に、リン酸糖分子の数は、15以下、通常12以下、好ましくは約 ９以下、そして少なくとも３、好ましくは少なくとも約４、より普通には約５〜 ８の範囲内にあるであろう。５〜６炭素原子をもつ様々な糖が使用されることが できるけれども、便利には、使用される糖はリボースである。この糖の２つのヒ ドロキシル基は、そのリン酸エステル結合に関係するであろうし、一方、１′− 位のヒドロキシル基を除く、残りのヒドロキシル基は、化学的に不活性であるよ うに、又は水素で置換されるように、１〜３炭素原子のアルキルにより、置換さ れ、特にエーテル化されるであろう。この１′−位は、エネルギー遷位成分に結 合するための部位として役立つことができ、又は上記のように非反応性であるよ うに修飾されるであろう。上記スペーサー内で使用される糖として特に重要なの は、その３′と５′位がその鎖におけるリン酸エステル部位として働くであろう １′，２′−ジデオキシ・リボースであろう。所望により、その末端５′位は、 エネルギー遷位成分の中の１に結合するための部位として使用されることができ る。 エネルギー遷位（“ET”）成分は、効率的なエネルギー遷位を許容するスペー サーのいずれかの部位に存在することができる。それ故、このエネルギー遷位成 分は、一般に、約３〜９、より普通には約４〜８のリン酸ホスフェート部分程離 れて配置されるであろう。この特定の配置は、同様の配置が、組合せにおいて使 用されることが予定されている各化合物について使用される限り、本発明にとっ て臨界的ではない。便利には、５′末端ヒドロキシル基は、エネルギー遷位成分 の中の１、特にドナー・エネルギー遷位成分のための部位であることができる。 また、他の成分も、便利には、１′−位において、直接的にか又は、約20以下の 、より普通には約12以下の（環介在基が存在する場合には、その環の周りにより 少ない数の原子がカウントされる）連結基を通じて、置換されるであろう。 上記連結基は、広く変動することができ、そして本発明には臨界 的ではない。これら連結基は、脂肪族、非環式、芳香族又は複素環式、又はそれ らの組合せであることができる。上記連結基内に存在することができる官能基又 は複素原子は、酸素、硫黄その他を含み、ここで存在することができるその複素 原子官能基は、オキシ、オキソ、チオ、チオノ、アミノ、アミドその他である。 エネルギー遷移及び電気泳動を妨害しないさまざまな連結基のいずれも使用され ることができ、これらは、置換が環員、例えば炭素、又は側鎖上、例えばチミジ ン内のメチルであるであろう、プリン又はピリミジン、特にウリジン、チミジン 、シトシンを含むことができる。ET成分は、１〜６、より普通には１〜３の原子 、特に炭素原子の連結基を通じて又は直接に上記塩基に結合されることができる 。この連結基は、飽和又は、通常約１以下の脂肪不飽和の部位をもって不飽和で あることができる。 その１′−位へ連結されたET成分については、そのET成分を連結するための部 位としてヌクレオチドの塩基、その糖の１′−ヒドロキシルを有利に使用するこ とができ、又はその１′−位に官能基、例えば、アミノ、カルボキシその他を導 入することができる。その１′−位の官能基は、特に２〜８、通常２〜６炭素原 子の置換アルキレン基を用いて延長されることができ、ここで、その最終的な官 能性は、そのET成分上に存在する利用可能な官能性に依存するであろう。通常、 ET成分に連結するための官能性は、カルボキシル又はアミノであろう。 含まれることができる連結基は、アミノ（例えば、還元的アミノ化による）、 アミド、エーテル、オキシ又はチオ、エステルその他を含む。ET成分を含む蛍光 標識は、いずれかの慣用の連結基、通常リン酸エステル結合によりその核酸分子 に結合されることができる。本蛍光標識分子は、通常、その核酸分子の５′末端 にあるであろ うが、特定の状況においては、所望により異なる部位にあることができる。配列 決定における使用のために、本化合物は、通常、その配列の５′末端にあるであ ろう。 着目の化合物は、一般に、以下の式： 方式中： Ｄは、ドナー成分であり； Ａは、アクセプター成分であり； Ｓは、スペーサー・モノマーであり； Ｓ′は、修飾されたスペーサー・モノマーであり、ここで、その修飾は、Ａへ の連結についてその１′−位にあり； Ｘは、標識付けされるべき標的分子であり、これはポリヌクレオチド、ポリペ プチドその他であることができ、そしてＸは、ヒドロキシル、保護されたヒドロ キシル、又はモノ−又は一般に１〜30、より普通には１〜20ヌクレオチドをもつ ポリヌクレオチド、特にデオキシリボヌクレオチドとの反応のための活性化され たリン酸基を含み；そして ｎは、２〜14、より普通には４〜７の範囲にある。 をもつであろう。 上記エネルギー・ドナーは、一般に、約300 〜800 nmの範囲内で、より普通に は、約450 〜700 nmの範囲内で吸収する成分であり、そしてドナーの吸収波長よ りも、15nm、より普通には20nm以上高い波長の光を一般に吸収するフルオレッサ ーにエネルギーを遷移させることができる。これらのフルオレッサーは、一般に 、約400 〜90 nmの範囲内で発光するであろう。多種多様なエネルギー・アブソーバー、例えば 、フルオレセイン、BODLPY，DAPI，Indol-1、クマリン、ダンシル、シアニン染 料その他を使用することができる。エネルギー・アクセプター／フルオレッサー は、約450 nm以上において蛍光を発する先に示した化合物のいくつか、並びにロ ーダミン、フラー２、及び別種のシアニン染料の如き化合物を含むことができる 。一般に、上記ET成分は、電気泳動の条件下、非インターカレーティングで、安 定であるであろうし、そして高い消光係数及び高い蛍光効率をもつ。 上記エネルギー・ドナーは、所望の消光波長、望ましくは、約10⁴を超える、 好ましくは約10⁵cm^-1M^-1を超える強いモル吸光係数をもつであろう。上記ドナー の最大励起及び上記アクセプターの最大発光は、少なくとも約15nm以上程離れて いるであろう。上記ドナーの発光スペクトルも上記アクセプター発色団の吸収ス ペクトルの間の、スペクトル重複総体(spectral overlap integral)並びに上記 発色団の間の距離は、ドナーからアクセプターへのエネルギー遷移の効率が典型 的には約20〜100 ％の範囲にあるであろうようなものであろう。一般に、上記ド ナー・アクセプター染料は、約２kD未満、一般に、約1.5kD 未満の分子量をもつ であろう。 一般に、１対のET成分が使用されるであるけれども、３つまでの異なる発色団 がセットで使用されるであろう状況が存在することができ、通常、２を超えない 異なる発色団により相違することができる。すなわち、通常、上記エネルギー・ ドナーは、同一及び最終フルオレッサーであり、そして１の他の中間体発色団は 、相違するであろう。より多くのET成分を使用することにより、可視波長範囲内 で励起させ、そして赤外波長範囲、通常、約1,000 nm未満、より普通には約900 nm未満での発光をもつことができるように、そのStok esシフトをかなり延長させることができる。この赤外波長範囲内の光を検出する ことは、多くの利点をもつ、なぜなら、その励起光から生じるRaman 及びRaylei gh光からの干渉を受けないであろうし、そして生物学的サンプルからのバックグ ラウンド発光シグナルは、上記赤内でより低いからである。易動定数を維持する ために、各標識に対し２〜３の同一ET成分をもって、各標識に対し同数のET成分 を使用することができる。 本標識がプライマーとして使用される場合、それらは、約８〜30の、より普通 には約８〜20ヌクレオチドのヌクレオチド配列をもつことができ、ここで、この 配列は、上記プライミング部位又は、様々な商業的に入手可能なベクター内のプ ライミング部位に相補的である。これらのベクターは、一本鎖糸状バクテリオフ ァージ・ベクター、バクテリオファージ・ラムダ・ベクター、シャロン（charon ）ベクター、pUC ベクター、pGEMベクターその他を含むことができる。従って、 本標識は、そのベクターの共通配列からそのクローン化された配列内まで延長さ れるであろう。例えば、汎用プライマーが調製されることができ、このプライマ ーは、そのプライマーへの上記標識の結合により修飾されている汎用プライマー の中のいずれか１であることができる。従って、様々な商業的プライマー、例え ば、pUC/M13, λgt10，λgt11その他からのプライマーである。Sambrook et al .，Molecalar cloning : A Laboratory Manual，2nd ed.，CSHL，1989，Section 13 を参照のこと。 本発明は、核酸鎖と共に特に利用され、ここで、これらの核酸鎖は、配列決定 、ポリメラーゼ連鎖反応、特にサイジング、又はプライマーが核酸伸長のために 使用され、そして特定の標識に関して混合物の各種成分の間を識別しようとする ような他のシステム内での、プライマーとして利用される。例えば、配列決定に おいては、汎 用プライマーが使用されることができ、ここでは、ET成分の異なる対が、その配 列決定反応の間その伸長のために使用される異なるジデオキシヌクレオチドの各 々について使用される。DNA 配列は、決定されるべき配列に結合されたプライマ ー配列をもつ適切なベクター内でクローン化される。異なる２′，３′−ddNTPs が、その鎖伸長において存在する特定のddNTP に依存して、異なる部位において 終結が生じるように、使用される。本プライマーを使用することにより、各ddNT P は、特定の標識と会合されるであろう。クレノウ断片による伸長後、得られた 断片を、次に、電気泳動による単一レーン内で、又は電気泳動による単一キャピ ラリー内で分離されることができ、ここで、この標識の蛍光によりその末端ヌク レオチドを検出することができる。 本化合物は、ヌクレオチドへの連結のために活性なホスフェートをもつことが できる。各活性ホスフェートは、ホスホアミジットを含み、ここで、その酸素は 、１〜３炭素原子をもつアルキル基、特に２〜３炭素原子をもつシクロアルキル 、等により置換される。このアミノ基は、一般に、ジアルキル化されるであろう し、ここで、そのアルキル基は、１〜４の、より普通には、２〜３炭素原子であ ろう。あるいは、ホスフィット・エステルが使用されることができ、ここで、利 用可能な酸素原子は、１〜３炭素原子をもつアリール基により置換されるであろ う。 本化合物は、慣用の技術に従って容易に合成されることができ、ここで、この 合成は、ヌクレオチドのための慣用の合成手順に従う。従って、DNA が合成され るのと同じやり方で１′−Ｙ３′−活性化、５′−保護２′−デオキシリボース を容易に合成することができ、ここでＹは、水素、官能基、又は直接に又は連結 基を介して結合されたET成分である。 通常少なくとも２つの標識の組合せをもつキットが提供される。各標識は、通 常同一の骨格をもつ、ドナー・アクセプター対をもつであろうし、ここでそれら 標識は、その骨格に沿って分離され、そして使用される分離方法において妥当な 易動性を与えるであろう。一緒に使用される群内の標識のそれぞれが、ほぼ同一 の波長において吸収し、そして異なる波長において発光するであろう。その群内 の標識のそれぞれは、上記分離方法における易動性に対してほぼ同一の効果をも つであろう。 これらのキットは、対合している約６までの、通常約４までの異なる標識をも つであろうが、２〜６の異なる標識をもつ、マッチング標識の２以上のセットを もつことができる。 以下の実施例を、限定のためではなく説明のために提供する。 実施例 汎用スペーサーをもつ、エネルギー遷移蛍光染料タグ付けオリゴヌクレオチド 標識のデザイン及び合成 以下の配列： をもつ18−ヌクレオチドを含むＭ13（−21）汎用プライマーであって、DNA 合成 装置上で以下の５′−ジメトキシトリチル−１′，２′−ジデオキシリボース− ３′−〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）〕−ホスホルアミ ジット(dSpacer CE Phosphoramidite，Glen Research)（構造式１）： を使用して導入された、６つの１′，２′−デオキシリボース・ホスフェート（ Ｓ）により分離されたドナー−アクセプター蛍光団対をもつものを、合成した。 上記18マーは、以下の５′−ジメトキシトリチル−５−〔Ｎ−（トリフルオロ アセチルアミノヘキシル）−３−アクリルイミド〕−２′−デオキシウリジン， ３′−〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）〕−ホスホルアミ ジット(Amino-Modifier c6 dT，Glen Research)（構造式２）： であって、そのＣ−５位に保護された第１アミン・リンカー・アームをもつもの を使用することにより導入された修飾塩基Ｔ^*を含む。このＴ^*は、上記スペーサ ー前のヌクレオチド配列の５′末端に付着された。ドナー染料は、上記オリゴマ ーの５′側上の上記スペ ーサーの末端に付着され、そしてアクセプター染料は、Ｔ^*上の第１アミン基に 付着された。これらのプライマーを、Ｄ−Ｓ₆−Ａ（ETカセット）と表す。ここ で、Ｄはドナーであり、Ａはアクセプターであり、そしてＳ₆はＤとＡの間のス ペーシング糖の数を示す。調製された全プライマーにおいて、Ｄ＝FAM(F)、フル オレセイン誘導体；Ａ＝FAM(F)，JOE(J)，TAMRA(T)又はROX(R)であり、最後の２ つは、ローダミン誘導体である。我々はまた、カルボキシローダミン−６Ｇは、 JOE の良好な代替物である(FAM：６−カルボキシフルオレセイン；JOE；２′， ７′−ジメトキシ−４′，５′−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、TA MRA：Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン；ROX：６ −カルボキシ−Ｘ−ローダミン）ことを発見した。代表例として、FS₆Tの構造式 を以下に示す（構造式３）： 本明細書中に記載するエネルギー遷移アプローチの利点は、（１）単に、上記 オリゴヌクレオチド配列の５′末端にAmino modifier dT 又は他のホスホルアミ ジット、例えば、以下のAmine-VN Phosphoramidite（CLONTECH）（構造式４）： を使用してＴ^*を導入し、そして次に、dSpacer を使用して６つの１′，２′− ジデオキシリボース・ホスフェトを導入することにより、ETカップル染料で、い ずれかの配列を標識付けすることができること（ドナーと蛍光染料は、この骨格 に容易に付着されることかでき、ETカセットを形成する。）、 （２）より大きなStokesシフトとより強い蛍光シグナルが、488nmで励起され るときに発生することができること、そして（３）FS₆(F，J，T，R)プライマー から伸長するDNA 配列決定断片の４−色データ上の易動性シフトの調整が、配列 調査に全く必要とされないこと、である。 ETプライマーの吸収スペクトルと発光スペクトルを図１に示す。各ETプライマ ーは、496 nmにおけるFAM の特徴的な吸収並びにFS₆J内のJOE に因る525 nmにお ける、FS₆T内のTAMRA に因る555 nmにお ける、そしてFS₆R内のROX に因る585 nmにおける、強い吸収を示す。これらのET プライマーの蛍光発光スペクトルは、そのアクセプター発光により支配される。 FS₆Fの最大発光は525 nmにあるけれども、488 nm励起によるFS₆Jの発光は、555 nmにStokes−シフトされ、FS₆Tの発光は、580 nmにシフトされ、そしてFS₆Rは、 605 nmにシフトされる。FS₆Rの場合には、このStokesシフトは、100 nmを超える 。図１は、対応のETプライマーのモル濃度と同一のモル濃度において計測された 単一染料標識プライマーの発光スペクトルをも提示する。ETプライマー発光強度 の実質的な強化は、対応の単一染料−標識プライマーに比較して観察され、効率 的なエネルギー遷移が生じていることを示している。図１から得られた蛍光強度 の改良は：FS₆F＝1.7 ×FAM ; FS₆J＝３×JOE ; FS₆T＝10×TAMRA ; FS₆R＝12× ROX。 ET（FS₆F，FS₆J，FS₆T，FS₆R）プライマーによるDNA 配列決定 DNA 配列決定のための汎用スペーサーを使用したET染料−標識プライマーの首 尾よい適用を具現化した。上記プライマーは、いずれの異常をも伴わずにDNA ポ リメラーゼのための良好な基質であることが示された。図２は、FS₆Nプライマー ・セットを使用した４−色DNA 配列決定データの一部（10〜230 ヌクレオチド） を示す。この反応を各塩基伸長について、当量のプライマー（0.4pモル）と0.4 μｇの鋳型DNA を使用して行った。４−色CE配列決定プロフィールを、それら４ つのチャンネルの間のクロストーク(crosstalk)について補正するために、その 生データにマトリックス変換を単に適用した後に得た。この配列は、いずれの易 動性シフト調整を適用せずにコール(call)されることができる。より複雑なピー ク・コーリング・ソフトウェアを使用した上記データの分析は、より良好な塩基 コーリング及びより長い読みを導くはずである。 上記の汎用スペーサー（ETカセット）方法により、我々が、共通ドナー及び２ ，３，４以上の異なるアクセプターをもつ、染料−標識バイオポリマー又は他の 標的分子の広いファミリーを合成することができるということは、明らかである 。このアプローチにより、配列決定、PCR 及びハイブリダイゼーションのための 全てのオリゴヌクレオチド・プライマー及びプローブは、ETカップル染料でタグ 付けされることができる。このようなクラスのドナー−アクセプター標識分子は 、多色遺伝子分析において広く利用される。 本明細書中に述べた刊行物及び特許出願の全てを、あたかも個々の刊行物又は 特許出願が特別に、かつ、別個に引用により示されるような程度で、引用により 本明細書中に取り込む。 本発明をこれまで十分に記載してきたが、多くの変更又は修正が、添付の請求 の範囲又は本発明の本質から逸脱せずに本発明に対して行われることができるこ とは、当業者にとって自明であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グレイザー，アレキサンダー，エヌ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94720, バークレー，スタンリー ホール 229, デパートメント オブ モレキュラー ア ンド セル バイオロジー，ユニバーシテ ィ オブ カリフォルニア (72)発明者 ユ，ジングュエ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94720, バークレー，ヒルドブランド 329，デパ ートメント オブ ケミストリー，ユニバ ーシティ オブ カリフォルニア

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．エネルギー・ドナー成分とそのエネルギー・ドナー成分により遷移された エネルギーを吸収するアクセプター成分を含む化合物であって、上記成分が、糖 リン酸エステル・モノマー結合を含む骨格により連結され、その１−ヒドロキシ 基が、水素により置換され又はエーテル化されている、前記化合物。 ２．前記骨格が、３〜15の１，２−ジデオキシリボシル−３，５−ホスフェー ト・エステル・モノマー結合を含む、請求項１に記載の化合物。 ３．前記エネルギー・ドナー成分が、その５骨格末端で共有結合されており、 そして前記アクセプターが、連結基を通じてその１−位における１，２−ジデオ キシリボシル−３，５−ホスフェート・エステルの３−末端で、前記骨格に共有 結合されている、請求項２に記載の化合物。 ４．前記骨格の３−末端が、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、ホスホルアミ ジット、ホスフィット、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである、請求項３ に記載の化合物。 ５．３〜15の１，２−ジデオキシリボース−３，５−ホスフェートモノマー単 位をもち、そして１，２−ジデオキシリボース−３，５−ホスフェート・モノマ ー単位の３−末端の１−位において連結基を通じてフルオレセイン又はローダミ ンで置換されている、式５−フルオレセイン置換ポリ−１，２−ジデオキシリボ ース−３，５−ホスフェート化合物。 ６．前記骨格の３−末端が、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、ホスホルアミ ジット、ホスフィット、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである、請求項５ に記載の化合物。 ７．前記連結基は、カルボキシル又はウリジル基である、請求項５に記載の化 合物。 ８．電気泳動分離における蛍光標識の組合せ物を使用した異なる核酸配列の同 定方法において、上記蛍光標識が、異なる波長において蛍光を発し、そして各異 なる標識が異なる核酸配列に結合され、そして標識として請求項１〜７いずれか １項に記載した化合物を使用することを特徴とする前記方法。 ９．そのアクセプターにおいて相違し、かつ、同一のエネルギー・ドナーをも つ、請求項１〜７に記載の少なくとも２の化合物を含むキット。