JPH10512846A

JPH10512846A - 呼吸器系合胞体ウィルス（ｒｓｖ）感染の型または亜型−特異的診断のためのｒｓｖのｇタンパク質に由来する抗原ペプチド

Info

Publication number: JPH10512846A
Application number: JP8507962A
Authority: JP
Inventors: ペトルスマリアラングディヂク，ヨハネス
Original assignee: インスティテゥートヴォーディールホウデレイエンディーゲゾントヘイド（イーデー−デーエルオー）
Priority date: 1994-08-25
Filing date: 1995-08-22
Publication date: 1998-12-08
Also published as: EP0777685A1; CA2198279A1; DE69509103D1; NZ291243A; EP0777685B1; AU3231695A; WO1996006112A1; NO970829D0; ATE178906T1; US6077511A; NO970829L; DE69509103T2; AU710713B2

Abstract

(57)【要約】呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質の２つのムチン様領域の間に位置するアミノ酸配列に由来するペプチド部分からなる抗原性物質またはその前躯体。前記抗原性物質または前躯体は、呼吸器系合胞体ウイルスの異なった型または亜型間あるいはそれらに対する抗体間の区別化または同定を可能にする。好適な実施の形態では、ペプチド部分は、ウシ呼吸器系合胞体ウイルス、ヒト呼吸器系合胞体ウイルスＡ、ヒト呼吸器系合胞体ウイルスまたはヒツジ呼吸器系合胞体ウイルスから誘導される。ＲＳＶ感染の予防のために、ＲＳＶ型、亜型（に対する抗体）を検出または固定するためのアッセイおよび試験キットに、並びにＲＳＶ型または亜型に対する抗体を得るための方法に、前記の抗原性物質または前躯体を（ワクチンで）用いる。ＲＳＶ型または亜型を検出または同定するためのアッセイおよび試験キットにこのような抗体を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】呼吸器系合胞体ウィルス（ＲＳＶ）感染の型または亜型−特異的診断のためのＲＳＶのＧタンパク質に由来する抗原ペプチド発明の分野本発明は、呼吸器系合胞体ウィルス（ＲＳＶ）感染によって、またはそれに由来して起きる病気についてのペプチドを基にする診断およびワクチンの分野に関する。本発明は、ＲＳＶの付着タンパク質Ｇのムチン様領域の間の未だ固定されていない、個別にホールディングされる、球状タンパク質モジュールならびにその用途に関する。より詳しくは、本発明はたとえば診断アッセイのために用いることができるＲＳＶの付着タンパク質のタンパク質モジュールに対応する、好ましくはペプチドを基にする抗原性物質の設計に関する。この個別にホールディングされる球状タンパク質に対応するペプチドは、他のペプチドとともにワクチンに組込み、ウィルスに対する予防的な免疫応答を誘起することができる。発明の背景ＲＳＶ感染は、ヒト、家畜、羊、ヤギにおける呼吸器系疾患の主な原因である（Ｓｔｏｔｔ，Ｔａｙｌｏｒ，１９８５）。ウィルスは、パラミクソウィルス科の肺炎ウィルス属の内に分類される。ヒト呼吸器系合胞体ウィルス（ＨＲＳＶ）は、子供および幼児での細気管支炎のもっとも重要な原因体である。ＲＳＶ感染の結果、米国では毎年約１０万人の子供が病院に入院する。このウィルスに対するワクチンはなく、そのワクチンの開発は、世界保健機関の優先性リストの上でマラリア、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に次いで第３位に位置する。家畜では、呼吸器系の病気は、もっとも頻繁に記録されるものの一つである。最近の報告によれば、呼吸器系の病気は、飼育用地の家畜において約６０％の罹病率と約６０％の致死率にあたる。ウシ呼吸器系合胞体ウィルス（ＢＲＳＶ）感染は、家畜の呼吸器系病の主な原因であり、甚大な経済的損失をもたらしている。異なった抗原性亜種が、ＨＲＳＶおよびＢＲＳＶについて報告されているので（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９８７，Ｆｕｒｚｅら，１９９４）、１つの罹病群で主流の亜種を追跡して、正しい亜種の類での候補ワクチンを選択することが重要である。ウィルスは、２つの主要な表面糖タンパク質を有し、これは付着タンパク質Ｇおよび融合タンパク質Ｆである。Ｇタンパク質はＲＳＶに特異であり、ＨＲＳＶ亜種間で変化しやすい（５３％アミノ酸ホモロジ，Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９８７）、あるいはＨＲＳＶと有蹄類のＲＳＶの間で変化しやすい（３０％アミノ酸ホモロジ，Ｌｅｒｃｈら，１９９０）。しかしながら、亜種間の内では、ホモロジがもっと高く（数種のＨＲＳＶ−Ａ株の内では８０％以上であり、Ｃａｎｅら，１９９１）、数種のＨＲＳＶ−Ｂ株の内では９０％以上であり（Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒら，１９９１）、さらに４つのＢＲＳＶ株の内では９０％以上である（ＭａｌｌｉｐｅｄｄｉおよびＳａｍａｌ，１９９３ａ）。Ｇタンパク質は、他のパラミクソウィルスの他の付着タンパク質と配列ホモロジも構造ホモロジも共有しない（Ｓａｔａｋｅら，１９８５，Ｗｅｒｔｚら，１９８５）。他のパラミクソウィルスの付着タンパク質と対照的に、Ｇは短く、血球凝集またはノイラミニダーゼ活性を欠く。ＲＳＶ−ＧはＩＩ型膜タンパク質であり、そして重量基準で約６０％の炭水化物を含む。炭水化物部分の約２０％は、Ｎ−結合炭水化物であり、約８０％はＯ−結合炭水化物であり、タンパク質中の異常に多い数のヒドロキシアミノ酸に結合されている。ＲＳＶ検出のための数種の診断アッセイが知られている（Ｗｅｌｌｉｖｅｒによる総説，１９８８）。しかしながら、これらのアッセイは、ＨＲＳＶの亜種間を有効に区別しないし、異なったＲＳＶ型間でも区別しない全ウィルスまたは完全なタンパク質に基づいている。Ｆタンパク質は、すべてのＲＳＶ型の間で高度にコンサーブされている（相同性を維持している）ので、区別できるアッセイをＦタンパク質に基づいて設計するのは難しく、そのためより変化し得るＧタンパク質の少なくとも一部含ませるべきである。ＢＲＳＶ−ＧおよびＨＲＳＶ−Ｇ上の主免疫部位を決定する経験的方法によれば、ペプチドの主免疫部位がこのペプチドのＣ−末端半分の内に位置することが示された（残基１７４−１８８，Ｎｏｒｒｂｙら，１９８７）。１５残基ペプチド（残基１７４−１８８）を亜型特異的部位特異的血清学のために用いることがｏｒｒｂｙら，１９８７）。ペプチドは安価で、再現性をもって製造しやすいので、感染症の血清学的診断においてペプチドを抗原として用いることは興味を持たれてきた。しかしながら、日常の診断にペプチドを用いることは、今まで感受性の欠如のために制限されてきた。発明の要約本発明は、呼吸器系合胞体ウィルスのＧタンパク質に由来するアミノ酸配列から成り、該配列が約２８〜約３７アミノ酸残基の長さを有し、２つのムチン様領域の間に位置するＧタンパク質の領域から誘導されることを特徴とするペプチドを提供する。好ましくは、前記アミノ酸配列が、たとえばＧタンパク質のアミノ酸残基１５８位−１８９位または１５７位−１９３位（ウシ呼吸器系合胞体ウィルスのＧタンパク質の番号付けに従う）のような少なくともアミノ酸残基１５９位−１８６位から成り、そしてせいぜいそれらの間で４アミノ酸のみ異なっている。また好ましくは、前記呼吸器系合胞体ウィルス（ＲＳＶ）が、ウシ呼吸器系合胞体ウィルス（ＢＲＳＶ）、ヒト呼吸器系合胞体ウィルスＡ（ＨＲＳＶ−Ａ）、ヒト呼吸器系合胞体ウィルスＢ（ＨＲＳＶ−Ｂ）、そしてヒツジ呼吸器系合胞体ウィルス（ＯＲＳＶ）から成る群より選ばれる。前記アミノ酸配列は、好ましくは、から成る群より選ばれる配列を含み、さらに好ましくは、たとえば、から成る群より選ばれる配列のように、から成る群より選はれる配列を含む。ペプチドは、対応するＧタンパク質中で、その相当部分の三次構造を取り得ることが好ましい。本発明は、異なったＲＳＶ型または亜型の間での区別化または同定を可能にするか、あるいは異なったＲＳＶ型または亜型に対する抗体の区別化または同定を可能にし、前記に定義したペプチドから成ることを特徴とする抗原性物質またはその前駆体に関する。ここで定義された抗原性物質またはその前駆体は、ＲＳＶ感染症の診断またはＲＳＶ感染症の予防に用いることができる。本発明は、ＲＳＶ型または亜型の検出あるいは同定のため、またはＲＳＶ型または亜型に対する抗体のための診断キットを提供し、該診断キットは、ここで定義されたペプチド、抗原物質または前駆体と、検出のための適切な手段とから成る。診断キットは、好ましくは、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（たとえば、ブロッキングＥＬＩＳＡ）を提供する。本発明はまた、ここで定義されたペプチド、抗原物質または前駆体と体液の試料を接触させ、該ペプチド、抗原物質または前駆体と、ペプチド、抗原物質または前駆体に対して特異的な抗体とから成る複合体を形成し、続いて該複合体を検出することを特徴とするＲＳＶ（に対する抗体）の検出のための方法を提供する。さらに本発明は、ここで定義されたペプチド、抗原物質または前駆体と、哺乳類に投与するための適当なアジュバンドまたは賦形剤とから成ることを特徴とするＲＳＶ感染症の予防のための薬学的組成物を提供する。本発明は、呼吸器系合胞体ウィルスに対して免疫応答を誘起するのに充分な量の前記に定義された組成物を哺乳類に投与することを特徴とするＲＳＶ感染症の予防のための方法を提供する。さらに本発明は、ここで定義されたペプチドを模倣するペプチド類似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｕｍ）を提供する。本発明の別の側面は、哺乳類の受容体にここで定義された抗原性物質または前駆体を適当なアジュバンドとともに投与し、該哺乳類の受容体から抗体または抗体産生細胞を収穫することを特徴とするＲＳＶ型または亜型に対する抗体を誘起する方法である。前記の方法によって得られるＲＳＶの型または亜型に特異的な抗体は、本発明の一部である。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。本発明の別の側面に従えば、本発明は前記の抗体および検出のための適切な手段とから成るＲＳＶ（に対する抗体）の亜型または型の検出、またはそれらの間で区別化するための診断キットを提供する。発明の詳細な説明血清学で用いられてきたほとんどのペプチドは、連続したエピトープを表す。小さな線状ペプチドを用いて複雑な不連続なエピトープに対する抗体を検出することは不可能であり、タンパク質のアミノ酸配列に基づいて不連続なエピトープを予想することも難しい。加えて、大きな球状タンパク質の抗原表面を小さな線状ペプチドで正確に模倣させることはできない。本発明者らは、その抗原性を保持しながら安定な三次構造を取り得るＲＳＶウィルスのＧタンパク質中の個別のホールディング領域を予想することによってこの問題を解決した。この予想は、有用な抗原の正確な設計に重要である。ＲＳＶ−Ｇは、Ｏ−グリコシル化の受容体部位であるヒドロキシアミノ酸の異常に高含量を有する（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９８７）。本発明者らは、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）のようなヒドロキシアミノ酸がＲＳＶのＧタンパク質の２つの別々の領域中で、プロリン（Ｐ）と集塊していることを発見した。セリン、トレオニンおよびプロリン（ＳＴＰ）に富むこれらの領域は、多くグリコシル化され、そしておそらく、剛い伸長したコンホメーションを取る共通のモチーフである（Ｊｅｎｔｏｆｔによる一般的総説，１９９０）。このような領域は、ムチンの主要構成物であるので（粘膜ゲルを形成する大きい重合体分子）、領域はムチン様領域を呼ばれる。定義によれば、ムチン様領域内のアミノ酸配列は、セリンまたはトレオニン残基の２５−４０％から成る（Ｊｅｎｔｏｆｔ，１９９０）。本発明者らは、ＲＳＶ−Ｇ中の第１のムチン様領域が経膜（トランスメンブラン）領域から相同性がコンサーブされた二重Ｐｒｏ_155,156まで延び、そして第２のムチン様領域がおおよそコンサーブＰｒｏ₁₉₄からＣ−末端まで延びていることを見い出した。本発明者らは、ＲＳＶのＧタンパク質の外ドメインを２つの別個のムチン様領域間に存在する小さな疎水性の球状領域と定義した。この小さなＲＳＶ−Ｇの中央疎水性領域の提案された位置（図１，図２）、その比較的コンサーブされた性質そして、その中でほとんどグリコシル化される可能性のない部位によって、この短い領域を表すペプチドは、免疫アッセイのための抗原として用いる有望な候補となる。Ｎｏｒｒｂｙらによって開示された１５残基ペプチドに実質的に対応するペプチドを用いて実施された比較試験（この比較試験に使われたペプチドは１７４− １８９残基から成る１６残基のペプチドであった）によれば、ＨＲＳＶ−Ｇの中央疎水性領域に対応する３２残基のペプチドが、該中央疎水性領域の一部分のみを表す１６残基のペプチドよりもＥＬＩＳＡにおいて抗原としてよりよく反応することが示された。おそらく３２残基のペプチドが、より自然型の完全な構造を取り得るためであろう。Ｎｏｒｒｂｙらの１５残基ペプチドを用いる時に得られるような感受性の低い試験は、ＲＳＶの型または亜型間の区別化をしようとするときに非常に重要である感受性の高い血清免疫学的研究を行うのに適切でない。本発明は、異なったＲＳＶの亜型によって感染された個体間の区別化するための抗原性物質を提供する。この抗原性物質は、２つの別個のムチン様領域に位置するＲＳＶ−Ｇのアミノ酸配列に対応するペプチドである。本発明に従う抗原性物質は、ＲＳＶに対して免疫応答を誘起し得るか、ＲＳＶに対する抗体を含む血清によって認識され得るいかなるペプチド様またはペプチドに基づく物質であると解釈すべきである。このような抗原性物質の前駆体は、それら自身免疫原性ではなく、たとえば免疫応答を誘起し得るかまたは認識され得るためには担体に結合される必要がある対応するペプチド様またはペプチドに基づく物質を含むと意図される。本発明に従えば、ペプチドに基づくまたはペプチド様物質は、ペプチドの機能を備えるいかなるものも含むと意図される。これらの物質は、いくつかのアミノ酸残基が置換されたかまたは修飾されたペプチド自身であるということをこれは意味する。それらは、本発明のペプチドのアミノ酸配列を表面に有するように設計された、たとえば融合タンパク質であり得るということを意味する。定義に従えば、ペプチド類似体およびペプチドから誘導される抗イディオ型抗体をも含む。本発明の好適な実施形態では、特定のＲＳＶ型および亜型（ＨＲＳＶおよび亜型、ＢＲＳＶおよび亜型、ＯＲＳＶおよび亜型）に特異的な抗体を検出するための診断アッセイに用いることができるペプチドが提供される。さらに、これらのペプチドは、ＲＳＶワクチンに組込むことができる。Ｇタンパク質中の個別のホールディング領域に関する本発明は、すべてのＲＳＶ型に適応される。したがって、本発明はここに特定的に開示されたペプチドに限定されるのみならず、すべてのＲＳＶ型およびこれらのウィルスのすべての亜型における同族ペプチドおよびその誘導体にまで拡がる。本発明に従って用いられる好適なペプチドは、表１に記載されたペプチドまたはそれらの誘導体の少なくとも抗原性部分から成り、その鎖長は約２８残基から約３７残基である。本発明者らは、２つの異なった診断アッセイを開発することによってペプチドの診断分野における応用性を評価した。２つのアッセイとは、間接ＥＬＩＳＡおよびブロッキングＥＬＩＳＡである。これらの両試験法は、型および亜型特異的である。他の診断アッセイももちろん当業者なら容易に設計することができる。これらは、いかなる適切な形態でもっても提供し得る。アッセイは溶液中で、または固相で実施し得る。さらにたとえば酵素、固体粒子、金属ゾル、他のゾル、ラテックス粒子、色素、螢光物質、放射性物質のようないかなるラベルを用いても実施することができる。たとえば血液、血清、尿、乳等の哺乳類からの体液の中に抗体を検出するためにペプチドを用いることができる。通常、抗体は固相の上に存在する本発明のペプチドに結合されている。その後、ペプチドと抗体の複合体は、ラベルされた試薬で検出される。後者は、ヒトまたはウシ抗体に対して特異的なラベルされた抗体であり得る。本発明に従えば、ペプチドは、ＲＳＶ型および／または亜型に対して特異的な抗体を得るためにも用いることができる。ペプチドを哺乳類、通常齧歯類に免疫原性な形態で投与し、１回以上の投与の後、動物の血清を採取し、それから抗体を精製する。別法として、このような動物の脾臓を除去し、抗体産生細胞を得てもよい。これらを融合または形質転換によって、モノクローナル抗体産生セルライン（細胞系）に変化させることもできる。ＲＳＶに特異的で本発明のペプチドによって誘起された（モノクローナル）抗体に基づくアッセイも本発明の一部を構成する。本発明に従うペプチドは、ＲＳＶによる感染を予防するワクチンに使用することができるのはもちろんである。それらは、他の抗原とともにまた単独でＲＳＶに対する免疫応答を誘起するのにも使用できる。通常、ペプチドは受容体に投与される前に、抗原性の形態として適用されるために担体に結合されねばならない。ペプチドを充分に抗原性にする他の方法は、当業者に公知である。もっと非特異的に免疫応答を高めるために、ワクチンにアジュバントが通常、添加される。本発明は、ＲＳＶ−Ｇタンパク質の中央領域に対応するペプチドに基づくいく組かのＲＳＶ診断アッセイに関する。その領域は、ＢＲＳＶ、ＯＲＳＶ、ＨＲＳＶ−ＢおよびＨＲＳＶ−Ａについて表１に列挙されている。診断アッセイに用いられるペプチドの鎖長は、好ましくは約２８ないし約３０残基である（表１）。適当なペプチドの最小の長さは、Ｈｉｓ₁₅₉とＣｙｓ₁₈₆の間に介在するモジュールの長さによって支配される。適当なペプチドの最大の長さは、Ｐｒｏ₁₅₆とＰｒｏ₁₉₄の間に介在するモジュールの長さに支配される。その領域は、変化の多いタンパク質の中で比較的コンサーブされた領域に相当する。異なったＢＲＳＶ株の間で、表１に示す下線を施した２２−ｍｅｒペプチドに対応する配列および残基１５９位−１８６位から成る２８残基のモジュールの配列の両方に９０％以上のアミノ酸ホモロジが見られる。したがって、本発明は表１に記載されたすべてのペプチド、ならびに３２−ｍｅｒまたは２８残基モジュールの内で、せいぜい４アミノ酸異なっているすべての同族体ペプチドに関する。さらに、未だ配列決定されていないＢＲＳＶまたはＯＲＳＶの亜型に対応するペプチドならびにせいぜい４アミノ酸異なっている同族体もまた本発明の一部を構成する。ペプチドに基づく診断アッセイは、血液、血清、乳または他の体液中の抗体レベルを決定するのに用いることができる。本発明に従う物質は、ワクチンに組込むために使用することもできる。実施例ＲＳＶＧタンパク質の構造解析ＲＳＶのＧタンパク質（ＲＳＶ−Ｇ）の一次構造の詳細な解析によって、タンパク質をより短いモジュールに切断することが可能となった。図１にこの一次構造の解析に基づく模式表示を示す。この解析に従えば、タンパク質は、細胞質領域、経膜領域、延びたムチン様領域（３７％セリンおよびトレオニン）、中央疎水性球状領域および第２の延びたムチン様領域内の短い正に帯電した領域（３８％セリン、トレオニン）から成る。中央疎水性球状領域は、２つのムチン様基部の間に位置し、Ｎ−末端のコンサーブされた２重Ｐｒｏ_155,156およびＣ−末端のコンサーブされたＰｒｏ₁₉₄（図１，図２）によって近似的に制限されていることをモジュールの建築様式は立証している。この模式的なモデルは、タンパク質結合において中央疎水性領域がただ一つのさらされたタンパク質領域であるので、非常に重要な機能的役割を果たすことを示唆している。ＲＳＶ−Ｇの外ドメインの残りは主にムチン様である。ムチン様領域の厚い炭水化物膜が、細胞間酵素系によって外皮タンパク質に加えられ、その理由からムチン様領域はおそらくあまり抗原性ではないだろう。２つの免疫的に不活性なムチン様領域の間にある小さな疎水性タンパク質モジュールの位置、この短い配列の自己ホールディングの可能性、比較的コンサーブされた性質およびほとんどグリコシル化の可能性のない部位によって、この短い領域を表すペプチドが免疫アッセイのための抗原として用いる有望な候補となる。ペプチド合成２つのムチン様領域の間に位置するＲＳＶ−Ｇの中央疎水性領域から、ペプチドが選択された。すべてのクローン化されたＲＳＶ型および亜型の中央疎水性領域（残基１５８−１８９）が合成された。ＢＲＳＶ−Ｇ（Ｌｅｒｃｈら，１９９０；ＷＯ９２／０１４７１）；ＯＲＳＶ−Ｇ（Ｍａｌｌｉｐｅｄｄｉ，Ｓａｍａｌ，１９９３ｂ）；ＨＲＳＶ−ＧＡ型（Ｗｅｒｔｚら，１９８５）；およびＨＲＳＶ−ＧＢ型（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９８７）を参照。加えて、ＨＲＳＶ −ＧＡ型の免疫的に重要なペプチドに対応するペプチド（残基１７４−１８９）が合成された。ペプチドの合成は、アプライドバイオシスラムズ４３０Ａ合成機でＦａｓｔｍｏｃ化学を用いて標準的な手法に従って行った（Ｆｉｅｌｄｓら，１９９１）。精製した酸化ペプチドは、次のようにして得た。すなわち、β−メルカプトエタノールで還元したペプチドは３日間にわたり、しばしば新しくした１％ＮＨ₄ＨＣＯ₃に対して透析することによってゆっくり酸化した。これらのペプチドを酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で抗原として用いた。血清試料およびモノクローナル抗体以下の血清試料およびモノクロナール抗体を本研究に用いた。家畜．Ｆ−ＥＬＩＳＡ（Ｗｅｓｔｅｎｂｒｉｎｋら，１９８５）を用いて調べたところ、少なくとも１カ月間ＢＲＳＶに対して抗体が検出されなかった生後４〜６カ月の子牛から陰性フィールド血清試料（Ｎ＝４０）を得た。血清は、夏の季節の間に採取した（ＶａｎｄｅｒＰｏｅｌら，１９９３）。さらに、陰性血清試料（Ｎ＝１２）を特異的病原体（ＳＰＦ）子牛から得た。子牛は帝王切開の後、初乳を与えず、隔離して育てた。パラインフルエンザウィルス３型（ＰＩ−３）、ウシヘルパスウィルス１（ＢＨＶＩ）、ウシウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）、マイコプラズマのいずれかに特異的な抗体を含むＢＲＳＶ−陰性の血清試料（Ｎ＝４）を本研究では使用した。Ｆ−ＥＬＩＳＡで陽性のフィールド血清試料をＢＲＳＶ感染の記録のあるいくつかのオタンダ国の農場から得た（ＶａｎｄｅｒＰｏｅｌら，１９９３）。間接的なペプチドに基づくＥＬＩＳＡ（ｉＧ−ＥＬＩＳＡ）で１０２血清検体を調べ、そしてブロッキングペプチドに基づくＥＬＩＳＡ（ｂＧ−ＥＬＩＳＡ）でこれら１０２のうち９７血清検体を調べた。７６の異なった動物からの対になった血清試料（Ｎ＝１５２）を抗体力価の上昇を試験するために用いた。血清は、１９９０年１２月と１９９１年１月と１カ月間の間隔で２つの異なったオランダ国の農場で採取した（ＶａｎｄｅｒＰｏｅｌら，１９９３）。これらの血清試料のうちのいくつかは、ＢＲＳＶ−ＧペブチドまたはＯＲＳＶ−Ｇペプチドに対する反応性を区別するために用いた。最後にＦ−ＥＬＩＳＡで非特異的に反応した血清試料（Ｎ＝６）を調べた。ヒツジ．Ｆ−ＥＬＩＳＡでＲＳＶに対して陽性のヒツジ血清試料（Ｎ＝３）をヒツジ血清バンクから得た。ヒト．コンプリメントフィクシゼーション試験でＨＲＳＶ特異的な抗体について陽性のヒト血清試料（Ｎ＝１４）を国立微生物学センタ（スペイン，マドリード）のＪ．Ａ．Ｍｅｌｅｒｏ博士から得た。これらの血清は、１９９３年−９４年のＲＳＶ伝染時期の間に７カ月〜７０才の年齢の患者から採取した。ＲＳＶに対して陽性のヒト血清試料（Ｎ＝２３）をオランダ国ビルトフォーベンのＲＩＶＭのＪ．Ｃ．ｄｅＪｏｎｇ博士から得た。これらの血清試料は、抗原として１６残基と３２残基を比較するために試験で用いた。ウサギ．ＨＲＳＶ−Ａ（Ｌｏｎｇ株）およびＨＲＳＶ−Ｂ（９３２０株）で感染された細胞の上澄液でそれぞれウサギ（Ｎ＝３）を免疫化した。１ｍｌの上澄液と１ｍｌのフロイントアジュバント（ＦＣＡ）と１：１に混合したものでウサギにワクチン接種した。モノクローナル抗体ＢＲＳＶ−Ｇ特異的なモノクローナル抗体の製造は、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔら，１９８６に記載されたように実施した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを１００μｇＢＲＳＶ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ株）と胎児ウシ気管細胞上で生育させ、ＦＣＡと混合したもので免疫化した。ＭＡｂ２０のＲＳＶ特異性は、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔら，１９８６に記載されたようにイムノペルオキシダーゼ単層アッセイを用いて決定した。このアッセイでは、ＢＲＳＶ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ株）で感染されたＶｅｒｏ細胞を用いた。さらに、ＭＡｂ２０をＢＲＳＶ−Ｇペプチドを基にしたｉＧ−ＥＬＩＳＡおよびｂＧ−ＥＬＩＳＡで反応させた。ＨＲＳＶ−ＡのＧタンパク質に特異的なＭＡｂ２Ｇおよび１９Ｇは、国立微生物学センター（スペイン，マドリード）のＪ．Ａ．Ｍｅｌｅｒｏ博士から得た。ＨＲＳＶ−ＢおよびＡのＧタンパク質にそれぞれに特異的なＭＡｂ２６および３０は、ＡＦＲＣ動物健康研究所，コンプトン、英国のＪ．ＦｕｒｚｅおよびＧ．Ｔａｙｌｏｒ博士から贈られた。異なったペプチドの抗原性の比較ペプチド結合研究で決定されたＢＲＳＶ−Ｇの単一線型主免疫領域（残基１７４−１８５）とＮｏｒｒｂｙらによって記載されたＨＲＳＶ−Ｇの主免疫ペプチド（残基１７４−１８８）は、ＲＳＶ−Ｇ（残基１５８−１８９）の中央疎水性領域のＣ−末端半分に対応する。経験的に決定されたＨＲＳＶ−ＧＡ型の主免疫エピトープが予想された抗原部位（中央疎水性領域１５８−１８９に対応する３２残基）と同一の抗原特性を有するかどうかを調べるために両方のペプチドをＨＲＳＶ亜型ＡのＧ−ペプチドを抗原として用いて、ｉＧ−ＥＬＩＳＡでそれらの抗原性について試験した。４倍以上の血清試料が３２残基ペプチドに基づく間接Ｇ−ペプチドＥＬＩＳＡ（ｉＧ−ＥＬＩＳＡ）で１６残基ペプチドに基づくｉＧ−ＥＬＩＳＡよりも陽性とされた。表２を参照。ペプチド結合研究では、主免疫部位が１６−ｍｅｒペプチドにある（Ｎｏｒｒｂｙら，１９８７）と示されていたが、この研究で調べられたＨＲＳＶ−ＧＡ型の中央疎水性領域に対応する３２残基は、１６残基ペプチドと比較するとヒト血清に対して、より反応性に富んでいる。したがって、ＲＳＶのいくつかの型あるいは亜型のＧ−タンパク質の中央疎水性領域に対応する３２−残基を免疫アッセイの抗原として使用した。呼吸器系合胞体ウィルス特異的Ｆ−ＥＬＩＳＡ試験方法本発明者らの実験室で日常的診断試験に用いるＲＳＶ特異的間接２重抗体サンドイッチアッセイを実質的に以前記載した通り実施した（Ｗｅｓｔｅｎｂｒｉｎｋら，１９８５）。ただし、ウマ抗ＲＳＶ血清の代わりにＭＡｂを捕獲抗体として用いた。要するに、ＢＲＳＶ−Ｆに対して特異的２つのＭＡｂｓ（Ｎｏ８８９５３，ＩＤ−ＤＬＯ，Ｌｅｌｙｓｔａｄ）で覆ったミクロタイタプレートを、ウシＲＳＶ抗原、試験血清、ウサギ抗ウシ免疫グロブリンペルオキシダーゼ、基質クロモゲン溶液と順々にインキュベートした（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ，１５９頁）。使用前、そして各々のインキュベーション段階の後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む脱イオン水で６回濯いだ。試料血清および試薬を４％ウマ血清を含む「高塩分」ＥＬＩＳＡ緩衝液（８．１ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄，２．７９ｍＭＫＨ₂ ＰＯ₄，０．８ＭＮａＣｌ，２．６８ｍＭＫＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０，ｐＨ７．２）中で希釈した。ＢＲＳＶ抗原ストック溶液Ｎｏ８８９１５，ＩＤ−ＤＬＯ，Ｌｅｌｙｓｔａｄ）を１：２（ウエル当たり１００μｌ）に希釈し、３７℃で２時間インキュベートした。試験血清を１：８０（ウエル当たり１００μｌ）に希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。ウサギ抗ウシ免疫グロブリン（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ，１５９頁）でコンジュゲートしたホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）を１：２０００（ウエル当たり１００μｌ）に希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。基質クロモゲン溶液は、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ｗ／ｖ５−アミノサリチル酸および新たに加えた０．０５％ｖ/ｖの過酸化水素から成っていた。基質溶液のインキュベーションは４℃ で一晩行った。着色度は４５０ｎｍで測定した。抗原のない対照ウエルの試験血清の平均的背景値の２倍以上の吸光値を「陽性」と判定した。試験はＢＲＳＶ特異的抗体の検出のために開発されたが、ＲＳＶ型と亜型の間の広範囲にわたるＦタンパク質免疫交差反応性があるので他のすべてのＲＳＶ型に対する抗体をこの試験で検出することができる。間接ＧペプチドＥＬＩＳＡ（ｉＧ−ＥＬＩＳＡ）試験方法ｉＧ−ＥＬＩＳＡを上記のＦ−ＥＬＩＳＡの試験方法に基づき以下の修正を行って実施した。抗体は捕獲されず、直接プレート上にコートした。１５０ｎｇの粗酸化ペプチド（高結合能平坦底マイクロプレート，Ｇｒｅｉｎｅｒ）をウエル毎に１００μｌ炭酸塩緩衝液中、４℃、ｐＨ９．０で一晩コートした。ＥＬＩＳＡプレートをコートするペプチドの最適の希釈は、チェス盤滴定で最大の結合が得られるように選択した。１：５に希釈した試験血清とコンジュゲートを４％ウマ血清を含む「低塩分」ＥＬＩＳＡ緩衝液（８．１ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄，２．７９ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄，０．５ＭＮａＣｌ，２．６８ｍＭＫＣｌ，１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ，０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ８０，ｐＨ７．２）中、３７℃ 、１時間インキュベートした。続いて、上記のように試験を行った。試験に用いたコンジュゲートは、抗ウシ（１：２０００）、抗ヒツジ（１：１０００）、そして抗ヒトＨＲＰＯ（１：１０００）（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）であった。抗原のない対照ウエルの試験血清の平均的背景値の２倍以上の吸光値を「陽性」と判定した。ｉＧ−ＥＬＩＳＡｉＧ−ＥＬＩＳＡでのウシ血清の異なったパネルの反応性を日常のＦ−ＥＬＩＳＡ診断における反応性と比較した（図３）。すべての陰性血清（Ｎ＝４０）の平均吸光度に標準偏差の２倍を加えたものを陰性としての境界値（カットオフ）として用いると、ｉＧ−ＥＬＩＳＡの相対的特異性は０．７８と見い出された。この境界値を用いると、数カ所のオランダ国内の農場から得られた１０２陽性フィールド血清試料について、試験の感受性は０．９０（９２／１０２）と見い出された。他の微生物（ＢＨＶＩ，ＢＶＤＶ，ＰＩ−３，マイコプラズマ）に対する抗体を含む４つの異なった血清は、ｉＧ−ＥＬＩＳＡにおいてすべて陰性であった（データは示していない）。日常のＦ−ＥＬＩＳＡで非特異的に反応した６つの血清は、ｉＧ−ＥＬＩＳＡでも非特異的に反応した（データは示していない）。日常のＦ−ＥＬＩＳＡに比較して低い感受性は（ｉ）ＢＲＳＶ−Ｆに比較してＢＲＳＶ−Ｇの低い抗原性、（ｉｉ）数種の動物の低い抗体力価、または（ｉｉｉ）いくつかの血清が別の未だ同定されていない亜型に特異的であるかもしれない、等の理由によるものである。ブロッキングＧペプチドＥＬＩＳＡ（ｂＧ−ＥＬＩＳＡ）試験方法ＢＲＳＶ特異的抗体を測定するためのこのＥＬＩＳＡ法は、ＢＲＳＶ−Ｇ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ２０）と試験試料に存在するかもしれないペプチド特異的抗体によるコートされたペプチドとの相互作用によるブロッキングに基づいている。ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．０中４℃ で一晩ウエル当たり３０ｎｇの酸化ペプチドでコートした。ＥＬＩＳＡプレートをコートするペプチドの最適の希釈は、チェス盤滴定で最大に近い結合が得られ、試験の感受性が高く維持されるように選択した。使用前、そして各々のインキュベーション段階の後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む脱イオン水で６回濯いだ。プレートを１：２に希釈した試験血清１：５０００に希釈したＧペプチドに特異的なＨＲＰＯコンジュゲートされたモノクローナル抗体（ウシＲＳＶ−ＭＡｂ，ＩＤ−ＤＬＯ，Ｌｅｙｌｙｓｔａｄ）、基質クロモゲン溶液と順々にインキュベートした。基質溶液とのインキュベーションは４℃で一晩行った。試験血清とコンジュゲートを４％ウマ血清を含む「低塩分」ＥＬＩＳＡ緩衝液中、３７℃ で１時間インキュベートした。各々の試験試料のブロッキング率（％）を次式に従い、４％ウマ血清を含む「低塩分」ＥＬＩＳＡ緩衝液の４５０ｎｍでの吸光度を基準（すなわちブロッキング率０％）として用い算出した。試験試料のブロッキング率ｂＧ−ＥＬＩＳＡウシ血清の異なったパネルのブロッキング率をｂＧ−ＥＬＩＳＡ（図４）で比較した。すべての陰性血清（Ｎ＝４０）（χ＋２ＳＤ＝４２％）のブロッキング率を「陰性」の境界値として用いたとき、相対的特異性は０．９８と見い出された。１０２の陽性フィールド血清試料のうち９７検体を用いて決定された試験の相対的感受性は０．９８（９５／９７）と見い出された。他の微生物（ＢＨＶ− １，ＢＶＤＶ，ＰＩ−３，マイコプラズマ）に対する抗体を含む血清は、ｂＧ− ＥＬＩＳＡですべて陰性であった（データを示していない）。日常のＦ−ＥＬＩＳＡおよびｉＧ−ＥＬＩＳＡで非特異的に反応した６つの血清をｂＧ−ＥＬＩＳＡで試験した。これらの血清の２つは有意（７５％）にブロックした。これはこの血清がＢＲＳＶ抗体に対して陽性であると示唆している。ＲＳＶ感染の検出一対の血清中の抗体力価の上昇は、通常、感染または再感染の結果とみなされる。７６の対の血清試料中、セロコンバージョンまたは少なくとも４倍の力価の上昇は、ｉＧ−ＥＬＩＳＡで４２回、日常のＦ−ＥＬＩＳＡでは３２回検出された（表３）。力価上昇の頻度における差は、動物の年に関係しているように思われる（表３）。ＢＲＳＶｉＧ−ＥＬＩＳＡは、Ｆ−ＥＬＩＳＡよりも再感染を検出するのに感度が高かった。力価上昇の頻度における差は、動物の年に関係しているように思われる。若い子牛（１才以下）でセロコンバージョン検出するのには、ｉＧ−ＥＬＩＳＡおよび日常のＦ−ＥＬＩＳＡは等しく感受性があった。しかし、より老いた家畜（１才以上）では、ｉＧ−ＥＬＩＳＡを用いたとき、抗体力価の上昇がより頻繁に検出された。したがって、力価上昇がＦ−ＥＬＩＳＡに基づくとき、再感染の回数は過小評価されるかもしれない。両方のアッセイの異なった結果は、（ｉ）感染後のＦの抗体力価に比較してＧの抗体力価の低下がはやいこと、または、（ｉｉ）最初の感染後、Ｆに対するよりＧに対する抗体応答が小さいことで説明できる。その結果、再感染は、Ｆに対してよりもＧに対して抗体の顕著な増加を引き起こす。したがって、本明細書に記載したペプチドＥＬＩＳＡを含むＧ−特異的ＥＬＩＳＡは、ＲＳＶによる再感染をよりよく検出するので、Ｆタンパク質に基づくＥＬＩＳＡに対して有利である。ペプチドＥＬＩＳＡの型および亜型特異性全ウイルスに基づくＲＳＶＥＬＩＳＡは、非常にコンサーブされた抗原タンパク質を含む。したがって、このようなＥＬＩＳＡは、型または亜型特異的でなく、これは、このようなアッセイがヒトＲＳＶと有蹄類ＲＳＶとを区別しない、そしてＨＲＳＶ−ＡとＨＲＳＶ−Ｂ間またはＢＲＳＶとＯＲＳＶとを区別しないことを意味する。ＲＳＶ−Ｇのアミノ酸配列に従うＲＳＶの系統分類的関係に基づき、およびＲＳＶ−Ｇの中央疎水性領域に基づきデンドグラム（dendogram）を計算した（図５）。ＲＳＶ−Ｇは、ＲＳＶ型および亜型の間で非常に変化しうるので、本発明者らはペプチドに基づくｉＧ−ＥＬＩＳＡが型あるいは亜型特異的抗体を認識することができるかどうか調べた。マドリッドでの１９９３−１９９４年伝染勃発の期間に採取された患者の血清の反応性について、１３の血清がＨＲＳＶｉＧ−ＥＬＩＳＡと特異的に反応し、ＢＲＳＶｉＧ−ＥＬＩＳＡで反応しないことが示された（表４）。さらに、１２血清は、ＨＲＳＶ−ＡｉＧ −ＥＬＩＳＡで、ＨＲＳＶ−ＢｉＧ−ＥＬＩＳＡよりも高い反応性を示した。ＨＲＳＶ−ＡまたはＨＲＳＶ−Ｂに対して特異的なポリクロナールウサギ血清をＨＲＳＶペプチドに対する反応性について調べた。ＨＲＳＶ−Ａで免疫化したウサギの血清は、ＨＲＳＶ−ＡｉＧ−ＥＬＩＳＡでのみ反応し、ＨＲＳＶ−Ｂで免疫化したウサギの血清はＨＲＳＶ−ＢｉＧ−ＲＬＩＳＡでのみ反応することを表５が示している。さらに、ｉＧ−ＥＬＩＳＡで試験した公知の亜型に特異的な４つのＧ−特異的ＭＡｂは交差反応性を示さなかった（表４）。いくつかの対の血清試料を用いる１５残基ペプチドに基づくＥＬＩＳＡの亜型特異性は以前のｂｙら，１９８７）。ＯＲＳＶおよびＢＲＳＶは、ＨＲＳＶ亜型ＡとＨＲＳＶ亜型Ｂとの距離に比べ同様に遺伝的に離れた２つの有蹄類ＲＳＶ型である（図５）。中央疎水性領域のアミノ酸配列に基づく遺伝学的な距離は、ＯＲＳＶおよびＢＲＳＶ間の方がＨＲＳＶ−ＡおよびＨＲＳＶ−Ｂ間よりも僅かながら長い。したがって、ＲＳＶｉＧ−ＥＬＩＳＡの亜型特異性は、ほぼＯＲＳＶおよびＢＲＳＶでのみ、それぞれ感染されたヒツジおよび家畜のＲＳＶ陽性血清で確認することができる。同一の時点で採取され、日常のＦ−ＥＬＩＳＡで陽性として反応する２４の異なった動物からのウシ血清を、ＢＲＳＶｉＧ−ＥＬＩＳＡおよびＯＲＳＶｉＧ−ＥＬＩＳＡでそれぞれ反応性について試験した（表５）。ウシ血清はＢＲＳＶｉＧ −ＥＬＩＳＡのみで反応し、ＯＲＳＶｉＧ−ＥＬＩＳＡで反応しなかった。さらに、３つのＲＳＶ陽性ヒツジ血清は、ＯＲＳＶｉＧ−ＥＬＩＳＡのみで反応し、ＢＲＳＶｉＧ−ＥＬＩＳＡで反応しなかった（表５）。ワクチン研究子牛におけるペプチドの免疫原性を試験し、そしてペプチドによるワクチン接種がウイルス感染を軽減するか抑制するかどうかを調べるために、２つのペプチドワクチンを用いた。１頭の子牛をフロンドアジュバント（ＦＣＡ）中の３２残基ＢＲＳＶ−Ｇペプチドで１回のワクチンを接種した。もう１頭の子牛を、ＦＣＡ中、ＫｅｙｈｏｌｅＬｉｍｐｅｔＨａｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）と結合した３２残基ＢＲＳＶ−Ｇペプチドでワクチン接種した。対照子牛はワクチン接種しなかった。ペプチドに対する抗体反応性を実験の間中、追跡した。ワクチン接種の９週間後、動物を鼻腔から２ｍｌウイルス（Ｏｄｉｊｋ株，ＴＣＩＤ５０：１０^3.8／ｍｌ）にさらした。チャレンジの前そしてチャレンジの後、５，７，１１および１４週間後、肺洗浄物を子牛から集めた。洗浄物中の細胞をＢＲＳＶ抗原の存在に関して試験し、そしてウイルス滴定を洗浄物で実施した（図７ａ，ｂ）。担体タンパク質にコンジュゲートされたペプチドでワクチン接種した子牛は、ウイルスチャレンジに対してかなりの防御を示した。防御はコンジュゲートしていないペプチドと比較してコンジュゲートしているペプチドの方がよい。これはペプチドに対する抗体応答に関連しているように思える。図面の説明図１は、ＲＳＶ−Ｇの１次構造を模式的に示すものであり、陰影をつけた箱は、経膜領域（ＴＭ）、点を施した箱は正に帯電した領域を表す。ムチン様領域の拡がりは上の矢印で表し、これはセリン、トレオニニンおよびプロリンの高含量（３７−３８％セリン、トレオニン含量）に対応する。「・」はシスティンを表す。図の下部は、Ｇにおける一般的な可変性を示す（Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒら，１９９１，Ｃａｎｅら，１９９１，ＭａｌｌｉｐｅｄｄｉおよびＳａｍａｌ，１９９３ａ）。図２は、ＲＳＶ−Ｇの構造的モデルを模式的に示す。中央疎水性領域（残基１５８−１８９）を灰色楕円体として示す。ムチン様領域は可能なＯ−結合グリコシル化部位（短い水平線）および可能なＮ−結合グリコシル化部位（枝分かれ線）として示されている。陰影の領域は、経膜領域および細胞質領域に対応する。図３ａは、試験方法に記載されたＢＲＳＶｉＧ−ＥＬＩＳＡでの異なった血清の反応性を示す。図３ｂは、試験方法に記載されたＢＲＳＶＦ−ＥＬＩＳＡでの異なった血清の反応性を示す。図４は、試験方法に記載されたＢＲＳＶＦ−ＥＬＩＳＡでの異なった血清のブロッキング率（％）を示す。陰性の血清のいくつかは０以下のブロッキング率を有することに注意。図５は、ＲＳＶ−Ｇタンパク質とＲＳＶ−Ｇの中央疎水性領域の間のアミノ酸間隔を示す（残基１５８〜１８９）。隣接結合方法（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎｅｉ，１９８７）およびＰＨＹＬＩＰパッケージ中の集塊のＵＰＧＭＡ方法（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，１９８９）に従って、系統分類解析を実施した。図６は、ＢＲＳＶｉＧ−ＥＬＩＳＡで陽性の抗体希釈の逆数を示す。Ｘ軸上の数は、ワクチン接種後の週数を表し、矢印はチャレンジの時期を示す。図７ａ、はチャレンジの５日、７日後、それぞれの２頭のワクチン接種した子牛と１頭のワクチン接種していない子牛の肺洗浄物中の陽性細胞の％を示す。細胞はフルオレセインでコンジュゲートしたＢＲＳＶ−Ｆ特異的ＭＡｂを用いて染色した。図７ｂは、肺洗浄物中のウイルス力価を示す。ＨＲＳＶ−Ａ配列中の箱は、Ｎｏｒｒｂｙらの（１９８７）経験的研究に基づく主免疫抗原性部位を表わす。破線によって下線を施された残基は、本研究に用いられた３２−ｍｅｒペプチドに対応する。配列は、ＢＲＳＶについてはＬｅｒｃｈら（１９９０），ＯＲＳＶについてはＭａｌｌｉｐｅｄｄｉ，Ｓａｍａｌ（１９９３ｂ），ＨＲＳＶ−ＢについてはＪｏｈｎｓｏｎら（１９８７），ＨＲＳＶ−ＡについてはＷｅｒｔｚら（１９８５）から引用した。ａ：試験方法に記載されたＨＲＳＶ−ＡＧタンパク質に対応するペプチド。血清は１：２５に希釈された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１０月３０日【補正内容】請求の範囲１．呼吸器系合胞体ウィルスのＧタンパク質に由来するアミノ酸配列を含むペプチドであって、該アミノ酸配列は、２８ないし３７アミノ酸残基の鎖長を有し、かつ２つのムチン様領域の間に位置する個別にホールディングされた球状タンパク質モジュールを含むことを特徴とするペプチド。２．前記アミノ酸配列は、Ｇタンパク質の１５９位〜１８６位（ウシ呼吸器系合胞体ウィルスのＧタンパク質の番号付けに従う）のアミノ酸残基を含み、かつせいぜい４つのアミノ酸がその間で異なっていることを特徴とする請求項１記載のペプチド。３．前記アミノ酸配列は、Ｇタンパク質の１５８位〜１８９位（ウシ呼吸器系合胞体ウィルスのＧタンパク質の番号付けに従う）のアミノ酸残基を含み、かつせいぜい４つのアミノ酸がその間で異なっていることを特徴とする請求項１記載のペプチド。４．前記アミノ酸配列は、Ｇタンパク質の１５７位〜１９３位（ウシ呼吸器系合胞体ウィルスのＧタンパク質の番号付けに従う）のアミノ酸残基を含み、かつせいぜい４つのアミノ酸がその間で異なっていることを特徴とする請求項１記載のペプチド。５．前記呼吸器系合胞体ウィルスは、ウシ呼吸器系合胞体ウィルス、ヒト呼吸器系合胞体ウィルスＡ、ヒト呼吸器系合胞体ウィルスＢ、およびヒツジ呼吸器系合胞体ウィルスから成る群より選ばれることを特徴とする請求項１記載のペプチド。６．前記アミノ酸配列は、から成る群より選ばれる配列を含むことを特徴とする請求項１記載のペプチド。７．前記アミノ酸配列は、から成る群より選ばれる配列を含むことを特徴とする請求項１記載のペプチド。８．前記アミノ酸配列は、およびから成る群より選ばれる配列を含むことを特徴とする請求項１記載のペプチド。９．呼吸器系合胞体ウィルスの異なった型または亜型（に対する抗体）間での区別化、あるいは同定を可能にする、請求項１記載のペプチドを含むことを特徴とする抗原性物質。 10．呼吸器系合胞体ウィルスの診断における請求項１記載のペプチド、または請求項９記載の抗原性物質の用途。 11．呼吸器系合胞体ウィルス感染の予防に用いるための請求項１記載のペプチドまたは請求項９記載の抗原性物質。 12．呼吸器系合胞体ウィルス型または亜型（に対する抗体）を検出するあるいは同定するための診断試験キットであって、検出のための適当な手段とともに請求項１記載のペプチドまたは請求項９記載の抗原性物質を含むことを特徴とする診断試験キット。 13．たとえばブロッキングＥＬＩＳＡのような酵素結合免疫吸着剤アッセイである請求項１２記載の診断試験キット。 14．体液の試料と請求項１記載のペプチドまたは請求項９記載の抗原性物質を接触させ、前記ペプチドと、抗原性物質と、該ペプチド、抗原性物質に特異的な抗体とから成る複合体を形成させ、続いて該複合体を検出することを特徴とする呼吸器系合胞体ウィルス（に対する抗体）を検出する方法。 15．哺乳類へ投与するのに適当なアジュバンドまたは賦形剤とともに請求項１記載のペプチドまたは請求項９記載の抗原性物質を含むことを特徴とする呼吸器系ウィルス感染を予防するための薬学的組成物。 16．呼吸器系合胞体ウィルスに対して免疫応答を誘起するのに充分する量の請求項１５記載の組成物を哺乳類に投与することを特徴とする呼吸器系ウィルス感染の予防方法。 17．適当なアジュバンドとともに、請求項９記載の抗原性物質を哺乳類受容体に投与し、該哺乳類受容体から結果としてできる抗体または抗体産生細胞を収穫することを特徴とする呼吸器系合胞体ウィルス型または亜型に対する抗体を誘起する方法。 18．請求項１７記載の方法によって得られることを特徴とする呼吸器系合胞体ウィルスの型または亜型に対して特異的な抗体。 19．モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１８記載の抗体。 20．呼吸器系合胞体ウィルス型または亜型（に対する抗体）を検出するあるいは型または亜型間を区別化するための診断試験キットであって、検出のための適当な手段と、請求項１８記載の抗体を含むことを特徴とする診断試験キット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．呼吸器系合胞体ウィルスのＧタンパク質に由来するアミノ酸配列を含むペプチドであって、該アミノ酸配列は、約２８ないし約３７アミノ酸残基の鎖長を有し、かつ２つのムチン様領域の間に位置する前記Ｇタンパク質の領域から誘導されることを特徴とするペプチト。２．前記アミノ酸配列は、Ｇタンパク質の１５９位〜１８６位（ウシ呼吸器系合胞体ウィルスのＧタンパク質の番号付けに従う）のアミノ酸残基を含み、かつせいぜい４つのアミノ酸がその間で異なっていることを特徴とする請求項１記載のペプチド。３．前記アミノ酸配列は、Ｇタンパク質の１５８位〜１８９位（ウシ呼吸器系合胞体ウィルスのＧタンパク質の番号付けに従う）のアミノ酸残基を含み、かつせいぜい４つのアミノ酸がその間で異なっていることを特徴とする請求項１記載のペプチド。４．前記アミノ酸配列は、Ｇタンパク質の１５７位〜１９３位（ウシ呼吸器系合胞体ウィルスのＧタンパク質の番号付けに従う）のアミノ酸残基を含み、かつせいぜい４つのアミノ酸がその間で異なっていることを特徴とする請求項１記載のペプチド。５．前記呼吸器系合胞体ウィルスは、ウシ呼吸器系合胞体ウィルス、ヒト呼吸器系合胞体ウィルスＡ、ヒト呼吸器系合胞体ウィルスＢ、およびヒツジ呼吸器系合胞体ウィルスから成る群より選ばれることを特徴とする請求項１記載のペプチド。６．前記アミノ酸配列は、から成る群より選ばれる配列を含むことを特徴とする請求項１記載のペプチド。７．前記アミノ酸配列は、から成る群より選ばれる配列を含むことを特徴とする請求項１記載のペプチド。８．前記アミノ酸配列は、およびから成る群より選ばれる配列を含むことを特徴とする請求項１記載のペプチド。９．対応するＧタンパク質の中で、相当部分の３次構造を取ることができる請求項１記載のペプチド。 10．呼吸器系合胞体ウィルスの異なった型または亜型（に対する抗体）間での区別化、あるいは同定を可能にする、請求項１記載のペプチドを含むことを特徴とする抗原性物質またはその前駆体。 11．呼吸器系合胞体ウィルスの診断における請求項１記載のペプチド、または請求項１０記載の抗原性物質または前駆体の用途。 12．呼吸器系合胞体ウィルス感染の予防に用いるための請求項１記載のペプチドまたは請求項１０記載の抗原性物質または前駆体。 13．呼吸器系合胞体ウィルス型または亜型（に対する抗体）を検出するあるいは同定するための診断試験キットであって、検出のための適当な手段とともに請求項１記載のペプチドまたは請求項１０記載の抗原性物質または前駆体を含むことを特徴とする診断試験キット。 14．たとえばブロッキングＥＬＩＳＡのような酵素結合免疫吸着剤アッセイである請求項１３記載の診断試験キット。 15．体液の試料と請求項１記載のペプチドまたは請求項１０記載の抗原性物質または前駆体を接触させ、前記ペプチドと、抗原性物質または前駆体と、該ペプチド、抗原性物質または前駆体に特異的な抗体とから成る複合体を形成させ、続いて該複合体を検出することを特徴とする呼吸器系合胞体ウィルス（に対する抗体）を検出する方法。 16．哺乳類へ投与するのに適当なアジュバンドまたは賦形剤とともに請求項１記載のペプチドまたは請求項１０記載の抗原性物質または前駆体を含むことを特徴とする呼吸器系ウィルス感染を予防するための薬学的組成物。 17．呼吸器系合胞体ウィルスに対して免疫応答を誘起するのに充分する量の請求項１６記載の組成物を哺乳類に投与することを特徴とする呼吸器系ウィルス感染の予防方法。 18．請求項１記載のペプチドを模倣することを特徴とするペプチド類似体。 19．適当なアジュバンドとともに、請求項１０記載の抗原性物質または前駆体を哺乳類受容体に投与し、該哺乳類受容体から結果としてできる抗体または抗体産生細胞を収穫することを特徴とする呼吸器系合胞体ウィルス型または亜型に対する抗体を誘起する方法。 20．請求項１９記載の方法によって得られることを特徴とする呼吸器系合胞体ウィルスの型または亜型に対して特異的な抗体。 21．モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２０記載の抗体。 22．呼吸器系合胞体ウィルス型または亜型（に対する抗体）を検出するあるいは型または亜型間を区別化するための診断試験キットであって、検出のための適当な手段と、請求項２０記載の抗体を含むことを特徴とする診断試験キット。