JPH10512866A - ポリマー担体上の有機化合物の多重合成装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 固相合成システムは、多重合成作業を効率的に処理するコンピュータ（25）によって実行される新しいタイミングプロトコルで作動する全自動ロボット（20）を使用することによって提供される。全自動ロボット（20）は、トラック（35）に沿って移動し、固体担体及びアミノ酸反応物質を含む注入器（40、60）をピックアップし、位置決めし、作動させるグリップアーム（30）を装備されている。新しいタイミングプロトコルは、逐次方式よりもむしろペプチドのような異なる化合物のために合成サイクルのステップを同時に実行することによって実現される。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリマー担体上の有機化合物の多重合成装置及び方法技術的分野 本発明は、例えば、繰り返される洗浄、脱保護、及びカップリングによって形 成された本質的に繰り返し構造単位から成る化合物の多重合成のための装置及び 方法に関する。特に、本発明は、多重合成作業を処理するために自動ロボットを 使用する、ペプチドのような有機化合物の多重合成のためのシステムに関する。マイクロフィッシュ付属物の参照 ２つのマイクロフィッシュ及び120のフレームからのマイクロフィッシュ付属 物は、明細書の一部として含まれる。マイクロフィッシュ付属物は本発明を実施 するプログラムリストを含んでいる。プログラムリストは著作権保護を受けてい る。しかしながら、著作権者は、特許商標庁のファイルあるいは記録にあるよう に、任意の者によるプログラムリストのファクシミリコピーに異議はないが、そ れ以外は全ての著作権を留保する。発明の背景 有機化合物、例えば、ペプチドの合成のためのシステムは多数の用途に非常に 望まれている。例えば、複数のペプチドの合成及び収集は、認識及び結合を含む 細胞反応を阻止し、促進し、その他、この細胞反応に影響を及ぼすことができる 試薬の開発に役立つ。これらの試薬は多数の病気の治療あるいは診断に有用であ る。特に、合成ペプチドは診断薬及び治療薬として使用することができる。 理解できるように、ペプチド合成システムが設計され、製作されている。ホー トン（Houghten）R.A.，Proc ．Natl Acad．Sci，82:5131-5135(1985)は、メリフ ィールド（Merrifield）R．B.，J．Amer ．Chem Soc.，85:2149-2154(1963)の最 初の固相手順の標準的な洗浄、脱保護、中和、カップリングのプロトコルで標準 的なＢＯＣアミノ酸樹脂をポリプロピレンメッシュパケットで使用する“ティー バッグ”方法を使用する。 ペプチド合成システムの中には複数のペプチドの合成に対して自動化されてい るものもあるけれども、これらは、一般に多重合成作業を効率的に処理できない 無意味な“待ち”時間を示す。例えば、商用ペプチド合成システム、例えば米国 のギルソン(Gilson)及びアドバンスド・ケミカル・テクノロジー(Advanced Chem Tech)からの商用ペプチド合成システムは、複数のペプチド序列を合成できる。 しかしながら、これらの自動合成システムは、全てのペプチドに対する合成サイ クルにおいて各ステップを１つずつあるいは逐次的に実行する。特に、タイミン グプロトコルは、ペプチド全部を１つずつ洗浄すること、ペプチド全部を１つず つ脱保護すること、次にペプチド全部を１つずつカップリングすることを含む。 例えば、第１のペプチドのためのカップリングが開始され、次に、これらの第１ 開始カップリングステップが完了されると、第２のペプチドのためのカップリン グが開始される。このようなタイミングプロトコルによって、ペプチド合成ステ ップ間には特に長い遅延時間あるいは待ち時間がある。ペプチド全部を１つずつ 洗浄することは時間がかかる。さらに、カップリング中、仕上げのためのカップ リングを待つ間、システムは、時間を空費する。２時間かかるカップリングの場 合、従来の自動合成システムの効率は厳しく制限されている。 さらに、従来の自動ペプチド合成システムは非常に柔軟性を欠いている。一旦 ペプチドセットの合成が開始すると、任意の追加ペプチドの合成は、たとえ緊急 に要求されるとしても、開始できない。さらに、従来のシステムは、一般に非ペ プチド化合物の合成に必要とされる２つ以上の種類のカップリング反応を実行す るための柔軟性を欠いている。発明の概要 従来技術の欠点を解決する新しい合成システムは、多重合成作業を効率的に処 理する新しいタイミングプロトコルで作動する全自動ロボットを使用することに よって実現される。新しいタイミングプロトコルは、逐次方式よりもむしろ複数 の有機化合物のための合成サイクルの異なるステップを同時に実行することによ って実現される。 有利なことには、この新しいタイミングプロトコルは、所望の化合物を合成さ れる化合物のリストに容易に加え、化合物が合成される順序を変えるか、あるい は予め登録された化合物を削除するという柔軟性を与える。さらに重要なことは 、このようなタイミング方式あるいはプロトコルは“待ち”時間を減少させる。 すなわち、次の化合物合成の新しい合成ステップは前の合成のステップの完了以 前に開始される。 典型的な実施例では、新しい合成システムは、選択化合物、例えば、ペプチド の各サイクル内で合成ステップをコンピュータ制御の下で実行する産業用ロボッ トシステムを含む。各合成サイクルは、５つの異なるステップ、すなわち、洗浄 、脱保護試薬の添加、脱保護、カップリング試薬の添加及びカップリングを含む 。脱保護及びカップリングは何らのロボット動作も含まないために、これらのス テップは、化学的に能動であるけれども、受動合成ステップである。他のステッ プは能動合成ステップである。 とりわけ、新しいタイミングプロトコルは、ある化合物合成の受動合成ステッ プ中、次の化合物合成の合成サイクルのための能動合成ステップを実行するロボ ットシステムを有することによって実現される。 本発明の好ましい実施例では、固体担体として使用される樹脂を含み、反応容 器にもなる第１セットのプラスティック注入器を用いて、固相ペプチド合成が使 用される。さらに、第２セットのプラスティック注入器はアミノ酸を含んでいる 。グリップアームを装備されたロボットシステムは、所定のアミノ酸を固体担体 にカップリングするために新しいタイミングプロトコルに従って所望の注入器か ら溶剤及び試薬を選択的に吸引し、分配するために複数の注入器の中のいずれか １つを位置決めする。図面の簡単な説明 本発明のより完全な理解は、同じ素子が同様に表示される添付図面とともに下 記の説明を読むことによって得られる。 図１は、本発明の原理による合成システムのブロック図である。 図２Ａ及び図２Ｂは、図１の合成システムの動作を示す具体的なフローチャー ト、特にタイミングプロトコルである。 図３は、図１の合成システムのタイミングプロトコルのチャート図である。詳細な説明 本発明は、繰り返される洗浄、脱保護、及びカップリングによって形成される 繰り返し構造単位、例えば、本質的にペプチドから成る化合物の多重合成のため の装置に関するものである。この装置、すなわち合成システムは、多重合成作業 を効率的に処理する新しいタイミングプロトコルで作動する全自動ロボットシス テムを使用する。新しいタイミングプロトコルは、下記により詳細に述べられて いるように、逐次方式よりもむしろ複数の有機化合物の異なる合成サイクルの異 なるステップを同時に実行することによって実現される。 本発明の原理に対する普遍性あるいは適応性を犠牲にするものではなく、本発 明の動作全部は、一例として、ペプチドのメリフィールド固相合成に応用された Ｆｍｏｃ/ｔＢｕ化学を使用して記載される。しかしながら、本発明は、参照す るためにここに組み込まれている、例えば、Borchardtらの「J ．Am．Chem．Soc. , 116:373(1994)」、Chenらの「J ．Am．Chem．Soc.，116:2661(1994)」、Simon らの「PNAS，89:9367(1992)」、Nikolaievらの「Rept ．Res.，6:161-70(1993)」 及びLeblらの「Vol．5:541-548、Techniques In Protein Chemistry、Academic Press、San Diego(1994)」に記載されているような繰り返し構造単位、例えば、 ポリマーあるいは有機化合物から本質的に成る化合物の固相合成のためのいかな る他の化学にも同様に適用できることを理解すべきである。 しかしながら、本発明を説明する前に、ペプチド合成の基本的原理を簡単に述 ベることは有益である。ペプチド合成は、アミノ酸のカップリングを含み、当業 者によく知られている技術によって遂行される。例えば、参照するためにここに 組み込まれている、1984年にイリノイ州のロックフォード市のピアス化学会社の スチュアート（Stewart）及びヤング（Young）の「固相合成（第２版）」を参照 されたい。 固体担体上のペプチド合成の工程は、その保護されたαアミノ基を有するＣ末 端アミノ酸が固相ポリマーに付着されるカルボキシルあるいはＣ末端からペプチ ドを形成することを一般に含む。次に、その保護基ははがされ、また保護されて いる次のアミノ酸は、固体担体に付着されているアミノ酸のαアミノ基にペプチ ド結合によってカップリングされる。所望のペプチドが合成されるまで、前のア ミノ酸を脱保護し、追加アミノ酸をカップリングするサイクルが繰り返される。 アミノ酸の任意の反応側鎖は、カップリング及びＮα脱保護手順に耐えることが できる化学基によって保護されている。しかしながら、これらの側鎖保護基は合 成終了時に取り除くことができる。 アミノ酸を成長合成鎖にカップリングするために、ブロックされたアミノ酸の カルボキシル基は活性化されねばならない。例えば、実行された対称性の無水物 （ＰＳＡ）、実行された混合無水物（ＰＭＡ）、塩酸、活性エステル及びカルボ ン酸の現場活性化を含む多数の活性化方法を使用することができる。 本合成システムは、合成される各所望の合成サイクルを実行するためのコンピ ュータに接続される全自動ロボットシステムを含んでいる。図１を参照するに、 本発明の原理に従って標準的なＦｍｏｃ/ｔＢｕ化学を応用する、化合物、特に ペプチドの多重合成のためのシステムの好ましい実施例のブロック図が示されて いる。 合成システム10は、ＩＢＭパーソナルコンピュータ25に接続されるカナダのハ リントン市のＣＲＣプラス社からのモデルＡ251のような産業用ロボットシステ ム20を備えている。コンピュータ25は、その全てが周知であり、技術上理解され ている、中央処理装置、プログラムメモリ及びランダムアクセスメモリ、タイミ ング制御回路、入出力インタフェース装置及び中央処理装置の動作に必要な他の ディジタルサブシステムのようなハードウェアを含む。したがって、このような コンピュータハードウェアは、明瞭にするためにはここでは述べられていない。 ロボットシステム20は、ロボットシステムに対して供給されたソフトウェアプ ログラムで一般的に実行できる予めプログラム化されたステップの使用によって 異なる機械操作を実行するようにプログラム化される。一方、このような予めプ ログラム化されたステップは、ニュージャージー州のスプリングフィールドのハ ドソンコントロールグループ社のウィンドウズのためのトータルコントロールの ような第三者のソフトウェアプログラムで実行できる。他のプログラミングソフ トウェアを含む他のコンピュータ手段、マイクロコンピュータ制御手段あるいは 他の自動制御手段は、機械操作を行うように選択的に備えられ得る。 プログラム制御の下でトラック35に沿って移動可能であるグリップアーム30を 装備された自動ロボットシステム20は、複数の注入器の中のいずれか１つをピッ クアップし、任意の所定の位置に位置決め（Ｘ，Ｙ，Ｚ）することができる。グ リップアームは、所定のアミノ酸を固体担体にカップリングするための反応容器 にもなる所望の注入器から溶剤及び試薬を選択的に吸引し、分配するために使用 される。より詳細には、各注入器は、当業者に周知なように試薬を吸引あるいは 分配するためにグリップアームによって移動できるプランジャを有している。参 照するためにここに組み込まれる、例えば、Krchnak，V.，Vagner，J.の「低圧 連続フロー条件の下でのカラー監視固相多重ペプチド合成(Peptide Res．3，182 (1990))」を参照されたい。グリップアームは注入器の中味を振る手段を備えて いる。さらに、各注入器の試薬の含有量は所望の注入器内のプランジャの位置を 検出することによって容易に決定することができる。それから、注入器が適当に しっかりとつかまれ、位置決めされたことを確認するために、注入器の動きを検 出する光センサ36は、好ましくは、合成システムにフィードバックを与えるため に使用される。 ポリスチレンあるいはポリエチレングリコール／ポリスチレン樹脂のような適 当な固体担体が選択され得る。保護アミノ酸は、Bachem社(カリフォルニア州の トランス市)、Advanced ChemTech社(ケンタッキー州のルイスビル市)、Propepti de(フランスのベール・ルー・プチ市)のような多数の場所から容易に得ることが できる。 とりわけ、コンピュータ25は、複数のペプチドの合成サイクルの異なるステッ プが逐次方式よりもむしろ同時に実行できる本発明の新しいタイミングプロトコ ルを実行するように、合成サイクルの各ステップが開始される時を制御する。 より詳細には、合成システム10は、ここでは“樹脂注入器”と呼ばれる固体担 体として使用される樹脂を保持する第１セットのプラスティック注入器40を含ん でいる。好ましい実施例では、ドイツのチュービンゲン市のラプ・ポリメールか ら得られるＲＡＭ‐テンタゲル(0.21ミリモル/g)が樹脂として使用される。 第１セットのプラスティック樹脂注入器40は、例えば、各々が30の10ｍｌ及び 30の2.5ｍｌの注入器まで保持する入来ラック50の中に置かれている。合成シス テム10は、ここで“アミノ酸注入器”と呼ばれるアミノ酸溶液を保持する第２セ ットのプラスティック注入器60を含んでいる。同様に、第２セットの注入器60は 、各々が、例えば、100の10.0ｍｌ及び100の2.5ｍｌの注入器まで保持するラッ ク70の中に置かれている。バスケット65は完了合成ペプチドを保持する。第１及 び第２セットの注入器の数及びサイズは、合成された異なるペプチドの数、必要 とされるペプチドの長さ及び異なるアミノ酸の数によって決まる。 好ましくは、プラスティック注入器40、60は、固相ペプチド合成で使用され、 トリフルオロ酢酸を含む全ての溶剤及び試薬に十分に化学的に不活性であるポリ プロピレンのような材料で作られている。代替材料は、ケブラー、テフロンある いはキャストガラスを含む。 反応容器として役立つ各プラスティック樹脂注入器40には、底部にフリット（ 図示せず）が装備されている。固相を維持し、過剰の試薬及び溶剤を除去するい ろいろな他の容器と、手段とが使用できることを理解すべきである。例えば、フ リットあるいはフィルタが備えられているカラムあるいは溜めは、本合成システ ムと互換性がある代替反応容器として使用されてもよい。その代替例では、カラ ムあるいは溜めは、その反応容器から切り離すことができるように真空源に接続 されている。さらに、フリットあるいは固相を維持する手段は反応容器と一体で ある必要がない。むしろ、それは、それは外部にあるかあるいはそこから溶液の 除去中固相を維持するときだけ存在し得る。 適当な溶剤及び試薬は、ネバダ州のレノ市のハミルトンマイクロラブ900のよ うな４つの10ｍｌのピストンポンプシステム90を使用して溶剤貯蔵器から送り出 しカップ80に導入される。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピペリジン／ＤＭ Ｆ、ＤＩＣ／ＤＭＦのような商用銘柄溶剤及び試薬が使用される。ピストンポン プの中の３つは溶剤及び試薬を送り出しカップ80に供給するのに対して、第４の ピストンポンプは、アミノ酸及びカップリング試薬が混合されているカップ80か らの洗浄溶液と同様に不用副産物を除去する。 送り出しカップ80は、全ての洗浄及び保護アミノ酸及びカップリング試薬の収 容のために使用される第１のカップ100と、脱保護試薬を収容するために使用さ れる第２のカップ110とを備えている。 当業者は、他の独立した操作装置が、分配、吸引、振とう、加熱、冷却あるい は還流のようなそこで望まれる特定の反応に応じて注入器を操作するために使用 できることに容易に気がつくであろう。これらの瞬間では、ロボットシステム20 は、所望の操作装置に適当な注入器を配置するだけに必要とされる。大部分の時 間がかかる作業は複数の独立した操作装置の中で分配されているために、これは 、能動合成ステップを実行するのに必要な時間を減少する。 上記合成システムを使用して、複数のペプチドは、合成中、所望のアミノ酸を 固体担体に繰り返し付着できるように注入器を操作することによって合成される 。当業者は、試薬容器と反応容器との間あるいは混合室と反応容器との間のいず れにも細管及び弁のような物理的結合がないことに気が付くであろう。これによ り、異なる試薬及び反応条件は同一あるいは異なるペプチド合成で使用できる。 各合成サイクルは次の基本的操作あるいはステップのシーケンス、すなわち、 洗浄、脱保護試薬の添加、脱保護、カップリング試薬の添加、及びカップリング から成る。各々が所望のアミノ酸をカップリングする合成サイクルを好判断に結 合することで所望のペプチドの合成に対する合成プロトコルを形成する。しかし ながら、上記の合成ステップの中の３つ、すなわち、洗浄、脱試薬の添加及びカ ップリング試薬の添加だけは、ロボットシステム20の使用を直接に必要とする。 これらのステップは、化学的には受動的であるが、ここでは、“能動合成ステッ プ”と呼ばれ、下記により詳細に述べられている。 洗浄中、ロボットシステム20は、ラック40、タンブラー120あるいは保持位置1 25から選択された樹脂注入器を位置決めし、次にそこの中のいかなる液体も液体 排管130に分配する。その後、予めプログラム化された洗浄液体量はピストンポ ンプシステム90を使用して第１のカップ100に供給され、次に、選択樹脂注入器 を使用して予めプログラム化された空気量とともに吸引される。次に、ロボット システム20は、最後に、効率的な混合を確実にするために予めプログラム化され た時間、選択樹脂注入器を振る。 脱保護試薬の添加は、同様にロボットシステム20の使用を必要とする。ロボッ トシステム20は、所望の樹脂注入器を液体排管130の上に置き、そこの中のいか なる液体も分配する。その後、予めプログラム化された脱保護混合物量は第２の カップ110に供給され、次に、選択樹脂注入器を使用して予めプログラム化され た空気量とともに吸引される。 最後に、カップリング試薬の添加もロボットシステム20の使用を必要とする。 ロボットシステム20は選択樹脂注入器を保持位置125に配置する。次に、ロボッ トシステム20は選択されたアミノ酸注入器を選択し、位置決めし、所定の所望の アミノ酸量を第１のカップ100に分配する。選択されたアミノ酸注入器はラック4 0に再配置される。次に、予めプログラム化された量の活性剤は第１のカップ100 に供給され、保持位置125に置かれた選択された樹脂注入器を使用して予めプロ グラム化された空気量とともに吸引される。次に、この選択された樹脂注入器は 、タンブラー120の中に配置される。次に、ロボットシステム20は、予めプログ ラム化された量の洗浄溶剤をその時に吸引される第１のカップ100に分配する。 一般的には、タンブリング及び洗浄の後者のステップは多数の回数、好ましくは ３回繰り返される。 脱保護及びカップリング中、注入器は、その各々が効率的な混合を確実にする ために18の注入器まで保持する2.5ｍｌあるいは10.0ｍｌのタンブリングラック1 20上に置かれる。 多重合成作業の処理をより効率的にできるタイミングプロトコルをより良く理 解するために、タイミングプロトコルに対する基本的な原理の論議は、特に図２ Ａ及び図２Ｂのフローチャートに関しては有益である。 まず第一に、ユーザは合成される化合物の序列を入力する。そして、必要な試 薬が使用可能であるならば、システムは所望の合成を始動し始める。そうでなけ れば、ユーザは欠陥があることを通知される。より詳細には、各所望の合成に関 しては、システムは、序列を合成するのに必要な能動及び受動の両方である特定 の合成ステップを決定するのと同様に何時これらの合成ステップが実行されるべ きであるか、すなわち合成サイクル内のそのタイミングあるいは時間の関係を決 定する。 当業者は、これらの合成ステップが序列特有であること、すなわちこれらの合 成ステップは所望の合成に詳細に相関づけられることに容易に気が付くであろう 。 ここでは、これらのステップは“序列特有タイミングプロトコル”と呼ばれる。 新しい合成を開始することを考察する際に、新しい所望の合成の“序列特有タイ ミングプロトコル”は、既に開始されたこれらの序列に対する序列特有ステップ あるいはタイミングプロトコルと比較される。これらの後者の序列特有ステップ は、現在開始されている合成の全ての個別の“序列特有タイミングプロトコル” の蓄積したものであるために、“累積既存タイミングプロトコル”と呼ばれる。 より詳細には、上記の比較では、システムは何時新しい所望の合成の能動合成 ステップが現在合成されている序列の能動合成ステップに関して生じるかをプロ ットアウトすることを要求している。そして、新しい所望の合成の能動合成ステ ップ及び既に開始されているステップを実行する際にタイミング衝突がない限り 、必要な試薬が使用可能であるならば、システムは新しい合成の開始を始動し始 める。所望の新しい合成の新しい序列特有タイミングプロトコルは“累積既存タ イミングプロトコル”に加えられることを理解すべきである。 しかしながら、万一タイミング衝突が存在した場合、新しい所望の合成の開始 がタイミング衝突を除去するために開始された合成のうちのいずれかの次の能動 合成ステップの開始まで、システムは、遅延、すなわち“時間シフト”すること ができるかどうかを決定しようと試みる。システムがタイミング衝突を解決する ことができない限り、システムは、新しい所望の合成を開始しないが、その代わ りに、現在進行中の合成の次の要求される能動合成ステップを実行し始める。一 旦能動合成ステップが実行されると、システムは、“累積既存タイミングプロト コル”を更新し、次に、継続している合成の中のいずれかの次の受動合成ステッ プ中にタイミング衝突を解決しようと再度試みる。全ての所望の合成が開始され るまで、このタイミングプロトコルは繰り返し実行され得る。 上記のタイミングプロトコルの原理による複数のペプチドの同時合成に対する 合成ステップの具体的な説明は下記にある。多重合成の各合成プロトコルは予め プログラム化されたステップあるいは手順の順番に並べられたサイクル順序であ ることを思い出すべきである。この具体的な説明に関しては、１つの合成サイク ルは、次の合成ステップ、すなわち（i）樹脂を毎回30秒間、ジメチルホルムア ミド（ＤＭＦ）で３回洗浄すること、（ii）10分間、ピペリジン／ＤＭＦの50％ でアミノ酸を脱保護すること、（iii）樹脂を毎回30秒間、ジメチルホルムアミ ド（ＤＭＦ）で５回洗浄すること、及び（iv）３モル過剰ＤＩＣ／ＨＯＢｔ活性 化されＦｍｏｃ保護されたアミノ酸を使用して２時間、カップリングすることか ら成る。 各ペプチドに対する最後の合成サイクルを終了した後、合成は、洗浄によって 、あるいはこれが適用可能であるならば、洗浄、脱保護及び洗浄によって終了さ れる。 上記の具体的な合成サイクルに従って作動するロボットシステム30は、第１の 樹脂注入器（ペプチド合成第１号）を位置決めし、プランジャを操作し、ジメチ ルホルムアミド（ＤＭＦ）の洗浄溶液を吸引し、次に樹脂注入器を振る。これは 、樹脂を30秒間、洗浄溶液で洗浄する。好ましくは、洗浄は３回繰り返される。 その後、第１の樹脂注入器は、ピストンポンプによって分配された脱保護試薬を 送り出しカップから吸引するために使用される。この後者のステップは“脱保護 試薬の添加”ステップである。この繰り返される洗浄及び脱保護の添加は約５分 かかる。 約10分続く脱保護中、有利なことには、合成システムは、ロボットシステムに 第２の樹脂注入器、すなわち次のペプチド合成（ペプチド合成第２号）に対する 洗浄及び脱保護試薬の添加を開始するように指令する。しかしながら、洗浄及び 脱保護試薬の添加はわずか５分以下しかかからないので、脱保護が第１の樹脂注 入器に対して完了される前に少なくとも５分なお残っている。ステップ間の遅延 時間が最少にされることを確実にするために、合成システムはさらに、ロボット システムに第３の樹脂注入器（ペプチド合成第３号）に対するさらにもう一つの 洗浄及び脱保護試薬の添加を開始するように指令する。 その後の樹脂注入器（次のペプチド合成）に対する他の洗浄及び脱保護試薬の 添加を開始するかどうかの決定は、前述のように、序列特有タイミングプロトコ ルを累積既存タイミングプロトコルと比較することによってプログラム制御の下 で自動的に制御される。事実上、最も少ない残存時間が脱保護に対し作業を完了 するのに十分長いならば、洗浄及び脱保護試薬の添加が開始される。 一旦第１の樹脂注入器に対する脱保護が完了されると、合成システムは、ロボ ットシステムに樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で30秒間洗浄するために 第１の樹脂注入器を位置決めするように指令する。好ましくは、これは、その後 樹脂注入器が一時的保持位置に置かれ５回繰り返される。次に、カップリングさ れる所望のアミノ酸を含むアミノ酸注入器が位置決めされ、予めプログラム化さ れた量が、次にＤＩＣ溶液を収容する送り出しカップに分配される。第１の樹脂 注入器は、このアミノ酸をカップリングするためにアミノ酸溶液を送り出しカッ プから吸引するために使用される。この後者ステップは“カップリング試薬の添 加”ステップである。同様に、洗浄及びカップリング試薬の添加のための時間は 約５分かかる。このカップリング中、有利なことには、合成システムは、ロボッ トシステムに、第２の樹脂注入器（ペプチド合成第２号）に対するカップリング 及び次にその後の第３の樹脂注入器（ペプチド合成第３号）に対するカップリン グを開始するように指令する。 同様に、その後の樹脂注入器あるいはペプチド合成に対する他の洗浄及びカッ プリング試薬の添加を開始するかどうかの決定は、前述のように、序列特有タイ ミングプロトコルと累積既存タイミングプロトコルとを比較することによってプ ログラム制御の下で自動的に制御される。事実上、最も少ない残存時間がカップ リングに対し作業を完了するのに十分長いならば、洗浄及びカップリング試薬の 添加が開始される。 一旦カップリングが全ての３つの樹脂注入器、すなわち３つのペプチド合成に 対して開始されると、合成システムは、第４の樹脂注入器（ペプチド合成第４号 ）を利用し、洗浄及び脱保護を開始する。合成システムは、最も少ない残存カッ プリング時間が終了する前にできるだけ多数の樹脂注入器（ペプチド合成）に対 する洗浄及び脱保護を開始する。 最も短い長さのペプチドの序列が組み立てられるまで、この手順が繰り返され る。所望ならば、次に、付加的な樹脂注入器は新しいペプチド序列を合成するた めに使用することができる。 合成された最大ペプチド量は注入器のサイズによって制限される。例えば、約 500ｍｇの樹脂（0.5ミリモル／ｇ樹脂）を含む10ｍｌの注入器に関して、0.25ミ リモルのペプチド（およそ300ｍｇの粗製10ペプチド）を合成することができる 。 当業者は、各ペプチド合成に対するカップリング時間が同一である、すなわち 最も早く開始されたカップリングはその後に開始されたカップリングよりも前に 終了することを前記の具体的な説明で容易に気がつくであろう。この状況では、 ペプチド合成に対する各々の新しい開始された合成サイクルは、前のサイクルが 開始された順序に続く。このことが望まれるならば、異なるカップリング時間が 使用できることに理解すべきである。しかしながら、タイミングプロトコルの原 理は変わらない、すなわち、時間が許すならば、システムは、前のペプチド合成 の受動ステップ中、次のペプチド合成の能動合成ステップを開始する。 タイミングプロトコルを含む本発明の原理を実行するプログラムリストはマイ クロフィッシュに含まれている。 図３を参照するに、前述の固相ペプチド合成プロトコルを使用する12のペプチ ドの多重合成に対する洗浄、脱保護試薬の添加、脱保護、カップリング試薬の添 加及びカップリングとの間のタイミングプロトコルあるいはタイミング関係が示 されている。当業者は、受動合成ステップ（脱保護及びカップリング）中、次の ペプチド合成の合成サイクルの能動合成ステップは前のペプチド合成と同時に開 始されることを前述に基づいて直ちに気がついている。例えば、図３を参照する に、第１のペプチド合成（ペプチド合成第１号）の脱保護中、洗浄及び脱保護試 薬の添加は、第２及び第３のペプチド合成（ペプチド合成第２号及び第３号）に 対して開始される。 各化合物の合成を開始する前に、分配される溶剤あるいは試薬の種類及び量と 対応する洗浄ステップ及び／又は反応ステップの時間の長さを含むいろいろなパ ラメータ変数は、各所望のペプチド合成の合成プロトコルで指定されねばならな いことを理解すべきである。さらに、吸引は脱保護試薬を添加し、カップリング 試薬を添加する際に実行されるために、樹脂及び溶剤の効率的な混合を可能にす るために必要な空気量が指定されなければならない。 現在記憶されている合成プロトコルから指定されるかあるいは検索されねばな らないいろいろなパラメータ変数に加えて、合成システムは、ペプチド合成プロ トコルに含まれている溶剤及び試薬の指定及び識別と、対応する試薬量及びアミ ノ酸溶液量のそれぞれを計算するために使用される試薬濃度及びアミノ酸濃度 （ミリモル／ｍｌ）と、注入器のサイズと、注入器の樹脂量と、ミリモル／ｇの 樹脂の取り換えと、その濃度及び使用可能量を含み、好ましくは３文字〜５文字 のコードによって識別される各アミノ酸注入器の位置及び中味と、識別する３〜 ５文字コードを使用して合成されるように望まれるペプチド序列と、各ペプチド に対するその識別コード及び序列とを含む他の情報よっても開始されねばならな い。好ましくは、システムはユーザにプロンプトを表示してこの情報の入力を指 示する。一方、この情報は、ペプチド合成を開始する前に入力するかあるいはフ ァイルあるいはデータベースに記憶することができる。 合成される序列が入力される順序は、合成に対するその優先順位を確立し、合 成待ち行列を確立する。有利なことには、任意の化合物は任意の優先順位で入力 することができる。さらに、付加的序列は、必要な合成プロトコルとともに合成 待ち行列に加えることができる。さらに、必要ならば、付加的な試薬を添加する ことができる。 上記の情報から、システムは、アミノ酸の量及び試薬が全てのペプチドを作成 するのに十分であるかどうかを計算する。合成に対して使用可能な十分なアミノ 酸及び試薬がないなら、合成システムは、この合成を開始せず、その代わりに、 その状態を“レディーでない”と指示する。著しいことには、複数のペプチドの 合成サイクルのロボットシステムの使用を必要とする能動合成ステップは異なる 合成サイクルの受動合成ステップと同時に実行されるので、上記のタイミングプ ロトコルは、多重合成作業を効率的に処理できる。さらに、合成資源は各々の完 了された合成とともに直ぐに使用可能になるために、新しいペプチド合成は所望 のペプチドの全セットの完了合成を待つことなしに開始することができる。好ま しくは、新しいペプチド合成は要求により優先順位づけられるペプチドの待機リ ストの最上部からとられる。有利なことには、この優先順位づけられた待機リス トは、変わる状態に合わせるように任意のペプチドを添加あるいは削除のいずれ かをすることによっていつでも変えることができる。現在、合成されている任意 のペプチドは他のペプチドの合成に影響を及ぼさないで停止することができる。 有利なことには、試薬容器と反応容器との間あるいは混合室と反応容器との間 に結合がないので、異なる試薬及び反応状態は同一あるいは異なるペプチド合成 内で使用することができる。もちろん、このような柔軟性は、研究室が要求する 可変数のブロック形成試薬の合成を可能にする。 上記の新しいペプチド合成システムの信頼性及びスループットを試験するため に、５つの異なるペプチドアミド(IKRKR，VRYGI，AAAGY，FPRGR，VYFAW)は本発 明の原理に従ってRAMテンタゲル樹脂を使用して合成される。さらに、混合物Ｋ （82.5％のトリフルオロ酢酸、５％のＰクレゾール、５％のチオアニソール、2. 5％のエタンジチオール及び５％の水）は、側鎖を脱保護し、ペプチドを樹脂か らはがすためにために使用された。この実験の実行に基づく結果は、質量分光学 を使用する分析傾斜HPLCトレース及び分子ピーク分析に基づく高純度の原材料を 示している。 いろいな他の修正も、本発明の範囲及び精神から逸脱しないで当業者に直ちに 明らかであることが理解される。例えば、本発明の原理は、洗浄、脱保護及びカ ップリング‐特に、含まれているが、Borchardtらの「J ．Am．Chem．Soc.，116: 373(1994)」、Chenらの「J ．Am．Chem．Soc.，116:2661(1994)」、Simonらの「P NAS ， 89:9367(1992)」、Nikolaievらの「Rept ．Res.，6:161-70(1993)」及びLeb lらの「Vol．5:541-548、Techniques In Protein Chemistry、Academic Press、 San Diego(1994)」に記載されている有機反応に限定されない固相合成のような 繰り返される手順を含むいかなる化学にも同様に適用することができる。 したがって、ここに添付されたクレームの範囲はここに記載されている説明に 限定されるべきであることを意図するのではなくて、正確に言えば、クレームは 、本発明が関係している当業者によってその均等物として扱われる全ての特徴を 含む本発明にある特許可能な新規性の特徴を全て含むように解釈されるべきであ ることを意図している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 セリグマン，ブルース アメリカ合衆国 85715 アリゾナ州，ツ ーソン，エヌ．ニルバナ プレイス 6290

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．各々が合成ステップの繰り返される合成サイクルによって形成される複数 種の有機化合物の固相合成のためのシステムにおいて、 前記複数種の各々の合成のために予め決められた合成サイクルに関連した命令 のプログラムを処理するコンピュータと、 前記コンピュータに応動する自動ロボットであって、前記複数種の各々の合成 サイクルに従って前記合成ステップが実行されるように作動する自動ロボットと 、 前記命令のプログラムによって実行され、かつ前記コンピュータによって実行 され、少なくとも２つの異なる種の合成ステップが同時に実行されるように命令 するタイミングプロトコルと、 を備えていることを特徴とするシステム。 ２．前記複数種の各々が関連序列特有タイミングプロトコルを有し、現在合成 中の種の全ての序列特有タイミングプロトコルの累積が累積既存タイミングプロ トコルであり、前記システムが、新しい所望の種の序列特有タイミングプロトコ ルと累積既存タイミングプロトコルとの間のタイミング衝突があるかどうかを決 定する手段をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のシステム。 ３．前記合成ステップが、洗浄、脱保護試薬の添加、脱保護、カップリング試 薬の添加及びカップリングのステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の システム。 ４．前記合成ステップが能動及び受動の合成ステップを含み、前記タイミング プロトコルが、第２の種の第２の合成内の受動ステップと同時に実行される第１ の種の第１の合成内の前記能動ステップを命令することを特徴とする請求項１に 記載のシステム。 ５．前記有機化合物がペプチドを含むことを特徴とする請求項１に記載のシス テム。 ６．さらに、 各々の注入器が第１の種を合成するために化合物を固体担体に繰り返しカップ リングできる樹脂を含む第１セットの複数の注入器と、 各々の注入器が前記合成サイクルの中の１つの間、固体担体にカップリングさ れるべき所望の化合物を含む第２セットの複数の注入器と、 を備えていることを特徴とする請求項１に記載のシステム。 ７．カップリングされるべき前記化合物がペプチドの合成のためのアミノ酸で あることを特徴とする請求項６に記載のシステム。 ８．前記固相合成がメリフィールド固相ペプチド合成であることを特徴とする 請求項７に記載のシステム。 ９．前記自動ロボットが、 前記コンピュータに応動するグリップアームを含み、前記グリップアームが、 前記第１及び第２セットの複数の注入器からの注入器を選択的に位置決めし、操 作し、それによって前記合成サイクル内で必要とされる溶剤及び試薬を吸引ある いは分配することを特徴とする請求項１に記載のシステム。 １０．有機化合物の前記複数種の合成に必要とされるパラメータ変数を含むデ ータベースをさらに備え、前記データベースが前記複数種の各々に対して繰り返 される合成サイクルに特有な序列を含むことを特徴とする請求項１に記載のシス テム。 １１．各々が合成ステップの繰り返される合成サイクルによって形成される複 数のペプチドの固相合成のためのシステムにおいて、 各々が固体担体を保持する第１セットの注入器と、 各々が所望のアミノ酸を保持する第２セットの注入器であって、前記第１セッ トの注入器が前記第２セットの注入器からの所望のアミノ酸を前記固体担体にカ ップリングする反応容器として役立つものであるものと、 複数のペプチドの合成のために予め決められた合成サイクルに関連した命令の プログラムを処理するコンピュータと、 前記コンピュータに応動する自動ロボットであって、前記自動ロボットが、前 記第１及び第２セットの注入器に作動的に結合され、前記繰り返される合成サイ クルが所望のペプチド合成に従って実行されるように試薬を吸引し、分配し、そ れによって所望のアミノ酸を固体担体に繰り返しカップリングができるようにし 、前記繰り返される合成サイクルが、洗浄、脱保護試薬の添加、脱保護、カップ リング試薬の添加及びカップリングの合成ステップを含むものと、 タイミングプロトコルに従って実行される前記繰り返される合成サイクルと、 を備え、前記洗浄、脱保護試薬の添加あるいはカップリング試薬の添加が異なる ペプチド合成のための前記脱保護あるいはカップリングと同時に実行されること を特徴とするシステム。 １２．前記第１セットの注入器がポリプロピレンで作られていることを特徴と する請求項１１に記載のシステム。 １３．前記第１セットの注入器が固相保持装置を含んでいることを特徴とする 請求項１１に記載のシステム。 １４．前記固相保持装置がフリットであることを特徴とする請求項１３に記載 のシステム。 １５．前記固相担体がポリスチレン及びポリエチレングリコールのグループか ら選択された樹脂を含むことを特徴とする請求項１１に記載のシステム。 １６．前記自動ロボットが、前記第１及び第２セットの注入器の各々を操作す るように前記ロボットに作動的に接続されたアームを含むことを特徴とする請求 項１１に記載のシステム。 １７．前記第１及び第２セットの注入器の各々がそれに作動的に結合されたプ ランジャを含み、前記プランジャが、前記自動ロボットの前記アームによって移 動でき、それによって試薬を吸引するかあるいは分配することを特徴とする請求 項１６に記載のシステム。 １８．前記注入器の各々の中の試薬の含有量が対応する注入器のプランジャ位 置によって決定されることを特徴とする請求項１７に記載のシステム。 １９．前記第１及び第２セットの注入器の移動に応動する光センサをさらに含 み、前記光センサが、前記第１及び前記第２セットの注入器の位置決めを確認す ることを特徴とする請求項１１に記載のシステム。 ２０．前記ペプチドの合成がＦｍｏｃ/ｔＢｕ化学を使用することを特徴とす る請求項１１に記載のシステム。 ２１．さらにピストンポンプ及び送り出しカップを備え、前記ピストンポンプ が、前記第１及び第２セットの注入器が前記溶剤あるいは試薬を分配あるいは吸 引する前記送り出しカップに溶剤及び試薬を送り出すことを特徴とする請求項１ １に記載のシステム。 ２２．複数のペプチドの合成に必要なパラメータ変数を含むデータベースをさ らに含むことを特徴とする請求項１１に記載のシステム。 ２３．繰り返される合成ステップの合成サイクルによって形成される有機化合 物の複数種の固相自動合成のための方法において、 ａ）ある種の合成サイクルの合成ステップを開始するステップと、 ｂ）ステップａ）の前記合成ステップに対する時間が、異なる種の合成サイク ルの合成ステップを開始するのに十分であるかどうかを決定するステップと、及 びもしそうなら、 ｃ）前記異なる種の合成サイクルの合成ステップを開始するステップと、 ｄ）前記複数種が合成されるまでステップａ）、ｂ）及びｃ）を繰り返すステ ップと、 から成ることを特徴とする方法。 ２４．前記合成ステップが、複数種の合成のための洗浄、脱保護及びカップリ ングを含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。 ２５．前記脱保護及びカップリングが反応容器として役立つ複数の注入器で実 行されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。 ２６．アミノ酸を固体担体に繰り返し結合ができるように洗浄、脱保護試薬の 添加、カップリング試薬の添加及びカップリングの繰り返されるサイクルによっ て形成される複数のペプチドの自動固相合成のための方法において、 ａ）第１セットの注入器の各々を樹脂固体担体で充填するステップと、 ｂ）第２セットの注入器の各々を所望のアミノ酸で充填するステップと、 ｄ）前記第１セットの注入器の中の１つを第１の溶液で洗浄するステップと、 ｅ）脱保護溶液をステップｄ）の注入器に添加し、脱保護を開始するステップ と、 ｆ）ステップｅ）の脱保護が続けられている間、これらのステップを実行する 時間が脱保護に必要な時間以下であるならば、ステップｄ）及びステップｅ）を 繰り返し、そうでなければ、ステップｇ）を続けるステップと、 ｇ）カップリング溶液をステップｄ）の注入器に添加し、それによって所望の アミノ酸を固体担体にカップリングするステップと、 ｈ）ｇ）のカップリングが続けられている間、これらのステップを実行する時 間がカップリングする時間以下であるならば、ステップｆ）及びステップｇ）を 繰り返し、そうでなければ、カップリングする時間が終了するまでステップｄ） 及びステップｅ）を続けるステップと、 から成ることを特徴とする方法。 ２７．ペプチドが合成されるまでステップａ）〜ステップｈ）が繰り返される ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。 ２８．カップリング溶液を添加する前にステップｄ）の前記第１セットの注入 器の各々を洗浄するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２６に記載の 方法。 ２９．前記システムがロボットの使用によって自動化され、前記ロボットが、 試薬を吸引し、分配するように注入器を操作することによってカップリング・脱 保護溶液を添加することを特徴とする請求項２６に記載の方法。 ３０．第１の溶液がジメチルホルムアミドであることを特徴とする請求項２６ に記載の方法。 ３１．脱保護溶液がピペリジン／ＤＭＦであることを特徴とする請求項２６に 記載の方法。 ３２．カップリング溶液がＤＩＣ／ＨＯＢｔの溶液であることを特徴とする請 求項２６に記載の方法。 ３３．ユーザに対話式にプロンプトを表示してパラメータ変数を入力するよう に指示し、それによって複数のペプチドの合成に必要なデータベースを形成する ステップをさらに含み、前記データベースが複数のペプチドの各々に特有なアミ ノ酸序列を含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。 ３４．合成されるペプチドのリストにペプチド序列を加えるかあるいはペプチ ド序列を削除するステップとを含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。 ３５．繰り返される合成ステップの合成サイクルによって形成される有機化合 物の複数種の固相自動合成のための方法において、 ａ）合成されるべき所望の種に関連した序列特有タイミングプロトコルを決定 するステップであって、前記序列特有タイミングプロトコルが所望の種に対する 合成ステップが一時的に生じる場合を含むものと、 ｂ）現在合成中の種の累積既存タイミングプロトコルを決定するステップであ って、前記累積既存タイミングプロトコルが、現在合成中の種に対する各合成ス テップが一時的に生じる場合を含むものと、 ｃ）前記序列特有タイミングプロトコルと前記累積既存タイミングプロトコル との間のタイミング衝突が存在するかどうかを決定するステップであって、タイ ミング衝突が、合成される所望の種に対する１つの合成ステップが現在合成中の 種の合成ステップと同時に実行できない場合に生じるものと、 からなることを特徴とする方法。 ３６．前記タイミング衝突を解決するように合成される所望の種の合成開始を 時間シフトするステップをさらに含んでいることを特徴とする請求項３５に記載 の方法。 ３７．タイミング衝突が、合成される所望の種の能動合成ステップが現在合成 中の種に対する任意の合成ステップと時間的に一致する場合に生じることを特徴 とする請求項３５に記載の方法。 ３８．前記有機化合物がペプチドを含んでいることを特徴とする請求項３５に 記載の方法。 ３９．前記有機化合物の合成に必要なパラメータ変数を入力するステップをさ らに含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。