JPH10513260A - 前臨床的に糖尿病を診断する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、前臨床的なインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）を診断する方法に関する。該方法は、前臨床的ＩＤＤＭに対して診断される患者のＴ細胞を胎児抗原１（ＦＡ１）と接触し、ＦＡ１のＴ細胞応答を検出することを具備する。このような応答は。患者の前臨床的ＩＤＤＭの指針となる。

Description

【発明の詳細な説明】 前臨床的に糖尿病を診断する方法 発明の分野 本発明は、特徴的な小島細胞抗原に対するＴ細胞の応答、又は血清中の特徴的 な小島細胞抗原に対する自己抗体の存在を決定することによるインスリン依存性 真性糖尿病の前臨床段階の診断方法、該方法に使用するためのキット、並びに治 療における小島細胞抗原の使用、及び前記使用のための薬学的組成物に関する。 本発明の背景 インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、インスリンを産生する膵島β− 細胞が徐々に破壊されることを特徴とする自己免疫疾患である。糖尿病の臨床症 状は、このプロセスの真の末期段階で起こり、この時点で、β−細胞の約９０％ が破壊されている。しかし、最近、ＩＤＤＭに付随するβ−細胞に対する多くの 循環自己抗体が、疾患の臨床的な開始の前に血清中に存在することが見出されて いる。このような循環自己抗体には、６４ｋＤの小島β−細胞自己抗原に対する ｋＤの自己抗体は、新たに診断されたＩＤＤＭの患者の８０％以上の血清に存在 することが見出されており、更に疾患の臨床症状が開始する前の数年までの血清 Ｍ.Ｒ.Ａtkinson et al.,Ｌancet 335,1990,pp.1357-1360;Ｅ.Ｓigurdsson 及び Ｓ. の自己抗体の早期検出は、ＩＤＤＭの進行の研究、並びに予防的な治療を案出す るのに大きな価値を有する。 ６４ｋの自己抗原が、酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）として なければ、これは中枢神経系のガンマ−アミノ酪酸の生分解に関係していること が知られている。ＩＤＤＭの前臨床診断のためのＧＡＤの使用は、ＷＯ９２／０ ４６３２及びＷＯ９２／０５４４６に示唆されている。 最近診断されたＩＤＤＭ患者の血液から単離されたＴ細胞クローンによって認 識される３８ｋＤのβ−細胞抗原は、ＷＯ９１／１７１８６に開示されている。 ＩＤＤＭの診断又は治療に該抗原を使用することが示唆されている。 本発明の概要 驚くことに、羊膜液から独自に単離され、胎児抗原１として知られる抗原が、 新たに診断されたＩＤＤＭ患者から得たＴ細胞によって認識されることが見出さ れた。該抗原が、慢性（long-established）ＩＤＤＭの患者のＴ細胞又は健康な 対象のＴ細胞とは反応しないことが実験で確立された。ＷＯ９１／１７１８６に 開示されたＧＡＤ又は３８ｋＤのβ−細胞抗原に対するＴ細胞の応答の検出は、 健康な患者にもに見出すことができ、ＩＤＤＭが進行している全ての個体には見 出されない。 従って、本発明は、前臨床的なインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）を診 断する方法であって、該方法が、胎児抗原１（ＦＡ１）を患者のＴ細胞と接触さ せ、前臨床的ＩＤＤＭを診断すること、及びＦＡ１に応答する（このような応答 は、患者の前臨床的ＩＤＤＭの指針となる。）何れかのＴ細胞を検出することを 具備する方法に関する。 該方法は、患者のＩＤＤＭの前臨床段階の進行を診断及び／又はモニターする のに有用であり、従ってＩＤＤＭの予防又は改善的な治療を開始するための有用 な機会を提供する。 ＦＡ１は、ヒト羊膜液から独自に単離された（Ｔ.Ｎ.Ｆay et al.,Ｅur.Ｊ.Ｏ bstet.Ｇvnecol.Ｂiol .29,1988,pp.73-85参照）。胎児膵臓組織及び成人膵臓組 織の小島β−細胞でのＦＡ１の存在は、Ｄ.Ｔromehave et al.,Ａnat.embrvol. 187 ,1993,pp．335-341に報告されている。ＦＡ１は、分子量３２〜３８ｋＤを有 する単鎖糖タンパク質として特徴づけられる。該タンパク質のアミノ酸組成及び ３７Ｎ−末端アミノ酸は、Ｃ.Ｈ.Ｊensen et al.,Ｈuman Ｒeproduction 8,1993 ,pp.635-641で明らかにされている。更に、該タンパク質は、β−細胞顆粒に位 置することで特徴づけられ、これが示されている。更に、完全なアミノ酸配列は 、Ｃ.Ｈ.Ｊensen et al.,Ｅur.Ｊ.Ｂiochem. 225,1994,pp.83-92に示されている。ヒトＦＡ１は、 副腎から単離された、翻訳されたヒトdlk ｍＲＮＡに９９％の同一性が見出され ている（Ｌaborda et al.,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem. 268,1993,pp.3817-3820;ＧenＢank/ ＥＭＢＬアクセス番号Ｚ12171参照）。従って、該タンパク質は、ヒトdlk ｍＲ ＮＡの翻訳後に修飾された遺伝子産物であることが仮定されている。 他の側面では、本発明は、胎児抗原１に対する自己抗原（ＦＡ１自己抗原）の 存在を決定する方法であって、該方法が、血清サンプルをＦＡ１自己抗体に結合 できる、ＦＡ１又はこれらのフラグメントと接触すること、及びＦＡ１に対する 自己抗体の何れかの結合を検出することを具備する方法に関する。 更なる側面では、本発明は、血清中のＦＡ１自己抗体の存在を決定するための 試験キットであって、別々の容器に、 （ａ）固体支持体に固定された胎児抗原１、及び （ｂ）ＦＡ１自己抗体に結合できる標識された試薬 を具備するものに関する。 この他には、本発明は、血清中のＦＡ１自己抗体の存在を決定するための試験 キットであって、別々の容器に、 （ａ）固体支持体に固定された胎児抗原１、及び （ｂ）ＦＡ１に結合するためのＦＡ１自己抗体と競争しうる標識された抗体を具 備するものに関する。 本発明の詳細な説明 ＦＡ１は、胎児膵臓、肝臓及び副腎、並びに成人の膵臓β−細胞及び副腎皮質 に存在することが見出されている。これらの組織から得たＦＡ１は、これらの起 源にかかわらず本発明の方法で使用しうる十分な相同性を有することが仮定され る。しかし、ＩＤＤＭ、又は患者の血清中のこれらの前臨床段階を診断する目的 に対しては、膵臓のＦＡ１を使用することが好ましい。同様に、畜牛、ブタ、ラ ット、マウス、イヌ又はネコのような異なった動物起源から誘導されるＦＡ１が 本発明の方法に使用しうることが考慮される。しかし、典型的には、ヒト患者の ＩＤＤＭを診断する目的では、ヒト起源から誘導されるＦＡ１を使用することが 好ましい 本発明の目的に使用されるＦＡ１は、異なった形態、例えばプレプロペプチド 、プロペプチド、これらの種々の加工された形態、成熟したＦＡ１又はこれらの 種々のグリコシル化された形態でありうる（例えば、Ｃ.Ｈ.Ｊensen et al.,Ｅu r.Ｊ.Ｂiochem. 225 ,1994,pp.83-92に開示されたようなもの、特に図２を参照。 ）。ＦＡ１の対立性変異体、即ち、突然変異した遺伝子によりコードされる変性 したＦＡ１タンパク質であるが、実質的にＣ.Ｈ.Ｊemsenらの上記文献で開示さ れたＦＡ１と同じ活性を有するものも本発明の範囲に含まれる。更に、前糖尿病 患者のＴ細胞又は前糖尿病患者のＦＡ１自己抗体と反応しうるＦＡ１フラグメン トは。本発明の範囲に含まれることになる。 加えて、ＦＡ１の相同体は、これらが前糖尿病患者のＴ細胞又は前糖尿病患者 のＦＡ１自己抗体と反応することができる限り使用されうる。本明細書において 、ＦＡ１の相同体とは、ＦＡ１のアミノ酸配列と少なくとも６０の程度の同一性 を示すアミノ酸配列を具備するタンパク質として定義される。同一性の程度は従 来の方法によって決定されうる。例えば、Ａltshul et al.,Ｂull.Ｍath.Ｂiol. 48 :603-616,1986及びＨenikoff,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 89:10915-109 19,1992を参照。手短に説明すれば、２つのアミノ酸配列を、Ｈenikoff及びＨen ikoff上記文献の、１０のギャップオープニングペナルティー（gap opning pena lty）、１のギャップエクステンションペナルティー(gap extension penalty)、 及び「ブローサム（blosum）６２」スコアーリングマトリクッスを用いて配列ス コアーを最適化するように配列する。 この他には、ＦＡ１相同体は、約２×ＳＳＣ及び約５０℃のハイブリダイゼー ション温度を用いる条件下で、ＦＡ１をコードするヌクレオチド配列を基に調製 されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によ ってコードされるものでありうる。 ＦＡ１相同体は、１以上のアミノ酸が置換、欠失又は添加されうる。これらの 変化は、好ましくは、タンパク質の保持又は活性に有意に影響しない保存性のア ミノ酸の置換、小さな欠失、アミノ末端メチオニン残基のようなアミノ−若しく はカルボキシル−末端の伸張を含めた副次的な性質に関するものである。保存性 の置換の例は、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン）、 酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例 えば、グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イ ソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプト ファン、チロシン）、及び小アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリン、 スレオニン、メチオニン）のグループの範囲内にある。 このような置換は、生じたＦＡ１相同体の活性に悪影響を与えることなく、分 子の機能に決定的な領域の外側で行いうることは、当業者には明かである。本発 明のペプチドの活性に必須のアミノ酸、従って、好ましくは置換を受けないアミ ノ酸は、部位を特定した変異誘発、又はアラニン走査変異誘発のような当分野で 公知の手順に従って同定される（Ｃunningham及びＷells, Ｓcience 244，1081-1 085,1989）。後者の技術では、突然変異が分子のあらゆる残基で誘導され、得ら れた突然変異体分子がＦＡ１活性に対して試験され、分子の活性に決定的なアミ ノ酸残基が同定される。 ＦＡ１相同体は、注目の種又は組織の細胞のゲノム又はｃＤＮＡライブラリー を調製し、例えばＳambrook et.al.,Ｍolecular Ｃloning:Ａ Ｌaboratory Ｍan ual ,2nd.Ｅd.Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory,Ｃold Ｓpring Ｈarbor,Ｎew Ｙork,1989に開示された標準的な技術に従って合成オリゴヌクレオチドを用い て、又は、例えばＰＣＲ Ｐrotocols,1990,Ａcademic Ｐress,Ｓan-Ｄiego,Ｃal ifornia,ＵＳＡに開示された特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）により、相同体の全部又は一部をコードするＤＮＡ配列に対してスク リーニングすることによって単離されうる。 本発明の方法に使用されるＦＡ１は、これを含有する組織から抽出によって製 造されうるが、本質的に公知の方法で組換えＤＮＡ技術によりこれを製造するこ とが好ましい。適切にＦＡ１をコードするＤＮＡ配列は、ゲノム又はｃＤＮＡラ イブラリーを調製し、標準的な技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを 用いたハイブリダイゼーションにより、ＦＡ１の全部又は一部をコードするＤＮ Ａ配列に対してスクリーニングして得られる（Ｓambrook et al.,上記文献参照 。）。該プローブは、適切には、ＦＡ１の確立されたアミノ酸配列を基にして調 製され うる。本発明の目的では、ＦＡ１をコードするＤＮＡ配列は、ヒト起源、即ちヒ トゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから誘導されるものが好ましい。 ＦＡ１をコードする配列はまた、確立された標準的方法、例えばＢeaucage及 びＣarthers,Ｔetrahedron Ｌetters 22,(1981),1859-1869に開示されたホスホ アミダイト法、又はＭatthes et al.,ＥＭＢＯ Ｊournal 3(1984),801-801に開 示された方法によって合成により調製されうる。ホスホアミダイト法に従えば、 オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、アニー ル化され、結紮され、適切なベクターでクローニングされる。 ＦＡ１をコードするＤＮＡ配列はまた、米国特許第４，６８３，２０２、Ｓai ki et al.,Ｓclence 239(1988),487-491、又はＰＣＲ Ｐrotocols,1990,Ａcadem ic Ｐress,Ｓan-Ｄiego,Ｃalifornia,ＵＳＡに開示されているような特別なプラ イマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により調製される。適切なプライマーは、 例えばＬaborda et al.、上記文献により開示された、確立されたdlk ｍＲＮＡ 配列を基に調製されうる。 ＦＡ１をコードするＤＮＡ配列は、組換えベクター上で宿主細胞に導入される 。この組換えベクターは、都合よくは、組換えＤＮＡ手順を受けうる何れかのベ クターである。ベクターの選択は、これを導入しうる宿主細胞にしばしば依存す る。従って、ベクターは、自主的に複製するベクター（その複製は、染色体の複 製に独立である。）、即ち染色体外の実在物として存在するベクター、例えばプ ラスミドでありうる。この他には、ベクターは宿主細胞に導入された場合に、宿 主細胞ゲノムに同化し、これが同化された染色体とともに複製されるものであり うる。 ベクターは、好ましくは、発現ベクターであって、ＦＡ１をコードするＤＮＡ 配列がＤＮＡの転写に要求される追加のセグメントに外科的に結合されるもので ある。一般に、発現ベクターは、プラスミド又はウイルス性ＤＮＡから誘導され るか、又は両方の要素を含有しうる。「外科的に結合される」とは、該セグメン トが、これらの意図した目的、例えば転写がプロモーターで開始され、ＦＡ１を コードするＤＮＡ配列を介して進行するというようなものと協調して機能するよ うに配列されることを指す。 プロモーターは、選択された宿主細胞で転写活性を示す何れかのＤＮＡ配列で あり、宿主細胞に対して相同的性又は異種性のタンパク質をコードする遺伝子か ら誘導されうる。 本発明のＤＮＡ構築物又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明の ポリペプチドを産生しうる何れかの細胞であり得、これにはバクテリア、酵母、 真菌、及び高級な真核細胞が含まれる。しかし、ＦＡ１の正確なグリコシル化を 提供するには、宿主細胞は哺乳動物細胞であることが好ましい。 適切な哺乳動物細胞系の例は、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ 1650）、Ｂ ＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ 1632; ＡＴＣＣ ＣＣＬ 10）、ＣＨＬ（例えば 、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 39）又はＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 61）細胞系であ る。哺乳動物細胞をトランスフェクションし、細胞内に導入されたＤＮＡ配列を 発現する方法は、例えばＫaufman及びＳharp,Ｊ.Ｍol.Ｂiol.159(1982),601-621 ;Ｓouthern及びＢerg,Ｊ.Ｍol.Ａppl.Ｇenet.1(1982),327-341;Ｌoyter et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 79(1982),422-426;Ｗigler et al.,Ｃell 14(1 978),725;Ｃorsaro及びＰearson,Ｓomatic Ｃell Ｇenetics 7(1981),603,Ｇrah am及びvan der Ｅb,Ｖirology 52(1973),456;及びＮeumann et al.,ＥＭＢＯ Ｊ . 1 (1982),841-845に開示されている。 哺乳動物細胞内の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を指示する ための適切なプロモーターの例は、ＳＶ40プロモーター（Ｓubramani et al.,Ｍ ol.Ｃell Ｂiol.1(1981),854-864）、ＭＴ-1（メタロチオネイン遺伝子）プロモ ーター（Ｐalmiter et al.,Ｓcience 222(1983),809-814）又はアデノウイルス ２主要後期プロモーターである。 必要であれば、ＦＡ１をコードするＤＮＡ配列はまた、ヒト成長ホルモンター ミネータのような適切なターミネータに外科的に結合されうる（Ｐlamiter et a l.,前掲引用文献中）。ベクターは、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ40又 はアデノウイルス５Ｅlb領域）、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ40エンハン サー）及び翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルスＶＡＲＮＡsをコード するもの）のような要素を更に含有する。 次に、トランスフェクションされた宿主細胞を、適切な栄養培地中において、 ＦＡ１が発現し、引き続いて培養物からＦＡ１を回収することを可能にする条件 下で培養しうる。細胞を培養するのに使用される培地は、適切な補助剤を含有す る最小の培地又は複合培地のような宿主細胞を成長させるのに適した何れかの従 来の培地である。適切な培地は、商業的供給者から利用可能であるか、又は発表 されている処方に従って調製されうる（例えば、アメリカンタイプカルチャーコ レクション（Ａmerican Ｔype Ｃalture Ｃollection）のカタログ）。 次に、細胞によって産生されるＦＡ１は、遠心又は濾過によって培地から宿主 細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムによって上清又は濾液の蛋白質成分 を沈殿させ、種々のクロマトグラフ法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精 製することを含む従来の手順で培養培地から回収されうる。 本発明に従った方法では、ＦＡ１に対するＴ細胞応答が、例えば抗原としてＦ Ａ１を使用して、Ｂ.Ｏ.Ｒoep et al.,「β―細胞の破壊を伴うβ−細胞膜抗原 に対するＴ細胞の反応性（Ｔ cell reactivity toβ-cell membrane antigen as sociated with β-cell destruction）」、Ｄiabetes,印刷中、に開示されたリ ンパ球刺激アッセイで、Ｔ細胞の増殖を測定することによって決定されうる。従 って、患者の血液から単離されたＴ細胞を数日間、例えば５日間ＦＡ１の存在下 で培養し、この後、³Ｈ−チミジンのような放射性マーカーを加え、Ｔ細胞によ る該マーカーの取り込みをシンチレーションカウンティングで測定する。 この態様では、都合よくは、ＦＡ１を、前臨床的ＩＤＤＭに対して診断される 患者から採取されたサンプルのＴ細胞と反応する。サンプルは、適切には、血液 （血清）又は膵臓若しくはリンパ節サンプルのような組織サンプルでありうる。 この他には、Ｔ細胞は、例えばＷＯ９１／１７１８６に開示されたような患者の 血液又は組織から単離されたＴ細胞クローンでありうる。 ＦＡ−１と反応する全長又は部分的なＴ細胞受容体に対応するペプチド配列は 、抗体（これは、次に、ＦＡ−１を認識するＴ細胞応答をブロックするのに使用 され、これによってＦＡ−１に対するＴ細胞の免疫応答をブロックする。）を産 生する抗原として使用されうる。この他としては、ＦＡ−１のＴ−細胞受容体ペ プチド配列に向けられたこのような抗体は、これ自身、診断薬として、ＦＡ−１ と反応するＴ細胞が与えられた個体に存在するかどうかを、例えばＴ細胞／リン パ 球での、イムノヒストケミストリー、ＦＡＣＳ分析、イムノプレシピテーション 分析、ウエスタンブロッティング分析、又はＥＬＩＳＡ分析により決定するのに 使用されうる。与えられたＴ細胞受容体を認識するＦＡ１をコードするＤＮＡ配 列のフラグメントに対応するプライマーを用いて、リンパ球から単離された（ｃ ）ＤＮＡのＰＣＲ分析も、ＦＡ−１と反応するＴ細胞が与えられた個体に存在す るかどうかを決定するのに使用されうる。 ＦＡ１に応答するＴ細胞はまた、細胞毒性アッセイで測定されうる。該アッセ イでは、ＦＡ１を発現する標的細胞（この発現は生来であるが、又はこれらがＦ Ａ１をコードするＤＮＡ配列でトランスフェクションされることによる。）は、 細胞に取り込まれた放射性同位元素、例えば⁵¹Ｃｒ、又は蛍光標識で標識される 。次に、エフェクター細胞（Ｔ細胞）を標的細胞とインキュベートする。標的細 胞がこのような接触で死亡するならば、放射性同位体又は蛍光標識が細胞から放 出され、インキュベーション培地で検出されうる。サイトカインプロフィールを 、Ｔ細胞活性、例えばガンマインターフェロン、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ− １２及びＩＬ−４を決定するためにＴ細胞アッセイで測定しうる（例えば、Ｒom agnani et al.,Ｉmmunol.Ｔoday 13,1992,pp.379-81に開示されたもの）。Ｔ細 胞反応性は、光学顕微鏡を用いても特徴づけられるうる。 本方法の特別な態様では、ＦＡ１は患者に皮下的に投与され、投与部位での何 れかの皮膚反応を引き続いて検出する。このような皮膚反応はＦＡ１に対するＴ 細胞の応答の指針となる。 pp.7757-7761に開示されているように、投与された部位での皮膚の局在化した赤 色化又は腫れとして視認しうる。この目的では、ＦＡ１と共に適切な希釈剤又は 担体を含有する組成物が調製される。このような組成物は、都合よくは、等張食 塩水のような適切な希釈剤に溶解又は懸濁されたＦＡ１を含有する注射可能な調 剤の形態でありうる。試験に使用するためには、この製剤は患者の皮膚下に直接 注射されうる。 血清中にＦＡ１自己抗体が存在することを決定する本発明に従った方法では、 都合よくは、血清サンプルを固体支持体に固定されたＦＡ１と接触しうる。この 後、固体支持体をＦＡ１に結合した何れかの自己固体に結合しうる標識された試 薬と接触する。固体支持体に結合された何れかの標識を検出することで、サンプ ル内のＦＡ１自己抗体の存在が示される。 ＦＡ１は、物理的吸着、又は共有結合により又はプロテインＡ、ポリリジン又 は固体支持体に対する抗体（ＦＡ１自己抗体の結合に関与しないＦＡ１のエピト ープと反応することが好ましい。）のような架橋分子を介して固体支持体に直接 固定化されうる。本発明の方法及び試験キットに使用される固体支持体は、好ま しくはポリマーを包含する。該ポリマーは、プラスチック（例えば、ラテックス 、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビ ニルアルコール、ナイロン、ポリ酢酸ビニル、及びこれらの何れかの適切なコポ リマー）、セルロース（例えば、ニトロセルロース紙等のような種々のタイプの 紙）、ケイ素ポリマー（例えば、シロキサン）、多糖（例えば、アガロース又は デキストラン）、又はイオン交換樹脂（例えば、従来のアニオン又はカチオン交 換樹脂）よりなる群から選択されうる。 固体支持体の物理的形状は重要ではないが、幾つかの形状が本発明の目的に対 しては他のものよりも都合がよい。。従って、固体支持体はプレート、例えばマ イクロタイタープレート又は細長い紙片、ディップスティック（dipstick）、膜 （例えば、ナイロン膜又はセルロースフィルター）、又は固体粒子（例えば、ラ テックスビーズ）の形状でありうる。 本発明の方法及び試験キットで使用される標識された試薬は、抗−イディオタ イプ抗体（即ち、ＦＡ１自己抗体のエピトープ結合部位に向けられた抗体）を含 むＦＡ１自己抗体と反応する抗体（例えば、抗−ヒト抗体）でありうる。標識さ れた試薬は、ＦＡ１自己抗体又はＦＡ１自己抗体に結合することができるこれら のフラグメントに応答するＴ細胞でもありうる。 ＦＡ１自己抗体への結合に使用される試薬に対する標識物質は、酵素、着色又 は蛍光物質、及び放射性同位体よりなる群から選択させることが好ましい。 標識物質として有用な酵素の例には、ペルオキシダーゼ（例えばセイヨウワサ ビペルオキシダーゼ）、ホスファターゼ（例えば酸又はアルカリ性ホスファター ゼ）、β−ガラクトシダーゼ、ウラーゼ、フルコースオキシダーゼ、リソザイム 、 マレート（malate）デヒドロゲナーセ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロ ゲナーゼ、β−グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ピルベートデヒドロゲナーゼ、 エステラーゼ、ルシフェラーゼ等である。 酵素はそれ自身検出し得ないが、基質と結合し、検出可能な最終産物の反応を 触媒する必要がある。従って、支持体と標識された試薬を接触し、着色又は蛍光 物質を形成させた後に基質を添加することができる。本発明に従って使用されう る基質の例には、過酸化水素／テトラメチルベンジジン又はクロロナフトール又 はｏ−フェニレンジアミン又は３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸又 はルミノール、インドキシルホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、 ニトロフェニルガラクトース、４−メチル ウンベリフェリル−Ｄ−ガラクトピ ラノシド、又はルシフェリンが含まれる。 この他には、標識物質は、金粒子、着色又は蛍光ラテックス粒子、色素粒子、 フルオレセイン、フィコエリスリン、又はフィコシアニンを含めた着色又は蛍光 物質を包含しうる。 本発明の目的に使用されうる放射性同位体は、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｈ− ３、Ｐ−３２，Ｐ−３３、及びＣ−１４から選択されうる。 他の態様では、血清サンプルを固体支持体に固定化されたＦＡ１と接触させ、 同時にＦＡ１への結合に対して自己抗体と競争する予め決められた量の標識され た抗体を固定化されたＦＡ１と接触することができる。添加された標識抗体の量 に対して固体支持体に結合された標識抗体の量の何れかの減少を検出することで 、サンプル内のＦＡ１自己抗体の存在が示される。 この場合、標識された抗体は、適切には、ＦＡ１に結合するフＦＡ１のエピト ープと反応するものである。従って、抗体は、このエピトープを含有するペプチ ドフラグメントに対して生じるものでありうる。 この態様では、固体支持体及び標識物質は先に説明したとおりである。 ＦＡ１のフラグメントに対して生じた抗体は、都合よくは、標識された試薬、 標識された抗体又はＦＡ１が実質的に結合する固体支持体に固定化された抗体と して本発明の方法及び試験キットに使用されうる。本明細書中で、「抗体」の語 は、抗原にさらされることによる応答として、ヒト又は動物体内で、又はヒト又 は動物細胞によって形成される何れかの物質を示すのに使用される。抗体は、ポ リクローナル又はモノクローナル抗体でありうるか、又は組換えＤＮＡ技術で製 造されるものでありうる。この語はまた、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、又はＦｖ フラグメントのような抗体フラグメント、並びにシングルドメイン抗体を包含す る。 モノクローナル抗体は、十分に確立された方法、例えばＡ．Ｊohnstone及びＲ .Ｔhorpe，Ｉmmunochemistry in Ｐractice，2nd．Ｅd.，Blackwell Ｓcientifi c Ｐublications,1987,pp.35-43に開示されているような方法で得ることができ る。組換えＤＮＡ技術によって調製する場合、抗体は、適切な細胞、例えば微生 物、植物、動物又はヒト細胞に該抗体をコードするＤＮＡ配列又はそのフラグメ ントをクローニングし、注目の抗体又はフラグメントの産生を行える条件下で細 胞を培養し、培養物から抗体又はこれらのフラグメントを回収することによって 産生されうる。クローニングされた抗体を調製するための可能な戦略は、例えば ラット可変領域とヒト定常領域のキメラ抗体の調製を開示するＬ.Ｒiechmann et al.,Ｎature 332,３月２４日１９８８年、p.323 ff;キメラマウスーヒトＦａｂ フラグメントへの調製を開示するＭ.Ｂetter et al.,Ｓcience 240、５月２０日 １９８８年p.1041 ff;抗体に結合する可変ドメインを含有する免疫グロブリンＦ ｖフラグメン 日、１９８８年、p.1038-1040；及び単離された抗原に結合する可変ドメインの クローニング（「シングルドメイン抗体」）を開示するＥ.Ｓ.Ｗard et al.,Ｎa ture 341、１０月１２日、１９８９年、pp.544-546に開示されている。 抗体を生じさせるペプチドフラグメントは、Ｄ.Ａtar et al.,Ｊ.Ｉmmunol.14 3 ,1989,pp.533-538に開示されたような、アップライドバイオシステム（Ａpplie d Ｂiosystems）から入手可能な装置を用いて、従来のペプチド合成で製造され うる。 特に、固体支持体に固定化された標識試薬又は抗体として使用するためには、 抗体はＦＡ１のエピトープに対して生じるもであって、サンプルに存在する何れ かのＦＡ１自己抗体の結合を妨害しないように、又はアッセイでＦＡ１に結合さ れた何れかのＦＡ１自己抗体に対する標識された試薬の最適な結合を保証するた めに自己抗体との結合に関与しないものであることが有利である。 一方、抗体が、固定化されたＦＡ１への結合に対してサンプル内の何れかの抗 体と競争する標識された抗体として使用されることを意図する場合、該抗体は、 ＦＡ１自己抗体を結合するＦＡ１のエピトープに対して生じるものであることが 好ましい。 診断方法の特別な態様 一態様において、本発明の試験キットは、別々の容器に、 （ａ）固体支持体に固体かされた胎児抗原１（ＦＡＩ）及び （ｂ）ＦＡ１抗体に結合しうる標識された試薬 を具備する。 この場合、ＦＡ１は先に説明したように、固体支持体に固定化された抗体に結 合されうる。標識された試薬は、好ましくは抗体である。 他の態様では、本発明の試験キットは、別々の容器に、 （ａ）自己抗体の結合に関与しないＦＡ１のエピトープと反応する抗体（この抗 体は固体支持体に固定化される。）、 （ｂ）ＦＡ１、及び （ｃ）自己抗体に結合しうる標識された試薬 を具備する。 更なる態様では、本発明の試験キットは、別々の容器に、 （ａ）固体支持体に固定化された胎児抗原１（ＦＡ１）、及び （ｂ）ＦＡ１への結合に対してＦＡ１自己抗体と競争しうる標識された抗体 を具備する。 標識された抗体は、ＦＡ１のペプチドフラグメントに対して生じるものであり うる。 ＦＡ１は上記のように、固体支持体に固定化された抗体に結合されうる。 更なる態様では、本発明の試験キットは、別々の容器に、 （ａ）ＦＡ１のエピトープと反応する抗体であって、エピトープがＦＡ１自己抗 体の結合に関与せず、抗体が固体支持体に固定化されているもの、 （ｂ）ＦＡ１、及び （ｃ）ＦＡ１への結合に対して自己抗体と競争しうる標識された抗体、 を具備する。 現在、ＦＡ１は治療に使用されうることが考慮されている。従って、ＩＤＤＭ の進行を防止する方法への使用の可能性が考えられる。この方法では、ＦＡ１又 は、このフラグメントをＩＤＤＭの臨床症状を示していない個体に、ＦＡ１に対 する免疫学的耐性を誘導するのに十分な量で投与される。ＦＡ１の投与が、前臨 床的ＩＤＤＭの治療、又は早期に臨床的ＩＤＤＭを改善するために使用されうる ことも可能である。 提案されたＦＡ１の治療への使用は、他の抗体を用いたＩＤＤＭの免疫療法を 提供するのと同様の仮定に基づいている。ＩＤＤＭの動物モデルで、グルタミン 酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ₆₅，より小さなアイソ型）を用いた免疫療法は、 幾つかのグループで例示されている（Ｋaufma et al., Ｎature 366,1993,pp.69- 72,Ｔisch et al.,Ｎature 366,1993,pp 72-75,Ｐetersen et al.,Ｄiabetes 43 1994,pp.1478-84及びＥlliott et al.,Ｄiabetes 43,1994,pp.1494-99）。３週 齢の肥満していない糖尿病（ＮＯＤ）マウスに組換えＧＡＤ₆₅を静脈内注射する ことによって、Ｋaufmanet al.は、ＩＤＤＭ並びに小島自己免疫の進行、即ち小 島への単核細胞の浸潤（インスリン炎）を完全に防止した。３週齢の肥満してい ない糖尿病（ＮＯＤ）マウスの胸腺に組換えＧＡＤ₆₅を注射することによって、 Ｔisch et al.は、ＩＤＤＭ並びに小島自己免疫の進行、即ち小島への単核細胞 の浸潤（インスリン炎）を完全に防止し／遅らせたた。新生児（２４時間）の肥 満していない糖尿病（ＮＯＤ）マウスに、腹腔内でラット脳から親和性精製した ＧＡＤ₆₅を注射することによって、Ｐetersen et al.は、ＩＤＤＭ並びに小島自 己免疫の進行、即ち小島への単核細胞の浸潤（インスリン炎）を完全に防止し／ 遅らせた。ＮＯＤマウスをＧＡＤ６７（より大きなアイソ型）で一回免役するこ とによって、Ｅlliott et al.は、臨床的糖尿病の開始を完全に防止した。 更に、ＩＤＤＭの動物モデル（Ｇotfredsen et al.,Ｄiabetologia 28，1985, pp.933935及びＡckinson et al.,Ｄiabetes 39,1990,pp.933-37）並びに疾患の 高いリスクを負ったヒト（Ｋeller et al.,Ｌencet 341,1993,pp.927-28）での インスリン治療も糖尿病の開始を遅らせ／防止することを示している。Ｋeller et al.は、 皮下での低投与量のインスリンが、疾患の進行の高いリスクを負っている個体で 、臨床的ＩＤＤＭの開始を遅らせ／防止することを示した。同様に、ＢＢ−ラッ ト（Ｇotfredsen et al．）及びＮＯＤマウス（Ａckinson et al.）の両方で、 予防的なインスリン治療が臨床的糖尿病の開始を防止し／遅らせることを示した 。Ｈ.Ｚhang et al.(Ｐroc Ｎatl Ａcad. 88,pp.10252-56)も、ＮＯＤマウスで の経口インスリン治療がＩＤＤＭ並びにインスリン炎の開始を遅らせ／防止した ことを示した。 これらのデータに基づいて、アジュバントを用いて又は用いずに注射によって 又は経口で投与されたＦＡ１が疾患の進行のリスクを負っている個体、又は自己 免疫β−細胞の破壊を阻害／防止するために近くＩＤＤＭになる患者でＩＤＤＭ の免疫療法に使用されうることが示唆されている。 患者に投与されるＦＡ１の投与量は、治療される症状のタイプ及び重篤度、並 びに、投与の形態（例えば経口又は静脈内）で変化するであろうが、一般に、約 １年間１日あたり１００から１０００mgの範囲（経口投与に対して）である。 最後に、本発明は、前臨床的ＩＤＤＭを予防又は治療するため、又は初期の臨 床的ＩＤＤＭを改善するための組成物であって、該組成物が、胎児抗原１と共に 薬学的に許容しうる希釈剤又は担体を含有するものを提供する。 本発明の薬学的組成物では、ＦＡ１は、例えばＲemington's Ｐharmaceutical Ｓciences,1985に開示されたような薬学的組成物を処方する何れかの確立され た方法によって処方されうる。組成物は、系統的な注射又は注入に適した形態で あり得、そのまま無菌水又は等張食塩水又はグルコース溶液で処方されうる。組 成物は、当分野で周知の従来の無菌化技術で無菌化されうる。得られた水溶液は 、使用するためにパッケージングされるが、又は無菌条件下で濾過され、凍結乾 燥されうる。凍結乾燥された製剤は、投与の前に無菌の水溶液と混合される。組 成物は、生理学的条件に近づけることが要求される場合に、緩衝剤、張度調節剤 等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、 塩化カルシウム等のような薬学的に許容しうる補助物質を含有しうる。 本発明の薬学的組成物は、経口、鼻孔、経皮、又は直腸投与にも適する。本組 成物に使用される薬学的に許容しうる担体又は希釈剤は従来の何れかの固体担体 でありうる。固体担体の例は、ラクトース、白土、蔗糖、タルク、ゼラチン、寒 天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸である 。同様に、担体又は希釈剤には、当分野で公知の放出を持続させる何れかの材料 、例えば単独又はワックスと混合したモノステアリン酸グリセリル又はジステア リン酸グリセリルが包含される、経口投与に対して、組成物は錠剤化されるか、 粉末又はペレットの形態で硬質ゼラチンカプセルに詰めるか、又はこれはトロー チ又はロゼンジの形態でありうる。固体担体の量は、広範囲に変化するであろう が、通常は約２５mgから約１ｇであろう。ＦＡ１は、シロップ、ピーナッツオイ ル、オリーブオイル又は水のような液体担体で軟質ゼラチンカプセルに詰めるこ ともできる。 本発明は、以下の例によって更に例示されるが、これらは何れの形式において も、権利主張した本発明の範囲を制限することを意味するものではない。 例 ＦＡ１の放射性ヨウ素化 ２００〜３００μｌの精製されたＦＡ１（約１５０μｇ、Ｃ.Ｈ.Ｊensen et a l.,Ｈuman Ｒeprod.8,1993,.pp.635-641に開示された免疫特異的アフィニティー クロマトグラフィーで精製したもの）を２０ｎｇのヨードゲンで予めコーディン グしたガラスアンプルに移した ４μｌの¹²⁵Ｉ（特異的活性１００mＣi/ml、ア マーシャムインターナショナル（Ａmersham Ｉnternational）から入手可能）を 加え、室温で１５分攪拌しながらヨウ素化を行った。標識されたタンパク質を、 ＰＢＳ中の０．２％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０で予め平衡化し、これで操作されるＰ Ｄ１０カラム（セファーデックスＧ２５、ファルアシア（Ｐharmacia）から入手 可能）で単離し、６００μｌのフラクションを集めた。これらのフラクションを トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿で分析した。 先に得られた各フラクションの２μに、ＰＢＳ中の１mlの１０％（ｗ／ｖ）Ｔ ＣＡ及び１mlの０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えた。サンプルを氷上で１５〜３ ０分インキュベートし、１５００×ｇで１０分間遠心した。２μｌの上清を採り 、このペレットと２μｌの基のフラクションと共にガンマシンチレーション カウンターで分析した。最良のフラクションを同定し、ヨウ素化されたＦＡ１を サイズクロマトグラフィーで更に精製した。 ＦＡ１に対する自己抗体の検出 ＣＯＳ−７細胞を、先に開示した方法（Ｂ.Ｍidhelsen et al.,Ｐroc.Ｎatl. Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 88,1991,pp.8754-8758）でＦＡ１をコードするＤＮＡでトラ ンスフェクションし、２０×１０⁶のトランスフェクションされたＣＯＳ−７細 胞を含有する１０ｍlの培地中で４時間、３７℃において５mＣiの³⁵Ｓ−シスチ ンで標識した。標識した後、トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞を、氷 上で、１０mＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１mＭ ＭｇＣｌ₂及び１mＭ ＥＧＴＡ 中において１０分間膨張させ、ポリトロン（Ｐolytron）を用いて、スピード４ で２×４０秒でホモジナイズした。次に、細胞のホモジネートを３０００rpmで １０分間遠心した。トランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞から得た上清をイ ムノプレシピテーション分析に使用した。約１×１０⁶の細胞枯れた上清を、Ｉ ＤＤＭ患者又は健康な対照から得た２０μｌの血清と１６時間４℃でインキュベ ートし、免疫複合体を形成した。この免疫複合体を、プロテインＡ−セファロー ス（ＰＡＳ）（ファルマシア、スウェーデン）（１mg／１μｌ血清）に吸収させ ることによって単離した、洗浄した後、ＰＡＳペレットを、β−メルカプトエタ ノールを有する１Ｍのトリス、６０％ｖ／ｖ蔗糖、１５％ｖ／ｖＳＤＳ、０．０ １％ｗ／ｖブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８中で３分間煮沸し、遠心し、上 清を１０％ＳＤＳ−ＰＡＳＥで分析した。乾燥した後、ゲル−イムノプレシピテ ーションされたＦＡ−１を蛍光間接撮影法によりゲル上で検出した。６４％（１ ４の内の９）のまもなくＩＤＤＭになる患者がＣＯＳ−７細胞に発現されたＦＡ −１に対して抗体反応性を示した。対照的に健康な対照では、０％（５の内０） であった。 ＦＡ−１に対するＴ−細胞反応性の検出 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、近くＩＤＤＭになる患者、ＩＤＤＭが確認さ れている患者、及び健康な対照から新たに採取したヘパリン化した血液から、フ ィコール−メトラトリゾエート密度勾配遠心によって単離した。１５０．０００ ＰＢＭＣを、１０％ヒト型ＡＢ貯蔵血清、１０u/mlペニシリン、及び１０μｇ／ mlストレプトマイシン（フローラボラトリーズ、アーヴィン、スコットランド） を添加した２mＭのグルタミンを有する１５０μｌイスコーブ（Ｉscove's）の修 飾されたダルベッコの培地（ギブコ（Ｇibco）、ペーズリー、スコットランド） 中において、フィにティー精製されたヒトＦＡ−１抗原０〜２５μｌ又は破傷風 トキソイド（１．５Ｌf/ml）の存在下、又は培地単独で、５％ＣＯ₂、３７℃で ５日間、組織をコートした丸底の６９−ウェルプレートで培養した。５日後、０ ．５μＣiの³Ｈ−チミジンを含有する５０μｌＲＰＭＩ１６４０（ギブコ）をウ ェルあたりに加え、インキュベートを１６時間継続した。次に、培養物をガラス 繊維フィルター上で回収し、³Ｈ−チミジンの取込を液体シンチレーションカウ ンティングで測定した。結果を刺激指針（抗原のある場合のcpmを抗原のない場 合のcpmで割ったもの）として表した。３．０以上のＳＩ指針を生じるインキュ ベート物を陽性とみなした。７７％（１３の内の１０）の近くＩＤＤＭになる患 者が０％である対照と比較して陽性であった。（（図２）Ｐ＜１０^-4）更に、平 均で４．５年の間ＩＤＤＭである患者の５７％（４／７）が陽性であった（ポス ト−ＩＤＤＭ（post-ＩＤＤＭ）（図２））。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 コッホ・ミヒェルセン、ビルギッテ デンマーク国、デーコー−2800 リングビ ー、ニーブロベイ 252アー (72)発明者 ピーターセン、ヤコブ・ステーン デンマーク国、デーコー−2100 コペンハ ーゲン・オ、トスインゲガデ ４ (72)発明者 レープ、バルト・オー オランダ国、エヌエル−2300 アールシ ー・ライデン （番地なし）、デパートメ ント・オブ・イミューノヘマトロジー・ア ンド・ブラッド・バンク、ユニバーシティ ー・ホスピタル内 (72)発明者 テイスナー、ボルゲ デンマーク国、デーコー−5000 オデン セ・シー、ベステルガデ 93、２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 前臨床的インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）を診断する方法であ って、該方法が、胎児抗原１（ＦＡ１）を、前臨床的ＩＤＤＭに対して診断され る対象のＴ細胞と接触し、ＦＡ１に対する何れかのＴ細胞応答（このような応答 は、対象の前臨床的ＩＤＤＭの指針となる。）を検出する方法。 ２． 請求の範囲第２項に記載の方法であって、ＦＡ１が対象から採取された サンプルのＴ細胞と接触される方法。 ３． 請求の範囲第２項に記載の方法であって、該サンプルが血液又は組織サ ンプルである方法。 ４． 請求の範囲第３項に記載の方法であって、Ｔ細胞が対象の血液又は組織 から単離されるＴ細胞クローンである方法。 ５． 請求の範囲第１項に記載の方法であって、ＦＡ１が対象に皮下的に投与 され、投与の部位での何れかの皮膚反応（このような皮膚反応は、ＦＡ１に応答 するＴ細胞の指針となる。）が引き続いて検出される方法。 ６． 請求の範囲第１項から第５項の何れかに記載の方法であって、ＦＡ１が ヒトＦＡ１である方法。 ７． 前臨床的ＩＤＤＭの診断のための組成物であって、該組成物がＦＡ１と 共に、適切な希釈剤又はビヒクルを含有する組成物。 ８． 血清中の胎児抗原１に対する自己抗体（ＦＡ１自己抗体）の存在を決定 するための方法であって、該方法が、血清サンプルをＦＡ１又はＦＡ１自己抗体 を結合することができるこれらのフラグメントと接触すること、及びＦＡ１への 自己抗体の何れかの結合を検出することを具備した方法。 ９． 請求の範囲第８項に記載の方法であって、血清サンプルが、固体支持体 に固定化されたＦＡ１と接触され、この後、固体支持体が、ＦＡ１に結合された 何れかの自己抗体に結合しうる標識された試薬と接触される方法(固体支持体に 結合された何れかの標識の検出は、サンプル内のＦＡ１自己抗体の存在を示す。 )。 １０． 請求の範囲第９項に記載の方法であって、標識された試薬が抗体であ る方法。 １１． 請求の範囲第１０項に記載の方法であって、抗体が抗−イディオタイ プ抗体である方法。 １２． 請求の範囲第１１項に記載の方法であって、ＦＡ１が、固体支持体に 固定化された抗体に結合され、前記抗体がＦＡ１自己抗体の結合に関与しないＦ Ａ１のエピトープと反応するものである方法。 １３． 請求の範囲第１２項に記載の方法であって、抗体が、ＦＡ１自己抗体 の結合に関与するエピドープを含有しないＦＡ１のペプチドフラグメントに対し て生じるものである方法。 １４． 請求の範囲第８項に記載の方法であって、血清サンプルが、固体支持 体に固定化されたＦＡ１と接触され、これと同時に固定化されたＦＡ１を、ＦＡ １への結合に対してＦＡ１自己抗体と競争する、予め決められた量の標識された 抗体と接触する方法（添加された、標識された抗体の量に比較して、固体支持体 へ結合された標識された抗体の量の何れかの減少の検出は、サンプル内のＦＡ１ 自己抗体の存在の指針となる。）。 １５． 請求の範囲第１４項に記載の方法であって、標識された抗体が、ＦＡ １自己抗体の結合に関与するエピトープを含有するＦＡ１のペプチドフラグメン トに対して生じるものである方法。 １６． 請求の範囲第１４項に記載の方法であって、ＦＡ１が固体支持体に結 合された抗体（前記抗体はＦＡ１自己抗体の結合に関与しないＦＡ１エピトープ と反応する。）に結合される方法。 １７． 請求範囲第１６項に記載の方法であって、固定化された抗体が、ＦＡ １自己抗体の結合に関与するエピトープを含有しないＦＡ１のペプチドフラグメ ントに対して生じるものである方法。 １８． 請求の範囲第８項から第１７項の何れかに記載の方法であって、ＦＡ １がヒトＦＡ１である方法。 １９． 前臨床的ＩＤＤＭの診断のための請求の範囲第８項から第１８項の何 れかに記載の方法。 ２０． 血清中のＦＡ１自己抗体の存在を決定するための試験キットであって 、別々の容器に、 （ａ）固体支持体に固定化された胎児抗原１、及び （ｂ）ＦＡ１自己抗体に結合しうる標識された試薬を含有するもの。 ２１． 請求の範囲第２０項に記載の試験キットであって、標識された試薬が 抗体であるもの。 ２２． 請求の範囲第２０項に記載の試験キットであって、ＦＡ１がヒトＦＡ １であるもの。 ２３． 血清中のＦＡ１自己抗体の存在を決定するための試験キットであって 、別々の容器に、 （ａ）ＦＡ１自己抗体の結合に関与しないＦＡ１のエピトープと反応する抗体（ 該抗体は固体支持体に固定化される。）、 （ｂ）胎児抗原１、及び （ｃ）ＦＡ１自己抗体に結合することができる標識された試薬を含有するもの。 ２４． 請求の範囲第２３項に記載の試験キットであって、標識された試薬が 抗体であるもの。 ２５． 請求の範囲第２３項に記載の試験キットであって、ＦＡ１がヒトＦＡ １であるもの。 ２６． 血清中のＦＡ１自己抗体の存在を決定するための試験キットであって 、別々の容器に、 （ａ）固体支持体に固定化された胎児抗原１、及び （ｂ）ＦＡ１への結合に対してＦＡ１自己抗体と競争しうる標識された抗体を含 有するもの。 ２７． 請求の範囲第２６項に記載の試験キットであって、標識された抗体が 、ＦＡ１自己抗体の結合に関与するエピトープを含有するＦＡ１のペプチドフラ グメントに対して生じるものであるもの。 ２８． 請求の範囲第２６項に記載の試験キットであって、ＦＡ１がヒトＦＡ １であるもの。 ２９． 血清中のＦＡ１自己抗体の存在を決定するための試験キットであって 、別々の容器に、 （ａ）ＦＡ１のエピトープと反応する抗体（該抗体は、固体支持体に固定化され る。）であって、エピトープがＦＡ１自己抗体の結合に関与しないもの、 （ｂ）胎児抗原１、及び （ｃ）ＦＡ１への結合に対してＦＡ１自己抗体と競争しうる標識された抗体を含 有するもの。 ３０． 請求の範囲第２９項に記載の試験キットであって、ＦＡ１がヒトＦＡ １であるもの。 ３１． 前臨床的ＩＤＤＭの予防又は治療のため、又は初期の臨床的ＩＤＤＭ を改善するための医薬の製造のための胎児抗体１（ＦＡ１）の使用。 ３２． 請求の範囲第３１項に記載の使用であって、ＦＡ１がヒトＦＡ１であ る使用。 ３３． 前臨床的ＩＤＤＭの予防又は治療のため、又は初期の臨床的ＩＤＤＭ を改善するための薬学的組成物であって。該組成物が、胎児抗原１と共に、薬学 的に許容しうる希釈剤又は担体を含有する組成物。