JPH10513340A

JPH10513340A - 標的細胞および分子を検出するための試験キットおよび方法

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Publication number: JPH10513340A
Application number: JP8508221A
Authority: JP
Inventors: ロトマン，エム・ボリス
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-08-18
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 1998-12-22
Also published as: DE69509104D1; EP0777861B1; EP0777861A1; CA2197769A1; AU3367495A; WO1996006356A1; US5792617A; DE69509104T2

Abstract

(57)【要約】試料中の被検体の存在が、被検体結合ドメインおよび増殖性細胞の成長を促進できる成長促進ドメインの両方を有する多機能性プローブの使用により測定される。多機能性プローブを使用するキットも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】標的細胞および分子を検出するための試験キットおよび方法発明の背景蛍光免疫化学、フローサイトメトリー、酵素−結合免疫細胞化学およびイン・サイチュー（in situ）DNAおよびRNAハイブリダイゼーションの使用により説明されるように、高感度な検出システムは医学診断および生物学的研究における重要な分析手段となった。これにもかかわらず、幾つかの分野では現在利用できる検出限界を広げる、新たな経費的効果がある技法の開発に実質的な関心がもたれている。例えば初期の癌患者の中には、彼らの骨髄中に、骨のスキャン、生化学的分析および細胞学検査のような通例の手順による検査を逃れる少数の転移性腫瘍細胞を有する者もいる。通常、不顕性の微小転移と呼ばれるこれらの稀な腫瘍細胞を検出するために最も頻繁に使用されている方法は、免疫細胞化学である（ Premi,T.,およびBattifora,H.Human Pathol.18,728-734,1987、引用により本明細書に編入する）。しかし現在、免疫細胞化学は極めて時間がかかるので、通常の基本的検査に使用することができない。例えば、100万個の骨髄細胞あたり10 個未満の悪性細胞を含む検体（および適当な対照）を分析するために、組織病理学の熟練者は約４時間の顕微鏡走査が必要である。フローサイトメトリーおよびコンピューター連動造影分析のような自動化されたスクリーニング法には、莫大な資本投資が必要なばかりでなく、従来の免疫細胞化学よりも感度が低いと判明した。したがってこの特別な分野において、血液または骨髄の臨床検体中に低頻度で存在する悪性細胞を検出できる、簡単かつ経費的効果のある技法が必要であることは明らかである。このような技法は；１）癌患者の再発を早期に検出するために；２）微小転移性疾患の患者の治療中、補助的処置の効果を試験するために；３）腫瘍細胞が患者に浸出することを防ぐために、自己移植に使用される血液または骨髄中の腫瘍細胞の存在を監視するために；４）患者内に遺伝子操作した細胞を追跡循環するために、感受性の高い手段を提供できるので、他の臨床分野もこれら技術からの恩恵を受けることができる。同様に、簡単で、より感受性のある技法は、酵素−結合または放射活性プローブを使用して現在分析されている組織病理学的に重要な巨大分子の検出レベルを下げ、臨床的または研究的応用にも役立つことができる。例えば、ＤＮＡプローブ検出に現在使用されている増幅− 視覚化法には、化学発光生成物、蛍光生成物または着色した不溶性沈殿を生じる酵素−触媒反応を含む。典型的にはこれらの技法において、標識した核酸プローブを、溶液中または不活性支持体に固定化された相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列とアニールさせる。標識プローブ（通常、放射性元素を含むか、または通常のリガンド−結合タンパク質法を介して酵素に付いているいずれかのオリゴヌクレオチド）の結合は、反応混合物中の標的配列の存在または不在を報告する。ＤＮＡプローブ増幅視覚化法を使用する臨床応用例は、酵素−標識ＤＮＡプローブを使用するウイルス、発癌遺伝子または多耐性遺伝子のための試験である。発明の要約本発明は、標的分子に結合する生物分子プローブの使用を通して、標的分子および被検体を検出するための試験キットおよび方法に関する。本発明の基礎にあるのは、細菌連鎖反応（bacterial chain reaction :BCR)であり、これは革新的な増幅−視覚化システムである。ＢＣＲは被検体を検出するために生細胞を使用する。本明細書に記載するこの革新的方法は、試料中の被検体の存在を測定するために有用である。この方法には、被検体を含有すると思われる試料を提供し、そして存在する任意の被検体を多機能性プローブと複合し、該プローブは結合ドメインおよび成長促進活性ドメインの両方を有し、多機能性プローブ−被検体複合体を形成し、ここで成長促進活性ドメインは予め選択した調節物質に作用して増殖性細胞の成長を促進することができる。多機能性プローブ−被検体複合体を、（ｉ）調節物質および（ii）成長が多機能性プローブの調節物質に対する活性により増強される増殖性細胞の試料の反応マトリックスとを接触させる。全試料を次に成長促進環境の形成および増殖細胞の成長を提供するために十分な時間、インキューベーションする。次に被検体は、バックグラウンドの上に新規増殖細胞の発生を観察することにより検出される。１つの態様では、被検体は細胞表面抗原である。別の態様では、被検体は透過された細胞内に位置する。ある態様では、被検体はブロット上に存在してもよい場合もある。好適な態様では、被検体は哺乳動物腫瘍細胞の既知のマーカーである。さらに別の態様では、被検体は血液または骨髄の試料中に存在するだろう。ある態様では被検体はタンパク質または核酸である場合もある。本発明の方法は、好ましくはβ-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、エステラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、アデニルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ペニシリナーゼ、ヌクレオシダーゼおよびホスホトランスフェラーゼから成る群から選択される酵素活性を有する多機能性プローブを採用できる。好適な態様では、調節物質はセファロスポリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、フォルマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンから成る群から選択される抗生物質である。最も好適な態様では、増殖性細胞は細菌である。ＢＣＲに使用するために好適な細菌は、枯草菌(Bachillus subtilis)、バチルスセレウス(Bachillus cereu s )、エシェリッヒアクロアカエ(Escherichia cloacae)、プロビデンシアスチュアルティ(Providencia stuartii)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、霊菌 (Serratia marcescens)、サリシナルテア(Sarcina lutea)、ビブリオフィッセリ（Vibrio fischeri)、大腸菌(Escherichia coli)および黄色ブドウ球菌(Sta phylococcus aureus)から成る群から選択されることができる。１つの特別な態様では、プローブはネズミIgGモノクローナル抗体を含んで成り、そして酵素活性は抗マウスIgG抗体を介してこれに間接的に結合している。別の好適な態様では、被検体はサイトケラチンであり、そしてプローブは抗サイトケラチン免疫反応性を含んで成る。別の態様では、特定の腫瘍抗原に対する酵素−標識モノクローナル抗体は、特定の抗原を有する特異的な腫瘍細胞を検出および定量するために使用できる。適切な条件下で、酵素結合プローブ分子で覆われた抗原所有腫瘍細胞は、近くの細菌細胞が増殖し始める引き金を引き、腫瘍細胞の周りに細菌のミクロ−コロニーの目に見えるクラスター（本明細書では“サテライトコロニー”と呼ぶ）を生じる。このように、ＢＣＲにより生じる増幅は、正常細胞の大群中に特定の抗原を所有する稀な腫瘍細胞の存在をレポートする視覚的信号（すなわち、サテライトコロニー）と自然に関連しているので、かなり現実的な重要性を有する。この特別な例では、単にサテライトコロニーを計数することにより、稀な細胞（すなわち、被検体中に存在する抗体−結合細胞）の定量的見積もりを得ることが可能である。本発明は、本方法を行うために有用な試験キットも含み、この試験キットは、被検体と反応して被検体−プローブ−複合分子を形成するように調整された酵素 −結合多機能性プローブ分子；コート表面が多機能性プローブの酵素活性により破壊されるように調整され選択された抗生物質、および選択された抗生物質−感受性細菌細胞を含んで成る固体の反応マトリックス−コート表面を含んで成り、これによりコート表面が多機能性プローブに暴露され、そしてインキューベートされて、後に検出される細菌のミクロコロニーのサテライトコロニーを形成する。被検体（典型的には、大変少量（例えば、0.001％）のプローブ−特異的細胞を含むヒトまたは動物細胞の懸濁液）は、ＢＣＲに適するレポーター分子で特異的細胞を被覆するように処理される。例えば、細胞性の被検体は、特異的モノクローナル抗体、そしてβ-ラクタマーゼＩおよび抗マウスIgGまたはIgM免疫グロブリンの共有結合物を用いて連続的に処理される。これらの結合物は種々の手法により得られ、そして免疫グロブリンは通常、マウス以外の動物種、例えばウサギ、ヤギ、モルモットまたはウマで生成される。各処理の間で、被検体を１％のウシ血清アルブミン(BSA)を含有するリン酸−緩衝塩溶液(PBS)で数回洗浄する。処理の結果、プローブ−特異的細胞は（被検体中の全ての他の細胞とは対照的に）、β-ラクタマーゼＩの被覆を獲得する。この段階で、被検体の試料をペニシリンＶ（β-ラクタマーゼＩにより加水分解される基質、ならびに幾つかの細菌種ではβ-ラクタマーゼＩ合成のインデューサーでもある）、および誘導性β-ラクタマーゼＩオペロンを持つペニシリン−感受性細菌または誘導性β-ラクタマーゼＩオペロンを持つように遺伝子操作されたペニシリン− 感受性細菌を含む融解した柔らかな寒天（45℃に保つ）に加える。示した条件下で、プローブ−特異的細胞は、それらが新たに獲得した酵素コーティングがプローブ−特異的細胞に直ぐ近接している抗生物質を加水分解し、付近の細菌間の増殖性連鎖反応を引き起こすため、検出できるようになる。ＢＣＲは幾つかの相互に関連した出来事の結果であり、その幾つかは予測できるが、他はできない。与えられた例として、これらの出来事は；ｉ）酵素分解のためにβ-ラクタマーゼＩ−被覆細胞付近のペニシリン濃度が劇的に下がる；ii ）局所的なペニシリン濃度が特定の閾値未満に下がると、個々のβ-ラクタマーゼＩ被覆細胞付近の細菌が増殖し始める；iii）定常期の細菌細胞とは対照的に、増殖している細胞はペニシリンにより誘導されてβ-ラクタマーゼを生産する；iv）β-ラクタマーゼを合成している細菌は、ペニシリンに対して感受性が低くなる；ｖ）局所的なペニシリン濃度はさらに細菌酵素により低くなる；vi）さらなる細菌増殖および誘導サイクルが起こる。全体としてその結果(数時間のインキューベーション後)、被検体に存在するプローブ−特異的細菌の周りにサテライトコロニーが形成される。サテライトコロニーは典型的には、サテライトコロニーの中心付近に位置する大きなミクロコロニー、および周辺に向かって比例的に小さくなるミクロコロニーを持つ環状パターンに整列した種々の大きさ(0.1 −2.0mm範囲)の５−100個の細菌ミクロコロニーから成る。このサテライトコロニーの特徴的な形態（これは全コロニーの寸法およびサテライトコロニー内のミクロコロニー数とは無関係である）は、細胞からはるかに遠い細菌に比べて、酵素−被覆細胞付近の細菌に急速な増殖を引き起こす抗生物質の濃度勾配から生じる。混入細菌は単一コロニーとして成長し、すなわちサテライトコロニーを形成しないため、細菌の混入はこのアッセイを妨害しないので、この形態はＢＣＲアッセイにおいて重要な役割を果たす。本発明の別の態様では、分析されるプローブ−特異的細胞は、顕微鏡スライドのような表面に固定された細胞群（または組織切片）中に存在する。このような被検体の提示には、骨髄または循環白血球のような臨床的検体が組織学的または免疫化学的検査に使用される時に、しばしば遭遇する。前述の態様のように、細胞をＢＣＲに適する酵素を用いて被覆すように処理する。しかしこの場合、処理はスライドを試薬溶液に連続して浸すことにより適用する。処理後、スライドは抗生物質および細菌を含有する融解した柔らかな寒天の薄層を用いて覆われる。数時間インキューベーションした後、サテライトコロニーはプローブ−特異的細胞の周りに個別の位置で現れる。スライド上にサテライトコロニーの位置の印を付け、そして寒天層を取り除いた後、ＢＣＲアッセイは従来の細胞化学的技法により直接確認できる。例えばサテライトコロニーによりレポートされる細胞の特異性を確認するために、スライドを蛍光−標識モノクローナル抗体でカウンター染色できる。あるいは、レポートされた細胞を剥ぎ取り、そしてポリメラーゼ連鎖反応を使用して特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を分析できる。本発明の様々な態様において、被検体は膜フィルターのようなマトリックス上に固定化される。このような被検体の提示には、電気泳動によるタンパク質、核酸および他の巨大分子の分析的分離中にしばしば遭遇する。前述の態様のように、適当な酵素を用いて被検体を特異的に被覆すように設計された試薬を用いてマトリックスを処理する。続いてマトリックスを抗生物質および細菌を含有する融解した柔らかな寒天の薄層を用いて覆う。数時間インキューベーションした後、サテライト細菌コロニーはマトリックス上の被検体に位置をしるす。好適態様の説明本発明は、被検体に結合したプローブを増幅および検出するためのＢＣＲシステムを使用する、種々の被検体のための高感度アッセイが特徴である。本発明は、特異的な被検体−結合プローブの使用を通して被検体を検出することを含んで成る。プローブは多機能性であり、被検体に結合でき、ならびに被検体の周囲環境に変化を生じることができる活性を有することができる。この環境の変化は、細胞成長に対して伝達的である。被検体は、細菌のような細胞の存在中に被検体 −プローブ複合体を置くことにより検出され、多機能性プローブにより成る成長促進活性のために、このプローブ付近の細菌が成長できるか、またはその成長が促進される。最終的目的は、特異的な被検体−結合プローブの存在、位置および／または数を測定するために有力に使用される細胞増殖である。被検体。本発明は、特別な標的被検体を検出し、そして場合によっては定量するために設計されている。本明細書で使用する時、“被検体”という用語は、検出すべき標的の巨大分子を言うことを意味する。標的の巨大分子は、本発明の被検体−特異的プローブに結合するために接近できる、またはある点まで接近できるようにされる、ことが本発明の重要な観点である。ほとんどの場合で被検体は不溶性であるか、または容易に固定化されるだろう。上記に示したように、被検体は細胞表面に存在し、そして接近できるので、ブロット上にも存在できる。本明細書で使用する時、“ブロット”とは、スロットまたはドットブロット、ノーザン、ウェスタンおよびサザンブロットに使用されるような濾紙、ニトロセルロース、ナイロンまたは他のブロッティング材料上に、巨大分子の固定化を形成する任意の多数の方法を言う。有用な被検体の説明的例には、制限するわけではないが、以下のものがある：１）特異的な細胞表面巨大分子および抗原（ホルモン、タンパク質複合体および細胞レセプターにより認識される分子を含む）２）透過細胞中の細胞タンパク質、異常なＤＮＡもしくはＲＮＡ配列または異常量の特定なメッセンジャーＲＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡ。これら被検体の検出は、それらが種々の癌の初期段階で見い出されるような稀な細胞に含まれる状況、および／または種々の癌の初期段階で見い出されるような稀な細胞のアイデンティファイヤーである状況で特に有用である。幾つかの態様では、被検体は可溶性巨大分子である。被検体−結合プローブ。本明細書に定義するように、被検体結合プローブまたは“プローブ”は、被検体に特異的に結合、複合体化、会合または接着（今後、被検体を“結合”すると言う）できる分子を含んで成る。タンパク質様物質（例えば糖タンパク質、リポタンパク質およびその他のような）を含んで成る被検体 −結合プローブには、特異的免疫反応分子（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびその断片）、特異的結合タンパク質（例えば、ビオチン− 結合タンパク質（アビジン、ストレプトアビジン）、炭水化物結合タンパク質（レクチン）およびＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質）、細胞レセプター、レセプターアゴニスト、ならびに輸送タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。核酸を含んで成る被検体結合プローブの例は、ヒト、動物または植物起源の組織中、ウイルス、細菌、プラスミドならびに遺伝子操作した生物または人工の構築物に存在する配列に相補的な、天然または合成のオリゴヌクレオチドを含む。場合によってはプローブはハプテン、または第２多機能性プローブを結合できる他の成分も含むこともある（以下を参照にされたい）。被検体が核酸である時の特に好適な態様では、プローブをハプテン化ＤＮＡ（例えばビオチン化）することができる。多機能性プローブ。本明細書で使用する時、“多機能性プローブ”は、分子、または分子の結合体もしくは複合体を言い、これは“結合ドメイン”および“成長−促進活性ドメイゾ”を含む。多機能性プローブの目的は、成長−促進活性と被検体とを近接させ、被検体領域中に成長−促進活性を樹立することであり、これにより続いて増殖している細胞の成長により検出される。好適な態様では、多機能性プローブの結合ドメインは、上記のような被検体− 結合プローブである。多機能性プローブの結合ドメインが別の異なる被検体結合プローブと結合することを意味する特別な場合では、多機能性プローブを“第２多機能性プローブ”と言い、そして一方の被検体−結合プローブを“第１プローブ”と呼ぶ。いずれの場合でも、中間の第１被検体結合プローブの有無にかかわらず、いったん多機能性プローブが被検体と複合体化すれば、この複合体を“被検体−多機能性プローブ複合体”と言う。多機能性プローブの成長促進活性は、被検体の付近に成長促進的環境を樹立することができる任意の種または物質であってよい。ほとんどの場合、活性は酵素または触媒であるが、放射性、発光および他の活性分子を使用することもできる。好適な態様では、多機能性プローブは被検体−結合プローブに連結した酵素的な成長−促進活性を採用する。酵素−プローブ結合物は、特定のプローブの特異性および感受性、ならびに酵素の触媒活性を保存する多種類の方法で調製できる。本発明の好適な態様は、米国特許第4,002,532号明細書に記載されるようなグルタルアルデヒドとの共有結合により調製された酵素標識プローブを使用する。あるいは、文献に記載されている多数の方法の１つを使用して、酵素をプローブに直接結合できる。第２多機能性プローブは、安定なプローブ−被検体複合体を得るための間接的手法を採用する。これらの手法は一般的に、ビオチン−アビジンまたはジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体のために開発されたようなリガンド−結合技法に基づく。例えば酵素−ストレプトアビジン結合物は、ストレプトアビジンがビオチンと高い会合定数で結合するので、ビオチンを含有するタンパク質様プローブを標識するための中間体を提供する。ビオチン−含有プローブは周知な方法により容易に合成できるか、あるいは多くの場合は市販されている。ビオチン−標識およびジゴキシゲニン−標識プローブの例は、抗体（ポリクローナル、モノクローナルまたはその断片）、オリゴヌクレオチド、レクチンおよび結合タンパク質を含む。この方法は、ビオチン−またはジゴキシゲニン−標識核酸前駆体で合成された酵素−標識オリゴヌクレオチドプローブに特に有用である。好適な態様では、核酸被検体を同定するために有用なものは、第１プローブがハプテン（例えば、ビオチン）に連結された核酸であり、そして第２多機能性プローブが抗体−酵素複合体である。本発明は多プローブの“サンドイッチ”を採用する、より複雑な間接的標識法も意図する。増殖性細胞（例えば細菌）。本発明に存在する増殖性の細胞は、多機能性プローブによる成長促進環境の樹立に反応して、被検体の付近で増殖する。次に細胞の増殖は、被検体の存在、位置および／または量を示す。細胞の急速な増殖速度から、これらの細菌が本発明に使用するために最も好適な生物である。酵母、藻類または種々の真核細胞系のような他の生物および調製物(例えば、植物または昆虫に由来する細胞、その中の幾つかは10分未満の倍化時間を有する)は、この反応で細菌に代わりに使用できる可能性がある。ゆっくりと分割する細胞は、本発明の力をほとんど無くしてしまうだろう。一般的に、 30分未満の倍化時間を持つ細菌が好ましい。大腸菌および黄色ブドウ球菌に見られるような、より迅速な倍化時間が最も好ましい。急速な増殖速度に加えて、ＢＣＲに採用する生物は成長と適合性があるか、または有力な反応混合物中で適合性があり、そして適当な抗生物質または他の成長阻害物質を利用できることが好ましい。好適態様では、阻害物質は細胞を実際に殺すことなく、増殖性の細胞成長を遅らせるか、または止める。植物細菌細胞または胞子をＢＣＲアッセイに使用できる。例えば、サリシナルテア(Sarcina lutea)細胞を、37℃でデフコハートインフュージョン(Difc o Heart Infusion)ブロス中で成長させる。培養はチューブローラーで通気し、そして定常期に達する前に収穫する。ＢＣＲアッセイには低温保存カルチャーも使用できることに注目すべきである。低温保存には、カルチャーをグリセロール（最終濃度20％）と混合し、アリコートに分け、そして-20℃に置く。胞子を使用する時、カルチャーを、胞子形成を導く条件下で定常期に到達させる。胞子を遠心により集め、蒸留水で洗浄し、そして65℃で30 分間加熱する。熱処理の後、胞子を蒸留水で３回洗浄し、そして加熱工程を繰り返す。胞子の懸濁物を０−４℃で数週間、維持することができる。以下にＢＣＲに有用な細菌株の例を表す（しかし、これらに限定されるわけではない）：枯草菌(Bachillus subtilis)、バチルスセレウス(Bachillus cereu s )、エシェリッヒアクロアカエ（Escherichia cloacae)、プロビデンシアスチュアルティ(Providencia stuartii)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、霊菌 (Serratia marcescens)、サリシナルテア(Sarcina lutea)、ビブリオフィッセリ（Vibrio fischeri)、大腸菌(Escherichia coli)および黄色ブドウ球菌(Sta phylococcus aureus)。成長調節系。本発明の重要な特徴は、多機能性プローブが細胞成長を促進する能力を有するということである。すなわち、多機能性プローブの成長促進ドメインの活性と、多機能性プローブによりモディファイされる細胞成長調節剤とが、検出に使用される細胞に近くで合わされることが重要である。本明細書に使用する時、成長調節系は、成長促進環境を作成するための増殖性細胞、多機能性プローブ上に存在する成長促進活性および酵素が作用する基質（本明細書では調節物質という）を含んで成る系を言う。好適な態様では、成長調節系は抗生物質、抗生物質分解酵素および特定の細菌株を含んで成る。この場合、調節物質は抗生物質である。しかし本発明は、多機能性プローブの酵素活性が成長培地に存在する前駆体から栄養要求アミノ酸を生成することを意図する時に、栄養要求性細菌株を用いて行うような、他の成長強化法の使用も意図している。抗生物質に依存的な態様の場合には、ＢＣＲ用の特定な酵素−抗生物質の組み合わせを使用することに先立ち必要な要件は：１）抗生物質がこの系に使用する細菌の特別な種に細胞毒性であるか、または細胞増殖抑制性のいずれかでなければならない、そして２）多機能性プローブ上に存在する酵素が、抗生物質の活性を細胞を成長させるために十分変化させなければならない。最も多くは、これは抗生物質活性の破壊で完結されるだろう。ＢＣＲに適する酵素−抗生物質の組み合わせ例を（これらの例に限定するわけではない）、表１に示す。特定の酵素−抗生物質の組み合わせに関しては、誘導活性から抗生物質−破壊活性が分かれることが可能であることに言及すべきである。例えば、セファロスポリン（β-ラクタマーゼIIにより加水分解される抗生物質）およびイソプロピル-β-D-ガラクトシド(lacプロモーターのインデュサー）から成るハイブリッド分子は、β-ラクタマーゼIIで被覆した被検体に隣接する周囲中に、イソプロピル-β-D-ガラクトシドを遊離する。これらの条件下で、β-ラクタマーゼII遺伝子の上流にlacプロモーターを持つ細菌は、被検体付近で遊離されたインデュサーに反応してβ-ラクタマーゼIIを合成し始める。この作用は次に、ＢＣＲを強化するセファロスポリン-イソプロピル-β-D-ガラクトシドの局所的加水分解を増加させるだろう。適当な栄養要求系の例は、グルタミン酸の栄養要求細菌株、グルタミン酸エステル調節物質および多機能性プローブ上にエステラーゼ活性を含んで成る増殖細胞の使用である。反応マトリックス。本明細書で使用する反応マトリックスは、増殖性細胞、増殖性細胞用の成長培地、多機能性プローブ中に存在する成長促進活性が作用する調節物質、およびＢＣＲを支持するために使用する任意の３次元支持体構造を含む環境を言う。反応マトリックスの成分は様々に形成することができるが、反応マトリックスの最も重要な特徴は、増殖性細胞が存在する中でプローブ−被検体複合体を維持し、かつプローブ領域内で細胞の成長を促進するために多機能性プローブが作用できる物質も提供することである。好適な態様では、反応マトリックスはまた、その成長が促進される増殖性細胞を固定した位置に、プローブ−被検体複合体を維持する。最も好適な態様では、マトリックスは寒天またはアルギネート、アガロース、コラーゲンまたはヒアルロン酸のような他のヒドロゲルを含んで成る。ほとんどの場合で、増殖性細胞を反応マトリックス内で均一に分散させる。幾つかの態様では、プローブ−被検体複合体は成長下層内に分散する。別の態様では、プローブ−被検体複合体は支持マトリックス上に存在し、そして増殖している細胞が支持マトリックスの上層となる反応マトリックス内に均一に分散する。この態様では、反応マトリックスはしばしばガラスまたはプラスチックに付いている固体ヒドロゲルとして適用されるか、あるいは適用後に“セットアップ”できる液体として適用される。細菌細胞は一般的に、10⁴−10⁸細胞／ml濃度で反応マトリックス中に存在する。被検体試料。多くの場合、標的とする被検体は特別な細胞上または内にある。もし被検体が細胞表面に存在するならば、適当なプローブを利用できることを条件として、細胞表面被検体を含んで成る生細胞をアッセイに使用することができる。しかし多くの好適態様において、ＢＣＲの開始前に、細胞をエタノール、アセトンまたはパラホルムアルデヒドのような固定化剤を用いて固定する。もし被検体が細胞中に存在するならば、被検体は細胞溶解を採用する手段により、あるいは免疫細胞化学の技術者に周知な透過法の１つを通して、プローブと接近できるようにしなければならない。幾つかの態様では、被検体は可溶性化合物として存在する。他の試料から、ＢＣＲの使用前に被検体を抽出および／または可溶化することができる。次に可溶性被検体を含む試料を、任意の数の精製工程を通すか（抽出およびカラムクロマトグラフィーのような）、または試料を直接ＢＣＲに使用することもできるが、ただしこの場合は試料中に競合する基質が存在しないか、またはＢＣＲの成功裏の操作に重要な任意の工程に悪いものがない。どのような場合でも使用可能な信号−対−ノイズ比を提供するために、被検のプローブへの結合後に過剰なプローブは排除しなければならない。多くの好適な態様において、プローブ−被検体結合物は固定化される。そのような場合、過剰なプローブは連続して洗浄することにより除去できる。有用な固定化法は、多機能性プローブが被検体と接触する前に、磁気ビーズまたは濾紙のような支持体基材に結合した多機能性プローブの使用を含む。被検体−プローブ結合物を認識できる第２抗体を、被検体−プローブ結合物を免疫沈降させるために使用できる。沈降状態で、結合物を洗浄し、そして過剰なプローブを除去できる。好適な態様では、被検体−含有試料を濾紙、ポリアクリルアミド、アガロースまたは他の電気泳動基材の電気泳動に供する。電気泳動後、被検体を電気泳動の基材から周知技法によりブロットする。全、精製、または部分精製した試料も、従来のスロットおよび／またはドットブロット法を使用してブロットに固定できる。ブロット調製後、多機能性プローブをブロットに結合し、そして次にブロットを適当な回数洗浄することによりすすぐことができる。次にブロットを増殖性細胞および調節物質を含有する反応マトリックスに暴露することにより、ＢＣＲ反応を開始する。あるいは、非結合の多機能性プローブを破壊、トラップあるいは反応から除去することができる。核酸プローブの場合には、非結合プローブを固定化された相補的核酸配列でトラップするか、あるいはＳ１ヌクレアーゼ消化のような適当な方法を使用して破壊できる。検出。ＢＣＲにおいて被検体の検出は、反応マトリックスのいたるところに存在するバックグラウンドレベルに比べて、増殖性細胞の数が増加した反応マトリックス内の領域を同定することにより行う。バックグラウンド上の細胞増殖のそのような検出が可能である、任意の方法を使用できる。本発明の多くの態様は、裸眼または顕微鏡のいずれかを使用する視覚的検出を採用する。利用できる倍率に依存して、インキューベーション時間を変化できる。検出は蛍光、色素または発光増殖細胞の使用を通して増強できる。限定するわけではないがそのような細胞の有用な例には、ビブリオフィッセリ(Vibrio fischeri)のような天然に発光する細菌、またはそのような特性を有するように遺伝子操作された細胞（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子の導入を介する）を含む。増殖細胞のβ-ガラクトシダーゼ含有種も、それらが発色基質の添加を通して着色反応生成物を生産するように誘導できる時、有用となり得る。あるいは、信号は成長基中に代謝色素を入れることを通して強化できる。アラマーブルーはそのような色素の１例である。代謝色素を使用する時、蛍光または発光細胞は、代謝色素に関連する光の特別な波長を検出できる分光光度または蛍光光度顕微鏡を使用することが有用であり得る。発光細胞を使用する１つの好適な態様では、ＢＣＲの終了後に、感光性フィルムを反応マトリックスに張り合わせる。フィルムは、反応マトリックス中の発光細胞からの発光がフィルムに露光するための十分な時間、反応マトリックスの存在下でおいておく。次に被検体をフィルムを現像することにより検出し、そしてバックグラウンドレベルよりも大きい露出領域を探す。ＢＣＲアッセイ。ＢＣＲアッセイは、被検体を多機能性プローブと直接、または別の被検体−結合プローブの使用を介して間接的に結合することを含んで成る。反応マトリックスの存在下に多機能性プローブ−被検体複合体を置いて、ＢＣＲ反応系を形成し、そしてＢＣＲ反応系を増殖性細胞が検出できる成長に到達するために適切な条件下でインキューベーションする。正しいインキューベーション条件は、選択した細胞ならびにアッセイ系の他の成分に依存する。細胞生物学および微生物学の分野の熟練者は、特定の増殖性細胞の細胞成長を促進するための適当な条件（例えば、温度、成長培地など）を知っている。さらにアッセイ系を至適化するためのガイダンスは、糸またはビーズのような基材上に存在する人工的被検体を採用する試験系を使用することにより見いだすることができる。適当なそのようなアッセイ系を、以下の実施例に記載する。本発明のＢＣＲアッセイ系の成分および試薬は、アッセイの簡便性および感度が保存されたキットの状態で供給できる（水性、または凍結乾燥した状態で）。反応を加速するために、全ての必要な試薬を過剰に加える。好適な態様では、キットは一般的に顕微鏡スライドまたはペトリ皿状の試料保持手段を含んで成る。ブロット状態で被検体を検出するために設計されたキットでは、試料保持手段は調製したブロットを中に置くための簡単なトレイから成ることができる。キットはまた、被検体を含む試料を適用するフィルム状態の、構成された反応マトリックスを含んで成る。この構成された反応マトリックスは一般的に、ペニシリンのような細菌抑制剤が存在する中に細菌が分散されているヒドロゲルマトリックス（例えば寒天）から成る。このマトリックスは、ポリマー（例えば、酢酸セルロース、またはＰＶＡ）またはガラスで作成された平らなシート状材料であることが多い裏材手段に付いていてよい。この裏材手段は、反応マトリックスに機械的強度および取り扱いの容易性を提供するように機能している。このマトリックスフィルムに直接、被検体を含む試料を適用することができ、そして裏材は必要に応じて残すか、または取り除くことができる。ほとんどの態様では裏材材料は、顕微鏡、デンシタメーター、フルオリメーターまたは他の装置で定量できるように透明である。視覚化のために使用する適切な装置は、細菌の性質、およびキットに使用する任意の特定な信号強化法に依存する。ＢＣＲの態様の中には、in situで行う場合もある。これらの態様では、分析される細胞を最初にガラス顕微鏡スライドまたは同様な支持体に固定する。次にスライドをプローブ、続いて多機能性プローブで連続的に、あるいは多機能性プローブ単独で処理する。次に洗浄は、染色ジャー(Coplin)のような従来の容器を使用して、スライドをPBS-BSAのような洗浄溶液中に沈めることにより行う。最後の洗浄後直ぐに、スライド（細胞側を下）を反応マトリックスを含む寒天フィルム上に置いた。十分な増殖性細胞の成長を生じるための適当なインキューベーション時間の後、サテライトコロニーの位置を顕微鏡または裸眼で決定する。実施例１ヒト骨髄または血液検体中の希少な腫瘍細胞の計数この実施例は、正常な骨髄細胞または末梢血白血球中に極めて低頻度で存在する腫瘍細胞のためのＢＣＲアッセイを説明する。プローブ−特異的細胞をβ-ラクタマーゼＩを用いて被覆するために、細胞をサイトケラチン18に特異的な抗サイトケラチンモノクローナル抗体（シグマ化学社：Sigma Chemical Co.)、およびヤギ抗マウス免疫グロブリン（シグマ）およびβ-ラクタマーゼＩ（シグマ）で連続的に処理した。被検体の調製。血液または骨髄検体の２ml試料（ヘパリン処理シリンジで集める）を、リン酸−緩衝塩溶液(PBS)で１：２に希釈し、そして有核細胞をFicoll- Hypaque(リットンバイオネティックス社:Litton Bionetics Inc.)密度勾配遠心を使用して分離する。遠心後、界面の有核細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、 0.5mlのＰＢＳ中に再懸濁し、そしてヘモサイトメーターで計数する。細胞の生存能をフルオロクロマシア(fluorochromasia)を使用して測定する。血液または骨髄検体のいずれかに由来する軟層を、密度遠心により分離した細胞に代えることができる。このために、血液または骨髄検体を室温で10分間デカントし、そしてほとんどの有核細胞を含む最上層を分離する。前述のように、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして計数する。典型的には軟層からの細胞懸濁液は10％未満の赤血球を含み、その量はＢＣＲアッセイを妨害しない。これらの観察は、本発明が Ficoll-Hypaque分離、組織学的、免疫細胞化学的および他の手法に必要な経費および時間がかかる工程を回避することができるので重要である。ＰＢＳに懸濁した有核細胞を、強い撹拌下（ボルテックス混合）で等容量のエタノールを加えることにより固定し、そして懸濁液を室温で30分間インキューベーションしておく。固定した細胞を遠心により回収する。異なるモノクローナル抗体に対して異なる固定処理が必要かもしれない。ＰＢＳに再懸濁した固定細胞を、０−４℃で数週間保存できる。固定細胞は、-20℃でエタノールにて数週間保存できる。酵素−プローブ共有結合物。共有結合物は、米国特許第4,002,532号明細書に記載の手法に従い調製した。50マイクログラムのヤギ抗マウスIgG（全分子、ヒト血清タンパク質に吸着、シグマ化学社）を、410マイクログラムのβ-ラクタマーゼＩ（シグマ）と0.02Mのグルタルアルデヒドの存在下で結合した。室温で４時間インキューベーションした後、反応混合物を0.05％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳに対して徹底的に透析した。この結合物を、Seph adex G-200クロマトグラフィーを使用して反応混合物から分離した。ＢＣＲアッセイ。固定細胞の懸濁液を、特異的なモノクローナル抗体そして酵素−プローブ共有結合物を用いて連続的に処理した。各処理の間で、細胞をPBS −BSAを用いて２回洗浄した。典型的に細胞は、1:100希釈の抗サイトケラチン18 モノクローナル抗体で室温にて30分間処理し、遠心により分離し、そしてPBS−B SAを用いて同様に２回洗浄した。細胞のペレットを、酵素−プローブ共有結合物の希釈物(例えば1:500)中に再懸濁し、そして室温で30分間インキューベーションした。インキューベーション後、細胞をPBS−BSAを用いて４回洗浄し、そして次に10mlの融解した柔らかな寒天（45℃に維持した0.45％のデフコハートインフュージョン寒天)(ペニシリンＶ(10⁵単位/ml)およびエス.ルテア(S.lutea)細胞 (10⁶細胞/ml)を含む)に加えた。37℃で一晩インキューベーションした後、プレート上の細菌のサテライトコロニーを、分割顕微鏡または拡大レンズを使用して計数した。ＢＣＲアッセイの特異性を試験するために、血液または骨髄のいずれか由来の正常なヒト有核細胞を、MCF-7由来の限定数の細胞（もともと転移性の哺乳類腺ガンを持つ患者から単離した樹立細胞系）と混合した。結果は、MCF-7細胞と混合した有核細胞を含むプレート上にのみサテライトコロニーが存在することを表した。さらに、モノクローナル抗体または抗体−酵素複合体のいずれかを欠く対照は、サテライトコロニーを持たなかった。実施例２顕微鏡スライド上に固定したヒト骨髄または血液検体中の希少な腫瘍細胞の計数この実施例は、顕微鏡スライド上に固定された正常な骨髄細胞または末梢血白血球中に極めて低頻度で存在する腫瘍細胞計数のための本発明の使用を説明する。試薬は前実施例に使用したものと同一である。被検体の調製。有核細胞（密度遠心または軟層のいずれかを使用して、実施例１に示したように調製）を、ポリリシン−被覆顕微鏡スライド（シグマ）に沈着させ、室温で乾燥させ、そして無水エタノールを用いて30分間処理することにより固定した。スライドを-20℃で数週間保存した。ＢＣＲアッセイ。被検体を含むスライドを、ウマ血清を用いて室温で30分間処理して、非特異的結合部位をブロックし、そして次に適当な溶液中にスライドを浸すことにより、特異的モノクローナル抗体、そして酵素−プローブ共有結合物を用いて連続的に処理した。各処理の間で、スライドをPBS-BSA中に10分間含浸することにより洗浄した。典型的には、スライドを室温で抗サイトケラチン18Ig G1モノクローナル抗体（シグマ)の1:100希釈物中で30分間インキューベーションし、２回洗浄し、酵素−プローブ共有結合物の1:500希釈物中で室温にて30分間インキューベーションし、そして次に４回洗浄した。処理後、スライドをペトリ皿に置き、そして14mlの融解した柔らかな寒天(45℃に維持した0.45％のデフコハートインフュージョン寒天)(ペニシリンＶ(10⁵単位/ml)およびエス.ルテア(S .lutea)細胞(10⁶細胞/ml)を含む)で覆った。37℃で一晩インキューベーションした後、細胞のサテライトコロニーはβ-ラクタマーゼで被覆した腫瘍細胞の位置を示した。前記のようにアッセイの特異性は、血液または骨髄のいずれか由来の正常なヒト有核細胞と混合したMCF-7癌細胞を使用して試験した。MCF-7細胞を同定するために、蛍光−標識抗サイトケラチン18IgG1モノクローナル抗体（シグマ）を第一抗体として使用した。結果は、サテライトコロニーが蛍光モノクローナル抗体と結合することにより容易に認識されるMCF-7細胞の周りのみに存在することを表した。実施例３ニトロセルロース膜上にブロットされた被検体の検出この実施例は、ニトロセルロースフィルター上にブロットとして存在する極めて少量の被検体を検出するための本発明の使用を説明する。試薬は前実施例に使用したものと同一である。蛍光−標識抗サイトケラチン18モノクローナル抗体（シグマ）の１：２の連続希釈物を、各希釈物に対して2-マイクロリットル容量を使用して、ニトロセルロースフィルター（BA-85;バイオラッド社:Bio-Rad Ltd.)の切片上にスポット状に適用した。フィルターを室温で30分間乾燥させ、そして次に50mlのブロッキング溶液（PBS中に５％の乾燥スキムミルク）中に１時間浸した。切片をブロッキング溶液から取り出し、そして酵素−プローブ共有結合物の1:500希釈物を用いて被覆した。この切片を室温で30分間、密閉トレー中でインキューベーションし、そして次にPBS-BSAを用いて徹底的に洗浄した。スポットを視覚化するために、切片を14mlの融解した柔らかな寒天(45℃に維持した0.45％のデフコハートインフュージョン寒天)(ペニシリンＶ(10⁵単位/ml)およびエス.ルテア(S. lutea )細胞(10⁶細胞/ml)を含む)で覆った。37℃で一晩インキューベーションした後、細菌のサテライトコロニーがほとんどのスポット上で観察された。本発明の感度は、蛍光により検出できるよりもかなり低い抗体濃度を含むスポットが、それにもかかわらずサテライトコロニーの存在により視覚化されたという事実により明らかに実証された。被検体を欠く対照スポットは、サテライトコロニーを表さなかった。実施例４ヒト骨髄または血液検体中の希少な腫瘍細胞の計数この実施例は、アビジン−ビオチン法により調製された第２抗体−酵素複合体の使用を説明する。実施例１のように、このアッセイは正常な骨髄細胞または末梢血白血球中に極めて低頻度で存在する腫瘍細胞を計数するため使用した。プローブは、低分子量サイトケラチン8(ダコ社:Dako Corp.)に特異的な抗サイトケラチンモノクローナルIgM抗体（クローン35βH11）であった。被検体の調製。有核細胞は、密度遠心または軟層のいずれかを使用して、上記（実施例６）に示したように調製した。第２抗体−酵素複合体。共有結合物は、米国特許第4,002,532号明細書に記載された手法に従い調製した。50マイクログラムのストレプトアビジン（シグマ化学社）は、200マイクログラムのβ-ラクタマーゼＩ（シグマ化学社）に、0.005M グルタルアルデヒドの存在下で結合させた。室温で4.5時間インキューベーションした後、反応混合物を0.1％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳに対して徹底的に透析した。ウシ血清アルブミンを結合物に加えて、１mg/mlの終濃度に作成した。ＢＣＲアッセイ。固定細胞の懸濁液を、抗サイトケラチン8モノクローナルIgM抗体、ビオチン化ウサギ抗−マウスIgM免疫グロブリン（全分子、ヒト血清タンパク質に吸着、シグマ化学社）、およびストレプトアビジン−酵素結合物を用いて連続的に処理した。各処理の間で、細胞をPBS−BSAを用いて２回洗浄した。典型的に細胞は、1:50希釈の抗サイトケラチン8モノクローナル抗体で室温にて30分間処理し、遠心により分離し、そしてPBS−BSAを用いて同様に２回洗浄した。細胞のペレットを、ウサギ抗−マウスIgM免疫グロブリンの希釈物(例えば1:100)中に再懸濁し、そして洗浄工程を繰り返した。最後に、細胞をストレプトアビジン−酵素結合物と共に室温で30分間インキューベーションした。インキューベーション後、細胞をPBS−BSAを用いて４回洗浄し、そして次に10mlの融解した柔らかな寒天（45℃に維持した0.45％のデフコハートインフュージョン寒天)(ペニシリンＶ(10⁵単位/ml)およびエス.ルテア(S.lutea)細胞(10⁶細胞/ml)を含む)に加えた。37℃で一晩インキューベーションした後、プレート上の細菌のサテライトコロニーを、分割顕微鏡または拡大レンズを使用して計数した。ＢＣＲアッセイの特異性は、MCF-7腫瘍細胞を使用して上記（実施例１）に示すように試験した。実施例５ IN SITU ＢＣＲ簡略化したin situ ＢＣＲ法を開発し、そして以下のように行った：１．2-mlの末梢血試料(MCF-7細胞の添加有り、または無し)を、β-ラクタマーゼ -抗体結合物と混合し、そして次に37℃で30分間、穏やかに撹拌しながらインキューベーションした。２．インキューベーション後、血液を８mlのPBS−BSAを用いて希釈し、そして重力により粗いNytex 膜を通して濾過した。膜上に留まる細胞を各回毎に５回、約１mlのPBS−BSAを用いて迅速に洗浄した。この工程には２−３分を要する。３．最後の洗浄後すぐに、細胞は膜（細胞が下）をスライドに約３分間押し付けることにより、ポリリシンで被覆したガラススライド（“Polyprep”スライド、シグマケミカル）に移した。細胞は負に荷電したNytex 膜には結合しないが、正に荷電したPolyprepスライドには急速に結合するので、細胞の転写は定量的である。細胞の転写後、Nytex 膜を染色することにより膜に付いて残る検出可能な細胞が無いことを確認した。４．スライドをエス．ルテア(S.lutea)およびペニシリンＶを含む寒天フィルムと接触するように置き、そして湿潤箱中で37℃にて一晩インキューベーションした。５．次にサテライトコロニーを計数した。 MCF-7細胞の存在は、細胞が上に固定され、そして免疫細胞化学用のダコ(Dako )APAAPキットを使用してサイトケラチン18について染色された２組のスライド（工程３後）を使用して確認された。実施例６ＢＣＲで有用な可能性のある酵素の比較ＢＣＲで調節物質として作用する酵素の選択は、アッセイの様々な性質に意味のある影響を及ぼすことができる。この実施例は、ＢＣＲでの使用において２つの酵素、β-ガラクトシダーゼおよびβ-ラクタマーゼＩの利点を比較する。擬陽性の最小化。β-ガラクトシダーゼと比較して、β-ラクタマーゼＩは真核細胞中に見い出されない。したがってβ-ラクタマーゼＩを使用して、内因性のβ-ガラクトシダーゼを持つ細胞による擬陽性の問題の可能性を回避する。酵素活性。β-ラクタマーゼＩの触媒的活性は、拡散−限界反応（diffusion-l imited reactions)に近付く既知の最高値にランク付けられ、してその代謝回転数（1×10⁵−1×10⁶min^-1）はペルオキシダーゼに匹敵する。多機能性プローブの調製。β-ラクタマーゼＩは30,800ダルトンのモノマーであり、一方β-ガラクトシダーゼは465,000ダルトンのテトラマーであるので、β -ラクタマーゼＩはβ-ガラクトシダーゼよりも化学修飾し易い。さらにβ-ラクタマーゼＩは、リシンおよびアルギニン含量が高く、システイン残基を含まず、耐熱性がよく、そして活性を失わずに固相に結合する。増殖細胞と酵素の使用ガラクトシダーゼに基づくＢＣＲが特定のリボフラビイン−欠失大腸菌突然変異体を必要とすることとは対照的に、ラクタマーゼに基づく系の要件は細菌がβ -ラクタム系抗生物質に感受性であることだけなので、多くの種々の細菌種を用いて行うことができる。細菌胞子はまた、ラクタマーゼに基づくＢＣＲに適し、そして植物細胞よりも利点を提供することができる。実施例７ＢＣＲ至適化のためのアッセイ反応マトリックス条件は時々、経験的に至適化できる。特定のＢＣＲ系を至適化するための最初の工程を容易にするために、簡単な被検体−多機能性プローブ複合体代替物を使用できる。１つの態様において被検体代替物は、段階的濃度のβ-ラクタマーゼＩに浸した通常の綿糸の小片（1-cm長)から成るものであった。終点は、糸の周りに細菌のミクロコロニーを生じる最低濃度であった。方法の再現性は、放射性溶液に浸した個々の糸の放射性を測定することにより試験した。結果は、個々の糸により保持される放射性溶液の平均量が3,452CPM(1.01μl容量に等しい)であり、平均 ±12％の標準誤差を示した。別の被検体代替物は、β-ラクタマーゼ−被覆MCF-7細胞の酵素活性を模するように設計された。被検体は、ストレプトアビジン-β-ラクタマーゼ共有結合物にカップルしたビオチン−被覆アクリル酸ビーズ（直径50μ、シグマ化学社）から成った。共有結合物は、多官能性カップリング剤としてグルタルアルデヒドを使用して調製した。処理後、このビーズをPBS-BSAを用いて徹底的に洗浄して非結合酵素を除去し、そして次に０−４℃で保存した。試験のために個々のビーズを、細菌およびペニシリンを含有する寒天フィルム表面上に沈着させた（滅菌パスツールピペットを使用して）。個々のビーズの周りのサテライトコロニーの直径を測定することにより、感度の半−定量的な測定が得られた。保存中のビーズの均一性および安定性から、これらのビーズは標準的条件下でＢＣＲを至適化するための価値ある道具を提供した。実施例８感度実験拡散。ＢＣＲにおいて感受性の１要素は、調節物質の成長促進／可能状態への変化速度である。アッセイ条件下で、ほとんどの場合、酵素活性は少なくとも部分的には被検体に向かう調節物質の拡散により制限されるだろう。調節物質の拡散を加速できる２つの方法は、ヒドロゲル濃度を減少させること、および／または調節物質自体の濃度を増加させることによる。調節物質としてペニシリンを使用する場合は、ペニシリン加水分解の速度を寒天中に存在する十分に高い初期濃度Ｃｉから、被検体付近で細胞成長の引き金を引く臨界値Ｃｇへと減少させることが重要である。この前提に合致して、ペニシリンの寒天中での拡散速度の上昇はアッセイ感度を上げることが観察された。拡散速度の変化は寒天濃度を変化させるか、または通常の細菌学の寒天よりも低濃度で固体化する精製された寒天またはアガロースを使用することにより影響を受ける。アッセイ感度を上昇させる別の手段は、酵素活性が生じる反応容量を減少させることである。反応容量の減少は、Ｖ（Ｃｉ−Ｃｇ）に等しい調節物質の臨界絶対量の変化を減少させ；ここでｖは反応容量である。この仮定の妥当性は、反応マトリックスとして種々の厚さの寒天フィルムを使用するアッセイ感度の比較を行うことにより試験した。ペニシリンおよびβ-ラクタマーゼＩを、成長調節物質系として使用した。寒天厚を４から１mmに減少した時、約２−倍の感度上昇が観察された。細菌濃度。一般的に最適なアッセイ感度は、約5×10⁵細菌／mlの濃度で達成された。大腸菌を使用した実験で、成長を完全に阻止する最小ペニシリン濃度は、 mlあたりの細菌数におよそ比例した。対照的にエス．ルテア(S.lutea)に関しては、ペニシリンが細菌濃度には依存せずに成長を阻止した。成長培地の化学組成。予備実験の間、１つの単純な無機培地（デイビスの最少培地）およびデフコの３種の複合培地、抗生物質培地No.3、ハートインフュージョンブロスおよび栄養寒天を含む４種の成長培地を試験した。大腸菌を使用して、複合培地は無機培地よりも優れているが、３種の複合培地間に有意な差異は無いことが判明した。対照的に、エス．ルテア(S.lut ea )に関しては、ハートインフュージョンブロスが他の培地よりも良かった。この一連の実験で重要な考察は、エス.ルテア(S.lutea)が抗生物質培地No.3中で良く成長するが、ＢＣＲの感度が下がることであった。抗生物質培地No.3は、ハートインフュージョンブロスよりも多い無機塩を含むので、塩を含まない抗生物質培地No.3の組成、抗生物質培地No.1を試験した。２倍上昇した感度が塩を含まない培地を用いて観察された。実施例９ＢＣＲキットおよび方法骨髄末梢血の臨床検体中の、不顕性微小癌組織転移を検出するためのアッセイキットの成分および操作手順を以下に記載する。必要な装置：１）37℃用のインキューベーター；２）拡大レンズまたは分割顕微鏡。自由選択の装置：１）従来の遠心用または細胞遠心用のサイトスピンアダプター。材料および試薬：１．顕微鏡スライドを適当な物質（例えば、ポリ−Ｌ−リシン）で被覆して、細胞を接着し易くする（これらの数種のスライドは、シグマ、フィッシャーサイエンティフィック：Fisher Scientific および他の供給元から市販されている）。２．栄養素、ペニシリンおよびポリマーフィルムに固定化された細胞を含む反応マトリックス。３．ラクタマーゼ、マウスIgG 抗-ラクタマーゼ、抗-サイトケラチンモノクローナルIgG、および架橋化抗体（例えば、マウスIgGに対するウサギ抗血清の免疫グロブリン画分）を含む可溶性の多機能性プローブ。４．緩衝液およびすすぎ用のクエンチング溶液（例えば、PBS-BSA、粉末化ミルク）。アッセイ法：すべてのインキューベーションは室温で行う。工程１．Ficoll-Hypaque密度勾配遠心を使用して、検体から有核細胞を分離する。工程２．約5×10⁵細胞／スライドを使用して、数個のスライドに有核細胞を塗る（またはサイトスピン）。２時間または一晩、風乾する。スライドを無水エタノールに１−２分間浸し、細胞を固定する。スライドを-20℃以下で保存できる。スライドを保存するならば、スライドを隙間なくくるむ。工程３．ブロッティング溶液をスライドに適用し、そして10分間インキューベーションする。過剰な溶液を除去する。工程４．ラクタマーゼ免疫性複合体を適用し、そして30分間インキューベーションする。洗浄ビンからの緩衝液で穏やかにすすぎ、過剰な液体を除去し、そして次にスライドを緩衝液浴に5−20分間置く。工程５．細菌を含む反応マトリックスから保護ラップをはがし、そしてスライド（細胞が下）をフィルム上に置く。スライドとフィルム表面間に気泡がトラップされていないことを確認する。フィルムを37℃で一晩インキューベーションする。工程６．拡大レンズまたは分割顕微鏡下でスライドを検査し、そしてガラス記入ペンまたはダイヤモンドマーカー（もし、後の染色工程で無機溶媒を使用するならば）を使用して、ギャラクシーコロニーの位置に印を付ける。工程７．β-ラクタマーゼについて、発色性基質を使用して細胞を染色する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年９月９日【補正内容】明細書標的細胞および分子を検出するための試験キットおよび方法発明の背景蛍光免疫化学、フローサイトメトリー、酵素−結合免疫細胞化学およびin sit u DNAおよびRNAハイブリダイゼーションの使用により説明されるように、高感度な検出システムは医学診断および生物学的研究における重要な分析手段となった。これにもかかわらず、幾つかの分野では現在利用できる検出限界を広げる、新たな経費的効果がある技法の開発に実質的な関心がもたれている。例えば初期の癌患者の中には、彼らの骨髄中に、骨のスキャン、生化学的分析および細胞学検査のような通例の手順による検査を逃れる少数の転移性腫瘍細胞を有する者もいる。通常、不顕性の微小転移と呼ばれるこれらの稀な腫瘍細胞を検出するために最も頻繁に使用されている方法は、免疫細胞化学である（Premi,T.,およびBatti fora,H.Human Pathol.18,728-734,1987、引用により本明細書に編入する）。しかし現在、免疫細胞化学は極めて時間がかかるので、通常の基本的検査に使用することができない。例えば、100万個の骨髄細胞あたり10個未満の悪性細胞を含む検体（および適当な対照）を分析するために、組織病理学の熟練者は約４時間の顕微鏡走査が必要である。フローサイトメトリーおよびコンピューター連動造影分析のような自動化されたスクリーニング法には、莫大な資本投資が必要なばかりでなく、従来の免疫細胞化学よりも感度が低いと判明した。したがってこの特別な分野において、血液または骨髄の臨床検体中に低頻度で存在する悪性細胞を検出できる、簡単かつ経費的効果のある技法が必要であることは明らかである。このような技法は；１）癌患者の再発を早期に検出するために；２）微小転移性疾患の患者の治療中、補助的処置の効果を試験するために；３）腫瘍細胞が患者に浸出することを防ぐために、自己移植に使用される血液または骨髄中の腫瘍細胞の存在を監視するために；４）患者内に遺伝子操作した細胞を追跡循環するために、感受性の高い手段を提供できるので、他の臨床分野もこれら技術からの恩恵を受けることができる。同様に、簡単で、より感受性のある技法は、酵素−結合または放射活性プローブを使用して現在分析されている組織病理学的に重要な巨大分子の検出レベルを下げ、臨床的または研究的応用にも役立つことができる。例えば、ＤＮＡプローブ検出に現在使用されている増幅−視覚化法には、化学発光生成物、蛍光生成物または着色した不溶性沈殿を生じる酵素−触媒反応を含む。典型的にはこれらの技法において、標識した核酸プローブを、溶液中または不活性支持体に固定化された相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列とアニールさせる。標識プローブ（通常、放射性元素を含むか、または通常のリガンド−結合タンパク質法を介して酵素に付いているいずれかのオリゴヌクレオチド）の結合は、反応混合物中の標的配列の存在または不在を報告する。ＤＮＡプローブ増幅視覚化法を使用する臨床応用例は、酵素−標識ＤＮＡプローブを使用するウイルス、発癌遺伝子または多耐性遺伝子のための試験である。 Schmeltzer,H.ら(Experimental Hematology 15,877-882,1987)は、寒天カルチャー中の造血コロニーを免疫学的に染色するためのin situ法を開示する。コロニーは従来の発色酵素免疫アッセイにより検出される。このアッセイは、酵素反応が細菌連鎖反応の引き金を引く本発明よりもはるかに感度が低い。発明の要約本発明は、標的分子に結合する生物分子プローブの使用を通して、標的分子および被検体を検出するための試験キットおよび方法に関する。本発明の基礎にあるのは、細菌連鎖反応(bacterial chainreaction:BCR)であり、これは革新的な増幅−視覚化システムである。ＢＣＲは被検体を検出するために生細胞を使用する。本明細書に記載するこの革新的方法は、試料中の被検体の存在を測定するために有用である。この方法には、被検体を含有すると思われる試料を提供し、そして存在する任意の被検体を多機能性プローブと複合し、該プローブは結合ドメインおよび成長促進活性ドメインの両方を有し、多機能性プローブ−被検体複合体を形成し、ここで成長促進活性ドメインは予め選択した調節物質に作用して増殖性細胞の成長を促進することができ【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１０月１６日【補正内容】請求の範囲１．（ａ）被検体を含むと思われる試料を提供し；（ｂ）該試料を多機能性プローブと接触させ、もし該被検体が存在するならば成長促進活性と被検体とを近接させ、そしてプローブ−被検体複合体を形成し、該プローブは結合ドメインおよび成長促進活性ドメインの少なくとも両方を有し、該成長促進活性ドメインは増殖性細胞の成長を促進することができ；（ｃ）該プローブ−被検体複合体がバックグラウンド上で検出できるように、十分量の非結合多機能性プローブを除去し；（ｄ）工程（ｂ）の多機能性プローブの成長促進ドメインを調節する物質および成長が工程（ｂ）の複合体の成長促進活性により増強される増殖性細胞の両方を含む反応マトリックスと接触させることにより被検体を検出するために生細胞を利用する増幅−視覚化系を形成し；（ｅ）反応マトリックス内で成長促進環境を形成し、そして該増殖性細胞の成長を可能とするために十分な時間、工程（ｄ）の反応系をインキューベーションし、そして（ｆ）バックグラウンド上に新たな該増殖性細胞の存在を観察する、工程を特徴とする試料中の被検体の存在を測定する方法。２．工程（ｃ）の除去が、上記系から非結合の多機能性プローブを洗浄することにより行われることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。３．工程（ｃ）の除去が、非結合の多機能性プローブを不活性化するが物理的には存在するように残すことにより行われることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。４．上記成長促進活性が酵素的であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。５．調節物質が抗生物質であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。６．増殖性細胞が、細菌、昆虫−由来細胞および藻類細胞から選択されることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。７．上記結合ドメインがモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。８．被検体が細胞表面抗原であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。９．上記被検体が哺乳動物腫瘍細胞のマーカーであることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。１０．上記試料が血液または骨髄であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。１１．被検体が第二の透過細胞内に位置し、そして第１プローブが上記多機能性プローブと組み合わせて使用されることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。１２．被検体が核酸であり、そして第１プローブがハプテン化ポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求の範囲第１１項に記載の方法。１３．上記増殖性細胞が発光しており、そして上記検出工程は感光フィルムを反応マトリックスに、該感光フィルムを十分に露光するのに十分な時間適用し、そして該フィルムを現像することを含むことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。１４．試料中の被検体を検出するためのキットであって、（ａ）試料保持手段；（ｂ）成長促進活性と被検体とを近接させ、そして細胞成長促進ドメインおよび被検体結合ドメインの両方を有する多機能性プローブ；（ｃ）ヒドロゲル、増殖細胞および多機能性プローブの成長促進ドメインを調節する物質を含んで成る反応マトリックス、該細胞および該物質は該ヒドロゲル中に均一に分散しており、そして該マトリックスは裏材材料に固定されている、を含んで成り、そしてここで、該反応マトリックスは増殖細胞の存在中、プローブ−被検体複合体を維持し、そして多機能性性プローブがプローブの領域内に細胞成長を促進するように作用できる基質を提供する、上記キット。１５．ブロット中に存在する被検体を検出するための、請求の範囲第１４項に記載のキットの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）被検体を含むと思われる試料を提供し；（ｂ）該試料を、もし該被検体が存在するならばプローブ−被検体複合体を形成する多機能性プローブと接触させ、該プローブは結合ドメインおよび成長促進活性ドメインの少なくとも両方を有し、該成長促進活性ドメインは増殖性細胞の成長を促進することができ；（ｃ）該プローブ−被検体複合体がバックグラウンド上で検出できるように、十分量の非結合多機能性プローブを除去し；（ｄ）調節物質および成長が工程（ｂ）の複合体の成長促進活性により増強される増殖性細胞の両方を含む反応マトリックスと接触させることにより細菌連鎖反応系を形成し；（ｅ）反応マトリックス内で成長促進環境を形成し、そして該増殖性細胞の成長を可能とするために十分な時間、工程（ｄ）の反応系をインキューベーションし、そして（ｆ）バックグラウンド上に新たな該増殖性細胞の存在を観察する、工程を特徴とする試料中の被検体の存在を測定する方法。２．工程（ｃ）の除去が、上記系から非結合の多機能性プローブを洗浄することにより行われることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。３．工程（ｃ）の除去が、非結合の多機能性プローブを不活性化するが物理的には存在するように残すことにより行われることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。４．上記成長促進活性が酵素的であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。５．調節物質が抗生物質であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。６．増殖性細胞が、細菌、昆虫−由来細胞および藻類細胞から選択されることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。７．上記結合ドメインがモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。８．被検体が細胞表面抗原であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。９．上記被検体が哺乳動物腫瘍細胞のマーカーであることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。１０．上記試料が血液または骨髄であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。１１．被検体が第二の透過細胞内に位置し、そして第１プローブが上記多機能性プローブと組み合わせて使用されることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。１２．被検体が核酸であり、そして第１プローブがハプテン化ポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求の範囲第１１項に記載の方法。１３．上記増殖性細胞が発光しており、そして上記検出工程は感光フィルムを反応マトリックスに、該感光フィルムを十分に露光するのに十分な時間適用し、そして該フィルムを現像することを含むことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。１４．キットが（ａ）試料保持手段；（ｂ）ヒドロゲル、増殖細胞および調節物質を含んで成る反応マトリックス、該細胞および該物質は該ヒドロゲル中に均一に分散しており、そして該マトリックスは裏材材料に固定されている、ならびに（ｃ）細胞成長促進ドメインおよび被検体結合ドメインの両方を有する多機能性プローブ、を含む、試料中の被検体を検出するための上記キット。１５．ブロット中に存在する被検体を検出するための、請求の範囲第１４項に記載のキットの使用。