JPH10513343A

JPH10513343A - テロメラーゼの蛋白質成分

Info

Publication number: JPH10513343A
Application number: JP8519939A
Authority: JP
Inventors: グレイダー，キャロル; コリンズ，キャスリーン; コバヤシ，リュウジ; ヘレナヤン，ザイアオホン; エム．ヘミシュ，ジル; オーテグザイアー，チャンタル
Original assignee: コールドスプリングハーバーラボラトリー
Priority date: 1994-12-19
Filing date: 1995-12-18
Publication date: 1998-12-22
Also published as: WO1996019580A2; WO1996019580A3; EP0799315A2

Abstract

(57)【要約】テトラヒメナテロメラーゼの蛋白質成分のアミノ酸配列をコードする遺伝子ならびにその調製方法および使用が開示される。蛋白質成分は、８０ｋＤおよび９５ｋＤのポリペプチドという２つのサブユニットポリペプチドからなる。ヒトテロメラーゼの蛋白質成分の検出方法およびその使用も開示される。テロメラーゼの蛋白質成分を用いて、癌、微生物病および他の不調におけるテロメラーゼ活性の検出のための診断手段を開発し、テロメラーゼ活性を阻害または亢進する治療用化合物を生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】テロメラーゼの蛋白質成分発明の背景染色体の安定性は、細胞の生存能力に必須である。真核細胞は、直鎖状の染色体ならびに分解および組み換えから染色体を守る末端を覆うテロメアを有する。細胞増殖の間のテロメアＤＮＡの損失は、老化および癌において重要な役割を果たしている。カウンター（Counter，C.M．）ら、EMBO,11:1921-1929(1992)。テロメア配列は、真核生物において、高度に保存されている。ＤＮＡ配列は、特異的ＧＴに富むモチーフの単一の縦列反復を含む。正確な配列は、個々の生物の特徴をなし；すなわち、テトラヒメナ(Tetrahymena)においてはｄ（ＴＴＧＧＧＧ）、オキシトリシャ(Oxytricha)においてはｄ（ＴＴＴＴＧＧＧＧ）およびヒトにおいてはｄ（ＴＴＡＧＧＧ）である。いかなる一定の染色体末端の反復数も変化し、サザンブロットにおいて異質性または見かけ上「あいまいな」特徴をテロメアに付与する。配列の保存性に加え、テロメアの機能も真核生物において保存されている。テトラヒメナおよびヒトのテロメアは、酵母サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）で機能し、酵母テロメアは、他の菌類で機能する。スゾスタークとブラックバーン（Szostak，J.W．and E.H．Blackburn ）(1982)Cell，29:245-255。従って、安定な末端を維持する機構が、多様な真核生物において必須の特徴を共有しているに違いない。テロメア配列は、テロメラーゼと呼ばれる高度に特殊化されたＤＮＡポリメラーゼにより染色体末端で合成される。テロメラーゼは、ＲＮＡおよび蛋白質成分両方がテロメラーゼ活性に必須であるリボヌクレオ蛋白質酵素である。ＲＮＡ成分は、テロメア反復合成の鋳型を提供する。ブラックバーン（Blackburn E.H.）、(1992)Annu．Rev．Biochem.，61:113-129。テロメアの複製は、テロメアの短小化とテロメアの伸長化間の平衡を確立することを含む。ＤＮＡ−鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ分子の真の末端を複製できないことから、ＤＮＡの複製は、テロメアの短小化を導く。テロメラーゼは、de novo の配列付加を通して染色体を伸長する。次いで、ＤＮＡ−鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーによる二本鎖合成が、相補的なＣに富む鎖を埋める。テロメラーゼのＲＮＡ成分は、ヒト(Feng，J.，et al．(1995)Science 269:12 36-1241)、マウスおよびいくつかの哺乳類種（Greider，C.,未刊行のデータ）ならびにサッカロミセスセレビシエ、テトラヒメナ、ユープロテス(Euplotes)およびオキシトリシャで配列決定されている。シンガーとゴットシュリング(Singer and Gottschling)、(1994)Science，266:404-409;リングナー(Lingner)ら、(199 4)Genes & Development，8:1984-1988;ロメロとブラックバーン(Romero，D．P． and E．H．Blackburn)、(1994)Cell，67:343-353 参照。いかなる種由来のテロメラーゼの蛋白質成分も、いまだ配列決定またはクローニングされていない。発明の概要哺乳類を含む真核生物起源のテロメラーゼ蛋白質成分をコードする遺伝子、該遺伝子によりコードされるテロメラーゼ蛋白質、前記ポリペプチドをコードするＲＮＡおよびこれらの遺伝子とハイブリダイズする配列が本明細書に記載されている。本明細書に記載されるように、テロメラーゼ蛋白質成分をコードするゲノム配列が、本出願人により決定された。テロメラーゼのＲＮＡおよび蛋白質両成分は、染色体のテロメア長の維持に必須である。テロメラーゼの蛋白質成分は、診断もしくは治療法およびテロメラーゼのアッセイにおいて、それ自体またはＲＮＡ成分と組み合わせて用いることができる。本明細書で記載されるように、テトラヒメナのテロメラーゼ蛋白質成分をコードするテトラヒメナ遺伝子を単離し、シーケンスした。これらの遺伝子によりコードされるポリペプチドは、８０ｋＤおよび９５ｋＤのポリペプチド（それぞれ、ｐ８０およびｐ９５）であることが示された。ポリペプチドは、ＲＮＡ成分と結合して、テロメアＴＴＧＧＧＧ反復を追加するように作用して染色体テロメア長を安定化する蛋白質からなる。また、本発明は、開示されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列およびその一部、これらのＤＮＡ配列に相補的な配列ならびにセンスもしくは相補的（アンチセンス）配列またはその断片のいずれかとハイブリダイズする、例えばプローブ等の配列を提供する。特に、テトラヒメナのテロメラーゼ蛋白質成分である８０ｋＤおよび９５ｋＤのポリペプチドを単離し、シーケンスした。蛋白質成分の８０ｋＤおよび９５ｋＤのポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に開示され、８０ｋＤおよび９５ｋＤの蛋白質をコードするＤＮＡ（核酸）配列も同様である。さらに、ほとんどの真核細胞により翻訳されるｐ８０およびｐ９５テロメラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が開示される。これらのＤＮＡ配列は、プラスミドに取り込まれ、該プラスミドはベクターに形質転換される。これらのベクターを含んでいる宿主細胞は、組み換えテロメラーゼ蛋白質成分を製造するために提供される。また、開示された配列と実質的に同等のＤＮＡ配列およびポリペプチド配列の両配列も、本発明により提供される。テトラヒメナの蛋白質成分をコードするＤＮＡ配列を用いて、他の非脊椎動物および脊椎動物種の蛋白質成分、特に、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、チンパンジーまたはサル等の哺乳類種のテロメラーゼ蛋白質成分をコードするＤＮＡ配列を決定する方法も含まれる。また、本研究は、哺乳類、特にヒト個体が、異常なテロメラーゼ活性が症状もしくは原因である障害または疾病にかかる可能性があるかを決定する利用可能な方法を作製する。テロメラーゼ発現の検出方法は、ヒトまたは他の動物の不死化細胞または癌細胞の成長の傾向を診断する手段として提供される。１つの態様において、細胞または組織試料に存在するＤＮＡまたはＲＮＡが、テロメラーゼ蛋白質成分遺伝子の全部または一部と相補的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブとハイブリダイズする。本明細書で用いる場合、「テロメラーゼ蛋白質成分遺伝子」という用語は、配列が本明細書に記載されている遺伝子、該遺伝子またはその一部とハイブリダイズする遺伝子およびヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、チンパンジー、サルまたはテトラヒメナ等の他の種由来の同等な遺伝子を含む。ハイブリダイゼーションの検出は、癌または不死化細胞を生じる他の障害の成長、または存在の指標ではある。本発明の重要な特徴は、テロメラーゼの蛋白質成分を用いて、細胞でテロメラーゼの発現および／または活性を阻害するために使用可能なテロメラーゼ阻害剤をスクリーニングすることができることである。個体自身の細胞および組織内、侵入した寄生虫の外来細胞中または真核生物である疾病生物のいずれかで異常なテロメラーゼ活性により発病した個体を同定および治療する方法の基礎として、蛋白質成分を用いることができる。従って、本発明は、テロメラーゼ活性阻害剤を試験および改良することができ、かつ、癌等の疾病または酵母もしくは原生動物病等の感染症が診断できる診断道具を提供する。本発明の他の態様は、例えば、８０ｋＤもしくは９５ｋＤのポリペプチドの一方もしくは両方、合成テロメラーゼポリペプチド配列またはこれらのポリペプチドの一部に対する抗体等のテロメラーゼ蛋白質成分に対する抗体である。これらは、例えば、本発明の８０ｋＤおよび９５ｋＤのポリペプチドのいずれかまたは両方と結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体等のポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む。かかる抗テロメラーゼ抗体は、細胞および組織中のテロメラーゼ活性の検出に有用である。さらなる態様は、テロメラーゼサブユニットに対する遺伝子のいずかまたは両方を、単独またはテロメラーゼのＲＮＡ成分をコードする遺伝子等の他の遺伝子と組み合わせて含有する組み換えおよび／または形質転換細胞を包含する治療法および処置法を含む。抗テロメラーゼ抗体を産生する組み換えまたは形質転換細胞も同様に含まれる。かかる方法は、異常なテロメラーゼ活性から生じた障害の治療に適用可能であり、また、細胞死を予防するためにテロメラーゼ発現を増加または誘発するために使用可能である。図面の簡単な説明図１は、テトラヒメナ８０ｋＤ蛋白質遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１）である。ヌクレオチド配列は、ゲノムおよびｃＤＮＡクローンから由来する。図２は、図１で示したヌクレオチド配列から推定した８０ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：２）である。図３は、テトラヒメナ９５ｋＤ蛋白質遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：３）である。図４は、図３で示したヌクレオチド配列から推定した９５ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：４）である。図５は、１２個のデオキシリボヌクレオチド配列（プライマー１〜１２）からなるプライマーセット１である。図６は、１２個のデオキシリボヌクレオチド配列（プライマー１３〜２４）からなるプライマーセット２である。図７は、１０個のデオキシリボヌクレオチド配列（プライマー２５〜３４）からなるプライマーセット３である。図８Ａ−８Ｂは、１８個のデオキシリボヌクレオチド配列（プライマーＦ１〜Ｆ９およびＲ１〜Ｒ９）からなるプライマーセット４である。図９は、１０個のデオキシリボヌクレオチド配列（プライマーＦ１０〜Ｆ１４およびＲ１０〜Ｒ１４）からなるプライマーセット５である。図１０は、遺伝子工学的ｐ８０遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：８）である。図１１は、遺伝子工学的ｐ９５遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：９）である。発明の詳細な説明本発明は、真核生物テロメラーゼ蛋白質成分をコードする遺伝子、かかる遺伝子によりコードされるポリペプチドならびにポリペプチドをコードするＲＮＡ、相補的ヌクレオチド配列および該ヌクレオチド配列のセンスおよび相補的部分にハイブリダイズするプローブに関する。さらに、８０ｋＤおよび９５ｋＤテロメラーゼ蛋白質成分をコードする合成遺伝子、これらの遺伝子によりコードされる組み換えポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＲＮＡ、これらの遺伝子を合成するために用いるプライマーおよび相補的ヌクレオチド配列またはそれらの断片が提供される。当業者であれば、多くの異なるＤＮＡ配列が単一の蛋白質をコードすることができることを認識するであろう。前記遺伝子および他のヌクレオチド配列に加え、触媒活性なテロメラーゼ蛋白質成分をコードするＤＮＡ配列およびこれらのＤＮＡ配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列も本発明の範疇であると考えられる。一般に、これらは、中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明によれば、「ストリンジェントな条件」という用語は、６２°〜６６℃で４ｘＳＳＣ（ＮａＣｌ−クエン酸塩緩衝液）の塩濃度からなるハイブリダイゼーションの条件を意味し、「高ストリンジェントな条件」とは６８℃で０．１ｘＳＳＣの塩濃度からなるハイブリダイゼーションの条件を意味する。アウスベル(Ausubel)ら、(1994)Current Protocols in Molecular Biology，John Wile y & Sons，Inc.。これらの配列を用いて、他のテロメラーゼ成分を推論する方法が記載されている。テロメラーゼの蛋白質成分、該蛋白質成分をコードするヌクレオチド配列またはその一部を用いる診断方法および治療方法も含まれる。以下の本発明の態様の説明ならびに実験手順を記載した以下の実施例により、本発明の原理を説明する。材料と方法に対するすべての参考文献は、参照により本明細書に取り込まれる。また、本発明は、本明細書に記載されたポリペプチドを含む真核生物起源のテロメラーゼ蛋白質成分からなるポリペプチドも包含する。テロメラーゼ蛋白質成分からなり、テロメラーゼ成分として活性なすべてのポリペプチドは、本発明および本明細書で用いるテロメラーゼ蛋白質成分という用語により包含される。テロメラーゼ蛋白質成分は、以下の方法により「実質的に純粋な」型で製造される。「実質的に純粋な」とは、テロメラーゼＲＮＡ成分と結合した際にテロメラーゼ活性を示す最小のアミノ酸配列として定義される。テトラヒメナ蛋白質成分遺伝子容易に利用できるクロマトグラフィーマトリックスを用いて、テトラヒメナのテロメラーゼ酵素を精製した。２つの基準を用いて、以下の酵素精製を行った。第１に、標準テロメラーゼ測定法（Greider，C．W．(1987)Cell，51:887-898）を用いて活性測定を行い、32Ｐ−ｄＧＴＰの取込みは、ＤＥ−８１ペーパー上にスポットし、取り込まれたカウントを決定することにより定量した（Greider，C ．W．(1987)Ph．D．Thesis，Univ．Calif．Berekley）。第２に、テロメラーゼＲＮＡをノーザンブロット分析に付し、既知の量の合成テロメラーゼＲＮＡ標準のタイターとの比較により定量した。ヒドロキシルアパタイト、スペルミンアガロース、セファロースＣＬ−６Ｂ分粒カラム、フェニル−セファロース、ＤＥＡＥアガロース（またはＱ−セファロース）および１５ないし２０〜３５％グリセロール勾配の精製により、高度に精製されたテロメラーゼ画分を得た。活性画分中に、８０および９５ｋＤの２つの優勢な蛋白質が同定され、テロメラーゼ活性と共に共精製され、テロメラーゼＲＮＡと化学量論的に同等存在した。前記のように精製された物質の２つの試料を、未変性ゲル上で分離した。ゲルの１つのレーンをノーザンブロッティングして、テロメラーゼＲＮＡの位置を同定し、他のレーンを未変性ゲルから切り出し、ＳＤＳＰＡＧＥゲル上で二次元泳動した。大部分の蛋白質は、一次元目の未変性ゲルのウエル近くに留まったが、テロメラーゼＲＮＡならびにｐ８０およびｐ９５蛋白質両方とも、未変性ゲルの約３分の１の行程泳動し、同じ位置であった。このことは、ｐ８０およびｐ９５がテロメラーゼの成分であることを示唆する。３００Ｌすなわち１．２×１０¹¹ 細胞から出発して、最終グリセロール勾配中の活性画分は、１マイクログラムを越えるテロメラーゼＲＮＡを含んでいた。このことにより、共精製ポリペプチドをシーケンスするのに十分な材料があることを示された。ｐ８０およびｐ９５画分がテロメラーゼ活性からなるか、同様の性質を有して泳動した汚染物かを決定するために、テロメラーゼをミクロコッカスヌクレアーゼで処理した。従前の実験により、テロメラーゼＲＮＡの限定切断は完全にテロメラーゼ活性を不活化しないことが証明されている。Greider，C．W．and E．H. Blackburn（1989）Nature，337: 331-337。グリセロール勾配分析のために精製テロメラーゼの２つの画分を調製し、ＲＮＡの切断がグリセロール勾配でＲＮＰの移動度を変えるかどうかを決定した。一方の試料をミクロコッカスヌクレアーゼで短時間処理し、他方は緩衝液のみでインキュベートした。これらの試料をグリセロール勾配沈降させ、各勾配から画分を集めた。活性を測定し、蛋白質プロフィルを決定した。未処理画分では、ｐ８０およびｐ９５を有する画分８および９で、活性がピークを示した。ミクロコッカスヌクレアーゼ処理画分では、画分１０で弱い活性のピークを示し、ｐ８０およびｐ９５のピークも画分１０にシフトしたということは、これらの蛋白質がテロメラーゼ成分として予想される挙動を示すことを示唆する。勾配中の他のほとんどの蛋白質沈降物は、テロメラーゼの沈降物中の変化に比べて変化しないままであった。ｐ８０およびｐ９５の両方から部分ペプチド配列を決定した。２つのポリペプチドの完全なアミノ酸配列は、同様にして決定することが可能である。３４４Ｌのテトラヒメナ細胞由来のテロメラーゼを、未変性ゲル電気泳動およびＳＤＳＰＡＧＥ電気泳動の前にＤＥＡＥアガロース濃縮行程を追加して前記手順に従って精製した。蛋白質の直接Ｎ末端シーケンスに伴う問題を避けるために、切り出した蛋白質のバンドをアクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼで消化した。ペプチド断片をゲルから抽出し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムで分離した。いくつかの十分に明らかにされたペプチドピークを、Applied Biosystems自動シーケンサーで、連続エドマン分解に付した。テロメラーゼの２つの分離した調製物から、ｐ８０由来の７個のペプチドおよびｐ９５由来の２５個のペプチドに対してアミノ酸配列を決定した。テトラヒメナコドンバイアスを指針として用いて、縮重オリゴヌクレオチドをデザインした。マーチンデール(Martindale，D．W. )（1989）J．Protozol．36: 29-34。オリゴヌクレオチドを２つのセットで用いて、逆転写されたＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物を得た。各蛋白質遺伝子に対して、２つのＰＣＲ産物が得られた。４つのＰＣＲ産物の内３つの配列は、蛋白質のシーケンスにより同定されたが、ＰＣＲのプライマーとして使用しなかったペプチドをコードした（図２および４）。ｐ８０またはｐ９５蛋白質のいずれかに対するＰＣＲ産物をプローブに用いるゲノミックサザンブロットにより、該遺伝子はテトラヒメナゲノム内にシングルコピーとして存在する可能性があることが示された。活発に生育している細胞由来のノーザンブロット分析により、ｐ９５に対する約３．０ｋｂのシングルバンドおよびｐ８０ｍＲＮＡに対する２．５ｋｂのシングルバンドが示された。静止細胞由来のＲＮＡは、９５ｋＤ遺伝子の５’部分をプローブとして用いた場合に２つのバンドを示した。このことにより、この遺伝子の選択的プロセシングが示唆される。フルレングスの蛋白質配列を得るために、クローニングされたＰＣＲ産物を、テトラヒメナｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの両方に対するプローブとして用いた。陽性のクローンが得られ、サブクローニングし、シーケンスした。この配列は他の真核生物のものとは異なるので、これらの蛋白質配列を推定するために、テトラヒメナ遺伝コードを用いた。プレスコット(Prescott，D ．M.)（1994）Microbiol．Rev.，58:233-267。本出願人は、ｐ８０およびｐ９５蛋白質の両方に対する全読み取り枠（ＯＲＦ）の配列を決定した（それぞれ、図１、配列番号：１および図３、配列番号：３）。ヌクレオチド配列は、ゲノミックおよびｃＤＮＡクローン由来であり、ｍＲＮＡのポリアデニル化は、報告された配列の３’末端の近傍で起こる。第１に、ｐ８０およびｐ９５ｍＲＮＡのノーザンブロット分析により約２．４７および２．９ｋｂのサイズが示唆される。本出願人は、これらのｍＲＮＡに対する２．４および２．８ｋｂを越える配列を得た。第２に、すべての確実なペプチド配列が、ＯＲＦに見出された（ｐ８０に対して７／７；ｐ９５に対して２５／２５）。第３に、最長のＯＲＦ中の最初のメチオニンコドンからの示唆されるｍＲＮＡの翻訳により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる蛋白質分析から推定される分子量と同等またはやや大きい推定蛋白質産物が得られる。第４に、コード領域として翻訳される領域外の配列は、テトラヒメナ遺伝子の特徴である、コード領域よりも高いＡ／Ｔ含量を含んでいる。プレスコット(Prescott，D．M.)（1994）Microbiol．Rev.，58: 233-267。いずれの遺伝子も、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＫＭＢＬ、ＰＩＲおよびＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに対応物を有さない。８０ｋＤおよび９５ｋＤ蛋白質がテロメラーゼの成分であることを示すために、該２つの蛋白質に対するポリクローナル抗体を作製した。各蛋白質から２つの異なる領域に対応する合成ペプチドを合成した。８０ｋＤ蛋白質のペプチドに対する２つのポリクローナル抗体（Ａ８１およびＡ８２と命名）および９５ｋＤ蛋白質のペプチドに対する４つの抗体（Ａ８３、Ａ８４、Ａ８５およびＡ８６と命名）が、それぞれの蛋白質に対してよい力価を示した。表１は、用いた種々のペプチド配列に対する得られた抗体を記載している。ペプチド配列表は、直接ＰＣＲ産物の蛋白質シーケンスから得られた。最初のペプチドは、シーケンスの予備試験に由来するものであり、遺伝子がクローニングされた後誤りであることが決定した。後に、このペプチドおよびこれに対する抗体を対照として用いた。Ａ８５およびＡ８６を作製するためにラビットに注射したペプチドは、クローニングされた配列と比較して１つのエラー（第２番目の位置にＴの欠失）を有するが、このペプチドに対する抗体は、９５ｋＤ蛋白質と交差反応する。担体の蛋白質にペプチドを結合させるために、合成の間にＮ末端のＣ残基を各ペプチドに付加した。これらの抗体の中で、８０ｋＤ蛋白質に対する最も高い親和性を有するもの（Ａ８２）および９５ｋＤ蛋白質に対する最も高い親和性を有するもの（Ａ８６）を用いて、８０ｋＤおよび９５ｋＤポリペプチドが両方ともテロメラーゼ活性を有して共精製されることが立証され、これらの蛋白質はテロメラーゼ成分であることが示唆された。８０ｋＤ蛋白質に関する免疫沈降研究の結果は矛盾がなく、８０ｋＤ蛋白質がテロメラーゼの機能成分であることを示唆する。合成蛋白質成分遺伝子他の真核生物においてテロメラーゼ蛋白質成分をコードする遺伝子を作製するために、テトラヒメナ遺伝コードを変えて、大部分の真核生物、すなわち、ヒト等の哺乳類において使用／翻訳される遺伝コードを有する生物体で正しい翻訳および転写を可能にした合成遺伝子配列を構築した。オリゴヌクレオチドの重複セット（プライマーセット）から、該遺伝子を遺伝子断片として合成し、次いで、プラスミドにクローニングした。プラスミド中で断片を結合させることにより、フルレングスの遺伝子を構築した。ｐ８０遺伝子をプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中で構築し、ｐ９５遺伝子をプラスミドｐＳＥ２８０中で構築したが、いかなるプラスミドも使用できる。ｐ８０およびｐ９５蛋白質を発現させるために、合成遺伝子をｐＲＳＥＴベクターおよびｐＢｌｕｅＢａｃベクターの異なる制限部位にクローニングした。ＰＲＳＥＴおよびｐＢｌｕｅＢａｃ中の遺伝子の転写および翻訳により、それぞれ、大腸菌およびバキュロウイルス中で組み換え蛋白質を作製した。各組み換え蛋白質の末端のＨｉｓ−タグおよび切断部位は、蛋白質の精製を容易にする。大腸菌およびｐ８０およびｐ９５遺伝子構築物を含むｐＲＳＥＴ等のベクターを用いて、または別法としてバキュロウイルスおよび同じ構築物を含むｐＢｌｕｅＢａｃ等のベクターを用いて、組み換えｐ８０およびｐ９５が発現され得る。従って、本出願人は、ｐ８０およびｐ９５テロメラーゼ蛋白質成分の発現を可能にする最初の公知の細菌株または発現ベクターを製造した。本発明の１つの態様は、宿主細胞における１以上の組み換えテロメラーゼ蛋白質成分の製造である。１つの方法は、蛋白質またはその類似体をコードする遺伝子を含む宿主細胞を、蛋白質の製造を可能にする条件下で培養することからなる。１つの態様において、該方法は、蛋白質の一定量を回収する工程ならびに精製工程をさらに含むものである。当業者であれば、本発明の組み換え蛋白質を調製することができる種々の方法を認識するであろう。組み換え蛋白質およびその断片は、テロメラーゼの触媒活性を刺激または阻害する薬剤を検出するのに有用である。それらは、腫瘍細胞中のテロメラーゼ活性、またはある化合物への曝露に対する応答におけるテロメラーゼの刺激もしくは阻害産生の検出等のスクリーニング法に対する抗体を製造するのにも有用である。また、本発明によれば、ポリペプチドの他のテロメラーゼ蛋白質およびＲＮＡ成分との結合能力またはテロメラーゼの酵素活性に影響を与えることなく、ゲノムＤＮＡによりコードされるテロメラーゼポリペプチド由来のアミノ酸配列が変異したテロメラーゼポリペプチド（すなわち、テトラヒメナテロメラーゼポリペプチド等の天然のテロメラーゼポリペプチドとは異なる）も含まれる。これらの変異は、アミノ酸配列に対する付加、欠失、置換および他の変化（例えば、アミノ酸残基の修飾等）を含んでもよい。テトラヒメナのテロメラーゼ蛋白質成分をコードする遺伝子、合成遺伝子またはプライマーを用いて、本明細書に記載の公知の方法を用いて、ヒトテロメラーゼ蛋白質成分および他の哺乳類テロメラーゼ蛋白質成分をクローニングすることができる。２つのアプローチを用いて、テトラヒメナの、合成またはプライマー配列を用いてヒトテロメラーゼ蛋白質遺伝子をクローニングすることができる。これらの手法は、以下の実施例に詳細に記載されている。第１のアプローチにおいて、ＤＮＡ配列ハイブリダイゼーションを用いて、テトラヒメナ蛋白質のヒトホモローグを同定およびクローニングすることができる。テトラヒメナ遺伝子をプローブとして、一連のストリンジェンシーを高めた条件でヒトゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡブロットを行なう。特異的バンドが同定された場合、ファージラムダベクターにクローニングされたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを同様のストリンジェンシーで探し、ヒトホモローグに対する遺伝子を同定する。陽性ファージの制限酵素地図を作製し、サブクローニングしてシーケンスする。第２のアプローチは、ｐ８０およびｐ９５蛋白質の両方の種々の領域に対する一連の抗体を製造することである。前記抗体（Ａ８２およびＡ８６）を用いることができる。追加の抗体も合成ペプチドおよび融合蛋白質として作製し、交差反応性によりヒトテロメラーゼ蛋白質を同定するために用いることができる。蛋白質の一部を発現するヒトまたは他の哺乳類のｃＤＮＡライブラリーから、抗体をプローブとして用いて、標準的な分子生物学的手法によりヒトまたは哺乳類の遺伝子をクローニングすることができる。サンブルック(Sambrook)ら、(1989)Mole cular Cloning -A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Sprin g Harbor Laboratory，NY を参照。ヒトテロメラーゼは、抗癌療法にとって優れたターゲットである。テトラヒメナ酵素の蛋白質成分の有効性は、テロメラーゼの生化学の完全な理解を容易にし、特異的抗テロメラーゼ薬剤の同定の助けとなる。テロメラーゼ活性は、７０を越えるヒト不死化細胞株および癌組織で見出されているが、ヒト初代培養体細胞または組織ではほとんど見つかっていない。キム (Kim)ら、(1994)Science 266: 2011-2015。テロメア長の維持は、寿命の限られているヒト初代培養体細胞では起こらない。インビトロまたはインビボで初代培養細胞が分裂したとき、テロメア長は短くなる。生殖細胞は、この短小化を示さない。オールソップ(Allsopp)ら、(1992)PNAS 89: 10114-10118; ハーレー(Har ley)ら、(1990)Nature，337: 331-337; バジリ(Vaziri)ら、(1993)Amer．J．Hu m．Genet．52: 661-667。テロメラーゼ活性は、不死化ヒトＨｅＬａ細胞中に存在するけれども（Morin，G．B．(1989)Cell 59: 521-529）、テロメラーゼは、初代培養繊維芽培養物で検出されていない。本出願人は、ヒト初代培養細胞からＳＶ４０で不死化された細胞株を樹立して、テロメラーゼとテロメア短小化間の関係を調べた。初代培養およびＳＶ４０で形質転換したヒト胎児腎細胞の両方で、細胞を継代したとき、テロメアは短小化したが、テロメラーゼは検出されなかった。培養物が危機(crisis)を被ったとき、ほとんどの細胞株は死ぬが、生き残った不死化クローンでは、テロメラーゼ活性が検出され、テロメアは短いが安定に維持された。カウンター(Counter)ら、(1992)EMBO J．11:1921-1929。培養物中の初代培養マウス細胞で、同様な結果が得られた。プロウズとグライダー(Prowse，K．R．and C．W．Greider)（1995）PNAS 92: 4818。これらの結果より、初代培養細胞はテロメラーゼ活性をほとんどまたは全く発現しないが、不死化後の癌細胞はテロメラーゼを再活性化し、テロメア長を維持することが示唆される。事実、テロメラーゼ活性は、ヒト卵巣癌細胞で証明されていたが、正常子宮頸部内皮細胞では証明されていない。カウンター(Counter) ら、(1994)PNAS 91:2900-2904。危機前のテロメアの短小化は、致死的であるかもしれないが、テロメラーゼを再活性化できるこれらの細胞は、テロメア長を維持し、危機にもかかわらず生きている。このモデルにより、テロメラーゼが不死化細胞の生育に必要であるなら、テロメラーゼ阻害剤は、優れた抗癌剤となる。本研究により、正常にはテロメラーゼを発現しない体細胞におけるテロメラーゼ活性を検出することにより、臨床的な症状の露見前またはその間に、癌を診断できる方法を提供する。体細胞または組織試料中でのテロメラーゼｍＲＮＡの発現は、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて検出可能であり、このことは、テロメラーゼ発現の指標であり、体細胞は正常にはテロメラーゼを産生しないので、次には不死化癌細胞の指標である。ハイブリダイゼーシュンの検出は、細胞の不死化もしくは癌、または癌もしくは不死化細胞の存在の傾向の指標である。ハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子またはその断片をハイブリダイゼーシュン分析に用いて、アウスベル(Ausubel)ら、(1994) Current Protocols in Molecular Biology，(Suppl．26)，John Wiley & Sons, Inc．に記載の方法に従って、中程度のストリンジェンシーの条件下で、相補的ポリヌクレオチドを検出することが示される。真核生物の組織試料または真核細胞の試料中の不死化細胞の存在または不死化の傾向を検出する１つの態様において、核酸をプローブまたはプライマーとして用いる。この態様は、下記工程からなる：ａ）真核生物から組織試料または細胞試料を得る工程；およびｂ）試料中のテロメラーゼの存在を決定する工程、試料がテロメラーゼの存在を示した場合、不死化細胞または不死化への傾向が存在する。同じ方法を用いて、癌の傾向または癌細胞もしくは癌組織の存在を検出してもよい。また、哺乳類のテロメラーゼの発現は、ｐ８０もしくはｐ９５ポリペプチドサブユニット、両サブユニットまたはその断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて検出することができる。１つの抗体が両サブユニットを検出してもよいし、それぞれが異なるサブユニットを検出する２つの抗体を用いることもできる。例えば、個体由来の体細胞または腫瘍細胞試料を、（もし存在するならば）テロメラーゼを抗体との結合に利用できるように加工または処理した後、抗テロメラーゼ抗体と接触させることができる。抗体の結合は、テロメラーゼの存在の指標となり、従って、細胞の不死化または癌への傾向または癌細胞もしくは不死化細胞の存在の指標である。抗体を用いて真核生物の組織試料または真核細胞試料中のテロメラーゼを検出する方法は、下記工程からなってもよい：ａ）真核生物から組織試料または細胞試料を得る工程；およびｂ）試料を処理してテロメラーゼを抗テロメラーゼ抗体と結合できるようにし、そうすることによって、処理された試料を製造する工程；ｃ）処理された試料を、テロメラーゼに対する（ポリクローナルまたはモノクローナル）抗テロメラーゼ抗体と接触させる工程；およびｄ）テロメラーゼの抗体の結合を検出する工程、結合が起こった場合、テロメラーゼが存在する。抗体検出は、例えば、癌細胞の成長および癌もしくは不死化細胞の存在等で起こる細胞の不死化を検出するためばかりでなく、下記のように、多細胞生物の細胞および組織中の外来真核細胞の存在を検出するためにも有用である。本発明は、テロメラーゼ活性を破壊または不活化もしくは干渉する薬剤および医薬化合物を開発する方法も提供する。テトラヒメナのテロメラーゼ活性を阻害または不活性化する化合物は、哺乳類のテロメラーゼにおけるその効果についても評価することができる。ＲＮＡ成分を有するかまたは有さないテロメラーゼ蛋白質成分を用いて、下記抗癌剤および抗菌剤として有効な薬剤および医薬化合物をスクリーニングすることができる。さらに、別のテロメラーゼ活性が、抗老化効果を有し、テロメア長の安定化により細胞の回復を生じるかもしれないので、テロメラーゼ活性を刺激または誘導する可能性について、化合物をスクリーニングすることができる。蛋白質成分をテロメラーゼのＲＮＡ成分と結合させて、通常の方法により細胞に送達することができる機能的なテロメラーゼ分子を製造することもできる。別の方法として、テロメラーゼ分子をコードするＤＮＡを、組み換えＤＮＡ手法および形質転換技術により標的細胞に導入することができる。機能的なテロメラーゼ分子の余分なコピーの取込みにより、テロメア長を安定化することにより宿主細胞の複製寿命が延長されるかもしれない。従って、本発明は、哺乳類における遺伝子治療法を含む。本発明の別の適用は、哺乳類の体細胞および組織で真核生物病を起こした生物の検出および生じた疾病の治療である。哺乳類の細胞および組織に進入し、種々の疾病の原因となる多くの真菌、原生動物および藻類さえも存在する。かかる疾病の例としては、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、カンジダ症、パラコクシジオイドミコーシス、マラリア、旋毛虫症、フィラリア症、トリパノソーマ症（眠り病）、住血吸虫症、トキソプラスマ症およびリーシュマニア症が挙げられるが、これらに限定されない。これらの生物はテロメラーゼを必要とし、正常ではテロメラーゼを産生しない宿主細胞内で増殖したときに、この酵素を発現する。前記テロメラーゼを検出する方法を用いて、これらの真核微生物寄生虫の早期検出および診断方法を開発することができる。個体由来の組織試料または真核細胞試料中の真核微生物により生じる疾病のかかる検出方法の例としては、下記工程を含んでもよい：ａ）個体から組織試料または細胞試料を得る工程；およびｂ）試料中のテロメラーゼの存在を決定する工程、試料が真核微生物のテロメラーゼを示した場合、真核微生物により生じた疾病が存在する。核酸プローブもしくはプライマーまたはテロメラーゼ蛋白質成分と結合する抗体を用いることにより試料中のテロメラーゼを決定することができるが、本明細書に記載された方法に限定されない。さらに、哺乳類体細胞はテロメラーゼを必要としないので、テロメラーゼ阻害剤およびテロメラーゼに対する抗生物質の使用は、宿主にとって非毒性であるかほとんど毒性を示さない、かかる疾病の治療法を提供する。例えば、トリパノソーマ種により生じる疾病を治療するために用いる薬剤のほとんどは、重篤な副作用および死まで起こす。トリパノソーマ種のテロメラーゼの８０ｋＤまたは９５ｋＤ蛋白質成分に対するアンチセンスＲＮＡまたはテロメラーゼに対する薬剤を用いて、テロメラーゼを阻害し、従って、宿主の体細胞および組織に影響を与えることなく、個体におけるこの寄生虫種の増殖を予防することができる。テロメラーゼの蛋白質成分をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンス核酸が、これらの医薬品に含まれる。テロメラーゼ活性を阻害または破壊する化合物は、通常の材料と方法を用いて、薬学的に許容され得る担体および／または他の賦形剤を含む医薬組成物に処方することができる。それらは、テロメラーゼ活性の異常なレベルから生じた疾病または状態を治療するために、ヒトまたは非ヒト動物に投与することができる。投与は、多くのものが公知である適当な処方を用いて、通常のいかなる経路（非経口、経口、吸入など）であってもよい。化合物は、活性な誘導体と無毒で反応する非経口投与に適する薬学的に許容され得る有機または無機担体物質等の通常の賦形剤と混合して用いることができる。特定の場合における活性な化合物の実質的に好ましい量を、利用する特殊な化合物、処方された特定の組成物、適用方法、適用の特定の位置および治療される個体に従って変えることが評価される。一定のレシピエントに対する用量は、身長、体重、年齢および治療対象の状態のタイプと厳しさ等の個体の特徴に基づいて決定される。本明細書に記載の処方は、家畜病治療用ならびにヒトへの適用に用いてもよいし、「個体」または「宿主」という用語を限定して解釈するべきでないことに注意するべきである。これらの用語は、ヒトおよび非ヒト脊椎動物、特に哺乳類を含む。さらなる見地において、本発明は、下記工程からなる組み換え産物を製造する方法を提供する：（ａ）テロメラーゼ分子をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを製造する工程；（ｂ）該ベクターで宿主細胞を形質転換または感染させる工程；および（ｃ）形質転換または感染した細胞株を培養してコードされたテロメラーゼ分子（組み換えテロメラーゼ）を製造する工程。分子生物学的標準技術を用いて、テロメラーゼのＲＮＡおよび蛋白質成分をコードし、宿主細胞における酵素発現のための適当なプロモーターを有するベクターの構築のためのＤＮＡ配列を調製することができる。好適な宿主細胞／ベクター系、形質転換または感染方法および培養方法は、当該分野において公知である。これらの系を用いて、テロメラーゼに対する抗体を製造することもできる。前記方法を用いて、真核生物におけるテロメラーゼの役割を研究するための使用および治療目的のために、遺伝子導入細胞、組織および生物を製造できるということも評価される。従って、本発明は、哺乳類を含む真核生物由来のテロメラーゼの蛋白質成分からなる遺伝子導入生物材料を提供する。以下に実施例により本発明を説明するが、本発明はいずれもこれらに限定されない。実施例１テロメラーゼの精製テトラヒメナサーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）をＰＰＹＳ（２％プロテオースペプトン，０．２％イーストエクストラクト，１０μＭＦｅＣｌ₃）中で密度が４．０×１０⁵／ｍｌになるまで増殖させ、ＧＳＡローター（Sorvall 製）で遠心分離して集菌し、Ｄｒｙｌｓ（１．７ｍＭＮａＣ₆Ｈ₈Ｏ₇，１．２ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄，１．３ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄，２ｍＭＣａＣｌ₂）中で１８時間スターブした。スターブした細胞を再び集菌し、Ｔ２ＭＧ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，１ｍＭＭｇＣｌ₂，１０％グリセリン，２ｍＭＤＴＴあるいはβ−メルカプトエタノール，０．１ｍＭＰＭＳＦ，２μｇ／ｍｌロイペプチン，１μｇ／ｍｌペプスタチン）で再懸濁し、そして最終濃度０．２％のＮＰ−４０を加え溶解した。溶解した細胞を１３０，０００ｘｇで５０分間４℃で遠心分離して、Ｓ−１００抽出物を得た。以下の工程は全て４℃で行った。１〜２×１０¹¹個の細胞（約３００ＬのＰＰＹＳ培養液）から得たＳ−１００抽出物を粗く濾過し、Ｔ２ＭＧで平衡化したセラミックのＨＡＰ（AIC 製）にアプライした。テロメラーゼをＴ２ＭＧ中で０．２ＭのＫ₂ＨＰＯ₄勾配で溶出した。活性がピークの画分をプールし、３倍量のＴ２ＭＧで希釈し、０．１５Ｍグルタミン酸カリウム（ＫＣ₅Ｈ₈ＮＯ₄，ＫＧと略する）を含むＴ２ＭＧで平衡化したスペルミンアガロース(Sigma製)にアプライした。テロメラーゼを０．６５ＭのＫＧを含むＴ２ＭＧで溶出した。活性がピークの画分をプールし、２０ｍＭＫＧと３ｍＭＮａＮ₃を含むＴ２ＭＧで平衡化した１ＬのセファロースＣＬ−６Ｂ（Pharmacia 製）カラムに負荷し、同液で流した。活性がピークの画分をプールし、０．４ＭＫＧとなるように調整し、０．４ＭＫＧを含むＴ２ＭＧで平衡化したフェニルセファロース（Pharmacia 製）にアプライした。カラムをＴ２ＭＧで洗浄し、それから、テロメラーゼを１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＴ２ＭＧで溶出した。活性がピークの画分をプールし、Ｔ２ＭＧで平衡化したＤＥＡＥアガロース（BioRad製）にアプライした。テロメラーゼをＴ２ＭＧ中で０．４ＭＫＧまで勾配溶出、あるいは０．４ＭＫＧまで段階溶出した。活性がピークの画分を、時には蒸留水で希釈し、１５〜３５％あるいは２０〜３５％グリセリン勾配上に載せた。勾配をＳＷ４１ローター（Beckman 製）で２０時間遠心分離した。グリセリン勾配で精製したテロメラーゼを本発明に記載したいくつかの実験に用いた。テロメラーゼを、ペプチドシーケンシングのための蛋白質分解消化の前にさらに精製した。活性がピークのグリセリン勾配画分をプールし、Ｔ２ＭＧで平衡化したＤＥＡＥアガロースにアプライした。テロメラーゼを、０．４ＭＫＧを含むＴ２ＭＧで溶出した。ピークの画分をＴ２ＭＧで透析し、それから６％アクリルアミド，５０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸ゲルにアプライし、５０ｍＭＴｒｉｓ −酢酸緩衝液，ｐＨ８．０中で泳動した。未変性ゲルを約１２時間、約２５０Ｖで泳動した。テロメラーゼを含む未変性ゲルのレーンを切り出し、２×ＳＤＳ試料緩衝液（０．１２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，１０％ β−メルカプトエタノール，２０％グリセリン，ブロモフェノールブルー）に短時間浸し、ｍＭＴｒｉｓ−酢酸中の０．１％アガロースを含む変性７％アクリルアミドゲルのウェルに差し込んだ。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＴｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３，１９２ｍＭグリシン，０．１％ＳＤＳ）中で行った。実施例２分析規模の２次元ゲル分析画分を少なくとも１０％のグリセリンに調整し、６％アクリルアミド，５０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸のミニゲルである未変性ゲルに負荷した。未変性ゲルは５０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸緩衝液，ｐＨ８．０中で泳動した。テロメラーゼを含む未変性ゲルのレーンを切り出し、２×ＳＤＳ試料緩衝液に短時間浸し、２５ｍＭＴｒｉｓ−酢酸中の０．１％アガロースを含む変性５〜１５％、あるいは５〜２０％勾配アクリルアミドミニゲルのウェルに差し込んだ。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＴｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３，１９２ｍＭグリシン，０．１％ＳＤＳ）中で行った。電気泳動後、ゲルを５０％メタノールに１０分間２回浸し、５％メタノールで平衡化した。０．１ｍＭＤＴＴ中で２０分間、１ｍｇ／ｍｌ硝酸銀中で２０分間ゲルをインキュベーションして銀染色を行ない、０．２８ＭＮａ₂ＣＯ₃、０・０１８５％ホルムアルデヒド中で展開した。染色反応はクエン酸で止めた。実施例３テロメラーゼサブユニットの蛋白質分解消化とペプチドシーケンシングテロメラーゼの８０ｋＤと９５ｋＤのサブユニットを上記のように精製した。テロメラーゼを含む調製用ＳＤＳゲルを０．０５％クマシーブリリアントブルー（Aldrich 製）、２０％メタノール、０．５％酢酸中で染色し、メタノール−酢酸中で脱染した。蒸留水に１０分間浸した後、ポリペプチドをゲルから切り出した。ゲルのスライスを破砕し、５０％メタノールに２０分間２回浸し、デカントし、減圧下で短時間乾燥させた。蛋白質を約３００ｎｇのアクロモバクタープロテアーゼＩで、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９．０、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で、２４時間３７℃で消化した。ペプチドをゲル断片からスピン濾過により分離し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃで濃縮し、Ｃ−１８カラム（Vydac 製）にアプライした。ペプチドを０．０９％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル：イソプパノール（３：１）勾配で溶出した。２１４ｎｍの吸光度のピークを集め、凍結乾燥し、プロテイン・シーケンサー（ABI 製）にアプライした。実施例４８０ｋＤと９５ｋＤのテロメラーゼ・サブユニット遺伝子のクローニングテトラヒメナのコドン使用頻度を考慮に入れて、縮重プライマーをペプチド配列からデザインした。マーチンデール(Martindale，D．W.)（1989）J．Protozol ．36: 29-34。これらのプライマーは、様々なＰＣＲ条件下で複数の組み合わせで用いた。ＰＣＲのテンプレートは、テトラヒメナの大核のゲノムＤＮＡ、あるいは、上記のように増殖させ、スターブさせたテトラヒメナ由来の全ＲＮＡ、又はポリ−Ａ⁺ＲＮＡ（アウスベル(Ausubel)ら，(1992)Current Protocols in Mol ecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.とサンブルック（Sambrook）ら，前出、に記載されているように調製した）を含んでいた。ＰＣＲ増幅産物を精製し、大腸菌にクローニングし、標準的なプロトコルに従ってシーケンスした。ＰＣＲ産物がＰＣＲプライマーにより特定されない付加的なペプチド配列をコードしている場合、ＰＣＲ産物がｐ８０もしくはＰ９５遺伝子又はｃＤＮＡ由来の全くの内部ペプチドとして、又は反応に用いられた縮重ＰＣＲプライマーにより特定される配列に隣接する配列として得られたことを確認した。ＰＣＲ産物を用いて、オリゴｄＴを付加したテトラヒメナのλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー(タケマサ（Takemasa）ら（1989）J．Biol．Chem．264: 19293- 19301)をスクリーニングした。不完全なクローン（０．８ｋｂ以下）しか得られなかった。ＥｃｏＲＩあるいはＣｌａＩで消化したテトラヒメナのゲノムＤＮＡを用い、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋（Stratagene製）でゲノムライブラリーを構築した。ｐ８０遺伝子の大部分を含む３．２ｋｂのクローンが得られた。ｐ９５遺伝子をコードする配列の内部領域を含む１．１ｋｂのクローンが得られた。ＥｃｏＲＩで消化したゲノムＤＮＡのサザンブロットによりｐ９５遺伝子の他の部分を含む断片が検出されたが、構築したライブラリーにおいては全く不足していた。両遺伝子のｃＤＮＡの５’末端を得るために、スターブしたテトラヒメナ由来のポリ−Ａ⁺ＲＮＡを用いてＲＡＣＥプロトコルを行った（Ｇｉｂｃｏ＃１８３７４−０２５）。ｐ９５のｃＤＮＡの３’末端を決定するために、ラムダクローンの配列を３’ＲＡＣＥにより得られた配列と比較した。上記のプロトコルに基づいて、逆転写のためのｍＲＮＡのポリ−Ａ⁺末尾からプライミングするオリゴｄＴを用いて、ＰＣＲのためのゲノムクローンの既知の配列内からプライミングするものと組み合わせて３’ＲＡＣＥを行った。ｐ８０ｃＤＮＡの３’末端を決定するために、ラムダクローンとゲノムクローンの配列を比較した。ｐ８０に対して得られたラムダクローンは、ゲノムクローンでは４つのアデニン残基しか存在していないポリ−Ａ配列を有する３’末端で終る。ｐ８０での３’ＲＡＣＥの結果は、この領域がポリアデニル化の部位であることを支持している。以前のｐ９５の核酸配列の決定では、４０５番のヌクレオチドが”Ｇ”で、９７７〜９７９番のヌクレオチドが”ＣＧＴ”であることが示されていた。このことは、コードする蛋白質において、それぞれ、”Ｑ”と”Ａ”の代わりに”Ｒ” であるという結果になっていた。実施例５８０ｋＤと９５ｋＤのポリペプチドに対する抗体産出各蛋白質から二つの異なる領域に相当する合成ペプチドを合成した。これらのペプチドは Genosys Biotechnologies から入手した。これらのペプチドは、標準的なプロトコルを用いて、ＫｅｙｈｏｌｅＬｙｍｐｈｅｔＨｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ（ＫＬＨ）キャリアー蛋白質に、アミノ末端に付加したシスチン残基を介して結合させた。ハーロー（Harlow）ら（1988）Antibodies - A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY。ＫＬＨ蛋白質に結合した各ペプチドを、周期的に抗原を与える標準的なプロトコルを用いて、２匹の別々のラビットに注射した。ハーロー(Harlow)ら，前出。数週間毎にラビットから血清を採取した。動物への注射は Hazelton Corporation で行った。抗原を３〜４回与えた後、全てのラビットから血清を得て、最初に各ラビットに注射するのに用いた合成ペプチドに対するＥＬＩＳＡアッセイを行った。粗血清のいくつかは特異的にそのペプチドを認識した。それから、抗体をウェスタンブロットにより全テトラヒメナと精製したテロメラーゼ画分に対して試験した。１種類のペプチドで免役した２匹のラビットは８０ｋＤの蛋白質に対して非常に高い力価を持っていた。これらのラビットのそれぞれから得た抗体をＡ８１とＡ８２と名付けた。同様に、２種類のペプチドで免役した４匹のラビットは９５ｋＤの蛋白質に対して高い力価を持っていた。これらの抗体をＡ８３、Ａ８４、Ａ８５とＡ８６と名付けた。Ａ８２が８０ｋＤの蛋白質に対して最も親和性が高く、Ａ８６が９５ｋＤの蛋白質に対して最も親和性が高かった。それから、特異的なペプチドを結合させたカラムに結合させることで、抗体をアフィニティー精製した。まず、酢酸緩衝液（０．１ＭＮａＯＡｃ，ｐＨ４．０）で抗体をカラムから溶出し、続いてグリシン緩衝液（０．１Ｍグリシン，ｐＨ２．７）でより強固に結合した抗体を取り除いた。アフィニティー精製抗体を、ウェスタンブロットと免疫沈降の双方に用いた。Ａ８２抗体とＡ８６抗体を含む血清でのウェスタン分析により、８０ｋＤのポリペプチドと９５ｋＤのポリペプチドの双方が、カラム精製のスキーム全体を通じてテロメラーゼ活性を有したまま共精製されることが示された（実施例１参照）。９５ｋＤの蛋白質と８０ｋＤの蛋白質の両方のレベルは精製の各段階での酵素活性の倍増と並行しており、これらの蛋白質がテロメラーゼ成分であることと一致していた。テロメラーゼ活性は８０ｋＤの蛋白質に対する最も親和性の高い抗体（Ａ８２）により特異的に免疫沈降された。免疫沈降は標準的な技術（Harlow，ら，前出）を用いて行なった。アフィニティー精製した抗体をＧ蛋白質に結合させたアガロースビーズ（Pharmacia 製）とインキュベートした。最初の結合反応後、グリセリン勾配の非ピーク領域から高度に精製した画分（実施例１参照）を３〜４時間、４℃でビーズとインキュベートし、テロメラーゼを結合させた。それから、ビーズをエッペンドルフチューブ中で非常に低速度で回転させ、上清を除いた。ビーズを０．１ＭＫＧ、０．５％ＮＰ−４０を含むＴ２ＭＧで３回洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁した。それから、テロメラーゼ活性を、上清画分、最終洗浄画分とペレット画分において各抗体に対してアッセイした。抗体Ａ８２により、ペレットと上清のテロメラーゼ活性は活性が減少していることが示された。コントロールとして、アフィニティー精製した、ウェスタンブロットで８０ｋＤと９５ｋＤのどちらも認識しない抗体を免疫沈降に用いた。他の８０ｋＤのポリペプチドと９５ｋＤのポリペプチドに対する親和性がより低い抗体（Ａ８３、Ａ８４、Ａ８５とＡ８６）の場合と同じように、この抗体では、活性は上清に残っていた。これらの結果は、８０ｋＤのポリペプチドがテロメラーゼの機能成分であることを示している。実施例６８０ｋＤと９５ｋＤのテロメラーゼサブユニット遺伝子の合成繊毛虫類に加えて、いずれの生物においてもテトラヒメナの蛋白質を発現させるためには、グルタミンをコードするのにＵＡＡとＵＡＧを用いるテトラヒメナのコドン（マーチンデール（Martindale，D．W．）(1989)J．Protozol．36: 29 - 34）を置換しなければならない。ほとんどの真核生物では、これらのコドンは ”停止”を表していて、そのため、これらの翻訳では完全な長さの蛋白質の発現が妨げられる。ｐ９５遺伝子では４４個のグルタミンコドンが、ｐ８０遺伝子では１８個のグルタミン部位が置換を要するので、これらの遺伝子は、各置換を行う部位特異的変異を用いるよりもむしろde novo 合成した。合成遺伝子を構築するために、まず、どのコドンを各アミノ酸をコードするのに用いるかを確定した。組換え蛋白質を発現するのに効果的な２つのシステムである、大腸菌とバキュロウイルスでのコドン使用頻度（ローマン(Rohrmann，G．F.)(1986)J．Gen．V irol．67: 1499 - 1513 ;チャン(Zhang，G.)ら（1991）Gene 105: 61 - 72）をもとに、これらのコドンを選択した。選択したコドンのリストを表２に示す。ｐ８０とｐ９０の両方の蛋白質の配列を遺伝暗号として表２のコドンを用いて ”逆翻訳”するのに、ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ（IntelliGenetics 製）コンピュータープログラムを用いた。これにより選択した遺伝暗号の縮重により幾分縮重したＤＮＡ配列を創った。それから、各遺伝子配列において約３００ｂｐ毎にユニークな制限酵素部位を見つけるために、この縮重配列から予想される制限酵素地図を調べた。ここで、必要ならば、特定のアミノ酸をコードする異なるコドンを選択することで制限酵素部位を個々に削除した。適切な位置に制限酵素部位を有するユニークなＤＮＡ配列を得るまでこの過程を繰り返した。クローニングに用いた５’末端と３’末端に作製した制限酵素部位を有する最終的なＤＮＡ配列を図１０と１１に示す。図１０と１１に示した２つの遺伝子を合成するために、ｐ８０に対しては２８個のオーバーラップするオリゴヌクレオチドのセットを合成し（プライマーセット３と４、それぞれ、図７と８）、ｐ９５に対しては３４個のセットを合成し（プライマーセット１、２と３、それぞれ、図５、６と７）、そして遺伝子を重複伸長ＰＣＲにより構築した。プロドロモー(Prodromou，C.)とパール(L．H．Pear l)（1992）Protein Engineering 5: 827 - 829；バンボット(Bambot，S．B.)とルセル(A．J．Russell)（1993）PCR Meths．and Apps．2: 266 - 271。オリゴヌクレオチドをBioserve Biotechnologies（Laurel，MD）から購入した。各オリゴヌクレオチドは長さが約１００ｎｔで、それと相補なものとオーバーラップして、２０塩基対がハイブリッドするように設計した。各オリゴヌクレオチドは、また、オリゴヌクレオチドの３’末端の通常はホスホジエステルがある位置に、ホスホロチオエート結合を有する。このホスホロチオエートは、初期のポリメラーゼの伸長工程の間２０ｂｐのハイブリッドオーバーラップのエキソヌクレアーゼによる除去を妨げる。スキール(Skerr，A.)（1992）Nucl．Acid Res．20: 3551 - 3554。オリゴヌクレオチド対の最初のセット（プライマーセット４、図８Ａ〜８Ｂ）を組み合わせ、それから、述べたように全領域を増幅するためにＰＣＲを用いて、ｐ８０遺伝子を２つの断片に構築した。２番目の半分は、プライマーセット５（図９）を用いて同様の方法で構築した。遺伝子の各半分をプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、新たな変異が導入されていないのを確認するために全長をシーケンスした。５’半分はＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニングされ、３’半分はＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片にクローニングされた。それから、２つの断片を適切な順にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene製）に結合させて、全長の遺伝子を構築した。オリゴヌクレオチド対の各セットを組み合わせ、それから、全領域を増幅するためにＰＣＲを用いて、ｐ９５遺伝子を３つの断片に構築した。最初の断片は、プライマーセット１を用いて構築し、２番目の断片は、プライマーセット２を用いて構築し、そして、３番目は、プライマーセット３を用いて構築した。遺伝子の３つの断片をそれぞれ、プラスミドｐＳＥ２８０（Invitrogen製）にクローニングし、全長をシーケンスした。５’断片（断片とプライマーセット１）はＮｃｏＩ−ＢｓｔＢＩ断片にクローニングされ、内部断片（断片とプライマーセット２）はＢｓｔＢＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニングされ、３’断片（断片とプライマーセット３）はＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片にクローニングされた。それから、まず断片１と２をｐＳＥ２８０プラスミドに結合させて、そして、続いて遺伝子を完成させるために３’断片を加えて完全な長さの遺伝子を構築した。実施例７細胞由来の組換えｐ８０とｐ９５蛋白質の発現と精製当該技術に熟練した者に公知の方法（例えば、アウスベル(Ausubel),前出 ;サンブルック(Sambrook)，前出，参照）により、全長の構築物をそれぞれｐＲＳＥＴとｐＢｌｕｅＢａｃベクター（Invitrogen製）にクローニングし、ｐ８０とｐ９５蛋白質を大腸菌とバキュロウイルスで発現させる。これらのベクターにより、組換え蛋白質の発現と精製ができる。ｐ８０をｐＲＳＥＴとｐＢｌｕｅＢａｃのＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ｐ９５をＮｃｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。これらの構築物の転写と翻訳により一連の６つのヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を後部に有する組換え蛋白質が生産され、ＥＫ（エンテロキナーゼ）プロテアーゼ開裂部位により分離される。これにより、各蛋白質はＮｉ⁺⁺キレーティングカラムを通じた過程により精製される。精製した蛋白質はプロテアーゼ、エンテロキナーゼによる消化によりＨｉｓｔａｇから取り除かれる。実施例８ヒト・テロメラーゼ蛋白質成分のクローニグヒト遺伝子をクローニングするのに、２つの一般的なアプローチ、ＤＮＡ配列に基づいたアプローチと抗体によるアプローチ、が採られる。最初のアプローチはテトラヒメナ遺伝子のＤＮＡ配列を利用し、直接ヒトのホモログを同定する。当業者は、ＤＮＡ配列に基づいてホモログをクローニングするのに用いる３つの異なる方法を認識している：（１）テトラヒメナ遺伝子でヒトゲノム或いは、ｃＤＮＡライブラリーに対して直接ハイブリダイゼーションする方法；（２）他の生物種でテロメラーゼ蛋白質の保存された領域を同定し、これらの領域に基づいてヒト遺伝子をＰＣＲで増幅する方法；（３）ＰＣＲプローブでテロメラーゼ遺伝子の全領域を満たし、ＰＣＲを用い遺伝子長に沿って”ウォーク”しヒトのホモログを同定する系統的な方法。方法論の全ては標準的な分子遺伝学の実験室の方法に基づいている（サンブルック(Sambrook)ら，前出）。最初の方法では、テトラヒメナ遺伝子を用いて一連の増加させたストリンジェンシーで、ヒトゲノムＤＮＡブロットとｍＲＮＡブロットを調べる。特異的なバンドを同定した場合、ｃＤＮＡあるいはゲノムライブラリーを同様のストリンジェンシーで調べ、ヒトのホモログの遺伝子を同定する。それから陽性のファージの制限酵素地図を作製し、サブクローニングし、そしてシーケンスする。２番目の方法においては、テロメラーゼ蛋白質はヒトとテトラヒメナの間ではＤＮＡ配列のレベルではわずかに限定されて保存されているにすぎないので、最初に他の繊毛虫からのテロメラーゼ蛋白質のクローニングを伴う。それから、哺乳類の類似体をこれらのｃＤＮＡから得た情報を用いてクローニングする。このようにして、クローニングしたテトラヒメナ遺伝子を用いて、クロスハイブリダイゼーションする遺伝子を同定するために、遠縁のテトラヒメナあるいはオキシトリシャとユープローテス由来のライブラリーを、中程度のストリンジェンシーで調べることができる。繊毛虫オキシトリシャとユープロテスは、テトラヒメナのテロメラーゼと機能的に類似したテロメラーゼ酵素を有するので（リングナー (Lingner)ら（1994）Genes Dev．8: 1984 - 1998；シッペン−レンツ( Shippen - Lentz，D.)とブラックバーン(E．H．Blackburn)（1990）Science 247: 546 - 552）、おそらくこの方法でホモログ蛋白質が同定できるであろう。両繊毛虫由来のｐ９５ホモログとｐ８０ホモログの双方の遺伝子を完全にシーケンスすることができ、そして、異なる種間で最も高度に類似している領域を同定することができる。ヒト遺伝子をクローニングするための逆転写酵素ＰＣＲに基づく方法において用いるために、各蛋白質につき３つの保存領域を選ぶ。ｐ８０遺伝子とｐ９５遺伝子の双方に対する遺伝子をクローニングするのに同じアプローチを用いる。ヒトの翻訳コドンのバイアスを用いて、テトラヒメナ、オキシトリシャとユープロテスのテロメラーゼ蛋白質で保存された領域をコードする縮重オリゴヌクレオチドを合成する。３つのオリゴヌクレオチドのうちの２つでＰＣＲを初めに行う。最も３’側のオリゴヌクレオチド（オリゴ１）はｍＲＮＡに相補的である。このように、オリゴ１をプライマーとして用いて単離したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。最も５’側のオリゴ（オリゴ２）は、オリゴ１と反対方向で５’ から３’方向へ向いていて、ｍＲＮＡ鎖に配列が同一である。それから、このオリゴヌクレオチドをオリゴ１と共にＰＣＲ工程で用いて、オリゴ１とオリゴ２の間の領域を増幅させる。最後に、オリゴ１と２により標的とされる領域中にある蛋白質の保存領域に、３番目のプライマー（オリゴ３）を対向させる。オリゴの配列はｍＲＮＡに相補的であろう。オリゴ１と２で増幅したＰＣＲ産物をオリゴ２とオリゴ３を用いて再び増幅する。これにより、生産された特異的な産物全てがテロメラーゼ蛋白質の３つの保存領域を有することが確認される。ＰＣＲ産物をシーケンスし、蛋白質ホモログを含むものを同定する。３番目の方法は系統的に細かく調べるアプローチで、テトラヒメナ遺伝子とヒト遺伝子の間で相同性のある領域を見つけ、それから、ＰＣＲによりこれらの領域を増幅させるものである。テトラヒメナ遺伝子の蛋白質配列を手引きとして用い、ＤＮＡ配列におけるヒトのコドンのバイアスをさらに利用してテトラヒメナ遺伝子の領域をコードする一連のプライマーオリゴヌクレオチドを作る。初めに、１０アミノ酸分ハイブリダイズする領域が異なるプライマーセットを遺伝子の３’末端に対して作る。これらはｃＤＮＡを作製するためにＲＴＰＣＲ反応に用いられる。次に、遺伝子の５’末端から３’末端に向かうプライマーセットをｃＤＮＡを増幅するのに用いる。テトラヒメナ蛋白質の領域に対し期待されるサイズのバンドを同定するために、５’末端と３’末端由来の２つのＰＣＲプライマーの可能な組み合わせの全てを一緒に用いることができる。特異的産物が生産された場合、それらを最初の２つのプライマーの範囲内でアニーリングすべきプライマーを用いて再び増幅する。どんなプライマーを単独で用いても生産されなかった特異的産物をサブクローニングし、シーケンスする。実施例９ヒトのテロメラーゼホモログのクローニングの抗体によるアプローチこの方法は、抗体により認識される蛋白質表面上の保存されたエピトープを利用する。ｐ８０蛋白質とｐ９５蛋白質の両方の様々な領域に対する一連の抗体を作る。実施例５に述べたような抗体を用いることができる。抗体産生に対する抗原を合成ペプチドとして、あるいは、融合蛋白質として生産する。最初に融合蛋白質を作らなくてもよいので、合成ペプチドを生産する方が早くできる；しかしながら、これらのペプチドは合成ペプチドに比べ、力価が高くないかもしれない。ペプチドの約１０〜１５残基、好ましくは非構造的でそのため抗原性であるため蛋白質の５’末端と３’末端を選ぶ。加えて、非構造的で蛋白質の表面近くにありそうな領域を選択するために、蛋白質の親水性と予想される二次構造を決定するのにコンピューター分析を適用できる。合成ペプチドをＫＬＨ等のキャリアーに結合させ、ラビットに接種するのに用いる。キャリアーに結合するのに適当なアミノ酸がペプチドに存在しない場合、リンカーのシステイン残基をＮ末端に付加する。融合蛋白質をＴ７ポリメラーゼ系で生産し(スタデール(Studier)ら（1990）Me th．Enzymol．185: 60 - 89)、ラビットやマウスに接種するために精製する。それから、クローニングした蛋白質を発現する大腸菌由来の抽出物あるいは精製した画分を用いて、血清をウェスタンブロットでスクリーニングした。陽性抗体のウェスタンブロットで９５ｋＤあるいは８０ｋＤの蛋白質を認識する、及び／又は特異的にテロメラーゼＲＮＡを免疫沈降する、或いは、さもなければテロメラーゼ活性を阻害する能力を試験する。コントロールとして、ペプチドとプレインキュベートする時に、抗ペプチド抗体がテロメラーゼＲＮＡを沈降させる能力を消滅させるべきである。マウスとラビットの血清とモノクローナル培養基はテロメラーゼ活性を阻害し（ハリントン(L．Harrington),未発表結果）、アフィニティー精製したＩｇＧを抗体がテロメラーゼ活性を阻害する能力を試験するのに用いる。テトラヒメナのテロメラーゼ蛋白質に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を、交差反応するヒトとマウス細胞由来のテロメラーゼ蛋白質をウェスタンブロットで同定するのに用いることができる。陽性のシグナルを見つけた場合、反応性バンドがテロメラーゼ活性と共に共精製されているかどうかを決定するために、ヒトのテロメラーゼの精製した画分を用いる。共精製の証拠により、交差反応するバンドがヒトのテロメラーゼの成分であることが示される。最も良いシグナルを与える抗体を、それからラムダＧＴ１１発現ライブラリーを調べるのに用いる。モノクローナル抗体を用いるならば、発現ライブラリーを調べるのにいくつかの異なる抗体をプールしておく。ポリクローナル抗体では、２つ又は３つの異なる抗体を複製したプレートに用いる。両方のプローブで光を発するファージしか陽性であると考えない。これらのプラークを精製し、インサートをサブクローニングし、シーケンスする。実施例１０マウスホモログのクローニングと使用上記と同じ２つの方法、ＤＮＡの相同性又は抗体の交差反応性を、マウスのテロメラーゼ蛋白質の成分を同定することに同時に用いることもできる。マウスのテロメラーゼのクローンは癌の治療法を試験したり、哺乳類のテロメラーゼの生物学を理解するために役立てることができる。マウスのテロメラーゼの同定により、トランスジェニックマウスをｉｎｖｉｖｏでのテロメアの長さとテロメラーゼの役割を試験することに用いることもできる。一度、マウス又はヒトのホモログのいずれかが同定されると、いずれかのクローンを他の生物の配列を導き出すの適用することができる。ヒトとマウスの遺伝子間では配列の類似性が高いので、一方のクローンを他のクローン由来のプローブを用いて得ることは、簡単な過程である。それから、ゲノムライブラリーとｃＤＮＡライブラリーの両方をプレーティングし、中程度のストリンジェンシーで調べクロスハイブリダイゼーションするプラークを同定する。それから、陽性プラークを選択し、制限酵素地図を作製し、シーケンスし、テロメラーゼ蛋白質ホモログがクローニングされているかどうかを決定する。それから、再構築や遺伝子破壊等のさらなる機能分析をヒトとマウスのクローンに適用する。均等物当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。そのような均等物は下記請求の範囲に記載されるような本発明の範疇に含まれるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１２月１８日【補正内容】請求の範囲１．（ａ）テロメラーゼ蛋白質成分をコードし、配列番号：２または配列番号：４のヌクレオチド配列と同一または実質的に相同な単離されたＤＮＡ。２．請求項１記載のＤＮＡと中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。３．請求項１記載のＤＮＡから転写されるかまたは請求項１記載のＤＮＡと相補的な単離されたＲＮＡ。４．請求項２記載のＤＮＡから転写されるかまたは請求項２記載のＤＮＡと相補的な単離されたＲＮＡ。５．請求項１のＤＮＡによりコードされるポリペプチド。６．配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。７．薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせた請求項１記載の単離されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を含んでなる治療または診断用化合物。８．薬学的に許容され得る希釈剤、賦形剤または担体と組み合わせた請求項１記載のポリペプチドの一方または両方をすべてまたは実質的にすべて含んでなる医薬組成物。９．請求項１記載のＤＮＡ配列または該配列に相補的な配列を含む形質転換真核細胞または真核生物。１０．請求項１記載のＤＮＡ配列または該配列に相補的な配列を含む形質転換原核細胞。１１．請求項１のヌクレオチド配列を含む形質転換真核細胞または真核生物。１２．配列番号：８または配列番号：９を含んでなるＤＮＡ配列。１３．請求項１２記載のＤＮＡ配列によりコードされる合成テロメラーゼ蛋白質成分。１４．請求項１２記載のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡ配列。１５．プライマー１〜３４、Ｆ１〜Ｆ１４およびＲ１〜Ｒ１４からなる群より選ばれたＤＮＡを含んでなる発現ベクター。１６．ＡＥＧＹＳＤＩＮＶＲＧ、ＱＮＥＦＱＦＮＮＶＫおよびＥＦＧＬＥＰＮＩＬＴからなる群より選ばれたアミノ酸配列を含んでなるペプチドと結合する抗テロメラーゼ抗体。１７．実質的に純粋なテロメラーゼ蛋白質成分。１８．テトラヒメナテロメラーゼ蛋白質成分である請求項１７記載の実質的に純粋な蛋白質成分。１９．請求項１７記載のテロメラーゼ蛋白質成分の全部または一部と結合する抗テロメラーゼ抗体。２０．下記工程からなる、真核生物の組織試料または真核細胞試料において不死化細胞の存在または細胞の不死化への傾向の検出方法：ａ）真核生物から組織試料または細胞試料を得る工程；およびｂ）試料中のテロメラーゼの存在を決定する工程、試料がテロメラーゼの存在を示した場合、不死化細胞または不死化への傾向が存在する。２１．真核生物の組織試料または真核細胞試料における疾病（癌等）または疾病傾向の存在が、試料中のテロメラーゼの存在の決定により検出され、試料がテロメラーゼの存在を示した場合、疾病または疾病への傾向が存在する請求項２０記載の方法。２２．疾病が真核微生物により生じ、および試料が真核微生物のテロメラーゼを示した場合、真核微生物により生じた疾病が存在する請求項２１記載の方法。２３．下記工程からなる請求項２０、２１および２２いずれか記載の方法：ａ）試料を処理してテロメラーゼを抗テロメラーゼ抗体と結合できるようにし、そうすることによって、処理された試料を製造する工程；ｂ）処理された試料を抗テロメラーゼ抗体と接触させる工程；およびｃ）テロメラーゼへの抗体の結合を検出する工程、結合が起こった場合、テロメラーゼが存在する。２４．化合物をテトラヒメナの細胞に投与し、その細胞中のテトラヒメナのテロメラーゼ活性を測定することからなり、テトラヒメナのテロメラーゼ活性が低減した場合、その化合物はテロメラーゼ阻害剤である、真核細胞中のテロメラーゼ活性を阻害、破壊または干渉する化合物の同定方法。２５．化合物をテロメラーゼ活性を発現する真核細胞に投与し、テロメラーゼ活性を測定することからなり、テロメラーゼ活性が低減した場合、該化合物または化合物群はテロメラーゼ阻害剤として同定される、ヒトを含む哺乳類細胞中のテロメラーゼ活性を阻害、破壊または干渉する化合物の同定方法。２６．薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせてテロメラーゼ活性阻害剤を含んでなる治療または診断用化合物。２７．薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤または担体とともに抗テロメラーゼ化合物を組み合わせることからなる治療または診断用組成物の調製方法。２８．テロメラーゼ活性の異常レベルを伴う障害を受けた哺乳類（ヒト等）の治療処置方法であって、該レベルが高すぎた場合はテロメラーゼの産生を阻害し、該レベルが低すぎた場合はテロメラーゼを投与することからなる方法。２９．哺乳類で真核微生物により疾病が生じ、微生物中のテロメラーゼ活性を阻害するのに有効な量のテロメラーゼ阻害剤をその哺乳類に投与することにより疾病を治療する請求項２８記載の方法。３０．真核微生物寄生虫の活性を阻害するのに有効な量のテロメラーゼ阻害剤を哺乳類に投与することからなる、真核微生物寄生虫、特に真菌および原生動物寄生虫の活性を阻害するための請求項２８記載の方法。３１．下記工程からなる組み換えテロメラーゼまたは抗テロメラーゼ抗体の製造方法：ａ）テロメラーゼ分子または抗テロメラーゼ抗体をそれぞれコードするＤＮＡを含む発現ベクターを製造する工程；ｂ）該ベクターで宿主細胞を形質転換または感染させ、そうすることによって形質転換または感染した宿主細胞を製造する工程；およびｃ）形質転換細胞または感染細胞を培養してコードされたテロメラーゼまたは抗テロメラーゼ抗体を製造する工程。３２．テロメラーゼ蛋白質成分またはその断片をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターを含んでなる宿主細胞。３３．テロメラーゼ蛋白質成分またはその断片の製造が可能な条件下で、請求項３２の宿主細胞を培養する工程からなるテロメラーゼ蛋白質成分またはその断片の製造方法。３４．同じ細胞中で２以上のテロメラーゼ蛋白質成分またはその断片が製造される請求項３３記載の方法。３５．テロメラーゼ蛋白質成分またはその断片を精製する工程をさらに含んでなる請求項３３記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 ＡＧＺＡ６１Ｋ 45/00 ＡＤＸ 45/00 ＡＤＸ 48/00 ＡＤＵ 48/00 ＡＤＵＣ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/12 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/573 ＡＣ１２Ｐ 21/08 Ａ０１Ｋ 67/027 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ０１Ｋ 67/027 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＤＹ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者コリンズ，キャスリーンアメリカ合衆国ニューヨーク 11743 ハンティントン，プライムアベニュー 111 (72)発明者コバヤシ，リュウジアメリカ合衆国ニューヨーク 11791 シオスセット，コーブエッジロード 1152 (72)発明者ヤン，ザイアオホンヘレナアメリカ合衆国ニューヨーク 11740 グリーンローン，キューバヒルロード 90 (72)発明者ヘミシュ，ジルエム. アメリカ合衆国ニューヨーク 11746 ハンティントンステーション，フェンウッドロード４ (72)発明者オーテグザイアー，チャンタルアメリカ合衆国ニューヨーク 11731 イーストノースポート，ヴァーノンバレーロード 188

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に純粋なテロメラーゼ蛋白質成分。２．テトラヒメナテロメラーゼ蛋白質成分である請求項１記載の実質的に純粋な蛋白質成分。３．テロメラーゼ蛋白質成分をコードし、配列番号：１または配列番号：３のヌクレオチド配列と同一または実質的に相同である単離されたＤＮＡ。４．請求項３記載のＤＮＡと中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。５．請求項３記載のＤＮＡから転写されるかまたは請求項３記載のＤＮＡと相補的な単離されたＲＮＡ。６．請求項４記載のＤＮＡから転写されるかまたは請求項４記載のＤＮＡと相補的な単離されたＲＮＡ。７．請求項３のＤＮＡによりコードされるポリペプチド。８．配列番号：５のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。９．配列番号：７のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。１０．配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列と同一または実質的に同等なポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。１１．ＡＥＧＹＳＤＩＮＶＲＧ、ＱＮＥＦＱＦＮＮＶＫおよびＥＦＧＬＥＰＮＩＬＴからなる群より選ばれたアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗テロメラーゼ抗体。１２．実質的に純粋なテロメラーゼ蛋白質成分の全部または一部と結合する抗テロメラーゼ抗体。１３．下記工程からなる、真核生物の組織試料または真核細胞試料において不死化細胞の存在または細胞の不死化への傾向の検出方法：ａ）真核生物から組織試料または細胞試料を得る工程；およびｂ）試料中のテロメラーゼの存在を決定する工程、試料がテロメラーゼの存在を示した場合、不死化細胞または不死化への傾向が存在する。１４．下記工程からなる、真核生物の組織試料または真核細胞試料において真核微生物により生じる疾病の検出方法：ａ）真核生物から組織試料または細胞試料を得る工程；およびｂ）試料中のテロメラーゼを決定する工程、試料が真核微生物のテロメラーゼを示した場合、真核微生物により生じた疾病が存在する。１５．下記工程からなる真核生物の組織試料または真核細胞試料中のテロメラーゼの検出方法：ａ）真核生物から組織試料または細胞試料を得る工程；ｂ）試料を処理してテロメラーゼを抗テロメラーゼ抗体と結合できるようにし、そうすることによって、処理された試料を製造する工程；ｃ）処理された試料を抗テロメラーゼ抗体と接触させる工程；およびｄ）テロメラーゼへの抗体の結合を検出する工程、結合が起こった場合、テロメラーゼが存在する。１６．テロメラーゼの存在が、癌への傾向または癌の存在の指標となる請求項１５記載の方法。１７．テロメラーゼの存在が、不死化細胞の存在または不死化への傾向の指標となる請求項１５記載の方法。１８．真核微生物のテロメラーゼの存在が、真核微生物により生じる疾病の存在の指標となる請求項１５記載の方法。１９．化合物をテトラヒメナの細胞に投与し、その細胞中のテトラヒメナのテロメラーゼ活性を測定することからなり、テトラヒメナのテロメラーゼ活性が低減した場合、その化合物はテロメラーゼ阻害剤である、真核細胞中のテロメラーゼ活性を阻害、破壊または干渉する化合物の同定方法。２０．化合物をテロメラーゼ活性を発現する真核細胞に投与し、テロメラーゼ活性を測定することからなり、テロメラーゼ活性が低減した場合、該化合物または化合物群はテロメラーゼ阻害剤として同定される、ヒトを含む哺乳類細胞中のテロメラーゼ活性を阻害、破壊または干渉する化合物の同定方法。２１．薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせてテロメラーゼ活性阻害剤を含んでなる治療または診断用化合物。２２．薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせた請求項１０記載の単離されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる治療または診断用化合物。２３．薬学的に許容され得る希釈剤、賦形剤または担体と組み合わせて配列番号：２または配列番号：４記載のポリペプチドの一方または両方をすべてまたは実質的にすべてを含んでなる医薬組成物。２４．薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤または担体とともに抗テロメラーゼ化合物を組み合わせることからなる治療または診断用組成物の調製方法。２５．微生物中のテロメラーゼ活性を阻害するのに有効な量のテロメラーゼ阻害剤を哺乳類に投与することからなる、真核微生物により生じる哺乳類における疾病の治療方法。２６．真核微生物寄生虫の活性を阻害するのに有効な量のテロメラーゼ阻害剤を哺乳類に投与することからなる、哺乳類における真核微生物寄生虫、特に真菌および原生動物寄生虫の活性の阻害方法。２７．テロメラーゼ活性の異常レベルを伴う障害を受けたヒトまたは動物の治療処置方法であって、該レベルが高すぎた場合はテロメラーゼの産生を阻害し、該レベルが低すぎた場合はテロメラーゼを投与することからなる方法。２８．請求項３記載のＤＮＡ配列または該配列に相補的な配列を含む形質転換真核細胞または真核生物。２９．請求項３記載のＤＮＡ配列または該配列に相補的な配列を含む形質転換原核細胞。３０．配列番号：１および配列番号：３のヌクレオチド配列を含む形質転換真核細胞または真核生物。３１．下記工程からなる組み換えテロメラーゼの製造方法：（ａ）テロメラーゼ分子をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを製造する工程；（ｂ）該ベクターで宿主細胞を形質転換または感染させる工程；および（ｃ）形質転換または感染した細胞株を培養してコードされたテロメラーゼを製造する工程。３２．下記工程からなる組み換え抗テロメラーゼ抗体の製造方法：（ａ）抗テロメラーゼ抗体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを製造する工程；（ｂ）該ベクターで宿主細胞を形質転換または感染する工程、そうすることによって形質転換または感染した宿主細胞を製造する工程；および（ｃ）該形質転換細胞または感染細胞を培養して抗テロメラーゼ抗体を製造する工程。３３．配列番号：８または配列番号：９を含んでなるＤＮＡ配列。３４．請求項３３記載のＤＮＡ配列によりコードされる合成テロメラーゼ蛋白質成分。３５．請求項３３記載のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡ配列。３６．プライマー１〜３４、Ｆ１〜Ｆ１４およびＲ１〜Ｒ１４からなる群より選ばれたＤＮＡを含んでなる発現ベクター。３７．テロメラーゼ蛋白質成分またはその断片をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターを含んでなる宿主細胞。３８．テロメラーゼ蛋白質成分またはその断片の製造が可能な条件下で、請求項３７の宿主細胞を培養する工程からなるテロメラーゼ蛋白質成分またはその断片の製造方法。３９．同じ細胞中で２以上のテロメラーゼ蛋白質成分またはその断片が製造される請求項３８記載の方法。４０．テロメラーゼ蛋白質成分またはその断片を精製する工程をさらに含んでなる請求項３８記載の方法。