JPH08509504A

JPH08509504A - プロテインキナーゼ

Info

Publication number: JPH08509504A
Application number: JP7519735A
Authority: JP
Inventors: メリル，エフ．ホークストラ，
Original assignee: ザサルクインスティテュートフォーバイオロジカルスタディーズ
Priority date: 1994-01-21
Filing date: 1995-01-23
Publication date: 1996-10-08
Anticipated expiration: 2015-09-25
Also published as: US5756289A; EP0690876A1; CA2158750C; JP3091769B2; US5686412A; WO1995019993A1; DE69510410D1; CA2158750A1; DE69510410T2; US6060296A; ATE181559T1; EP0690876B1

Abstract

(57)【要約】「カゼインキナーゼＩ」と称するクラスに属するポリペプチドをコードし、そして、二本鎖ＤＮＡ損傷の修復活性に作用する組成物のスクリーニングにおいて有用な、プロテインキナーゼ変異体および野性型遺伝子が開示されている。また、細胞の増殖障害において、ポリヌクレオチドを使用する方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】『プロテインキナーゼ』本願出願は、1991年７月３日に出願された米国特許出願No．728,783の一部継続出願である、1993年１月21日に出願された米国特許出願No．08/008,001の一部継続出願である、1994年１月21日に出願された米国特許出願No．08/185,359の一部継続出願である。発明の分野本発明は、以下にカゼインキナーゼＩと称するプロテインキナーゼ単離物に対応し、また、プロテインキナーゼおよび／またはＤＮＡ組み換え／修復促進機能特性を有するポリペプチドをコードする新規のポリヌクレオチドに関する。発明の背景プロテインキナーゼプロテインキナーゼは、外部刺激への細胞の反応を媒介する真核プロテインの一際大きな超科を含み、また、酵素のいわゆる「触媒領域」内のアミノ酸配列相同性によって関連付けられる。今日まで、多種多様の真核生物から100を超える独特のプロテインキナーゼ科に属するものが、アミノ酸配列レベルにて報告され、そして特徴付けられている。約250〜300アミノ酸の範囲の大きさの65のプロテインキナーゼ触媒領域の配列対比を示したHanks，et al．（Science，241:42-52 ，1988）、ならびに、脊椎、無脊椎、高等植物、および酵母種酵素を含む117個の独立したプロテインキナーゼ科に関する触媒領域の対比を示したHanks，et al．（Methods in Enzymol.，200:38-62,1991）を参照のこと。プロテインキナーゼ内の触媒領域の位置は、一定していない。ほとんどの単一サブユニット酵素の場合、その領域はポリペプチドのカルボキシ末端近傍にあるが、多重結合のプロテインキナーゼの場合、サブユニットポリペプチドのほとんど全体に及んでいる。プロテインキナーゼは、燐酸化基質特性に基づいて、プロテイン−セリン／スレオニン亜科、あるいはプロテイン−チロシン亜科に分類される。プロテイン− セリン／スレオニンキナーゼ亜科にある酵素の多くの分類は、DEAEセルロースからの溶出順序に基づいて、カゼインキナーゼＩとカゼインキナーゼIIと称する２つの別異のクラスに分類される。カゼインキナーゼは、カゼインに見られるような酸性認識配列内のセリンあるいはスレオニン残基を燐酸化する能力によって、他のプロテインキナーゼと区別できる。Tuazon，et al.，（Adv．in Second Mes senger and Phosphoprotein Res.，23:123-164，1991）は、酵素のこれら二つの分類に関する理化学的特性、認識配列、基質特異性、および代謝調整に関する効果について、カゼインキナーゼＩとIIに関連した200以上の文献の検討を行っている。カゼインキナーゼIIは、異種四量体としての活性を有し、ヒト、ラット、Drosophila および酵母種の触媒領域の完全なアミノ酸配列が決定されている。部分的に精製したカゼインキナーゼＩ調製物が、多様な植物および動物種の細胞核、細胞質、および細胞膜から取得できるにもかかわらず、本願発明以前に、酵素的に活性な単量体ユニットの一次構造に関する知見は何ら得られていなかった。それ故、本願発明が完成された当時に、当該技術分野では、カゼインキナーゼＩクラスでのプロテイン−セリン／スレオニンキナーゼ酵素の一次構造（アミノ酸配列）に関する情報が待望されていたのである。１種以上のこれらキナーゼをコードするＤＮＡ配列（これより一次構造が推定される）の形態にて提供されるかような情報は、組み換え技法によるキナーゼの大規模生産、ならびに、これら酵素の分布と機能、膜結合形態と非膜結合形態との間での構造上の相違点、これらキナーゼが影響するリガンド−レセプター相互作用、および、リガンド−レセプター結合、キナーゼ、および他の活性を調整することができる薬剤の同定のための決定を可能ならしめるものである。ＤＮＡ組み換えおよび修復染色体は、高エネルギ照射、化学薬剤、ならびに複製中における自然変異の結果として、一本鎖あるいは二本鎖損傷を生じる。染色体に存在する遺伝子は、損傷、修復、交換、移動、および接着の作用を継続的に被るが、ある種の酵素は、染色体の特定の塩基配列を保護あるいは復原する。ＤＮＡ損傷の修復は、莫大な数の遺伝子生成物の調整を含む複雑なプロセスである。この複雑さの一部は、ＤＮＡ損傷および細胞周期の経過の双方に依存している。例えば、紫外線（UV）照射に応答して、遺伝子障害を訂正するために、細胞は光回復あるいは切出修復機能を使用することが可能である。鎖破損の修復は、Ｘ線によって生じたようなもので、組換機構を通して行うことができる。ＤＮＡ損傷の多様な形態に対して、細胞は、細胞周期のＧ２相に捕獲されるように誘導される。このＧ２捕獲期間中に、有糸分離に先駆けて染色体の正常性を保つために遺伝子障害が修復される。世代間における遺伝子情報の伝達がＤＮＡの正常性に依存していることから、遺伝子組換および修復に影響あるいはそれらを調整する遺伝子生成物を同定することは重要である。特定の遺伝子変異を行った生物の使用を通して、正常機能遺伝子が取得され、分子的にクローニングされ、そして、遺伝子生成物が研究されている。 Saccharomyces cerevisiaeのような真核細胞での遺伝子研究によって、30以上の放射線感受性（RAD）変異体の同定を可能にする修復欠陥変異体が決定されている（Haynes et al.，in Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，pp .371，1981；J．Game in Yeast Genetics：Fundamental and Applied Aspects， pp.109，1983）。これら変異体は、それらの感受性によって、三つのクラスに分類できる。これらクラスは、切出修復、誤差傾向修復、および組み換え修復機能に大別できる。酵母RAD遺伝子の分子特性は、切出修復に関与する酵素機構、ならびにDNA損傷による細胞分裂の捕獲の理解を深める結果を導いた。 RAD遺伝子およびその発現生成物は、より効果的な治療用組成物を開発するための研究が継続されるつれて、その重要性の大きさが認識された。これらの新規の組成物が、ある種の腫瘍のような特定の疾患状態に極めて効果的である場合がよくあるが、それら疾患を患った動物でのin vivo治療にて過剰の毒性を呈することがある。実際のところ、これら組成物は、同様の突然変異誘発を増大させるものである。ほとんどの突然変異誘発性あるいは発癌性物質は、それ自体が非反応性であるが、in vivoにて反応性の中間体に分解される。突然変異をもたらすDNAとこれら反応性の中間体は、相互作用を呈する。この現象は、化学的発癌現象の第一段階であると考えられている。大量の遺伝子での突然変異は、DNAを損傷する薬剤に対する細胞性反応に影響を与える。同様に、これら変異した遺伝子の多くは、DN A修復系に関与する酵素をコードする。従って、修復系が正常でない場合、細胞は極端に毒性薬物に対して感受的になる。DNA修復機構が正常に機能すればDNAは正常な状態に復元されるが、その機構が正常に機能しない場合には、増殖を続ける形質転換した腫瘍細胞を生じる結果を招く。化学物質および組成物の毒性あるいは突然変異性を決定するための試験方法があるが、実験室でのスクリーニング法および動物毒性試験の双方にて制約が課されている。これら制約には、実験室で得た動物に関するデータの、ヒトへの援用が含まれる。実験動物から得た結果を、ヒトでの効果に当てはめようととして矯正する際に、予想だにしない測定値の相違を生じることがよくある。たいていの場合、ヒトに投与しても安全性が確保される量が、試験薬剤の用量として、試験動物に使用される。加えて、特定の種に薬剤を投与した時に、ある種の毒性は検出できるが、適正な動物種での実験が行われていない場合には、その他の毒性については見過ごされていることになる。さらに、多くの利用可能な実験室用試験法では、ヒトにおいても発現するある種の毒性を検出することはできない。相同的標準機能性遺伝子を同定するための手段である、表現方相補性が広く使用されている。例えば、酵母細胞周期調節遺伝子、cdc2、のヒト相同体は、Schi zosaccharomyces pombe にてヒトcDNAライブラリーを発現し、そして、酵母cdc2 遺伝子での突然変異と相補できるクローンを選択することで、クローニングされた（Lee，et al.，Nature，327:31，1987）。酵母のRAS2^va119遺伝子の熱ショック感受性を復元することができる哺乳類遺伝子も、相補性を利用してクローニングされた（Colicelli，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:3599，1989）。ラット脳cDNAライブラリーを、酵母での活性化した RAS2遺伝子に関連する成長調節の欠失を補うことができる哺乳類cDNAをクローニングするために用いた。遺伝子、DPD（dunce-様ホスフォジエステラーゼ）は、高親和性CAMPホスフォジエステラーゼをコードする。要するに、実験室での試験にて存在する制約と不明確さは、DNAの完全性に関する組成物の効果を検定する正確な方法の提供の障害となっている。この点に鑑み、安価で、迅速で、そして、組成物で処置される動物の関連遺伝子を含んだスクリーニング方法の相当な必要性が存在しているのである。かような方法は、組成物が細胞のDNA修復系に作用するのであれば、決定のための直接分析手段を提供する。発明の概要本願発明の一態様にて、本願発明は、本明細書にて「HRR25様」プロテインと称するカゼインクラスＩの真核プロテインキナーゼをコードし、そして、原型酵母酵素HRR25のプロテインキナーゼ触媒領域との35％を超えるアミノ酸配列相同性を有することを特徴とした、精製および単離したポリヌクレオチド（例えば、 DNA配列およびそのRNA転写体）を提供する。本発明によって提供されるポリヌクレオチドには、アンチセンス形態を含んだRNA、mRNA、およびDNAが包含される。本願発明の好適なDNA配列には、ゲノミックおよびcDNA配列、ならびに全体的あるいは部分的に化学合成したDNA配列およびその生物学的複製物が含まれる。特に、本願発明にて言及しているのは、HRR25およびNUF1をコードするものを含むS accharomyces cerevisiae DNA、Hhp1＋およびHhp2＋をコードするものを含むSac charomyces pombe DNA、およびCKIα1Hu、CKIα2Hu、CKIα3Hu、CKIγ1Hu、CKI γ2HuおよびCKIδHuをコードするものを含むヒトDNAである。さらに、本願発明によって得られるものは、かような配列を組み込んだプラスミドおよびウィルスDNAベクターのような自律複製組み換え構築体、特に、HRR25-様カゼインキナーゼＩプロテインをコードする DNAが、内因性あるいは外因性発現調節DNA配列に連結されでいるベクターである。本願発明の他の態様によると、宿主細胞、特に、原核あるいは真核細胞のような単細胞性の宿主細胞が、所望のポリペプチドが発現されるような条件下にて、本願発明のDNA配列により安定裏に形質転換される。HRR25-様生成物を発現する宿主細胞は、様々な用途での応用が期待される。発現した生成物が宿主細胞表面に「表れる」程度にまで、当該生成物に免疫学的に特異的に反応する抗体基質を作成するために、貴重な免疫原から構成することもできる。本願発明の宿主細胞は、細胞を適切な培養培地にて成長させ、所望のポリペプチド生成物を細胞、もしくは細胞を成長させた培地から単離する、HRR25-様プロテインの大規模生産に非常に適している。本願発明にさらに包含されているものは、抗体基質（例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、CDR-移植した抗体、等）、およびHRR25-様プロテインに特異的な他の結合タンパク質（すなわち、HRR25 のプロテインキナーゼ触媒領域と少なくとも35％の相同性での関連が無い、プロテインキナーゼ分子と非反応性）である。抗体基質は、単離した天然あるいは組み換えHRR25-様プロテイン、あるいはその表面にかような生成物を発現する細胞を用いて、作成することができる。目下のところ本願発明の好ましい抗体としては、12301パークロウンドライブ、ロックビル、メリーランド州に所在のAmerican Type Culture Collectionに、1995年１月17日に寄託され、受託No．HB 11800、HB 11802、HB 11804、HB 11803、HB 11805およびHB 11801がそれぞれ付与された、ハイブリドーマ75C10H、80J9E、94A1D、94F4A、94J11C、および128Aによって産生されたモノクローナル抗体が含まれる。そして、この抗体基質は、組み換えあるいは自然発生したHRR25-様ポリペプチドの精製、およびその表面にかようなポリペプチドを生成する細胞を同定するのに有用である。この抗体基質および他の結合タンパク質は、HRR25-様プロテインが関与するリガンド−レセプター結合反応の調整（すなわち、ブロッキング、阻害、あるいは刺激）においても非常に有用である。抗HRR25-様抗体基質に特異的な、抗イディオタイプ抗体も、本願発明で意図している。細胞表面、および血清ならびに細胞質画分などの液体でのHRR25-様プロテインの検出および定量のための分析では、「サンドウィッチ」分析形態にて、単一抗体基質あるいは多重抗体基質が関与する。プロテインキナーゼのイソ体と特異的な免疫反応性を有する抗体、あるいは特定のイソ体のサブタイプと特異的な免疫反応性を有する抗体は、一つ以上のプロテインキナーゼのイソ体の異なる免疫精製においても有用である。本願発明に従って得られた組み換えHRR25-様タンパク生成物は、真核細胞プロテインキナーゼの中で独特の幾つもの特性を表した。その一例として、HRR25プロテインは、プロテイン−チロシンキナーゼおよびプロテイン−セリン／スレオニンキナーゼ活性の双方を備えていた。さらに、HRR25を、特異的なヌクレオチド配列にてＤＮＡ鎖損傷の修復を促進するために使用し、そして、HRR25は、このような組み換え／修復促進活性を有していることが知られているプロテインキナーゼに他ならないのである。本願発明によって得られる酵母および哺乳類（ヒトを含む）種のHRR25-様タンパク質に関するDNA配列情報は、DNA/DNAハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）クローニングなどの公知技術によって、他のHRR25-様タンパク質をコードするDNAの同定および単離を可能にした。組み換えHRR25-様タンパク質およびそれを発現する宿主細胞は、DNA損傷の修復に関する様々な組成物の効果、およびタンパク質のプロテインキナーゼ活性を検定するためのスクリーニング法として有用である。プロテインキナーゼ阻害活性は、Hidaka et al．（Methods in Enzymology，201:328-339，1991）に記載されたような公知のスクリーニング方法によって評価することができる。図面の簡単な説明本願発明の他の態様および利点は、好適な態様を述べた以下の詳細な説明を考慮し、図面を参照することで明らかになるであろう。そして；図１（Ａ）には、酵母CDC28、酵母KSS1、およびヒトRAF1プロテインキナーゼの触媒領域と、HRR25の推定したアミノ酸配列との対比を示している。図１（Ｂ）には、HRR25の構造の概要を示しており；および図２には、三つの他のSaccharomyces cerevisiae HRR25-様タンパク質（YCK1/ CKI2、YCK2/CKI1、およびNUF1）、Saccharo-myces pombeからの二つのHRR25-様タンパク質（Hhp1+、およびHhp2+）、およびヒトHRR25-様タンパク質の三つの推定イソ体（CKIα1Hu、CKIα2HuおよびCKIα3Hu）の配列と、HRR25の推定アミノ酸配列との対比を示している。発明の詳細な説明本願発明の一態様にて、本願発明は、DNA正常性に関する様々な組成物の効果を検査する分析システムに使用できるDNA組換／修復促進ポリペプチドに関する。DNA鎖損傷の修復を促進する能力で特徴付けられるこれら機能配列は、特定の組成物におけるかような修復活性の復原効果の有無を決定するための組成物のスクリーニングを可能ならしめるものである。本願発明は、正常有糸分裂組み換えを促進するが、プロテインキナーゼ活性が欠けており、DNA鎖損傷を実質的に修復できないポリペプチドをコードするDNA配列も提供する。この欠陥のあるDNA配列は、機能性プロテインキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする他のDNA 配列を同定するのに非常に有用である。加えて、本願発明は、この欠陥のあるDN A配列によってコードされたポリペプチド、ならびに機能性野性型DNAによってコードされたポリペプチドに関する。プロテインキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列を同定するために、かような活性が欠けた変異体にてDNA鎖損傷修復を復原できるヌクレオチド配列に関してDNAライブラリーをスクリーニングすることによる方法が提供される。プロテインキナーゼ活性を有する哺乳類ポリペプチドの活性が欠けた変異体にて、DNA二本鎖損傷修復活性を復元することができるポリペプチドに影響を与える組成物を同定するための方法が、さらに提供される。一般に、欠陥のあるプロテインキナーゼは、正常有糸組換を促進する能力と、開裂部位：にて生ずるDNA二本鎖破損の修復を必須的に不能にする能力によって特徴付けされる。欠陥のあるプロテインキナーゼの修復が必須的に不能であるDNA二本鎖損傷は、エンドヌクレアーゼ、Ｘ線、あるいはアルキル化剤を含む放射線様薬剤を含んだ様々な手段で誘発することができる。好ましいエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼHOのような同じヌクレオチド開裂部位を認識するものである。メチルメタンスルホン酸を含む放射線様薬剤が好ましい。当業者であれば、別段の実験を経なくとも、適当なDNA損傷を誘発する他の薬剤を同定できるであろう。本願発明は、接合型相互変換を開始する65キロダルトン部位特異性エンドヌクレアーゼをコードする、DNA二本鎖エンドヌクレアーゼHOの継続的発現に感受的な変異体を特に開示している（Kostriken，et al.，Cold Spring Harbor Symp． Quant．Biol.,49：89，1984）。これら変異体は、損傷を受けた染色体の認識および修復を含めた機能を理解する上で重要である。本発明は、酵母野性型DNA組換え遺伝子およびHRR25と称する修復遺伝子（HOおよび／または放射線修復）も開示している。ホモ接合性変異株hrr25-1は、メチルメタンスルホン酸およびＸ線に感受的であるが、紫外線照射には感受的でない。野性型遺伝子は、リン酸化によるDNA修復機能の活性において不可欠である、新規タンパク質キナーゼ、他のセリン／スレオニンキナーゼの相同体をコードする。 HRR25キナーゼは、正常細胞の生長、核分裂、DNA修復および減数分裂にとって重要であり、HRR25の削除は細胞周期欠陥の結果をもたらす。HRR25キナーゼとRa f/c-mosタンパク質キナーゼサブユニットとの間の配列類似性にて連結された表現型は、S．cerevisiae成長および発達において同様の役割を果たすものと思われる。DNA鎖破損修復における欠陥およびHRR25キナーゼにおける変異により表れる異常型生長特性は、タンパク質キナーゼが果たす役割にまで及び、DNA代謝に関連した特性の機能範疇にHRR25を位置させることになる。本願発明のタンパク質キナーゼポリペプチドをコードする特異的DNA配列の開発は、様々な技術を用いて達成される。例えば、（1）真核生物のゲノミックDNA からの二本鎖DNA配列の単離、（2）重要なポリペプチドのための必須コドンを提供するDNA配列の化学合成、および（3）真核ドナー細胞から単離したmRNAの逆転写による二本鎖DNA配列のin vitro合成、を含む方法を採用することができる。後者の方法の場合、mRNAの二本鎖DNA相補体は、cDNAと一般的に称されている形態に形成される。本願発明の新規DNA配列は、本願発明の新規プロテインキナーゼの機能的特性を示すポリペプチドの原核あるいは真核宿主細胞での発現をもたらすのに有用なすべての配列を含む。これらDNA配列には、（a）配列番号：１に示したDNA配列もしくはその相補鎖；（b ）前記（a）で定義したDNA配列もしくはその断片によってコードされたアミノ酸配列と、プロテインキナーゼ領域にて少なくとも約35％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNA配列；および（c）上記（a）および（b）にて定義された DNA配列、が含まれる。上記（b）において特に包含されるのは、対立性変異体をコードするゲノミックDNA配列である。項目（c）には、プロテインキナーゼの断片、およびプロティンキナーゼのDNA配列が、mRNAの翻訳を促進するコドンを組み込んでいる該プロテインキナーゼの類似体をコードするDNA配列の製造が包含されている。項目（c）にさらに包含されているのは、遺伝子コードの結果として変性されたDNA配列である。本明細書にて使用している「保存変異」なる語彙は、アミノ酸残基を、他の生物学的に同様の残基と置換することを指す。保存変異の例には、イソロイシン、バリン、あるいはメチオニンのような疎水性残基から他のものへの置換、あるいは、アルギニンからリシン、グルタミンからアスパラギン酸、あるいはグルタミンからアスパラギン等の置換を含む極性残基から他のものへの置換がある。本願発明のDNA配列は、この配列もしくは対応するDNA配列からのDNAの少量のポリペプチド断片を調製し、サブクローニングし、および発現することは今や定型となっている。「ポリペプチド」の語彙は、本願発明の変異型もしくは野性型プロテインキナーゼの特徴的活性を有する、本願発明のDNA配列の全部もしくは一部によってコードされたアミノ酸の配列を意味している。本願発明のDNA配列の発現の結果として得られたポリペプチドは、他の真核ポリペプチドもしくは自然の細胞環境下ではプロテインキナーゼと他の状態で関連を有する汚染物質との関連性が無いという点で、さらに特徴付けできる。本願発明によって提供された微生物的に発現したポリペプチドの単離および精製は、従来の手段によって、調製用クロマトグラフィー分離およびモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体調製物を含む免疫学的分離を含む。一般に、本願発明において有用な発現ベクターは、挿入した真核遺伝子配列の有効な転移を促進するプロモーター配列を含む。発現ベクターは、典型的には、複製の開始点、プロモーター、およびターミネーターと同様に、形質転換した細胞の表現型選択を可能かなしめる特異的遺伝子を含む。形質転換した宿主は、至適細胞生育を達成するために当該技術分野で周知の技術に従い、培養器中で成長させ、培養することができる。本願発明のポリペプチドは、成長培地、細胞溶解物、あるいは細胞膜画分から単離することができる。本願発明のDNA配列は、原核細胞もしくは真核細胞のいずれにおいてもin vivo で発現することができる。原核細胞での真核細胞コード配列を含むDNA配列の発現方法は、当該技術分野では周知である。宿主細胞での発現および複製のために、本願発明のDNA配列を組み込むために用いる生物学的機能性ウィルスおよびプラスミドDNAベクターは、当該技術分野では周知である。例えば、DNAは適当なベクターを用いて酵母に挿入でき、そして宿主細胞に生成物をもたらす。酵母での外来遺伝子の発現のための様々なシャトルベクターが報告されている（Heineman n，et al.，Nature，340:205，1989；Rose,et al.，Gene，60:237，1987）。当業者であれば、原核細胞および真核細胞双方にて遺伝子発現を得るための適切な技術、あるいは特別な実験を経ること無しにかような技術を容易に確かめうるであろう。宿主には、微生物、酵母、および哺乳類宿主細胞を含む。「宿主」の語彙は、原核細胞のみならず、酵母、繊維状真菌のような真核細胞、ならびに本願発明のイントロンを含まないDNA配列を複製および発現できる植物および動物細胞をも含む。この語彙は、上記した細胞の子孫をも含む。複製の際に変異が生じるので、前述した子孫は親細胞と同一でないと理解されている。しかしながら、かような子孫も、上記した語彙を使用した場合には当然含まれるものである。組換えDNAでの形質転換は、当業者に周知の技術によって実施できる。宿主が原核細胞である場合、DNA取り込みができる大腸菌のような反応能細胞は、対数増殖期後に収穫した細胞から調製でき、続いて当該技術分野で周知の手順を用いた塩化カルシウム法によって処理することができる。また、反応において、塩化マグネシウムあるいは塩化ルビジウムも使用できる。形質転換は、宿主細胞のプロトプラスト形成後でも実施できる。宿主が真核細胞である場合、DNA転移の様々な方法が使用できる。これら方法は、リン酸カルシウム沈殿によるDNAの形質変換、極微注射のような従来の機械的手順、リポソームで包んだプラスミドの挿入、スフェロプラスト電気泳動、単細胞生物の塩介在形質転換、もしくはウィルスベクターの使用を含む。真核DNAは当該技術分野で周知のベクターを用いた原核細胞でクローニングできるので、真核DNAの分析は非常に簡素化された。かようにクローニングした配列は大量に容易に取得でき、および細菌遺伝子技術によるin vivo技術および特異的酵素修飾によるin vitro技術に代替できる。真核細胞遺伝子の機能および発現に関するこれら実験的に誘発した改変の効果を決定するために、クローニングされ、真核生物へ再導入した細菌の配列換えした配列を取り出さなければならない。原核細胞に欠けている多くの機能が真核細胞にはあるので、（例えば、ミトコンドリアへのATP生成系の局在化、ヒストンへのDNAの会合、有糸分裂ならびに減数分裂、および細胞の分化）、かような機能の遺伝子調節は、真核細胞環境下で評価しなければならない。酵母中の他の真核細胞からのクローニング遺伝子は、クローニングした真核遺伝子ならびに他の酵母遺伝子の分析のために有用である。数多くの多様な酵母ベクターが、この目的のために構築されてきた。ベクターDNAの増幅にとって重要である、すべてのベクターが大腸菌において複製する。すべてのベクターが、酵母中で容易に選択できる、例えば、LE U2、HIS3、URA3などのマーカーを含んでいる。加えて、大腸菌での使用のために、これらベクターは、抗生物質耐性マーカーを保有している。周知の酵母遺伝子のヒト相同体をクローニングするための多くの方法が、当該技術分野では周知である。特に限定を意図するものではないが、これらには、１）分割したヌクレオチド配列を検出するための緩やかな条件下でのハイブリダイゼーション、２）分割した構造特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、および３）同様の機能を有する遺伝子を検出するための変異体の相補性、などがある。本願発明の目的のために、相同体であるプロテインキナーゼを、構造的および機能的類似性によって同定できる。構造的類似性は、例えば、アミノ酸相同性、あるいは本願発明のプロテインキナーゼに存在する独特のエピトープを認識する抗体、特にモノクローナル抗体によるスクリーニングによって評価することで決定できる。構造的類似性を評価するためにアミノ酸相同性を使用する場合には、プロテインキナーゼにおいて、原型のHRR25プロテインに対して少なくとも約35％の相同性を有するアミノ酸配列は、独特の特徴付けがされたポリペプチドであると考えられる。 HRR25アミノ酸残基での保存領域は、他の種からのHRR25-様遺伝子を同定するために使用することができる。HRR25-様遺伝子（相同体）の同定と単離のためのプローブとして使用できる保存領域には、例えば、GPSLED（配列番号：２の86〜 91位のアミノ酸）、RDIKPDNFL（配列番号：２の127〜135位のアミノ酸）、HIPYR E（配列番号：２の164〜169位のアミノ酸）、およびSVN（配列番号：２の181〜1 83位のアミノ酸）をコードするヌクレオチドが含まれる。これら保存部分は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような当該技術分野で周知の方法による他のHRR25-様遺伝子を検出するためのヌクレオチドプライマーを作成するために使用することができる。相同的アミノ酸配列が機能的特徴に基づいて評価された場合、相同性配列が、ヌクレオチド開裂部位：にて生ずる破損を含んだDNA二本鎖損傷を、必須的に修復できず（欠陥変異遺伝子の修復の場合）、または修復できる（自然遺伝子の）場合、および相同的アミノ酸配列が正常有意図分裂組換えを許容する場合に、相同的アミノ酸配列が、本願発明のアミノ酸配列と同等であると考えられる。本願発明により、スクリーニング法が提供され、それにより、遺伝子が劣性マーカーの相補性によるプラスミドライブラリーからクローニングされる。Saccha romyces cerevisiae のような受入株は、目的の遺伝子において劣性変異を保有するように構築される。この株は、プラスミド、例えば、野性型ゲノミックDNAもしくはcDNAを含むpYES2（インビトロジェン社、サンディエゴ、カリフォルニア州）によって形質転換される。目的の遺伝子を保有するクローンは、目的の遺伝子について、野性型表現型から変異体を識別するレプリカ培養によって選択することができる。プラスミドは、クローンから抽出され、DNAは研究に付される。いくつかの酵母ベクターが、酵母遺伝子の単離に結びつく相補性システムへの適用を許容する。様々な種類の種からの遺伝子を、これらベクターを用いて単離することができる。このようなシステムにおいて、入手元を問わずに取得したDNA配列は、ベクターにクローニングされ、酵母変異体に特異的に相補する活性に関して酵母にて直接スクリーニングできる。好適な態様において、本願発明は、HOエンドヌクレアーゼによって誘発された DNA二本鎖損傷への感受性によって同定された酵母での変異、hrr25変異体を用いる。この変異に相補的なゲノミックDNAが、hrr25株のDNAライブラリーによる形質転換およびそれに続くメチルメタン硫酸塩（MMS）耐性に関してスクリーニングすることによって単離された。あるいは、様々な哺乳種からの機能遺伝子が、前述したシステムを用いて今やクローニングできるようになっている。酵母遺伝子は、ハイブリダイゼーションプローブとしての精製RNA、調節されたRNA転写の特異性ハイブリダイゼーション、抗体スクリーニング、トランスポゾン変異、変異体表現型の交差抑制、異種cDNAもしくはオリゴヌクレオチドプローブを用いた交差ハイブリダイゼーション、ならびに大腸菌での相補性の使用を含む、様々な方法によってクローニングできる。最初のアミノ酸配列の小さな改変は、配列番号：２に示した配列と比較して、実質的に同様あるいは向上した活性を有するタンパク質によるものであると考えられる。改変は、特定部位の突然変異誘発のような選択的なもの、あるいは微生物を産生するHRR25による自然発生的であったりする。これら改変のすべてが、H RR25活性が保持されている限り、本願発明に包含される。配列番号：２に示した第151位のアスパラギン酸のグリシン酸残基への置換によって、変異体hrr25と同一になった。本願発明により提供される抗体は、変異ポリペプチドおよび／または自然発生プロテインキナーゼとの免疫反応性を有する。異なるエピトープ特異性を有する無数のモノクローナル抗体から必須的に構成される抗体、ならびに別異のモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法によるポリペプチドの断片を含む抗原から作製される（Kohler，G．et al .，Nature 256:495，1975；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel ，F．et al.，ed.，1989）。本願発明は、チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドの活性に影響を与える組成物を同定するための方法も開示している。このポリペプチドは、hrr25遺伝子を含む宿主細胞にてDNA二本鎖損傷の修復活性を復原することができる。組成物およびポリペプチドは、一定の時間、構成要素が相互作用を及ぼすのに十分な条件下で宿主細胞と共にインキュベートされ、プロテインキナーゼ活性の変化、例えば、DNA二本鎖損傷の減少した修復をモニターする。DNA鎖損傷には、例えば、メチルメタン硫酸塩のような放射線様薬剤、Ｘ線、もしくはHOのようなエンドヌクレアーゼによるものを含む。当該技術分野で周知の他の二本鎖損傷を誘発する手段も同様に使用できる。本願発明の一態様にて、HRR25-様タンパク質活性を調整する試薬の治療上有効量を、細胞増殖疾患を患った対象に対して投与することを含む、HRR25あるいはH RR25-様タンパクに関連する細胞増殖疾患を治療する方法が提供される。「細胞増殖障害」なる語彙は、形態学および／または遺伝子型的に周囲の組織とは異なる、悪性ならびに非悪性の細胞群を指す。かような障害は、例えば、HRR25-様タンパク遺伝子の不正常な発現に関連するものと思われる。「不正常な発現」とは、発現の増大あるいは減少したレベル、ならびにHRR25-様遺伝子の正常機能が改変された変異形態を含む。不正常な発現とは、細胞周期中での不適切な一時的な発現、あるいは誤った細胞型での発現も含む。本願発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、様々な器官系での悪性腫瘍を処置する上で有用である。HRR25-様遺伝子の改変した発現が原因である障害は、本願発明の試薬にて処置する候補である。細胞増殖障害の「処置」とは、悪性あるいは非悪性細胞の増大あるいは減少した個体を指す。本明細書で使用している「調整」なる語彙は、HRR25-様タンパク質発現あるいは発現の増大の抑制を意図するものである。細胞増殖疾患が、HRR25-様遺伝子の過剰発現に関連するのであれば、アンチセンスあるいは結合抗体のような適切な試薬を、細胞に導入することができる。この方法は、例えば、アンチセンス核酸によるmRNAの遮蔽、あるいはリボ酵素によるmRNAの開裂のいずれかにより、特異的なHRR25-様タンパク質mRNAの翻訳をブッロクするために、アンチセンス核酸あるいはリボ酵素を利用できる。あるいは、細胞増殖障害が、不十分なHRR25-様タンパク質に関連するものであるならば、センス・ポリヌクレオチド配列（DNAコード鎖）あるいはHRR25-様ポリペプチドが、公知の方法によって、細胞に導入することができる。本明細書で使用している「治療上有効」なる語彙は、HRR25-関連障害を改善するに十分なポリヌクレオチド、抗体、あるいはポリペプチドの量を指す。「改善」とは、治療を受ける対象における、HRR25-関連障害の症状が快方に向かうことを意味する。アンチセンス核酸とは、特異的なmRNA分子（Weintraub，Scientific American ，262:40，1990）の少なくとも一部と相補的なDNAあるいはRNA分子である。細胞において、対応するmRNAとハイブリダイズしたアンチセンス核酸は、二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖のmRNAを翻訳しないので、これはmRNAの翻訳に作用するであろう。アンチセンス核酸は容易に合成でき、また、目標とするHRR25産生細胞に導入した際に、大きな分子よりも翻訳への非特異的作用が小さいので、約 15個のヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴマーが好ましい。遺伝子のin v itro での翻訳を阻害するアンチセンス法の使用は、当該技術分野にて公知である（Marcus-Sakura，Anal.Biochem.，172:289，1988）。リボ酵素は、DNA制限エンドヌクレアーゼと同様の方法にて、他の一本鎖RNAを特異的に開裂する能力を有するRNA分子である。これらRNAをコードするヌクレオチド配列の修飾を通じて、RNA分子にて特異的なヌクレオチド配列を認識する分子を加工し、それを開裂することは可能である（Cech，J．Amer．Med．Assn．26 0 :3030，1988）。この方法の最大の利点は、リボソームが配列特異的であるので、特定の配列を有するmRNAのみが不活性化できることにある。リボソームには二つのタイプ、すなわち、tetrahymena型および「ハンマーヘッド」型がある。Tetrahymena型リボ酵素は、４塩基長の配列を認識し、一方で「ハンマーヘッド」型リボ酵素は、11〜18塩基長の配列を認識する。認識する配列が長くなるに従い、目標とするmRNA種でのみしかその配列が生じない結果になりやすい。従って、ハンマーヘッド型リボ酵素は、特異的なmRNA種を不活性化する上でtetrahymena型リボ酵素より好ましく、また、長い認識配列が、短い認識配列よりも好ましい。本願発明は、HRR25-様ポリペプチドによって媒介された細胞増殖障害を治療するための遺伝子治療も提供する。かような治療では、増殖疾患を有する対象の細胞にHRR-25アンチセンスポリヌクレオチドを導入することを含む。アンチセンス・ポリヌクレオチドの運搬は、キメラウィルスのような組み換え発現ベクターあるいはコロイド分散系を用いて行うことができる。HRR25の発現下に関連する障害は、ヌクレオチドコード配列を用いた遺伝子治療によって処置できる。本明細書にて言及している遺伝子治療のために使用できる様々なウィルスベクターには、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニア、もしくは、好ましくは、レトロウィルスのようなRNAウィルスが含まれる。レトロウィルスベクターは、マウスあるいはトリレトロウィルスの誘導体が好ましい。レトロウィルスベクターとしては、単一外来遺伝子が挿入されたものを含むが、モロニーマウス白血病ウィルス（MoMuLV）、ハービィーマウス肉腫ウィルス（HaMuSV）、マウス哺乳類腫瘍ウィルス（MuMTV）、およびラウス肉腫ウィルス（RSV）に限定されるものではない。他のレトロウィルスベクターの多くも、多重遺伝子に組み込むことができる。これらベクターのすべてが、形質導入した細胞の同定あるいは生成のための選択性マーカーのために、遺伝子に転移あるいは組み込むことができる。例えば、特異的な目標細胞に関するレセプターに対するリガンドをコードする他の遺伝子に加えて、対象となるHRR25-様配列をウィルス性ベクターに挿入することにより、そのベクターは目標細胞に特異的になる。レトロウィルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、あるいはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、目標細胞に特異的とすることができる。好ましい標的作りは、レトロウィルスベクターを標的とする抗体を用いることで達成される。当業者であれば、別段の実験を経ること無しに、HRR25-様アンチセンスポリヌクレオチドを含むレトロウィルスベクターの標的に特異的な伝播を許容するレトロウィルスゲノムへの挿入が可能な、特異的ポリヌクレオトド配列を容易に想到できるものと思われる。組み換えレトロウィルスには欠陥があるため、感染ベクター粒子を生成するための補助が必要となってくる。この補助は、例えば、LTRの調節配列による制御の下、レトロウィルスの構造遺伝子のすべてをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系を用いることによって得ることができる。これらプラスミドには、粒子包埋のためのRNA転移を認識する包含機構を実現するヌクレオチド配列を欠いている。ヘルパー細胞系は、包含シグナルの削除を含むが、例えば、Ψ２、PA31 7およびPA12に限定されるものではない。これら細胞系は、ゲノミックを包含していないので空のビリオンを生成する。包含シグナルが無傷の細胞にレトロウィルスベクターを導入するが、構造遺伝子を他の対象とする遺伝子と置換したとすれば、ベクターは包含され、そしてベクタービリオンが生成される。あるいは、NIH 3T3または他の組織培養細胞は、従来の燐酸カルシウム形質変換により、レトロウィルス構造遺伝子gag、Pol、およびenvをコードするプラスミドで直接形質変換することができる。そして、これら細胞は、対象となる遺伝子を含んだベクタープラスミドで形質変換される。得られた細胞は、培養培地中にレトロウィルスベクターを放出する。 HRR25-様アンチセンスポリヌクレオチドのための標的への他の運搬システムは、コロイド分散システムを含む。コロイド分散システムは、巨大分子体、超微小カプセル、微小球、ビーズ、および水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質を基礎としたシステムを含む。本願発明の好ましいコロイド分散システムは、リポソームである。リポソームは、in vitroおよびin vivo での運搬体として有用な人造膜泡体である。0.2〜4.0μｍの範囲の大きさの大単層状泡体（LUV）が、巨大分子を含む水性緩衝液の実質的な割合でカプセル被包されることが明らかになっている。RNA、DNA、および無傷のビリオンが、水性成分中にカプセル被包され、そして、生物学的に活性な細胞に誘導される（ Fraley et al.，Trends Biochem．Sci.,6:77，1981）。哺乳類細胞に加えて、リポソームは、植物、酵母、および細菌細胞にてポリヌクレオチドの運搬のために使用されてきた。リポソームを効果的な遺伝子運搬体とするためには、下記の特徴を備えるべきである：（1）生物学的活性の有無にかかわらず、高率での挿入体遺伝子のカプセル被包；（2）非標的細胞と比較した、標的細胞への好適かつ実質的な結合；（3）高率での標的細胞質への泡体の水性成分の運搬；および（4 ）遺伝子情報の正確かつ効果的な発現（Mannino et al.，Biotechniques，6:682 ，1988）。リポソームの標的付けは、解剖学上および機構上の側面から分類されてきた。解剖学上の分類は、例えば、器官特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性などの選択性のレベルに基づいている。機構上の標的付けは、受動性あるいは活動性かによって識別している。受動的標識付けは、洞様血管を含む器官の網内系（RE S）を細胞へ分布させるリポソームの性質を利用する。一方で、活動性標識付けは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、あるいはタンパク質のような特異なリガンドをリポソームに結合、または、局在している自然発生部位以外の器官および細胞型への標的付けを行うための、リポソームの組成あるいは大きさを変えることによるリポソームの改変を含む。標的付けした運搬系の表面は、様々な態様で修飾できる。リポソームで標的付けした運搬系の場合、標的とするリガンドとリポソーム二重層との安定会合を維持するために、脂質をリポソームの脂質二重層に組み込むことができる。様々な結合基が、標的とするリガンドへ脂質鎖を接合するために使用することができる。一般に、標的付けした運搬系の表面に結合した化合物は、標的付けした運搬系が所望の細胞にて認められ、そして「落ち着く」ことを許容するためのリガンドあるいはレセプターである。リガンドは、レセプターのような、他の化合物に結合するいかなる化合物であってもよい。本願発明は、下記実施例を考慮すれば、さらに理解が進むものと思われる。すなわち：実施例１は、Saccharomyces cerevisiaeのhrr25変異株の単離を記述し；実施例２は、相補性スクリーニングによるHRR25 DNAの単離を記述し；実施例３は、HRR25のDNAおよび推定アミノ酸配列の特徴付けに関し；実施例４は、HRR2 5野性型およびhrr25変異酵母の形態の顕微鏡観察を記述し；実施例５は、HRR25 のアミノ酸配列と、HRR25-様でない三つの例示的なプロテインキナーゼとの関連を記述し；実施例６は、二つのSaccharomyces pombe HRR25-様プロテインキナーゼをコードするDNAの単離を記述し；実施例７は、他のSaccharomyces cerevisiaeタンパク質NUF1をコードするDNAの単離に関し；実施例８は、三つのヒトイソ体、CKIα1Hu、CKIα2HuおよびCKIα3Huを含む様々な真核種HRR25-様タンパク質をコードするDNAの単離に関し；実施例９および10 はそれぞれ、カゼインキナーゼ、およびHRR25のセリン−スレオニンキナーゼならびにチロシンキナーゼ活性双方の決定に関し；実施例11は、HRR25生成物の組み換え発現および発現物に対する抗体の作成を記述し；実施例12は、ヒトCKIイソ体、CKIγ1HuおよびCKIγ2Huの単離に関し；実施例13は、他のイソ体CKIδHu の単離を記述し；実施例14は、ヒトCKIイソ体と酵母CKI変異体との相補性を記述し；そして、実施例15は、ヒトCKIδHuイソ体のペプチド断片に対するモノクローナル抗体の生成に関し；実施例16は、CKIδHuによるcisおよびtransチロシン燐酸化の観察に関し、および実施例17は、TNFαによるCKIδHu活性の刺激に関する。下記の実施例は例示的なものであり、これに本発明が限定されるものではない。下記実施例は本発明態様の典型例であるが、当業者に周知の他の手順も選択的に使用できる。実施例１ hrr25の単離 S．cerevisiae株K264-5B（MAT α ho ura3 can1^R tyr1 his7 lys2 ade5 met13 trp5 leu1 ade5）を、変異体単離に用いた。その酵母は、GAL1,10-調節したＨＯエンドヌクレアーゼを含むURA3-に基づいたプラスミドによる標準的方法に従って形質転換され、該形質転換体は（前出のCurrent Protocols in Molecular B iology ）に記載された通り、約50％が生存するように、エチルメタン硫酸塩（EM S）で突然変異された。培養液を、グリセロール含有の肥沃な培地（YPG、プチットを避けるため）に拡散し、コロニーは30℃で形成し、プレートをグルコース（HO抑制）とガラクトース（HO 誘導）培地に複製した。変異体はガラクトースでの非増殖性により同定した。約 200の変異体が初期性状に関して、また反復単一コロニー精製を通じてgal-表現型を有する62の変異体が選抜された。これらの中で、多くは、様々なgal-突然変異体とは相補的でなかった。残りの（25個の）変異体は、紫外線（UV）照射ならびにメチルメタンスルホン酸塩（MMS）に関する感受性を決定することによって、重複したＤＮＡ修復欠陥を調査した。このスクリーニング方法は、周知のrad 突然変異の五つの対立遺伝子ならびに一つの新規変異を同定した。この新規突然変異hrr25-1（HOおよび／または放射修復）は、重大な欠陥を示し、そしてさらに研究された。劣性ＤＮＡ欠陥は、ＭＭＳに対する感受性を含むhrr25-1により付与される。H rr25-1 株は、放射性修復遺伝子RAD50及びRAD52（Cole，etal.，Mol．Cell．Biol .，9: 3101，1989）における変異にて観察されるのと同様の5-20 Krad X-線照射にて感受性を示す。hrr25-1株は野生型よりもUV照射に対して感受的ではなく、また、37℃での増殖に関して温度感受性ではない。hrr25-1表現型のいくつかを有するhypo-およびhyper-rec rad変異体と異なり、hrr25-1株は標準有糸分裂組換えを受ける（Cole．et al.，Mol．Cell．Bｉol.，9:3101，1989）。自発性遺伝子転換および交換は、ホモ型接合性hrr25-1および野生型株に関して同じであった。しかしながら、hrr25-1ホモ型接合体には、減数分裂の正確な完成が要求される。hrr25-1ホモ型接合体は同系野生型株において75〜80％の胞子を生成する条件下で、１％以下の胞子（四核細胞）を示す。hrr25-1変異が、いくつかのhrr25表現型を示す多数の放射性感受性変異体（ rad6，50，52，54および57）に相補的であるということは、hrr25-1は新規の暴露したrad-様変異体であり、前述したこれら遺伝子の一つでないことを示唆するものである。これらの結果は、HRR25はＤＮＡ修復および減数分裂において役割を果たすが、組換による自発的有糸分裂損傷の修復は特に必要とされないことを示している。実施例２ HRR25の単離 HRR25遺伝子は、プラスミドYCp50に構築された酵母ゲノミックライブラリーを用いたMMS感受性への相補によって取得した（Rose，et al.，Gene，60:237，198 7）。hrr25-1株、MHML3-36d（ura3 hrr25）は、ウラシル原栄養株に対して標準方法（Nickoloff，et al.，J．Mol．Biol.，207:527，1989）によって形質転換し、形質転換体はウラシルを含まない培地にて増殖され、0.01％MMSを含む培地で複製した。1200個の形質転換体の内、単一のMMS耐性分離株が同定された。MMS 感受性に関する相補性は、当該技術分野で周知の方法により決定されたプラスミドで分離するために認められた。 12kbのゲノミック断片が同定され、相補活性が、トランスポゾン変異生成およびサブクローニングにより、3.1kb BamHI-SalI断片に局在していた。この領域は、ＤＮＡ修復欠陥ならびに減数分裂欠如に相補した。遺伝子目標実験では、このクローニングした領域をhrr25-1結合させた。同起源のHRR25ゲノミック遺伝子座へ戻されたBamHI-SalI断片内のトランスポゾン挿入変異は、MMS感受性に関するh rr25-1 と相補しなかったのに対し、hrr25-1に対して相補した時に、相補領域の外側の近接する染色体挿入体は、相反して分離した。 Mini-Tn10LUKランスポゾン（Huisman，et al.，Genetics，116:191，1987）は、12kbのBamHI-SalI断片におけるHRR25の概ねの位置を定めるために用いられた。（12kbのゲノミック断片の）左手側９kbに位置する挿入体は、変異しなかったプラスミドと比較して、hrr25-1MMSの相補耐性を不活性化しなかった。右手側２ kbにあるEcoRV部位近傍に位置する二つの挿入体は、相補性を不活性化した。HRR 25 相補活性は、3.4kbにあるSalI断片に局在していた。この断片（12kbの右手側）の約300塩基対は、（pBR322に基づくYCp50のBamHI間の）pBR322テトラサイクリン耐性遺伝子の一部である。HRR25の読取枠は、右末端３kbにあるEcoRV部位と二つのBglIIを横断する内部領域にわたっている。 3.1kb断片のＤＮＡ配列は、中央部に位置する1482個のヌクレオチドの読取枠を示した。この読取枠内のトランスポゾン挿入変異体は、HRR25相補性を不活性化したが、12kbクローンのその他の挿入体はHRR25相補性に影響を与えなかった。HRR25のトランスポゾンが介在した分裂も、hrr25-1には見られなかったいくつかの表現型を示した。予期していた通り、プラスミド保有HRR25コード領域中央部へのTn10に基づいたLUKトランスポゾン挿入体（Huisman，et al.，Genetics，116: 191，1987）は、MMS感受性に関する相補性を不活性化した。ゲノミックHRR2 5 遺伝子へのこの挿入体の移入は、MMS感受性および減数分裂不能に加えて、いくつかの成長欠陥を示した。このいくつかの成長欠陥は、hrr25-1株には見られなかった。野性型HRR25株は、肥沃な培地にて、30℃で、各80〜90分にて二倍になったのに対し、同系のhrr25::LUK株およびhrr25:Δは、各９〜12時間で二倍になった。hrr25-1は、二倍になるために２〜４時間の時間を要した。変異体表現型が、hrr::LUK分裂対立遺伝子が存在しない表現型を意味するか否かを決定するために、HRR25全コード配列を削除した。要約すれば、HRR25全コード配列の削除には、hisG::URA3::hisGカセット（Alan，et al.，Genetics，116: 541，1988）を用いた。3.1kbのHRR25 SalI断片をpBlues-criptにクローニングした（ストラタジェン社、ラヨラ、カリフォルニア州）。このプラスミドをBglII で消化し、HRR25全遺伝子にわたる長さの二つのBglII断片およびその端部処理した配列を削除した。hrr25Δ対立遺伝子を生成するために、この削除部分を、pNK Y51からの3.8kb BamHI-BglII hisG::URA3::hisG断片に導入した。SalI消化により、HRR25全遺伝子座が削除された直線状断片を生成した。削除−分裂対立遺伝子（hrr25Δ）を保有する酵母は、MMS感受性、緩やかな成長、および胞子形成欠陥を含む、野性型HRR25タンパク質がこれらプロセスと関連があり、ならびにHRR 25::LUK 対立遺伝子がＤＮＡ修復、成長、もしくは胞子形成を間接的に干渉しないという検討したすべての特性に関して、hrr25::LUK対立遺伝子の表現型と同一であることが示された。直接対比において、hrr25::LUKおよびhrr25Δ対立遺伝子は同一の挙動を示した。酵母株MHF-14（MATa/MATα ura3/ura3）を、ウラシル原栄養株に対するBglII- 直線化YCp50-HRR25::LUKで形質転換し、HRR25の異種接合体分裂をサザーン・ブロット分析法によって確認し、窒素および醗酵性炭素源欠乏によって二倍体の胞子形成を行い、四分子を切開し、細胞を30℃で、７日間、成長させた。２日間の標準培養に先駆けて、hrr25::LUKの重大な成長欠陥が、HRR25の欠損が致命的であることを示唆している。しかしながら、分離体の顕微鏡観察では、hrr25::LUK 成長細胞がゆっくりと生育し、観察したすべての事例（20/20四分子）にて、緩やかな成長、MMS感受性、およびウラシル原栄養株共分離体が認められた。アデニン生合成での変異のため、二倍体MFH14分離体による、色彩変化が観られた。MFH14は、ade5/ADE5 ade2/ade2 である。ade5/ade2株は白、およびADE5/ade2株は赤色を示した。実施例３ HRR25遺伝子の配列および構造 HRR25遺伝子の両鎖のＤＮＡ配列の決定をセキナーゼ（USB社、クリーブランド、オハイオ州）およびExo-Meth（ストラジェン社、ラヨラ、カリフォルニア州）法を用いて使用説明書に従って、一方向削除によって行い、その結果を配列番号：１および２にそれぞれ示した。図１Ａには、HRR25、CDC28、KSS1およびRAF1のアミノ酸配列の対比を示している。図１Ｂは、HRR25の構造の概略図である。プロテインキナーゼ相同体には影を付け、P/Q豊富領域は交差斜線によって示した。突然変異体、hrr25は一つのアミノ酸置換によって、HRR25と区別できる。151 位にて、アスパラギン酸はグリシンに置換される。 HRR25の予想される翻訳生成物は、rad-様ＤＮＡ修復機能の予想外の特性を示した。HRR25はセリン／スレオニンプロテインキナーゼの上科（Hanks et al.，S cience ，241:42，1988）の触媒領域との相同配列である特徴的な記号を含む。比較のために、HRR25翻訳生成物を、CDC28/cdc2グループおよびKSS1/FUS3グループの、酵母タンパク質キナーゼの二つのサブグループの触媒領域と対応させた。アミノ酸15および30の間に位置する領域は、GXGXXG保存領域を含んでいた。この領域のまさにＣ末端が、最も周知のキナーゼに存在するリシンおよびグルタミン酸の保存領域である。これら領域は、キナーゼ反応（Hanks et al.，Science，241:42，1 988）のヌクレオチド結合およびリン酸転移工程にて機能するものと考えられている。アミノ酸残基120から150は、HRDおよびDFG態様を含み、たいていのプロテインキナーゼ科にて認められる。加えて、すべての周知のセリン／スレオニンキナーゼの配列検討にて、HRR25はRaf/PKS/mosサブグループ（Hanks et al.，Scie nce ，241:42，1988）との付加的類似性を共有していることが示された。プロテインキナーゼ触媒領域でのGXGXXG、DGF、およびDXXSXGの周辺領域にて、最も強力な相同体が認められた。 HRR25とプロテインキナーゼとの間で観察された配列類似性機能の関連を、HRR 25 キナーゼ領域内の特定の残基を交換し、これら変換の表現型の成果を検討することで研究した。38位のリシン（Lys³⁸）を、当該技術分野で周知の方法による、特定部位の突然変異誘発によってアルギニン残基へ変異させた。突然変異誘発性のオリゴヌクレオチド、配列番号：22は；であった。 HRR25でのLys³⁸は、周知のタンパク質キナーゼのすべてにおいて認められるリシンと対応しており、このサブ領域はATP結合を含んでいる。v-src、v-mos、およびDBF2のようなプロテインキナーゼにて保存されたリシンの変異は、これらタンパク質を不活性化した。変異体hrr25-Lys³⁸対立遺伝子は、試験したすべての特性に関して、hrr25-1、hrr25::LUK、およびhrr25Δ対立遺伝子と相補できず、またHRR25キナーゼ領域の明示が、HRR25のin vivo機能において求められている。予想されたHRR25翻訳生成物（配列番号：２）は、タンパク質キナーゼ触媒領域の相同領域の外側に、数々の顕著な特徴を有している。例えば、最後の100アミノ酸は、これら残基の50個を含むプロリンおよびグルタミンが多く包含されている。これら二つのアミノ酸が多い領域を含む他のタンパク質は、転写要因Sp1 、jun、およびHAP2、ステロイドホルモン受容体、S．pombe ran1キナーゼ、およびmak-雄性微生物細胞関連キナーゼを含んでいる（Courey，et al.，Cell，55:8 87，1988:Bohmann，et al.，Science，238:1386，1987；Roussou，et al.，Mol ．Cell ．Biol., 8:2132，1988；Arriza，et al.，Science，237:268，1987；Mat sushima,et al.，Mol．Cell．Biol.，10:2261，1990）。Sp1およびjunの場合、プロリン−グルタミン領域は活性化を含むものであるのに対して、ヒト電解質コルチコイド受容体でのP/Q領域は、分子間架橋として作用すると考えられている。HRR25でのこのプロリン−グルタミン領域は、基質相互作用あるいは亜細胞性局在化の構造特徴として機能すると思われる。また、この領域でのグルタミンの多さは、DrosophilaおよびXenopus Notch/Xotchタンパク質（Wharton，et al.，Cell ，40:55，1985；Coffman，et al.，Science，249:1438，1990）に見られるo pa もしくはM-反復体と類似している。opa-反復体の機能は定かではないが、いくつかのDrosophila遺伝子にて認められている。最後に、タンパク質キナーゼに相同な領域のＣ末端における配列TKKQKYは、SV40ラージＴ抗原および酵母ヒストン H2Bの核局在シグナルと同様である（Silver，et al.，J．Cell．Biol.，109:983 ，1989；Moreland，et al.，Mol．Cell．Biol.，7:4048，1987）。実施例４ hrr25細胞の発生および増殖の顕微鏡分析肥沃な培地での発生後、HRR25およびhrr25::LUKコロニーの顕微鏡写真を取った。MFH14 hrr25::LUKヘテロ接合形質転換体は、滅菌顕微鏡スライド上のYPD肥沃培地の薄いフィルム上で切開され、分離物は湿潤した30℃のチャンバー内のスライドにて発生させた。２日間成長させた後に、コロニーの写真を取った。増殖しているHRR25Δおよびhrr25::LUK細胞の位相差およびDAPI染色を比較した。細胞をYPD肥沃培地に接種し、30℃での1.3×10⁷細胞／mlの中間対数密度にまで成長させ、要するに、凝集を超音波的に破砕し、ホルムアルデヒドで固定し、そして、DAPIで染色した（Williamson，et al.，Meth．Cell．Biol.，12:335，1975 ）。hrr25::LUKを有する多くの細胞が、DAPI染色できる核を有していなかった。発生および活性成長対数相半ばのhrr25::LUK細胞の顕微鏡観察から、異常型細胞形態が明らかになった。HRR25トランスポゾン破壊は細胞の拡大を招き、細胞の25〜40％は、繊維状になるかあるいは伸長していた。対数相半ばのDAPI細胞核染色（Williamson，et al.，Meth．Cell．Biol.，12:335，1975）は、hrr25変異体での通常の細胞周期が喪失されていたことを示していた。単細胞操作により生存不能とされたDAPI染色できる核を欠いた大量の細胞があった。この細胞核分離欠陥と一致して、hrr25::LUK半数体のプレート効果も、野生型の75〜80％の減少であった。しかしながら、このプレート効果での減少は、重大な生成率の減少を説明するには不十分であった。血球計計測により決定した細胞の総計に対する肥沃な培地でのコロニー形成の効果を比較することで、プレート効果を対数相半ばの細胞から測定した。細胞集団を、血球流量分析およびそれに続く（Hutter et al.，J．Gen．Microbiol.，113:369，1979）に記載のヨウ化プロピディウムによる染色によって、ＤＮＡ含量の分布について解析された。細胞種分析では、hrr25::LUK半数体集団での細胞の多くが、細胞環状に遅れがあり、G2ＤＮＡ含量を示したが、細胞集団は、細胞周期において均一に抑止される。実施例５ CDC28、KSS1およびRAF1を有するHRR25の配列比較 HRR25の予測した翻訳生成物（配列番号：２）と、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ上科の幾つかの触媒領域を比較した。最初の配列比較には、UWGCG プログラム（Devereux，et al.，Nuc.Acids．Res.，12:387，1984）を用いたのに対し、サブグループの比較には前出のHanks，et al.，の方法を用いた。HRR25 は、前出のHanks，et al.，に記載された11個のサブ領域をすべて含んでいた。構造的に類似する集団を、配列比較にて対比した。これらには、無極性鎖状残基、芳香性あるいは環含有残基、略中性極性をもつ小規模残基、酸性残基、非荷電極性残基、および塩基性極性残基が含まれる。 CDC28およびKSS1は、酵母中のセリン／スレオニンプロテインキナーゼの２つのサブグループを示す。CDC28は細胞周期調節に含まれ、一方、KSS1は酵母交配経路の調節下で活動する。HRR25はCDC28に対して21％の同一性、および41％の類似性を示し、KSS1（図１Ａ）に対して19％の同一性、および43％の類似性を示した。HRR25はタンパク質キナーゼのRaf1/PKS/Mos科に最も高い類似性を示した。触媒領域において、HRR25はRaf1に対して、30％の同一性、および49％の類似性を示した。実施例６ Sc.pombe Hhp1+およびHhp2+遺伝子の同定、単離および分析Ａ．Hhp1+およびHhp2+遺伝子の単離クローンを以下に示す２つの方法で単離した。すなわち、i）DNAに基づいたスクリーニング法；およびii）S.cerevisiaehrr25突然変異株中の直接相補性法。２つの遺伝子を同定した（Hhp1+およびHhp2+；Schizosaccharomyces pombeのHRR 25 相同性から命名）。S.cerevisiae hrr25突然変異株中のHhp1+の発現は、全ての突然変異株の欠損を完全に回復した。S.cerevisiae中のHhp2+の発現もまた、h rr25突然変異に関わる欠損を種々の程度で回復した。 Fikes等の方法（Nature，346:291-293,1990）に従って調製したSc．pombeゲノムおよびcDNA配列から得たHRR25-様DNAのDNAに基づいた増殖を、以下に示す部分的に変性したオリゴヌクレオチドプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応を用いて行なった。（1）プライマーNo.4583（配列番号：13）HRR25の残基16〜15をコードする先端鎖DNA;［１nmol/５μｌ］、Tm=52℃ （2）プライマーNo.4582（配列番号：14）HRR25の残基126〜133をコードする先端鎖DNA;［1.5nmol/５μｌ］、Tm=54℃ （3）プライマーNo.4589（配列番号：15）HRR25の残基126〜133をコードする末端鎖DNA;［0.5nmol/５μｌ］、Tm=54℃ （4）プライマーNo.4590（配列番号：16）HRR25の残基194〜199をコードする末端鎖DNA;［２nmol/５μｌ］、Tm=38℃ パーキンエルマー自動装置を用いて２つのシリーズの増幅を行なった。すなわち、第１のシリーズは、HRR25-ベースのプライマーNo.4583および4589を、そして、第２のシリーズは４つのプライマー全てを用いて行なった。第１のシリーズでは、30サイクルの変性（94℃、１分間）、アニーリング（48℃、１分間）および伸長（66℃、３分間）を行ない、最終サイクルでは伸長時間を５分間に延長した。反応生成物をアガロースゲル上で測定したところ、約306bpの推定サイズの顕著なバンドが認められた。第２のシリーズの増幅では、アニーリングおよび伸長を、それぞれ35℃および60℃で行なった以外は、上記と同様に30サイクルを行なった。予測されたサイズ（513bp、180bp 、および306bp）の３種類の主要生成物が、ゲノムおよびcDNAのライブラリの両方に発生し、これらを調製用アガロースゲル電気泳動で精製した。生成物を、M13mp19にクローニングし、ジデオキシ法（Maniatis et al.，Mole cular Cloning；A Laboratory Manual，1982）により配列決定した。２種類の配列が同定された。各種類の代表的クローンを、比放射能10⁶cpm/μｇまでランダムプライム切断した標識法（前出のManiatis et al）により、³²Ｐで放射標識し、これをハイブリダイゼーションプローブとして用いることにより、全長のcDNA クローンを単離し、サザンブロットにより酵母ゲノムDNAを、そしてノーザンブロットにより総RNAを実験対象とした。ハイブリダイゼーションは、６×SSPE、0 .1％SDS、５％デキストランスルフェートを含む緩衝液中で16時間行なった。２つの遺伝子を同定し、Sc．pombe由来のHRR25 Homologuesを、略してHhp1+および Hhp2+と命名した。 Hhp1+では７つのクローン（６つのクローンおよび１つの全長クローン）が同定された。Hhp2+では、２つの全長クローンが同定された。サザン分析およびノーザン分析の両方にて、これらのクローンが、別々の遺伝子に由来することが証明された。これらの遺伝子を標準ジデオキシ法（前出のManiatiset al.,）を用いて配列決定した。Hhp1+ のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、配列番号：３および４に示す。Hhp2 +のヌクレオチド、および推定アミノ酸配列を、配列番号：５および６に示す。Ｂ．S.cerevisiae hrr25突然変異株における Hhp1+およびHhp2+の機能分析 Sc．pombe Hhp1+およびHhp2+のcDNAをURA3を基にしたベクターpDB20中のS．ce revisiae アルコールデヒドロゲナーゼ-1（ADH1）プロモーターの制御下になるような位置にクローニングし、S.cerevisiae中で発現させた（前出のFikes et al ）。このようにして得られたクローンを、標準的な方法で、適切な酵母株へ形質転換した後に、hrr25-1突然変異およびhrr25△突然変異に関する抑制表現型を変性／修飾する能力を分析した（Ito et al.，J．Bacteriol．153:163，1983）。形質転換体を、hrr25突然変異に関する欠損を修復する能力について分析した（H oekstra et al.，Science，253:1931,1991）。Hhp1+の発現は、hrr25関連の欠損に対して完全な相補性を示し、全ての分析において野生型のHRR25と区別はつかなかった。相補性のDNA修復、細胞周期の進行、細胞形態および胞子形成に対する作用を分析した。Hhp2+は、Hhp1+と比較して相補性の程度は低かった（相補性レベルは真正のHRR25の相補性レベルの50〜75％であった）。hrr25関連の表現型の変性は、相補Sc．pombe Hhpプラスミドを有し、かつhrr25突然変異を有するような形質転換酵母株により変化した。 HRR25プロテインとHhp1+プロテインとのアミノ酸相同性の程度は、キナーゼ領域全体について73％である。同様および同一のアミノ酸の存在を考慮した類似性の程度は、85％より大きい。HRR25プロテインおよびHhp2+プロテインのアミノ酸の同一性は63％であり、百分率での同一性は、80％である。 Hhp1+プロテインとHhp2+プロテインとの種間比較では、72％の同一性であった。この構造および相補性の分析によれば、明らかに、Sc．pombeクローンは、Sc．c erevisiae HRR25の機能性相同体である。このように高い程度の関連は、プロテインキナーゼの他の何れのグループにおいても観察されていない。ここで、比較の手段として真正の機能相同体（すなわち、S．cerevisiae、Sc．pombeおよびヒトに由来するcdc2プロテインキナーゼ）は、40〜45％の同一性を示す。無作為に比較した、何れの二つのプロテインキナーゼでも、比較を種内または種間で行なうかに関わらず、約20〜25％の同一性の程度が示された。Ｃ．Sc．pombeにおけるHhp1+およびHhp2+ の分裂および突然変異 S．cerevisiae中のHRR25のプロテインキナーゼ活性を不活性化するか、または低下させるような突然変異は広範な種類の表現型、例えば、種々の形態のDNA損傷への感受性、重度の細胞周期の遅延、細胞周期の進行に影響する薬剤（例えば、カフェイン）への感受性、微小管の一体性に影響する薬剤（例えば、ベノミル）への感受性、および、複製DNAの一体性に影響する薬剤（例えば、ヒドロキシ尿素）への感受性をもたらす。同様に、Sc．pombeにおいては、Hhp1+およびHhp2+遺伝子を不活性化してコードされたプロテインキナーゼの活性を低下あるいは消滅させることにより、hee2 5の突然変異を模倣した細胞表現型をもたらした。例えば、Hhp1+遺伝子の欠失は、細胞周期の遅延および異常な細胞形態、MMSのようなDNA損傷薬剤への感受性、およびベノミルおよびヒドロキシル尿素への感受性をもたらした。Hhp2+遺伝子の欠失は、他の欠損からしても、特に、カフェイン感受性、ベノミル感受性、およびヒドロキシル尿素感受性をもたらしていた。 Hhp1+遺伝子を、以下のとおり破壊した。cDNAを、Sc．pombeベクターpHSS19にサブクローニングし（Hoekstra et al.，Meh．Emzymol.，194:329，1991）し、これを、NheI-EcoRIと命した。Sc．pombe URA4遺伝子を挿入し、Hhp1+キナーゼ領域を欠失させた。得られたプラスミド構築物由来の線状DNAを用いて標準的な方法（Moreno et al.，Meth．Enzymol.,94:795，1991）により、Sc．pombeを形質転換した。安定な形質転換体を同定し、半数性のhhp1△株を、標準的な方法（ Moreno et al.，Maniatis et al.,）により評価した。 Hhp2+遺伝子を以下のとおり破壊した。Hhp2+のcDNAを、Sc．pombeを基にしたベクターであるプラスミドpHSS19にクローニングし、ミニTn3トランスポゾンmTn 3Leu2を用いてトランスポゾンシャトル突然変異により破壊した（前出のHoekstr a et al.，Meth．Enzymol）。得られたプラスミド構築物由来の線状DNAを用いて、標準的な方法によりSc．pombeを形質転換した。安定な形質転換体を同定し、半数性のhhp2△株を標準的な方法により評価した（上記参照）。 S．cerevisiaeについて記載されている標準的な生理学的方法（Hoekstra et a l.，Science，253: 1031，1991）を用いて、hhp突然変異株を特性化した。表現型の分析によれば、hhp1およびhhp2の突然変異体の両方とも、MMS処置およびＸ線処置を含む、種々のDNA損傷処置への感受性を含む以前にhrr25突然変異体で見られた欠損を示した。上記した結果によれば、Hhp1+およびHhp2+はS．ｃerevisiae HRR25プロテインキナーゼのイソ体である。これら３種類のプロテインキナーゼは高い水準の配列の同一性を示す。さらに、これらのキナーゼを不活性化する突然変異は広範の種類の微生物中に極めて似た欠損をもたらす。Ｄ．S．ｃerevisiae HRR25遺伝子に対する Sc．pombe突然変異株の相補性上記したとおり調製したSc．pombe hhp突然変異体が、S．cerevisiae hrr25突然変異体と同一であることを示すために、そして、35％より大きいアミノ酸同一性を有するHHR25様プロテインキナーゼが、機能的に相同体であることを示すために、S．cerevisiae HRR25遺伝子を、Sc．pombe発現ベクターに導入し、Sc．po mbe hhp 突然変異体に形質転換した。メチオニンで始まるHRR25におけるDNA配列はNdel部位で変化していた（読み枠を保持しているが、HRR25遺伝子を適切なSc ．pombe プラスミドに導入させるようなサイレントコード変化）。これは、部位特異的DNA変化により行ない、市販のシステム（BioRad社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を用いた標準的な方法により、S．cerevisiae HRR25遺伝子内で作成した。改変したHRR25遺伝子を、Sc．pombe発現プラスミド、pREP1（Maund rell，K.J.，Biol.Chem．265:10857，1990）に、Ndel部位で連結し、得られた構築物をSc．pombe hhp突然変異体に、標準的方法で形質転換した。Sc．pombe突然変異株内でのHRR25の発現は、Hoekstra et al（前出のScience）により記載された生理学的方法で評価したところ、突然変異体欠損の相補性をもたらした。実施例７酵母HRR25様遺伝子の単離および特徴付けさらに別のHRR25様遺伝子のS．cerevisiaeからの単離を、HRR25コード配列を欠失したS．cerevisiae株（Demaggio et alの7D株，Proc．Natl．Acad．Sci.，U SA，89: 7008-7012，1992、参考文献として本明細書に組み込んでいる）からのゲノミックDNAのDNAを基にした増幅を行なうことにより、増幅からHRR25配列を獲得する機会を排除して行なった。プライマーおよび増幅条件は、実施例６の通りである。得られた増幅生成物を、M13mp19にクローニングし、ジデオキシ鎖停止法により配列決定した。これらの独特のクラスの増幅生成物を同定した。これら生成物の２つはそれぞれ、Robinson et al（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:28-32， 1992）およびWang et al（Molecular Biology of the Cell，３:275-286，1992 ）のYCK1/CKI2およびYCK2/CKI2遺伝子に相当した。第３の遺伝子生成物は、NUF1 （Number Fourを称する）と命名した。NUF1に相当する増幅生成物を、実施例６に示した通にり放射標識し、酵母YCp50を基にしたゲノムライブラリー（ATCC、ロックビル、メリーランド州）をスクリーニングするために用いた。８つのクローンを同定し、内１つはNUF1ハイブリダイゼーション遺伝子を含む約４KbのHind III断片を有していた。サザン分析によれば、NUF1は、HRR25，YCK1/CKI2およびY CK2/CKI1とは別の遺伝子であった。HindIII断片を配列決定したところ、そのプロテインキナーゼ領域全体において、HRR25に対する同一性が約65％のプロテインキナーゼであることがわかった。NUF1のDNAおよび推定アミノ酸配列を、配列番号：23および24に示す。 NUF1遺伝子をさらに特徴付けるために、HindIII断片を、酵母プラスミドYEplac112にサブクローニングした（GietzおよびSugino，Gene 74: 527-541(1988)）。得られた構築物をhrr25△欠失株7dに形質転換して、NUF1が、 hrr25△有糸分裂欠損に対して相補性を有することが判明した（例えば、NUF1は遅延成長欠損、異常形態欠損、DNA損傷薬剤感受性に対して相補性を示した）。さらに、NUF1のゼロ突然変異体対立遺伝子を、トランスポゾンシャトル突然変異誘発により構築し、NUF1遺伝子生成物を欠損した株が、hrr25△突然変異体様欠損を有することを発見した。特に、hrr25△突然変異体と同様、NUF1突然変異体は、より遅い有糸分裂成長速度を示し、MMS，UVおよびＸ線照射のようなDNA損傷処置に対して、より高い感受性を示した。実施例８ヒトHRR25様遺伝子の同定および単離上記実施例6Aに記載したアミノ酸配列由来のオリゴヌクレオチドを用いて、以下の材料：Arabidopsis thaliana、Drosophila melanogaster、Xenopus、ニワトリ、マウス、ラットおよびヒトHeLa細胞から得たcDNAを増幅した。これらのcDNA は、逆転写mRNA（前出のManiatis et al.,）から得るか、または、市販のcDNAライブラリ（Stratagene社、ラヨラ、カリフォルニア州およびClonetech社、パロアルト、カリフォルニア州）より得た。S．cerevisiae HRR25およびSc．pombe、 Hhp1+およびHhp2+から得たものと同様の移行サイズの増幅生成物を、1.0％アガロースゲル中に観察した（前出のManiatis et al.,）。この結果によれば、HRR2 5様遺伝子は、検査した全ての種に存在することが解った。ヒトHRR25様プロテインキナーゼをコードする全長のDNAの単離は、Rowles et al（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:9548-9552，1991）が報告した、ウシ脳カゼインキナーゼI cDNAの一部を基にした独特の配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ヒトゲノムDNAのPCR増幅を行ない、これによりその触媒分解領域において、HRR25に対して60％の相同性を有する哺乳類プロテインをコードするようにした。以下に示すような多くの種類のプライマーを作成し、対にして用いた。（1）プライマーJH21（配列番号：17）、ウシ先端鎖DNA塩基47〜67：（2）プライマーJH22（配列番号：18）、ウシ先端鎖DNA塩基223〜240：（3）プライマーJH29（配列番号：19）、ウシ先端鎖DNA塩基604〜623：（4）プライマーJH30（配列番号：20）、ウシ先端鎖DNA塩基623〜604；および（5）プライマーJH31（配列番号：21）、ウシ先端鎖DNA塩基835〜817。オリゴヌクレオチドJH21/JH30、JH22/JH30およびJH29/JH31の組合せを用いたD NA増幅は、第１のサイクルでは４分間、そして残りのサイクルでは１分間で94℃ の変性、２分間で50℃のアニーリング、そして４分間で72℃の伸長を行なうことにより、30サイクル行なった。３回の増幅で得られた推定サイズの生成物を、調製用アクリルアミドゲル上で精製し、ランダム・ニック・トランスレーションを用いて³²Ｐで（比放射能７×10⁶cpm/μｇ〜1.4×10⁷cpm/μｇとなるまで）標識した。標識されたプローブを１つのグループとして用いて、市販のヒト胎児脳cD NAライブラリ（Stratagene社）をスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは３×SSC、0.1％Sarkosyl、10×Denhart溶液、および2 0mMリン酸ナトリウム（pH6.8）を含むハイブリダイゼーション緩衝液中にて、65 ℃で、16時間行なった。２×SSC、0.1％SDS中にて、65℃で３回洗浄した。二連のフィルターを用いて30プレート上で、約1.5×10⁶個のプラークをスクリーニングした。ライブラリー調製業者の使用説明書に従って、６個の高い陽性のクローンを単離し、精製し、プラスミド形態に変換した。制限酵素による分解により、６クローンにつき以下の挿入サイズが判明した：クローン35A1、1kb；クローン3 5B1、1.4kb；クローン41A1、3.7kb；クローン42A1、>4kb；クローン47A1、3.35k b；およびクローン51A1、2.75kb。全ての６個の挿入体は、ウシCKIα遺伝子のDN Aと推定プロテイン配列の両方を照合できる配列を含んでいた。省略した部分cDN Aのクローン35A1および35B1は、これ以上分析しなかった。クローン41A1および4 2A1はサイズ以外は、同一であった。クローン42A1、51A1および47A1は、CKIα1H u、CKIα2HuおよびCKIα3Huと命名した。挿入体のDNAおよび推定アミノ酸配列をそれをれ、配列番号：７および８；９および10；および、11および12に示す。CK Iα1Huの推定アミノ酸配列は、報告されたウシCKIαの配列と同一であった。以下に示す表１には、ウシとヒトのDNAのヌクレオチドの差を示しており、番号は開始コドンATGの最初の塩基から付けてある。 CKIα3Hu DNAはまた、コード配列中の+454の位置に84塩基の挿入部を有しており、これはCKIα2Hu発現生成物の28個のアミノ酸の中間伸長を与えている。この DNA挿入体は、ウシ遺伝子には存在しないが、Rowles et alがCKI-アルファ-Lと命名したアミノ酸配列挿入体をコードしている。CKIα1Hu DNAの+971の位置での CKIα2HuおよびCKIα3HuのDNAの挿入。この挿入はウシの配列の何れにも認められず、カルボキシ末端に隣接する13個のアミノ酸の伸長をコードしている。CKI α3Hu配列の最後の２個のコドンは、ウシの配列またはCKIα1HuおよびCKIα2Hu の配列とは異っており、全てのその他のウシおよびヒトのカゼインキナーゼＩ配列で認められる、フェニルアラニンではなく、リジンを末端に有するCKIα3Hu発現生成物を与える。CKIα3Huの３'フランク配列は、CKIα1HuおよびCKIα2Huのものとは明らかに異っている。図２は、HRR25、Hhp1+、Hhp2+、CKIα1Hu、CKIα2Hu、およびCKIα3HuならびにYCK1/CKI2およびYCK2/CKI1を含む、上記実施例でDNAを単離したHRR25様プロテインの触媒領域のアミノ酸配列の対応を示している。CKIα3Hu中間挿入体および CKIα2HuおよびCKIα3Huのカルボキシ末端領域挿入体を除いて、３個のヒト生成物の配列は同一である。「共通の」残基が図に示されており、ここでは７個の残基の少なくとも３個が、対応する位置で同一である（ヒトの配列を単一の配列とみなした）。 Hhp1+およびHh1p2+と同様、３種類のヒトHRR25様プロテインキナーゼは、HRR2 5遺伝子生成物に対する極めて高い程度のアミノ酸同一性（68％）を示し、これらのヒトクローンが、酵母HRR25遺伝子の酵素的イソ体であることが確認された。HRR25、Hhp1+、Hhp2+およびヒト相補様キナーゼのイソ体の対応関係によれば、これら酵素が、多くの一次構造の特徴を共有しており、これら酵素が、異る種で同等の活性を示すことを示唆している。この結論の根拠は、一連の証拠に基づく。第１に、全ての酵素が、プロテインキナーゼに特徴的な共通の一次配列認識体を共有している。第２に、酵素は、無関係のプロテインキナーゼ中には保存されていないプロテインキナーゼ領域中に高い程度のアミノ酸の同一性を共有している。最後に、これら酵素は、他のプロテインキナーゼとは一次配列においてその領域が異るようなキナーゼ領域中に、同一性の領域を共有している。例えば、全ての知られたプロテインキナーゼの95％以上が、キナーゼドメイン全体の約2/ 3にいわゆるＡ−Ｐ−Ｅ（アラニン−プロリン−グルタミン）を有している。HRR 25様プロテインキナーゼは、A-P-E配列を有しておらず、その代わりに、S-I/V-N 配列（セリン−イソロイシンまたはバリン− アスパラギン）を有している。公知のプロテインキナーゼと種々の微生物より得た、本発明のプロテインキナーゼの間のこの一次配列の比較に基づくならば、本発明でのこれら酵素は、HRR25プロテインキナーゼのイソ体である。実施例９カゼインキナーゼとのHRR25の比較試験した全ての真核生物において、主要なプロテインキナーゼの２つは、カゼインキナーゼＩおよびII（それぞれ、CKIおよびCKII）である。これらの酵素は試験した全ての細胞型および種に認められた。両方の酵素は基質中の酸性環境中のSer/Thr残基を認識する。これら２つのプロテインキナーゼは、細胞全体に認められ、その活性は、細胞質画分、膜、核、ミトコンドリアおよび細胞骨格から精製されるか、またはこれらと共存している。CKIIは、一般的に核酵素であるが、同様の試験がCKIについても行う必要がある。 HRR25遺伝子生成物が、カゼインキナーゼとして機能するかどうかを測定するために、HRR25含有免疫沈降物質がカゼインを燐酸化する能力を調べた。酵母由来のHRR25含有免疫沈降物質を、カゼインと共にインキュベートし、燐酸化されたプロテインを検査した。酵母抽出物を、物理的破壊により調製した。等量の細胞を溶解緩衝液に懸濁し、酸洗浄した0.5mmのビーズを混合し、氷上で１分の間隔で、30秒間の衝撃与え、破壊の程度を顕微鏡で観察した。溶解緩衝液は、10mMリン酸ナトリウム（pH7. 2）、150mM NaCl，１％Nonidet P-40、１％Trasylol、１mM DTT、１mMベンズアミジン、１mMフェニルメチルスルホニルフロリド、５mM EDTA、ペプスタチン（1 ug/ml）、ペプスタチンＡ（2ug/ml）、ロイペプチン（1ug/ml）、100mMナトリウムバナデートおよび50mM NaFを含んでいた。抽出物を、30分間、100,000×ｇで遠心分離することにより精製し、グリセロールで50％（v/v）とし、液体窒素中で凍結し、−70℃で保存した。数か月に渡り凍結した抽出物中で、プロテインキナーゼ活性の損失は殆ど無かった。免疫複合プロテインキナーゼ分析を、Lindberg et al（Mol．Cell．Biol．10: 6316，1991）の方法に従って行なった。凍結した抽出物を溶解緩衝液を含有する 25％グリセロールで希釈するか、新しい抽出物を直接用いた。抽出物を前免疫血清およびプロテインＡ−セファロースで前浄化し、次に免疫血清（大腸菌由来HR R25型融合生成物を用いたウサギの免疫処置により、実施例11に記載の通り得た）で処理した。HRR25キナーゼ含有免疫複合体をプロテインＡ−セファロースを用いて沈降させた。免疫複合体を、溶解緩衝液で４回、15mM Hepes（pH7.4）、1 00mM NaClおよび10mM MgCl₂を含有するキナーゼ緩衝液で２回洗浄した。 HRR25免疫沈降物および熱処理済カゼイン（300ng/20ul反応容量）の反応混合物を、５〜10分間、30℃で、インキュベートし、20ul反応容量あたり10uCiのガンマ³²P-ATPを添加した。SDSおよびEDTAを添加することにより反応を停止し、SD S/PAGE試料緩衝液中で煮沸し、そして10％ゲル中で分割した。ホスホアミノ酸分析を文献に従って行なった（Hunter et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:1 311，1980）。 HRR+株から得た免疫沈降物は、カゼインを燐酸化することができた。適切なアミノ酸が燐酸化されたことを評価するために、HRR25燐酸化カゼインのホスホアミノ酸組成物をホスホアミノ酸分析により検査した。試料を、pH1.9およびpH3.5 の二次元電気泳動により分割した。哺乳類のCKI特異性と同様に、セリンおよびスレオニン残基が燐酸化された。カゼイン上のHRR25燐酸化セリン残基は、スレオニン残基より３倍多かった。同様に、in vitroの免疫複合体中HRR25の自動燐酸化は、セリンおよびスレオニン残基で起こった。高水準の配列の同一性と組合せて考えると、これらの結果はHRR25がCKIイソ体であることを示唆している。酵母由来のHRR25免疫沈降物が、カゼインを燐酸化できることを更に確認するために、いくつかの実験を行なった。HRR25を発現する大腸菌から免疫沈降されたHRR25（実施例11参照）もまた、カゼインキナーゼ活性を示し、HRR25プロテインを欠く大腸菌抽出物は、カゼインを燐酸化しなかった。HRR25含有バキュロウイルス構築物は、免疫沈降物中にカゼインキナーゼ活性をもたらした。野生型のバキュロウイルス感染細胞は、同様の条件下で0.5％に満たないカゼインキナーゼ活性を示した。HRR25プロテインを発現するS19細胞のプロテインキナーゼ活性は、酵母抽出物由来のHRR25プロテインの活性を低下、あるいは不活性化させる同様の条件に対して感受性を有していた。HRR25依存性のカゼインキナーゼ活性が、野生型のHRR25を発現する大腸菌細胞の免疫沈降物、HRR25含有バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、および、hrr25△突然変異体ではない野生型に存在するという観察結果は、HRR25遺伝子生成物が、カゼインキナーゼとして機能することができ、そして、HRR25プロテイン含有免疫沈降物中のカゼインキナーゼ活性が、HRR25遺伝子生成物によるものであることを示している。実施例10 HRR25様プロテインのプロテインキナーゼ活性の分析大腸菌にて最も多いプロテインキナーゼ活性は、セリン／スレオニンまたはチロシンキナーゼではなく、ヒスチジンキナーゼであるため、これら原核細胞は、内因性のキナーゼの存在により相殺されないHRR25様プロテインキナーゼ活性の検定のためのシステムを提供する。従って、HRR25およびHhp1+DNAの双方とも、I PTG誘導性T7RNAポリメラーゼおよびT7リゾチーム遺伝子を含有する大腸菌株BL21 （DE3）を用いて、IPTG誘導性T7遺伝子10を基にした市販の発現系（Invitrogen 社、サンディエゴ、カリフォルニア州）にて発現した。DeMaggio et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，89：7008-7012（1991）を参照されたい。最初の一連の実験では、大腸菌分解物は、２時間IPTGで中間対数期の細胞を誘導し、細胞を沈殿させ、そしてDeMaggio et al（前出）の記載した緩衝液を用いて凍結融解法により抽出して調製した。抽出物を、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ナイロン基材の支持膜に移行させ、ホスホチロシン（UBI社、レークプラシッド、ニューヨーク州）に対する抗体を用いたウエスターン分析によりプローブした。これらの方法によれば、HRR25およびHhp1+発現細胞は対照群の細胞（ベクターのみで形質転換されたものであるか、または、キナーゼ不活性突然変異体により形質転換されたもの）では観察されなかった、新しいチロシン燐酸化プロテインを含有していた。第２の実験では、HRR25およびHhp1+含有大腸菌株のチロシン燐酸化プロテインについて、感度の高い正確な、放射標識およびホスホアミノ酸操作により調べた。この実験を行なうために、細胞をIPTGで誘導し、³²Ｐオルトホスフェートの存在下に生育させた。放射標識された抽出物を凍結融解法により調製し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そしてゲルをオートラジオグラフィー法により調べた。新しいリン酸プロテインは、HRR25およびHhp1+を発現する菌株には観察されたが、上記した対照群には観察されなかった。リン酸プロテインは、標準的な方法（Boyle et al.，Meth．Enzymol．201:110，1991）を用いて、ゲルからプロテインを抽出し、加水分解することにより調べた。これらの実験によれば、HRR25およびHhp1+はプロテイン基質上のチロシン、セリンおよびスレオニン残基を燐酸化することが確認された。実施例11 HRR25生成物の組換え発現およびそれに対する抗体の生成大腸菌でのHRR25DNAの発現のために、２種類の異るプラスミド構築物を調製し、抗HRR25抗体の調製に有用な免疫原を生成した。第１のプラスミドの構築には、Koerner et al（Meth．Enzymol.，194:477-491 （1991）の方法に従って、プラスミドpATHを用いた。約［606］の塩基対のDNA断片を、BglII消化によりHRR25のオープン読み枠から単離し、この断片（アミノ酸残基275〜476をコードする）をBamHIで消化しておいたpATHに連結した。得られたプラスミドは、そのＮ末端で大腸菌TrpE遺伝子生成物を、Ｃ末端でHRR25のＣ末端断片を有するような融合タンパク質をコードしていた。細胞封入体を、大腸菌DH5α（Bethesda Research Laboratories、ベセスダ、メリーランド州）宿主細胞から単離し、Koerner et al（前出）の記載した溶解緩衝液を用いて、プラスミドを形質転換し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。次に、ゲル精製物質を用いてHarlow et al.，（Antibodies:A Laborator Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（1988））の指示に従って、皮下注射によりウサギを免疫化したが、その際、第１回の注射では完全フロインドアジュバントを、そしてその後の注射では不完全フロインドアジュバントと共にゲル精製生成物を用いた。血清の反応性は、ゲル精製抗原に対してウエスタンブロットで確認した。血清抗体のアフィニティー精製は、ニトロセルロース膜支持体に固定化した大腸菌生成物抗原を用いて行なった。実施例12 CKIγ1HuおよびCKIγ2Huの単離さらに、他のヒトHRR25様プロテインキナーゼをコードするDNAを、DNA増幅法およびライブラリスクリーニング法を組合せて単離した。HRR25様プロテインキナーゼにおける保存された領域に基づくオリゴヌクレオチドを用いて、DNAセグメントを増幅し、ヒトcDNAライブラリをスクリニングする際のプローブとして用いた。以下の配列の重複オリゴヌクレオチド：［式中、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣは標準ヌクレオチド、そしてＲ＝ＡおよびＧ；Ｙ＝ＣおよびＴ；Ｉ＝イノシン；Ｍ＝ＡおよびＣ；およびＫ＝ＧおよびＴである］を用いてヒト胎児脳cDNAライブラリー（Clonetech社）から得た約540個のヌクレオチドを増幅した。増幅条件は、200mMトリス塩酸（pH8.2）、100mM KCl、60mM（N H₄）₂SO₄、15mM MgCl₂、１％トリトンX-100、0.5μM の各プライマー、100ngの鋳型DNAライブラリー、200μM dNTPおよび2.5Uのポリメラーゼとした。反応は、30サイクル行なった。反応は、94℃で、４分間処理することにより開始し、全サイクルは、94℃で、１分間、５℃で、２分間のアニーリング、そして72℃で、４分間の伸長とした。増幅反応物は１％アガロースゲルを通して電気泳動し、約540塩基対に相当する領域を切り出し、DNAをNaI抽出およびガラス粉末結合を用いて溶出させた（Ge neClean社、Bio101、ラヨラ、カリフォルニア州）。ゲル精製断片を、SmaI消化ブルースクリプトII SK（+）に連結したところ、得られたプラスミドはライブラリスクリーニングのためのcDNAとして用いた、プロテインキナーゼ領域の一部を有していた。このプラスミド10μgをEcoRIおよびBamHIで消化し、サブクローニング断片を遊離させ、反応物を１％アガロースゲルに通して電気泳動した。約54 0ヌクレオチドの断片が、ゲルより溶出し、これを放射活性ヌクレオチドとして³ ² P-dCTPを用いながらランダムプライムオリゴヌクレオチド指定標識（Amersham 社、アーリントンハイツ、イリノイ州）により放射標識した。放射活性プローブを用いて、以下のとおり調製したファージクローニングベクターλgt10中に調製したヒトManca Ｂ細胞リンパ腫ライブラリー［Wiman et al.，Proc．Natl．Acad ．Sci.（USA）81：6798-6802（1984）］をスクリーニングした。ポリd（A）⁺ RN AはFast Trackキット（Invitrogen社）を用いてＢ細胞リンパ腫Manca細胞2.8×1 0⁸個から調製した。cDNA合成システム（Gibco BRL社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を用いてRNA５μgからオリゴd（T）プライムcDNA合成を行なった。得られたcDNAをアガロースゲル電気泳動によりサイズ選択し、Ribo Cloneキット（Promega社、マジソン、ウィスコンシン州）を用いてEcoRI受容体に連結した。種々の量の受容体cDNAを、酵素と共に、製造業者より供給された市販の緩衝液中でT4 DNAリガーゼ（Boehringer Mannheim社、インディアナポリス、インディアナ州）１単位を用いてEcoRI消化λgt10に連結した。連結は、G igapackパッケージング抽出液（Stratagene社）と共にパッケージされており、得られたファージプール（1.5×10⁶ファージ）をC600Hf1株内で増幅した。合計で１×10⁶個のファージプラークを、標準的なハイブリダイゼーション法（前出のManiatis et al）によりスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは６× SSPE（20×SSPEは175.3g/l NaCl、27.6g/l NaH₂PO₄ H₂O）、7.4g/l EDTA（pH7.4 ）、100ug/mlサケ精子担持DNA、５×Denhardt試薬（50×Denhardt試薬は、５％f iColl、５％ポリビニルピロリドン、５％ウシ血清アルブミン）、0.1％SDSおよび５％デキストラン硫酸ナトリウム中で、18時間、65℃で行なった。フィルターを、0.1×SSPE、１％SDS中で４回洗浄した。洗浄は各々、30分間、65℃で行なった。クローン５個を選択して、さらに分析した。これらのファージクローン由来のDNAを、QiagenラムダDNA調製キット（Qiagen 社、キャッツワース、カリフォルニア州）を用いて調製し、ヒトcDNA挿入体を、 EcoRI消化により切り出した。これらの挿入体を、EcoRI消化プラスミドブルースクリプトIISK（+）（Stratagene社）にサブクローニングし、挿入体の配列はABI 373A自動DNA配列決定装置を用いて行なった。５個のcDNAの内、２つはポリＡ末端およびプロテインキナーゼオープン読み取り枠を有するほぼ全長のcDNAを含有していた。これらのプロテインキナーゼは、カゼインキナーゼＩのイソ体に最も緊密に関連しており、これらをCKIγ1HuおよびCKIγ2Huと命名した。CKIγ1HuおよびCKIγ2HuのDNA配列をそれぞれ、配列番号：30および32に示す。CKIγ1HuおよびCKIγ2Huの推定アミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：31および33に示す。実施例13 CKIδHuの単離ヒトCKIδをサブクローニングするために、まず、λZAPII（Stratagene社）中に構築したヒト胎児脳ライブラリからヒト遺伝子を単離した。ラットCKIδを含有する2.2KbのEcoRI断片を、１％アガロースでゲル精製し、ガラス粉末を用いた NaI抽出（Bio101、ラヨラ、カリフォルニア州）によりゲルから単離し、³²P-dCT Pを用いてランダムプライマー法（Boehringer Mannheim社）により放射標識した。このプローブを用いてヒト胎児脳cDNAライブラリを含む１×10⁶個のプラークをスクリーニングした。プラークハイブリダイゼーションの条件は、３×SSC、0 .1％Sarkosyl、10×Denhardt試薬、50μg/mlサケ精子DNA担体とした。ハイブリダイゼーションは、65℃で、18時間行い、その後、フィルターを２×SSC、1.0％ SDS中にて、65℃で、各々30分間、４回洗浄した。陽性のクローンを増強スクリーンを用いて、−70℃でオートラジオグラフィーを行うことにより同定し、自動 ABI373A DNA配列決定装置（Applied Biosystems）フォスターシティー、カリフォルニア州）を用いて配列決定した。１個のクローンが、全長のCKIδイソ体をコードしていることが判明し、これをCKIδHuと命名した。CKIδHuのヌクレオチド配列を、配列番号：34に示し、推定アミノ酸配列を、配列番号：35に示す。次に、CKIδHuイソ体の発現を、８種類の異るヒト組織にて、プローブとして約1.2KbのEcoRI断片を用いて調べた。CKIδHu mRNAの濃度は、腎臓、肝臓および胎盤で最も高く、Graves et al（前出）により示された、ラット CKIδの精巣特異的な発現とは対照的であった。実施例14 ヒトCKI遺伝子による酵母CKI突然変異体の相補 CKIγ1Huが、酵母HRR25様プロテインのイソ体であるか否か決定するために、遺伝子を、酵母プロテインキナーゼ突然変異体中で発現させた。cDNAを、酵母GA L1プロモーターの制御下で発現させた。発現プラスミドは、酵母GAL1プロモーターを含むプラスミドpRS305（Stratagene社）に由来するものである。GAL1プロモーターを有する親プラスミドは、以前に記載されたものであり［Davis et al.， Cell 61：965-978（1990）］、これはGAL1プロモーターに隣接するBglII部位ならびにBglII部位に隣接するSacI部位を有していた。このプラスミドを、部位特異的突然変異誘発物質により変性し、GAL1プロモーターとBglII部位との間に独特のNcoI部位を有するようにした。NcoI部位は、遺伝子要素の順番が、GAL1プロモーター−NcoI−BglII−BamHI−SacIの順番になるように、GAL1プロモーターに隣接している。部位特異的突然変異誘発物質（MutaGene キット、BioRad社）は以下のオリゴヌクレオチド：を使用しており、独特のNcoI部位（配列番号：36の下線部）を発生させた。得られたプラスミドを、pRS305（N）2μGAL1と命名した。 CKIγ1Huを、pRS305（N）2μGAL1にクローニングするために、開始ATGにNcoI 部位を、そして3'未翻訳領域にBamHI部位を導入するオリゴヌクレオチドを用いて、cDNAからCKIγ1Hu cDNAを増幅した。アミノ末端の突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す（NcoI部位は下線）。 Stratageneより購入したオリゴヌクレオチドM13rev（Stratagene社、ラヨラ、カリフォルニア州）を用いて、3'未翻訳領域にBamHI部位を導入した。増幅条件は、200mMトリス塩酸（pH 8.2）、100mM KCl、60mM（NH₄）₂SO₄、15mM MgCl₂、１％トリトンX-100、0.5μMの各プライマー、100ngのテンプレート、200μM dNT Pおよび2.5Uのポリメラーゼとした。反応は、30サイクル行なった。反応は、94 ℃で、４分間処理することにより開始し、全サイクルは、94℃、１分間での変性、５℃、２分間でのアニーリング、そして、72℃で、４分間での伸長とした。増幅生成物を、NcoIおよびBamHIで消化し、NcoO/BamHI消化pRS305（N）2μGAL1にクローニングした。酵母CKI突然変異体の相補には、酵母株7D（hrr25△、ura3-1、trp1-1、leu2-3 、112、his3-11,15、can1-100、ade2-1）［前出のDeMaggio et al（1992）］およびY1227（cki1D、cki2D、 FOA^R，ade2-1、can1-100、his3-11,15、leu2-3,12、trp1-1、ura3-1、,pRS415:: Ckilts）を用いた。菌株7Dは、酵母CKI HRR25イソ体を欠いており、菌株YI227は、酵母CKIIの温度感受性対立遺伝子を含んでいた。酵母株を酢酸リチウム媒介形質転換により形質転換し、形質転換体をSD−ロイシン培地（Bio101）上で選択した。形質転換に対する対照群は、プラスミドpRS305（N）2ug GAL1単独、プラスミドpRS315（Stratagene社）およびゲノムHRR25断片においてSalI-EcoRIゲノム断片を有するプラスミドpRS315::HRR25（前出のHoekstra et al.，Science）とした。プラスミドpRS315::HRR25は、HRR25のSalI/EcoRIゲノム断片を、SalI/Eco RI消化したpRS315に連結することにより構築した。HRR25およびCKIγ1Huは共に、酵母突然変異体中で発現した場合、CKIの温度感受性生育欠損を完全に相補することができる。さらに、CKIγ1Huは、HRR25突然変異体に伴う重度の生育速度欠損を部分的に抑制した。CKIγ1HuによるHRR25生育欠損の部分的抑制は、pRS30 5（N）2μGAL1と比較して10〜20倍のプレート効率で検知された。相補性分析を、他のCKI科の構成要素にまで進めるために、他のヒトCKIα1Hu およびCKIδHu遺伝子が、HRR25突然変異体欠損に対して相補性を示す能力について調べた。ヒトCKIα1huをプラスミドpRS305（N）2μGAL1にサブクローニングするために、先ず、部位特異的突然変異誘発により開始メチオニンでNcoI部位を導入した。突然変異誘発性のオリゴヌクレオチド（NcoI部位は下線）は以下の配列：を有しており、突然変異誘発は、Mugageneキット（BioRad社）を用いて行なった。突然変異を誘発されたcDNAを、NcoIおよびBglIIで消化し、C KIα1Hu cDNA断片pRS305（n）2μGAL1に連結した。 CKIδHu cDNAを有する２つの構築物の相補性を調べた。プラスミドpEC7B（CKI δHu cDNAを含む）を部位特異的突然変異誘発（MutaGene、BioRad社）のテンプレートとして用いた。以下に示す突然変異誘発オリゴヌクレオチド：を用いてCKIδHuの開始ATGにて、BglII（配列番号：39の下線）およびNdeI（配列番号：39のイタリック体）を導入した。pRS305（CKIδ）を得るために、あるプラスミド構築物に、BglII/SacI消化したpRS305（N）2μGAL1に連結した、突然変異を誘発したcDNA由来のBglII/SacI消化したCKI DNAを採用した。pRS305（C KIδ）を得るために、第２のプラスミド構築物に、NcoI/SacI消化したpRS305（N ）2μGAL1に連結され、突然変異を誘発されていないpEC7B cDNA由来のNcoI/SacI で消化したCKIδHu cDNAを用いた。プラスミドpRS305（CKIδ）は、GAL1プロモーターとCKIδの開始メチオニンとの間に、以下のヌクレオチド：を有していた。プラスミドpRS305（N）（CKIδ）は、CKIδHuの開始メチオニンとGALIの3'末端との間にほぼ完全な融合体を有していた。ほぼ完全な融合体とは、プロモーターと開始メチオニンコドンが介在する核酸配列を殆ど、または、全く有しておらず、このためほぼ隣接していることを意味する。 CKIα1HuおよびCKIδHuを含むプラスミドを、酵母株7DおよびYI227に形質転換し、その突然変異欠損に対して相補性を示す能力について調べた。CKIγHuと同様、CKIα1Huは、HRR25突然変異に関する生育欠損に対し、部分的に相補性を示した。CKIδHuは、温度依存性CKI菌株の生育欠損、HRR25突然変異体の生育欠損、そして、HRR25のDNA修復欠損に対して相補性を示すことができた。CKIδHuが、これら酵母株における突然変異欠損に対して相補性を示すことのできる能力は、適切なプラスミド構築物を用いた場合にのみ、酵母HRR25またはCKI遺伝子と区別できなかった。プラスミドpRS305（CKIδ）は、さらに21個の塩基を有しており、何れの突然変異の表現型に対しても相補性を示すことができなかったが、pR S305（N）（CKIδ）のほぼ完全な融合体は完全に機能していた。この差は、酵母が伸長配列および／またはCGを多く含むリーダー配列を翻訳する能力に起因していた。実施例15 モノクローナル抗体の生成Ａ．CKIδHuペプチド以下に示すペプチドに対するモノクローナル抗体を作成した。配列番号：41は、CKIα1Hu、CKIα2HuおよびCKIα3Huの共通のＮ末端から誘導し、配列番号：42 は、CKIα3Hu中の内部互換性切り出し領域から誘導し、配列番号：54は、CKIδH uのアミノ末端領域から誘導し、そして、配列番号：56は、CKIα2HuおよびCKIα 3Huの双方に共通するＣ末端領域から誘導した。これらのペプチドをまず、各々ウシガンマグロブリン（Sigma社、セントルイス、モンタナ州）と結合させた。ガンマグロブリン５mgおよびペプチド５mgを、 100mM K₂HPO₄（pH7.2）0.4mlに再懸濁し、この混合物に予めK₂HPO₄（pH7.2）50 μｌに溶解した1-エチル−3（3-ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド-HC l（EDC、Pierce）35mgを添加した。反応を、４℃で、16時間進行させ、２Ｍエタノールアミン0.25mlおよび酢酸0.25mlを添加することにより反応停止した。次に、反応混合物を最終容量2.5mlとなるまでPBSで希釈し、セファデックスG-25M（P harmacia社）クロマトグラフィーを用いて脱塩した。タンパク含有画分を、遠心分離ミクロ濃縮（Amicon社）により濃縮した。次に８か月の期間にわたって、８〜12回、結合タンパク50μｇをマウスに注射した。産生した抗体を、対応するペプチドに対してELISAで測定した。融合は標準的な方法で行なった。簡単に記載すると、単一細胞懸濁液を、２mM Ｌ−グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、100単位/mlペニシリン、および10 0μg/mlストレプトマイシン（RPMI）（Gibco社）を添加した血清非含有RPMI1640 培地中に浸漬した２枚のガラス顕微鏡用スライドの艶消しした末端の間で、脾臓を粉砕することにより調製した。細胞懸濁液を、滅菌70メッシュNitex細胞ストレナー（Becton Dickinson社、パーシッパニィー、ニュージャージー州）を通して濾過し、５分間、200Gで遠心分離することにより２回洗浄し、そして、ペレットを血清非含有RPMI20ml中に再懸濁した。３匹の未投薬のBalb/cマウスから得た胸腺細胞を同様の方法で調製した。融合前３日間、11％ウシ胎児血清（FBS）（Hyclone、Labora- tories社、ロガン、ユタ州）と共に、RPMI中にて、対数期状態で保持したNS-1骨髄腫細胞を、５分間、200gで遠心分離し、ペレットを上記した通り２回洗浄した。洗浄後、各細胞懸濁液を血清非含有RPMI中10mlの最終容量とし、10μｌを１:1 00に希釈した。各希釈液から20μｌを取り除き、0.85％生理食塩水中の0.4％トリパンブルー染色液（Gibco）20μｌと混合し、血球計（Baxter Healthcare社、デアーフィールド、イリノイ州）に適用し、細胞を計数した。約２×10⁸個の牌細胞を４×10⁷個のNS-1細胞と合わせ、遠心分離し、上澄みを吸引した。試験管を叩いて細胞沈殿物を採取し、37℃のPEG5000（75mM Hepes中5 0％、pH8.0）（Boehringer Mannheim）２mlを１分間かけて撹拌しながら添加し、次いで、７分間かけて血清非含有RPMIの14mlを添加した。さらに、16mlのRPMI を添加し、細胞を10分間200gで遠心分離した。上清を廃棄した後、ペレットを15 ％FBS、100μMナトリウムヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μＭチミジン（HAT）（Gibco社）、25単位/ml IL-6（Mallinckrodt社、セントルイス、モンタナ州）および1.5×10⁶胸腺細胞/mlを含むRPMI 200ml中に再懸濁した。懸濁液を200μｌ/ウエルで、96穴の平底組織培養プレート（Corning社、Essex州、英国）に分注した。18ゲージの針（Becton Dickinson社）で各ウェルから培地の約半量を吸引し、10単位/ml IL-6を含有し、胸腺細胞を含有しない以外は、上記したものと同様のプレート培地を再充填することにより、融合とスクリーニングとの間に２〜３回、プレート中の細胞に培地を供給した。融合体は、細胞の生育が全面成長の60〜80％に達した時点（通常は７〜９日間）でスクリーニングした。融合体75は、共通するアミノ末端ペプチド（配列番号：41）または内部ペプチド（配列番号：42）の何れかによりELISAでスクリーニングし、融合体80はアミノ末端ペプチド（配列番号：41）のみでスクリーニングした。イムロン４プレート（Dynatech社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を50mM炭酸塩緩衝液（ pH9.6）中100ng/ウェルのペプチドで、一夜、４℃でコーティングした。プレートを、0.05％ツィーン20を含有するPBS（PBST）で３回洗浄し、培養上澄み50μ ｌを添加した。30分間、37℃で培養し、上記した通り洗浄した後、PBST中にて１ :3500に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスIgG（ fc）（Jackson Immuno Research社、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）50 μｌを添加した。プレートを上記した通りインキュベートし、PBSTで４回洗浄し、そして、１mg/mlのo-フェニレンジアミン（Sigma社）および100mMクエン酸塩（pH4.5）中の0.1μｌ/mlの30％過酸化水素からなる基質100μｌを添加した。15 ％硫酸50μｌを添加することにより、５分以内に呈色反応を停止した。490nmにおける吸光度を、プレートリーダー（Dynatech社）で読み取った。各融合体から３ウェル（75D3G、75C10H、75C2G、80G10H、80H4Fおよび80J9Eと命名）をRPMI、15％FBS、100μMナトリウムヒポキサンチン、16μMチミジンおよび10単位/ml IL-6中での２倍希釈により、順次２〜３回クローニングした。クローンプレートのウェルを４日後、目視により評価し、最も密度の低いウェル中のコロニーの数を記録した。各クローニングの選択されたウェルを上記した通りEL ISAで試験した。最終クローニングにおいて、単一のコロニーを含む陽性ウェルを、11％FBSを含むRPMI中で増殖させた。３種類の抗体は、CKIαHuのアミノ末端に対して作成したペプチド（80G10H11D 、80H12F12Bおよび80J9E10C）に対して反応性を有することが判明し、これらの抗体は、CKIα3Huの内部断片に対して作成したペプチド（75D3G10A、75C10H1Dおよび75C2G11F）と反応性を有していた。クローン75D3G、75C10H、75C2Gおよび80G10Hは、IgG1、クローン80H4F IgG3および80 J9E IgG2aのイソタイプに分類された。ハイブリドーマ75C10Hと80J9EをAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託され、受託Nos．HB 11800ならびに118 02が付与された。Ｂ．CKIHu/チオレドキシン融合タンパク質チオレドキシンとの融合タンパク質としてCKIHuイソ体を発現するために、発現プラスミドを構築した。特に、各イソ体のコード配列を、5'XbaI制限酵素切断部位および3'BamHI部位をもたらすようなプライマーを用いてPCRにより増幅した。CKIαHuイソ体のためのXbaI部位をもたらすために使用したプライマーを、配列番号：43に示し、XbaI部位は下線で示した。 CKIα1Huコード配列中の3'BamHI部位を作成するために使用したプライマーを、配列番号：44に示し、BamHI部位は下線で示した。 CKIα2HuおよびCKIα3Huのコード配列中のBamHI部位を作成するために使用したプライマーを、配列番号：45に示し、BamHI部位は下線で示した。 XbaIおよびBamHI部位は、CKIδ1Huコード配列中にて、それぞれ配列番号：46 および47に示すプライマーを用いて作成された。 CKIγHuイソ体のコード領域中にて、XbaIおよびBamHI部位を作成するために用いたプライマーを配列番号：48および49に示す。得られたPCR生成物を、XbaIおよびBamHIで消化することにより、プラスミドpT RXFUS中のチオレドキシンをコードする配列のカルボキシ末端で、枠内に断片を方向を定めてクローニングすることができた［LeVallie et al.，Nature/Biotec hnology11:187-193（1993）］。得られた発現構築物は、laqIq遺伝子を、その後にtacIIプロモーター（プラスミドpMal-c2由来、New England Biolabs社、ビバリー、マサチューセッツ州）を有しており、これは、CKI触媒領域のアミノ末端で融合した大腸菌チオレドキシン遺伝子の発現を誘発する。大腸菌XL-1ブルー細胞（Stratagene社）を標準的な方法により個々の発現プラスミドを用いて形質転換し、37℃で、中間対数期まで生育させた。試料を採取して未誘発の細胞のための対照群とし、残りの細胞は、37℃で、１mM IPTGで16時間誘発した。形質転換体は、OD₆₀₀が1.0になるまでLB培地にて生育させた。次に、20mM Tris-HCl、pH7.0、１mM EDTA、100mM塩化ナトリウムを含む溶解緩衝液に細胞を再懸濁し、そして、Frenchプレス器（SLM Instruments社、ウルバナ、イリノイ州）を用いて溶解した。不溶性抽出物中の細胞封入体を、20,000×ｇで、30分間遠心分離してペレットととし、溶解緩衝液で４回洗浄し、そして、10％グリセロールを含む溶解緩衝液中で、−80℃で保存した。組換えヒトCKIαHuおよびCKIδHuに対するモノクローナル抗体を先に記述したようにして作成した〔Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow and Lance，e ds.，pp.148-174，（1988）〕。二ヵ月の期間にわたって、50μｇの組換えタンパク質を６度注射することで、マウスを免疫処置した。脾臓をを取り出し、細胞をNS-1骨髄腫細胞と融合した。融合体を、組換えCKIイソ体に対する反応性に関してELISAでスクリーニングし、陽性ウェルの細胞を限定希釈によってさらにクローニングした。所望のモノクローナル抗体を含んだ細胞培養上清を調製するために増量したクローンを用い、そして、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーを用いてモノクローナル抗体を精製した。Isostrip（Boehringer Mannhei m社）を用いて、抗体のイソ型を分類した。クローン94A1D、94F4Aおよび94J11Cは、CKIα1Hu、CKIα2HuおよびCKIα3Huイソ体の各々に特異的な免疫反応性を示すモノクローナル抗体（イソタイプIgG1、 IgG1およびIgG2bそれぞれ）を産生した。クローン128Aは、CKIδに特異的な免疫反応性を示すモノクローナル抗体（イソタイプIgG1）を産生した。ハイブリドーマ94A1D、94F4A、94J11Cおよび128Aは、American Type Culture Collectionに寄託され、受託Nos. HB 11804、HB 11803、HB 11805ならびに11801のそれぞれが付与された。Ｃ．その他のCKIペプチド本実施例のセクションＡに記載のウシガンマグロブリンに結合したその他のCK Iペプチドに対しても、モノクローナル抗体を作成した。CKIγHuイソ体のアミノ末端から誘導したペプチドを、配列番号：50および51に示す。ウシCKIβ［前出のRowles et al］のアミノ末端から誘導したペプチドを、配列番号：52および53 に示す。CKIδHuのアミノ末端およびカルボキシ末端から誘導したペプチドを、それぞれ配列番号：54および55に示す。CKIα2HuおよびCKIα3Huのカルボキシ末端から誘導したペプチドを、配列番号：56に示す。全てのCKIHuイソ体に共通するペプチドを、配列番号：57に示す。配列番号：57に示した共通のCKI配列もウサギに注射して、ポリクローナル抗血清を作成した。８か月の期間に渡り、様々な予定を組んで、ペプチド／ガンマグロブリン複合体50μｇをマウスに注射した。実施例16 CKIδHuによるcisおよびtransチロシン燐酸化少なくとも一つのヒトCKIイソ体が、チロシン残基に関して自己燐酸化される可能性を評価するために、燐酸チロシン残基に特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を、固定化した組換えCKIδHuを用いたウェスターンブロットに適用した。 CKIδHuは、プラスミドpET-15b（Novagen社、マジソン、ウィスコンシン州）を用いて、大腸菌にて、組換えタンパク質として発現させた。pET-15bで発現したタンパク質は、ベクターによってコードされた組換えタンパク質の精製を促進するアミノ末端残基の六つの外因性ヒスチジン残基を含んでいる。２mM IPTGを培地に添加することで、CKIδHuの発現を誘発した。細胞を溶解し、そして、ニッケル親和性クロマトグラフィー樹脂（Novagen社）を用いて、製造業者の取扱い説明書に従ってCKIδHuを精製した。組換えCKIδHuを、文献の記載〔Harlow a nd Lane，（1988）、上掲〕にあるように、SDS-PAGEおよびウェスターンブロッティングによって分析した。抗燐酸チロシン残基を、製造業者の取扱い説明書に従って、抗燐酸化チロシンモノクローナル抗体4G10（UBI、ロックビル、メリーランド州）を用いて検出した。オートラジオグラフィーによると、CKIδHuのcis体が、燐酸化チロシン残基であることを示した。自己燐酸化の化学量論が決定できなかったとしても、オートラジオグラフィー後のバンド強度は、自己燐酸化のレベルが重要であることを示した。少なくとも一つのヒトCKIイソ体が、trans体にてチロシン残基を燐酸化する能力も、CKIδHuを用いて決定した。 CKIδHuは、プラスミドpET-15b（Novagen社、マジソン、ウィスコンシン州）を用いて、大腸菌にて、組換えタンパク質として発現させた。２mM IPTGを培地に添加することで、CKIδHuの発現を誘発した。細胞を溶解し、そして、細菌性タンパク質をSDS-PAGEで分離した。形質転換した大腸菌ならびに形質転換していない大腸菌の双方から単離したタンパク質を用いて、文献の記載〔Harlowand Lane，（1988）、上掲〕にあるようにして、ウェスターンブロッティングを行った。形質転換した細菌性タンパク質ならびに対照タンパク質でのチロシン燐酸化パターンを、製造業者の取扱い説明書に従って比較するために、抗燐酸化チロシンモノクローナル抗体4G10（UBI、ロックビル、メリーランド州）を用いた。 CKIδHuで形質転換した細菌からのタンパク質におけるチロシン燐酸化は、対照細胞にて観察されたパターンとは明らかに別異のものであり、CKIδHuがtrans 体でのチロシン燐酸化を行うことが認められた。実施例17 TNFαによるCKIδ活性の刺激サイトカインによるCKIイソ体の調節能力を評価するために、TNFαの有無によって、CKIδHuの活性を決定した。この分析のために、実施例８にて実証したCKI イソ体の発現能力に鑑みてHeLa細胞を採用した。 10％ウシ胎児血清、100単位／mlのペニシリン、および100μgs／mlのストレプトマイシンを補充した修正イーグル培地αにて、HeLa細胞を維持した。培地と補充物をGibco社から調達した。細胞を１ng/mlのTNFα（Genzyme社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）で５分間処理し、対照用の細胞はTNFαで処理しなかった。細胞を冷却したPBSで洗浄し、そして、50mM Tris-HCl、pH 7.5、150mM塩化ナトリウム、10mMフッ化ナトリウム、１mM EGTA、0.2mM NaVO⁴、１mM PMSF、１％アプロチニン、および１％NP40を含む１μMペプスタインＡを含んだIPB中で再懸濁した。超音波処理して細胞を溶解し、そして、不溶性物質を遠心分離によって除去した。おおよそ（具体的な数値）のマイクログラムのモノクローナル抗体128Aを上清に加え、そして、混合物を氷上で90分間保持した。プロテインＡセファロース（レプリジェン社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を加え、４℃で、30分間混合した。免疫沈降物をIPB中にてNP40を用いて三度、そして、pH 7.5の50mM Tris-HCl、15 0mM塩化ナトリウム、12mM塩化マグネシウムおよび0.2mM DTTを含むキナーゼ緩衝液で一度洗浄した。CKIδHuの活性を測定するために、24μｌのキナーゼ緩衝液、10μCiの³²P-ATP、30μMのATPおよび20μｇのカゼインを混合し、30℃で、10 分間インキュベートした。反応を、SDS-PAGEならびにオートラジオグラフィーで分析した。未処置の細胞は低レベルのCKIδHu活性を示したが、TNFα処置した細胞ではサイトカイン処置して１分以内に急速にCKIδHu活性が向上した。CKIδHu活性は、細胞を処置している間にわたって向上し続け、未処置細胞の約５倍の安定活性レベルにまで達した。約30分間にわたって、その安定活性レベルは維持された。 1991年７月３日に米国特許出願07/728,783号を出願した後に、HRR25様プロテインをコードするDNAの単離に関し、学術文献において多くの報告がなされている。例えば、Rowles et al（Proc．Natl．Acad．Sci．USA,88：9548-9592（1991 ））は、ウシ胸腺カゼインキナーゼI（CKI）酵素の精製を報告している。トリプシン断片の配列決定により、酵素の一次配列のほぼ25％が判明した。PCRクローニングにより、CKI酵素単離物をコードするクローン部分、およびCKIδと称される相同性酵素が開発された。そのクローン部分を用いたウシ脳ライブラリのスクリーニングにより、CKI単離物（CKIαと命名）および２つのその他の相同体（CK IβおよびCKIγ）に対する全長cD NAが得られた。ウシCKIαに対する推定配列は、Rowles et al（前出）によればその触媒領域は、HRR25に対して60％が相同性であると報告されている。前に記載した通り、Rowles et alのウシCKIα配列を、配列番号：７および８のヒトCKI α１配列と比較した場合、触媒領域に100％の相同性があることがうかがえる。他の例としては、Robinson et al（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89：28-32 （1992））が、酵母カゼインキナーゼＩ相同体をコードする２種類のサッカロマイセス・セレビシアエ遺伝子、YCK1およびYCK2の単離について記載しており、また、ウサギ網状赤血球分解調製物由来のウサギカゼインキナーゼＩの精製、および部分的配列決定について記載している。HRR25は、YCK1およびYCK2に対して50 ％の相同性、そしてウサギCKI部分の配列に対して60％の相同性を有するとされている。さらに、別の例としては、Wang et al（Molecular Biology of the Cel l、３：275-286（1992））は、S.Cerevisiaeからの54kDaのCKIの単離、および、相同体カゼイインキナーゼＩ蛋白CKI1およびCKI2をコードする２種類の酵母cDNA をクローニングするために、得られたアミノ酸配列情報の利用について記載している。CKI1遺伝子によりコードされるタンパク質の触媒領域の比較によれば、20 〜25％より大きい相同性を有する遺伝子対応が、ほとんど無いことが判明した。最も近似した符合は、HRR25（50〜56％）との間、およびRowles et alの３種類のウシアイソザイム（51〜56％）との間に認められた。Robinson et alのYCK1配列は、Wang et alのCKI2配列に相当し、YCK2配列は、CKI1に相当する。Brockman et al（Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，89：9454-9458（1992））は、ヒト赤血球カゼインキナーゼＩの免疫精製および配列決定を報告しており、HRR25に対する相同性は62％であると記載している。最後の例として、Graves et al（J．Bio l．Chem．265：6394-6401（1993））はラット精巣由来カゼインキナーゼＩのクローニングおよび特徴付けを報告している。このCKIはCKIδと命名されており、ウシ脳から単離されたCKIαとはアミノ酸レベルにおいて、76％の相同性、HRR25 に対しては65％の相同性を有していた。上記した説明のための実施例は、特に、HRR25-様プロテインであるHRR25、Hhp 1+、Hhp2+、CKIα1Hu、CKIα2Hu、CKIα3Hu、CKIδHu、CKIγ1HuおよびCKIγ2Hu をコードする「全長」のポリヌクレオチドの単離に関するものであり、本発明はこれらのポリヌクレオチドに限定されないことは容易に理解できる。HRR25-様プロテインをコードする遺伝子クラス内に含まれ、プロテインキナーゼ活性により特徴付けされ、そしてプロテインキナーゼ触媒領域を通じてHRR25-プロテインとの相同性が35％以上であることにより特徴付けられる全てのポリヌクレオチドを意図するものである。例として、HRR25のDNA配列に関する情報を用いることにより、実施例７の方法を用いて、Arabidopsis thaliana、Drosophila melanogaste r 、Xenopusu、ニワトリ、マウス、ラットおよびヒトに由来するcDNAライブラリから推定される長さのcDNAクローンを単離することが可能である。これらの部分 cDNAは、さらに、実施例６および７の方法により、これらの種に由来するHRR25- 様プロテインをコードする全長DNAを単離するために使用してよい。これら各々は、組み換え方法により相当するタンパク質の大規模製造に用いることができ、また、アンチセンスRNAのような他の有用なポリヌクレオチドの生成のためにも用いれる。このようなHRR25-様DNAの組換え発現生成物は、抗体の生成のため、そして、これら酵素のプロテインキナーゼおよび／または組換え／修復機能を調節する化合物を、スクリーニングする際に用いることができる。さらに、Rowles et al、Robinson et al、およびWang et alの文献で示唆されるとおり、複数のHRR25-様アイソザイムが種々の真核生物中に、膜結合状態および細胞質タンパク質状態の双方の態様にて存在することが予測される。多くの遺伝子および遺伝子生成物が、ヒトに存在すると推定することは合理的であると考えられ、これらの全てが相互に、そしてHRR25に機能的および構造的に関連している。本発明を以上の通り詳説したが、当業者であれば、本発明の範疇内にて様々な変更と修正を行い得るのは明らかである。配列の概要配列番号：１は、本願発明の酵母由来プロテインキナーゼ、HRR25をコードするゲノミック断片の核酸配列および推定アミノ酸配列である。配列番号：２は、本願発明の酵母由来プロテインキナーゼHRR25の推定アミノ酸配列である。配列番号：３は、本願発明のHhp1＋をコードするゲノミック断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。配列番号：４は、本願発明のHhp1＋の推定アミノ酸配列である。配列番号：５は、本願発明のHhp2＋をコードするゲノミック断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。配列番号：６は、本願発明のHhp2＋の推定アミノ酸配列である。配列番号：７は、本願発明のCK1α1Huをコードするゲノミック断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。配列番号：８は、本願発明のCK1α1Huの推定アミノ酸配列である。配列番号：９は、本願発明のCK1α2Huをコードするゲノミック断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。配列番号：10は、本願発明のCK1α2Huの推定アミノ酸配列である。配列番号：11は、本願発明のCK1α3Huをコードするゲノミック断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。配列番号：12は、本願発明のCK1α3Huの推定アミノ酸配列である。配列番号：13は、HRR25の16〜23の残基をコードする先端鎖DNAを表すプライマー4583である。配列番号：14は、HRR25の126〜133の残基をコードする先端鎖DNAを表すプライマー4582である。配列番号：15は、HRR25の126〜133の残基をコードする末端鎖DNAを表すプライマー4589である。配列番号：16は、HRR25の194〜199の残基をコードする末端鎖DNAを表すプライマー4590である。配列番号：17は、47〜67のウシ先端鎖DNAを表すプライマーJH21である。配列番号：18は、223〜240のウシ先端鎖DNAを表すプライマーJH22である。配列番号：19は、604〜623のウシ先端鎖DNAを表すプライマーJH29である。配列番号：20は、623〜604のウシ末端鎖DNAを表すプライマーJH30である。配列番号：21は、835〜817のウシ末端鎖DNAを表すプライマーJH31である。配列番号：22は、第33頁の実施例３にて認められた変異したHRR25キナーゼ領域プライマーである。配列番号：23は、本願発明のNUF1をコードするゲノミック断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。配列番号：24は、本願発明のNUF1の推定アミノ酸配列である。配列番号：25、26および27は、第18頁にて言及した保存部分である。配列番号：28および29は、ヒトcDNAライブラリーからプローブを増幅するために用いたHRR25様タンパク質の保存領域に基づいた重複オリゴヌクレオチドである。配列番号：30は、CHIγ1Hu遺伝子のヌクレオチド配列である。配列番号：31は、CHIγ1Huタンパク質の推定アミノ酸配列である。配列番号：32は、CHIγ2Hu遺伝子のヌクレオチド配列である。配列番号：33は、CHIγ2Huタンパク質の推定アミノ酸配列である。配列番号：34は、CHIδHuの核酸配列である。配列番号：35は、CHIδHuの推定アミノ酸配列である。配列番号：36は、発現プラスミドpRS305のNcoI制限部位を作成するために用いた突然変異誘発性オリゴヌクレオチドである。配列番号：37は、CKIγ１のNcoI制限部位を作成するために用いた突然変異誘発性オリゴヌクレオチドである。配列番号：38は、ヒトCKIαａのNcoI制限部位を作成するために用いた突然変異誘発性オリゴヌクレオチドである。配列番号：39は、ヒトCKIαのBglII制限部位を導入するために用いた突然変異誘発性オリゴヌクレオチドである。配列番号：40は、GAL1プロモーターとCKIα発現プラスミドの開始メチオニンコドンの間に介在する核酸配列である。配列番号：41および42は、モノクローナル抗体を作成するための、CKIαイソ体のアミノ末端と中間ペプチド断片である。配列番号：43は、CKIαHuコード配列にXbaI制限部位を作成するために用いたプライマーである。配列番号：44は、CKIαHuコード配列にBamHI制限部位を作成するために用いたプライマーである。配列番号：45は、CKIα2HuおよびCKIα3Huコード配列にBamHI制限部位を作成するために用いたプライマーである。配列番号：46は、CKIδHuコード配列にXbaI制限部位を作成するために用いたプライマーである。配列番号：47は、CKIδHuコード配列にBamHI制限部位を作成するために用いたプライマーである。配列番号：48は、CKIγ1HuおよびCKIγ2Huコード配列にXbaI制限部位を作成するために用いたプライマーである。配列番号：49は、CKIγ1HuおよびCKIγ2Huコード配列にBamHI制限部位を作成するために用いたプライマーである。配列番号：50は、マウスにてモノクローナル抗体を産生するために用いた、ウシγグロブリンに結合したCKIγHuのアミノ末端ペプチド断片である。配列番号：51は、マウスにてモノクローナル抗体を産生するために用いた、ウシγグロブリンに結合したCKIγHuのアミノ末端ペプチド断片である。配列番号：52は、マウスにてモノクローナル抗体を産生するために用いた、ウシγグロブリンに結合したウシCKIβのアミノ末端ペプチド断片である。配列番号：53は、マウスにてモノクローナル抗体を産生するために用いた、ウシγグロブリンに結合したウシCKIβのアミノ末端ペプチド断片である。配列番号：54は、マウスにてモノクローナル抗体を産生するために用いた、ウシγグロブリンに結合したCKIδHuのアミノ末端ペプチド断片である。配列番号：55は、マウスにてモノクローナル抗体を産生するために用いた、ウシγグロブリンに結合したCKIδHuのカルボキシ末端ペプチド断片である。配列番号：56は、マウスにてモノクローナル抗体を産生するために用いた、ウシγグロブリンに結合したCKIδ2HuおよびCKIδ3Huのカルボキシ末端ペプチド断片である。配列番号：57は、マウスにてモノクローナル抗体を産生するために用いた、ウシγグロブリンに結合した、すべてのヒトCKIイソ体に共通する中間ペプチド断片である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．75C10Hと命名されたハイブリドーマ（A.T.C.C.受託番号 HB 11800）。２．請求の範囲第23項に記載のハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体。３．80J9Eと命名されたハイブリドーマ（A.T.C.C.受託番号 HB 11802）。４．請求の範囲第25項に記載のハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体。５．94A1Dと命名されたハイブリドーマ（A.T.C.C.受託番号 HB 11804）。６．請求の範囲第27項に記載のハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体。７．94F4Aと命名されたハイブリドーマ（A.T.C.C.受託番号 HB 11803）。８．請求の範囲第29項に記載のハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体。９．94J11Cと命名されたハイブリドーマ（A.T.C.C.受託番号 HB 11805）。 10．請求の範囲第31項に記載のハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体。 11．128Aと命名されたハイブリドーマ（A.T.C.C.受託番号 HB 11801）。 12．請求の範囲第33項に記載のハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体。