JPH10513348A

JPH10513348A - ヒトｇｐ３９の種々のエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体およびその診断および治療における使用

Info

Publication number: JPH10513348A
Application number: JP8523029A
Authority: JP
Inventors: アントニーダブリューシアダーク; ダイアンホーレンボー; リサケイギリーランド; マーシアエルゴードン; ユルゲンバヨラート; アレヤンドロアアルッフォ; リンダジェイハーリス
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 1998-12-22
Also published as: CA2210419A1; AU4966996A; IL116882A0; PL182868B1; IL116882A; PL323565A1; AU692074B2; WO1996023071A2; WO1996023071A3; EP0807175A2; MX9705610A; NO973447D0; FI973120A0; NO973447L; HUP9802401A2; EP1728864A1; CZ233997A3; NZ303375A; HUP9802401A3; US5876950A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトgp39に対して特異的な、モノクローナル抗体、抗原結合フラグメントおよび組み換え結合タンパクを提供する。これらの抗体は少なくとも12個の異なるgp39上のエピトープに対して特異的である。これらのエピトープと結合する特異的抗体を分泌するハイブリドーマをも提供する。更に、本発明はgp39のエピトープと結合し、しかもgp39と結合するsFv およびヒト化された抗体を与える、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変部のアミノ酸配列を記載する。本発明はまた、gp39と結合する該モノクローナル抗体、抗原結合フラグメントおよび組み換え結合タンパクを含有する薬理組成物、および疾患状態の診断におけるこれら組成物の使用法、Ｂ細胞の活性化を阻害する方法、および免疫疾患、例えば自己免疫疾患、アレルギー性応答、器官拒絶反応および移植片−宿主疾患を治療する方法をも提供する。本発明の抗体は、また表面上にgp39を発現する細胞、例えば腫瘍細胞（リンパ腫）を具象化し、またターゲット細胞に治療薬を誘導するのに使用することもできる。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトgp39の種々のエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体およびその診断および治療における使用本特許出願は、１月26日付け出願に係わる米国特許出願第08/379,057号の一部継続出願であり、その全体がここに組み込まれている。発明の背景上首尾の免疫応答は、多数の細胞型の整合された相互作用を必要とする。T-ヘルパー細胞(Th)と抗原提示細胞(APC)、例えばＢ細胞、単球および樹状細胞との間の相互作用は、可溶性サイトカインまたは膜−結合タンパクを介して受け取られるシグナル並びに接着性の相互作用を包含する、複雑な伝達に起因する。これらシグナルの多くは指向性の免疫応答に対して特異的ではなく、該タンパクは広範囲に渡り分布している。細胞間相互作用に関与する重要なＴ細胞表面タンパクの幾つかが同定されており、これらはCD2 、CD4 、CD8 、CD28、LFA-1 、CTLA-4およびgp39を包含する。これらのタンパクは、APC 上のそのカウンターレセプタと結合することにより、細胞間接触状態で沈殿し、かつ重要な同時刺激シグナルを、該Ｔ細胞抗原レセプタを通して、受理したシグナルを変調するＴ細胞に与える。これらの同時刺激シグナルは該Ｔ細胞にとって、該Ｔ細胞依存性エフェクタ細胞（Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、好中球等）の適当な活性化のために必要とされる、膜−結合および可溶性因子両者と十分な関連をもち、かつ発現するのに必要である。このgp39/CD40 Ｔ細胞リガンド/Bレセプタ対が、体液性免疫応答における決定的な役割を演じている。インビトロでの研究は、このレセプタ／リガンド対がＢ細胞増殖、抗体およびサイトカイン生産および細胞の生存性に関与している。モノクローナル抗体による遮断またはgp39における遺伝子欠陥の観測両者によるインビボでの研究は、該インビトロでの研究結果を確認しており、かつこれらを、抗原に対する免疫応答中の、胚中心形成のための、機能的gp39に対する要件にまで拡張した。 CD40は、Ｂ細胞、マクロファージ、濾胞性樹状細胞、胸腺上皮細胞、正常基底上皮細胞、幾つかの癌およびメラノーマ由来の細胞系により発現される50 kDaのタイプＩ膜糖タンパクであり(クラーク＆レッドベター(Clark and Ledbetter),P roc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1986，83:4494; パエリー(Paerlie)等，Cance r Immunol．Immunother.，1985，20:23;レッドベター(Ledbetter)等，J．Immuno l.，1987，138:788;ヤング(Young)等，Int．J．Cancer，1989，43:786;ゲーリー＆スピッツ(Galy and Spits)，J．Immunol.，1992，149:775; アルダーソン(Ald erson)等，J．Exp．Med.，1993，178:669)、また最近Ｔ細胞上で発現されることが報告された(アーミテージ(Armitage)等，Eur．J．Immunol.，1993，23:2326) 。これは、多数の系において、ある範囲のダウンストリーム効果(downstream ef fects)をもつ重要なシグナル発信分子であることが示されている。初期の研究は、CD40が、Ｂ細胞の活性化に関与していることを示した。抗−CD40モノクローナル抗体によるCD40の架橋は、LFA-1 を介するＢ細胞凝集を誘発し(ゴードン(Gord on)等，J．Immunol.，1988，140:1425;バレット(Barrett)等，J．Immunol.，199 1，146:1722)、幾つかの細胞内基質のSer/Thr(ゴードン等の上記文献1988)およびTyr(ウックン(Uckun)等，J．Biol．Chem.，1991，266:17478)のホスホリル化を増し、かつＢ細胞が増殖し、かつ適当な第二のシグナルにより刺激された際にクラススイッチを行うことを可能とする、「応答(competence)シグナル」を与える。例えば、抗−CD40モノクローナル抗体は、PMA(ゴードン等，Eur．J．Immuno l.，1987，17:1535)または抗−CD20モノクローナル抗体（クラーク＆レッドベター等の上記文献1986）と共同作用して、Ｂ細胞の増殖を誘発し、またIL-4と共同作用して、Ｂ細胞増殖(ゴードン等の上記文献1987; ルーセット(Rousset)等，J ．Exp．Med.，1991，172:705)およびIgE 分泌(ジャバラ(Jabara)等，J．Exp．Me d.，1990，172:1861; ガスカン(Gascan)等，J．Immunol.，1991, 147:8; ルーセット等の上記文献1991; ツァン(Zhang)等，J．Immunol.，1991，146:1836;シャピラ(Shapira)等，J．Exp．Med.，1992，175:289)を誘発し、かつIL-10 およびT GF-βと共同作用して、sIgD B細胞によるIgA 分泌を誘発する(ドフランス(DeFra nce)等，J．Exp．Med.，1992，175:671)。ヒトCD40(スタメンコビッチ(Stamenkovic)等EMBO J.，1989，8:1403)をコードするcDNAクローンの単離は、CD40が神経成長因子レセプタ群と有意な相同性をもつことを示す。CD40の可溶性型、即ちCD40−免疫グロブリン融合タンパク(CD40- Ig)(アーミテージ等，Nature，1992，357:80; レーン(Lane)等，Eur．J．Immuno l.，1992，22:2573;ノエル(Noelle)等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A., 1992 ，89:6550)を用いて、該CD40リガンド(gp39，CD40-L)、即ち約39 kDaのタンパクが、活性化されたヒトおよびマウスＴ細胞により発現されることを見出した。更に、CD40-Ig(ファンスロー(Fanslow)等，J．Immunol.，1992，149:655;ノエル等の上記文献1992)または抗−マウスgp39モノクローナル抗体(MRI)(ノエル等の上記文献1992)を使用した遮断研究は、gp39−CD40結合の阻害が、Ｂ細胞の生物学的応答の阻害をもたらすことを示した。マウス（アーミテージ等，Nature，1992 ，357:80）およびヒト（ホーレンボー(Hollenbaugh)等，EMBO J.，1992，11:431 3;スプリッグス(Spriggs)等，J．Exp．Med.，1992，176:1543）のgp39またはgp3 9とIL-4とのまたはgp39とIL-10 との可溶性組み換え型両者をコードする相補DNA は、ヒトＢ細胞を、IgE およびIgA 、またはIgG およびIgM を分泌するように起動させることができる(アルフォ(Aruffo)等，Cell.，1993，72:291)。これらの結果は一緒に、gp39が、Ｂ細胞の分化およびイソタイプのスイッチングの幾つかの局面に対して応答性の、Ｔ細胞「スイッチ」であり得ることを示唆している（ノエル等，Immunol．Today，1992，13:431）。最近gp39をコードする遺伝子が、Xq26、即ちＸ染色体領域に写像した。該領域においては、高-IgM症候群(HIM)が既にマッピングされている(アルフォ(Aruffo) 等，Cell.，1993，72:291)。該HIM 患者中の該gp39分子は、機能的に異常であることが分かった。活性化Ｔ細胞は正常なレベルのmRNAを製造するが、該コードされたgp39は欠陥をもつことが分かっている(アルフォ(Aruffo)等の上記文献，199 3; ジサント(DiSanto)等，Nature，1993，361:541)。高-IgM症候群は、該X-染色体に写像された少なくとも７種の遺伝免疫不全症のうちの一つである（キノン＆レビンスキー(Kinnon and Levinsky)，J．Inherit. Metab．Dis.，1992，15:674）。この疾患は低いIgG 、IgA およびIgE濃度またはこれら免疫グロブリンが存在しないこと、正常または高いIgM 濃度、正常な再循環Ｂ細胞数、バクテリア感染および日和見感染症（カリニニューモシスティスを包含する）に対する罹りやすさ、胚中心のないこと、自己免疫性、好中球減少症、X-結合および常染色体型、および該疾患の該X-結合型におけるgp39リガンド遺伝子欠陥により特徴付けられる。分類不能型免疫不全症状(CVI)は、免疫不全疾患のもう一つの群であり、異常な抗体応答性および再発性バクテリア感染症により特徴付けられる。CVI の臨床的表示は様々である。というのは、この表現により記載される疾患が、まだ特徴付けされていない広範囲の疾患を包含するからである。CVIにより記述される疾患状態は、一般的に減少した血清IgG およびIgM 濃度を示すか、あるいはこれらが存在せず、一方IgM の濃度は正常であるか、あるいは低い可能性がある。多くのCVI 患者は、正常なＴ細胞数および応答をもつが、幾人かは減少した数の、異常なCD4/CD8 細胞比または異常なＴ細胞機能をもつ可能性がある。また、この患者集団には、高い自己免疫抗体の存在の可能性がある。 gp39をコードする遺伝子における変異はフレームシフトおよび未成熟停止コドンを生ずる欠失を、あるいはアミノ酸置換を生ずる点変異をもたらす（アレン(A llen)等，Science，1993，259:990; ジサント等の上記文献，1993; フライチャン(Fuleichan)等の上記文献，1993; コルサウワー(Korthauer)等の上記文献,199 3; アルフォ等の上記文献，1993; コラード(Collard)等，Immunol．Today，1993 ，14:559）。活性化Ｔ細胞によるgp39の発現に及ぼすこれら変異の影響は、可溶性のCD40−Ig、gp39バクテリア融合タンパクに対して生成されたポリクローナル抗体(抗−TRAP)((Graf)，Eur．J．Immunol.，1992，22:3191;コルサウワー等，N ature，1993，361:539)およびgp39特異的モノクローナル抗体5c8(レダーマン(Le derman)等，J．Exp．Med.，1992，175:1091)を使用して調べられている。可溶性 CD40−Igによる染色によって、gp39発現が存在しないことが分かり、一方で抗− TRAPについては、テストした３名の患者のうち１名のＴ細胞上では正常であり、このことは該モノクローナル抗体を使用して確認された。これらの結果はgp39の発現がHIM 患者においては可変であることを示し、また更なる研究を行って、gp 39の変異型の表面発現におけるこの変動性がHIM 疾患の重度と関連しているか否かを決定すべきことを示唆している。X-HIM の家族歴がない場合、この疾患は、CVI と識別することは困難である。X-HIM の原因薬物としてのgp39中の欠陥を同定するのに、一般的に利用されている方法は、ヌクレオチドの配列決定を含み、該ヌクレオチドは、インビトロで活性化されたCD40とは結合しないが、gp 39をコードする、mRNAを含むリンパ細胞から単離されたmRNAから形成されたcDNA 由来の該gp39遺伝子を含む。この方法は、CVI について診断された一患者が実際に高IgM 症候群に罹っていることを示すのに利用されている。しかしながら、これらの方法は労力を要し、かつより一般的な基準で使用するには高価過ぎるであろう。当分野で必要なことは、gp39の変異型についてアッセイし、および分類不能型免疫不全症とX-関連高IgM 症とを区別するための他の診断上の目的、およびCD40 とそのリガンドgp39との間の相互作用に応答性である疾患状体を変調するための治療法上の目的でのアッセイにおいて容易に利用できる、gp39の種々のエピトープと反応性の、付随的なモノクローナル抗体である。発明の概要本発明は、ヒトgp39上の少なくとも12種の別々のエピトープと結合できる、モノクローナル抗体を提供する。本発明は、更に本発明の該モノクローナル抗体由来の、gp39にも結合する、抗原結合フラグメントおよび組み換え結合タンパクを提供することにある。また、本発明の目的は記載されたgp39上の該12種のエピトープと結合するモノクローナル抗体を分泌する特異的なハイブリドーマを提供することにある。本発明の一態様において、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、gp39の該変異体がチロシン145 、アスパラギン 180 またはフェニルアラニン201 およびグルタミン酸202 とアラニンとの置換を含む場合に同様な活性をもつ、ヒトgp39の変異型および野性型gp39に対する結合性により特徴付けられ、かつ該変異体が、アラニンと置換されたグルタミン酸12 9 、セリン131 およびチロシン135 またはリジン143 を含む場合には、野性型gp 39に対する結合活性に比して、gp39の該変異体に対する貧弱な結合活性をもち、しかもウエスタンブロット法によってはgp39と反応しない。これらの特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な例は、ハイブリドーマ、例えばATCC HB 11822 と命名された39-1.3、ATCC HB 11816 と命名された39-1.122またはATCC HB 11821 と命名された39-1.138により分泌されるものである。第二の態様において、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、該gp39の変異体が、チロシン145、アスパラギン180 またはフェニルアラニン201 を含み、かつグルタミン酸202 がアラニンで置換されている場合に、野性型gp39に対する結合活性と比較して、幾分低い活性をもつ、ヒトgp39の変異型に対する結合性により特徴付けられ、更にgp39の該変異型がグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 またはアラニンと置換されたリジン143 を含む場合には、野性型gp39に対する結合活性に比して、変異体gp 39に対する貧弱な結合活性をもち、しかもウエスタンブロット法によってはgp39 と反応しない。これらの特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な例は、ATCC H B 11815 と命名されたハイブリドーマ39-1.59 により分泌されるものを包含する。本発明の第三の態様においては、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、該gp39の変異体が、アラニンで置換されたグルタミン酸202 およびセリン131 およびスレオニン135 、チロシン145 、アスパラギン180 またはフェニルアラニン201 を含む場合に、野性型gp39に対する結合活性と比較して、幾分低い活性をもつ、ヒトgp39の変異型に対する結合性によって特徴付けられる。該抗体は、またgp39の該変異型がアラニンにより置換されたリジン145 またはグルタミン酸129 を含む場合に、野性型gp39に対する結合活性と比較して、gp39の変異体に対する貧弱な結合活性によって特徴付けられる。更に、該抗体はウエスタンブロット法によってはgp39と反応しない。これらの特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な例は、ATCC HB 11813 と命名されたハイブリドーマ39-1.37 およびATCC HB 11809 と命名されたハイブリドーマ39-1.1 32により分泌されるものを包含する。本発明のもう一つの態様においては、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、該gp39の変異体型が、アラニンで置換されたグルタミン酸202 およびセリン131およびスレオニン135、チロシン145 、アスパラギン180 、またはフェニルアラニン201 を含む場合に、野性型gp39に対する結合活性と比較して、幾分低い活性をもつ、ヒトgp39の変異型に対する結合性によって特徴付けられ、更に該gp39の変異型がアラニンにより置換されたリジン143 またはグルタミン酸129 を含む場合に、野性型gp39に対する結合活性と比較して、gp39の変異体に対する貧弱な結合活性を有する。この群の抗体は、またウエスタンブロット法によってgp39と反応する。これらの特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な例は、ATCC HB 11819 と命名されたハイブリドーマ39-1.124 およびATCC HB 11817 と命名されたハイブリドーマ39-1.156により分泌されるものを包含する。本発明の更なる態様においては、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、該gp39の変異体型がアラニンで置換されているグルタミン酸202 およびグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン 135 、チロシン145 、アスパラギン180 またはフェニルアラニン201 を含む場合に、野性型gp39に対する結合活性に比して、幾分低いまたは同等な活性をもつ、ヒトgp39の変異型に対する結合性によって特徴付けられ、更に野性型gp39と比較して、アラニンにより置換されたリジン143 を含むgp39の変異型に対する低い結合活性をもつ。該抗体は、更にウエスタンブロットにおいてgp39と反応し得ないことにより特徴付けられる。これらの特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な例は、ATCC HB 11812 と命名されたハイブリドーマ39-1.7、ATCC HB 11818 と命名されたハイブリドーマ39-1.128およびATCC HB 11820 と命名されたハイブリドーマ39-1.26 により分泌されるものを包含する。本発明の更に別の態様においては、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、ヒトgp39の変異体型が、アラニンで置換されたグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 、チロシン145 、またはアスパラギン180 を含む場合に、該ヒトgp39の変異型および野性型gp39に対する結合について同等な結合活性をもつことによって特徴付けられる。該抗体は、更に該gp39の変異型がアラニンで置換されたグルタミン酸202 およびフェニルアラニン201 を含む場合に、野性型gp39に対する結合活性と比較して、ヒトgp 39の変異体に対する貧弱な結合活性を有し、かつ該変異型がアラニンで置換されたリジン143 を含む場合には、野性型gp39に対する結合活性と比較して、幾分低いgp39の変異体に対する結合活性をもつ。また、このモノクローナル抗体は、ウエスタンブロット法によってgp39と反応する。これらの特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な例は、ATCC HB 11814 と命名されたハイブリドーマ39-1.77 、 ATCC HB 11811 と命名されたハイブリドーマ39-1.106およびATCC HB 11810 と命名されたハイブリドーマ39-1.134により分泌されるものを包含する。本発明の更なる態様においては、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、ヒトgp39の変異体型が、アラニンで置換されたグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 、リジン143 、チロシン145 またはアスパラギン180 を含む場合に、該ヒトgp39の変異型および野性型gp39に対する結合について同等な結合活性をもつことによって特徴付けられ、また該gp39の変異型がアラニンで置換されたグルタミン酸202 およびフェニルアラニン201 を含む場合に、野性型gp39に対する結合活性と比較して、gp39の変異体に対する貧弱な結合活性を有する。また、この抗体は、ウエスタンブロット法による、gp39との結合能により特徴付けられる。これらの特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な１例は、ATCC HB 11808と命名されたハイブリドーマ39-1.29 により分泌されるものを包含する。本発明の更なる態様においては、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、ヒトgp39の変異体型が、アラニンで置換されたグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 、チロシン145 、またはアスパラギン180 を含む場合に、該ヒトgp39の変異型および野性型gp39に対する結合について同等な結合活性をもつことによって特徴付けられる。また、該抗体は、該変異型がアラニンで置換されたリジン143 を含む場合に、野性型gp39 に対する結合活性と比較して、gp39の変異体に対する幾分低い結合活性をもつことにより特徴付けられ、かつこの抗体は、ウエスタンブロット法によっては、gp 39と結合しない。これらの特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な１例は、AT CC HB 11823 と命名されたハイブリドーマ39-7.3E12 により分泌されるものを包含する。更に別の本発明の態様においては、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、ヒトgp39の変異体型が、アラニンで置換されたグルタミン酸129 を含む場合に同様な結合活性での、該ヒトgp39の変異型および野性型gp39に対する結合によって特徴付けられる。該抗体はまた、該変異体がアラニンで置換されたセリン131およびスレオニン135、アスパラギン180 、またはフェニルアラニン201 およびグルタミン酸202 を含む場合には、野性型 gp39に対する結合活性と比較して、gp39の変異体に対する幾分低い結合活性をもつことにより特徴付けられ、かつ該gp39の変異型がアラニンで置換されたリジン 143 またはチロシン145 を含む場合に、野性型gp39に対する結合活性と比較して、gp39の変異体に対する貧弱な結合活性を有する。この抗体は、ウエスタンブロット法によっては、gp39と結合できない。これらの特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な１例は、ATCC HB と命名されたモノクローナル抗体39-5.6E9 である。更に別の態様においては、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、gp39の変異体型がアラニンで置換されたグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 、リジン143 、チロシン145 、アスパラギン180 、またはグルタミン酸202 およびフェニルアラニン201 を含む場合に、幾分低いまたは同様な結合活性での、該gp39の変異型および野性型gp39に対する結合によって特徴付けられる。該抗体はまた、ウエスタンブロット法により、gp39と結合することにより特徴付けられる。これらの特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な１例は、ATCC HB と命名されたハイブリドーマ39-9.2 46により分泌されるものである。更に別の本発明の態様においては、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、ヒトgp39の変異体型がアラニンで置換されたグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 、チロシン145 、またはフェニルアラニン201 およびグルタミン酸202 を含む場合に、同様な結合活性での、該ヒトgp39の変異型および野性型gp39に対する結合によって特徴付けられる。これらのモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、また該変異体がアラニンで置換されたリジン143 を含む場合には、野性型gp39と比較して幾分低い、変異gp39に対する結合活性をもつことにより、また該gp39変異体がアラニンで置換されたアスパラギン180 を含む場合には貧弱な結合活性をもつことにより特徴付けられる。該抗体はまた、ウエスタンブロット法により、gp39と結合できないことにより特徴付けられる。これらの特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な１例は、ATCC HB と命名されたハイブリドーマ39-9.11 により分泌されるモノクローナル抗体である。本発明のその他の態様においては、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、ヒトgp39の変異体型がアラニンで置換されたグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 、チロシン145 、またはフェニルアラニン201 およびグルタミン酸202 を含む場合に、同様な結合活性での、該ヒトgp39の変異型および野性型gp39に対する結合によって特徴付けられる。該抗体はまた、ウエスタンブロット法により、gp39と結合できるものとしても特徴付けられる。これらの諸特徴をもつモノクローナル抗体の具体的な１例は、ATCC HB と命名されたハイブリドーマ39-9.274により分泌されるモノクローナル抗体である。本発明の更に他の態様においては、該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、ヒトgp39の変異体型がアラニンで置換された位置129 のグルタミン酸、位置131 のセリンおよび位置135 のスレオニン、位置145 のチロシン、または位置201 のフェニルアラニンおよび位置202 のグルタミン酸を含む場合に、該ヒトgp39変異体に対して高い反応性をもたないことにより特徴付けられる。あるいは、このモノクローナル抗体は、アラニンで置換された位置180 のアスパラギンまたは位置143 におけるリジンを含む場合には、ヒトgp39変異体に対して同等な反応性をもたないことにより特徴付けられる。これら抗体は、またウエスタンブロット法による、gp39との結合性またはこれとの結合性の欠如によっても特徴付けられる。これらモノクローナル抗体群の各々は、gp39のエピトープを識別し、かつ抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクの何れかを生成する化学的方法または組み換え法によって処理できる。抗原結合フラグメントの例は、Fab 、(Fab ')₂またはFvであり、これらは全抗体の酵素消化により生成される。本発明の組み換え結合タンパクは、親抗体の抗原特異性を維持し、かつ他のアミノ酸残基配列と再結合されている任意の分子を包含する。これらの例は、更にキメラ抗体sFvs、ヒト化抗体および融合分子を包含する。更に別の本発明の態様においては、該モノクローナル抗体または組み換え結合タンパクは検出可能なマーカーまたは治療薬と複合化することができる。検出可能なマーカーの例は、発蛍光団、放射性同位元素、酵素または発色団を含む。本発明で意図する治療薬は、放射性同位元素、毒素、または化学療法剤、例えば細胞毒性薬物を含むことができる。複合化技術以外にも、本発明の該組み換え結合タンパクは、本発明のモノクローナル抗体を由来とする可変領域および酵素、タンパク毒素またはタンパク様治療薬を含む、融合タンパクを生成するように組み立てることができる。本発明の更に他の態様においては、X-結合高IgM 症候群の検出法を記載する。この方法は、この症候群に関連する症状をもつ可能性のある患者由来の末梢血リンパ細胞を単離し、該末梢血リンパ細胞を活性化し、固定化し、該単離し、かつ活性化した末梢血リンパ細胞を透過性とし、表示されたモノクローナル抗体と、該活性化され、固定化されかつ透過性とされた末梢血リンパ細胞と混合し、該細胞と結合した抗体を検出する工程を含む。該抗体は、検出可能なマーカーで標識でき、あるいは未標識であってもよい。未標識状態で使用する場合、該第一の抗体に対して特異的な、第二の抗体（標識された）を添加する、追加の工程を、該検出工程に先立って実施する。該検出可能なマーカーは、例えば発蛍光団、放射性同位元素、酵素または発色団であり得る。更に、本発明はハイブリドーマにも関わり、該ハイブリドーマは、本発明において記載するエピトープ各々と反応性の特異的抗体を分泌する。これらハイブリドーマ各々は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Cultu re Collection)，12301パークローンドライブ、ロックビル、MD 20852に、ブダペスト条約の条件に基づき、1995年１月20日付けで寄託した。更に別の本発明の態様においては、ヒトgp39のエピトープを識別する、免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖および軽鎖に対するアミノ酸残基配列をコードする、単離され、かつ精製された核酸配列が、本発明によって記載される。特に、この核酸配列は、配列ID# 12および配列ID# 16に示された該免疫グロブリン軽鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードする。また、これらアミノ酸配列をコードする具体的な核酸配列をも記載する。これらは配列ID# 11および配列ID# 15に示されている。同様に、配列ID# 14および配列ID# 18に示されているアミノ酸残基配列をもつ、免疫グロブリン重鎖の可変領域をコードする、核酸配列をも提供する。該アミノ酸残基配列をコードする特定の核酸配列は、配列ID# 15および配列ID# 17に与えられている。本発明は、また薬理組成物をも提供し、該組成物は本明細書に記載する該モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクと、製薬上許容される担体との組み合わせを含む。これら組成物は、検出可能なマーカーまたは治療薬と複合化した、該モノクローナル抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクを含むことができる。これら薬理組成物を使用して、有効量の上記組成物の一種を投与することにより、動物における、Ｔ細胞依存性抗原に対する抗体応答を阻害する方法をも提供する。この組成物を投与する動物はサルおよびヒトを包含する。Ｔ細胞依存性抗原に対する抗体応答の阻害は、自己免疫応答、移植器官の拒絶反応、移植片−宿主疾患、アレルギー性応答または炎症性応答を阻害できる。この方法を利用して防止可能な自己免疫疾患は、特に乾癬、リウマトイド関節炎、全身紅斑性狼瘡または真正糖尿病等を包含する。更に、本発明は、患者の表面におけるgp39発現細胞を具象化する方法をも提供し、該方法は、検出可能なマーカーと複合化された上記のモノクローナル抗体を含む薬理組成物を、該gp39発現細胞をもつ表面上での、抗体／抗原錯体の形成を可能とする条件下で、患者に投与し、かつ該検出可能なマーカーの存在により示される、該抗体／抗原錯体の存在を検出する工程を含む。図面の説明第1A〜1D図は、マウス抗−ヒトgp39モノクローナル抗体7(39-1.7)および106（ 39.1-106）の、活性化ヒトおよびマウスＴ細胞との結合を明らかにする。Ｅロゼット正のＴ細胞は末梢血単核細胞から単離し、PMA およびイオノマイシンで６時間活性化し、次いで抗−ヒトgp39モノクローナル抗体７、106 または負のコントロール抗体と共にインキュベートした。次に、細胞をFITC山羊抗−マウスIgG ポリクローナル抗血清、次いでフィコエリトリンで標識したマウス抗−ヒトCD4 モノクローナル抗体と共にインキュベートした。細胞を、CD4 細胞についてゲート輸送させ(gated)、引き続きFACSカン(FACScan)を使用して、抗−gp39染色につき分析した。第1Aおよび1B図はヒトＴ細胞に関わり、第1Cおよび1D図はマカック族のサルのＴ細胞に関する。第2A〜2C図は、マウス抗−ヒトgp39モノクローナル抗体７および106 による、ヒトCD40−Igのヒトおよびマカック族サルのＴ細胞に対する結合の阻害を立証している。Ｅロゼット正のＴ細胞は末梢血単核細胞から単離し、PMA およびイオノマイシンで６時間活性化した。活性化されたＴ細胞を、５μg/mlの濃度のマウス抗−ヒトgp39モノクローナル抗体7(39-1.7)または106(39.1-106)と共に、次いでヒトCD40−Ig（20pg/ml）と共にインキュベートした。このインキュベート後に、該細胞を、フィコエリトリンで標識した山羊抗−ヒトIgG で染色し、かつFACS カン上で分析した。第2A図は、ヒトＴ細胞およびモノクローナル抗体７に関連し、第2B図は、ヒトＴ細胞およびモノクローナル抗体106 に関連し、かつ第2C図は、マカック族サルのＴ細胞およびモノクローナル抗体106 に関連する。第３図は、マウス抗−ヒトgp39モノクローナル抗体７および106 の、活性化されたマカック族サルのＴ細胞により刺激されたマカック族サルの細胞によるIgG およびIgM の生産を阻害する能力を立証する。第4Aおよび4B図は、gp39結合タンパクの、マカック族サルにおける、ヒツジ赤血球に対する免疫応答を抑制する能力を立証する図である。血清を毎週採取し、抗-SRBC IgM 力価（第4A図）および抗-SRBC IgG 力価（第4B図）をELISA 法により評価した。各値は、各々の群の４匹のサルについての平均値+SEMを表す。矢印は二次免疫の時間を表す。報告された値は、バックグラウンド値の５倍の吸収値を与える、血清の希釈率により決定される力価であり、ここでバックグラウンドは血清の不在下で記録された吸収値として測定される。第５図は、gp39結合タンパクで処理したマカック族サルの、KLH に対するIgG 応答を生ずる能力を示す。特定のサルの抗体の血清力価を、ELISA により測定した。結果は、各群のサル全体についての平均値である。報告された値は、バックグラウンド値の５倍の吸収値を与える、血清の希釈率により決定される力価であり、ここでバックグラウンド値は血清の不在下で記録された吸収値として測定される。第６図は、106 VLのヌクレオチド配列(Seq．ID# 11)およびその推定アミノ酸配列(Seq．ID# 12)を与える。第1B図は106 VLのヌクレオチド配列(Seq．ID# 13) およびその推定アミノ酸配列(Seq．ID# 14)を与える。該リーダー配列を丸で囲み、また相補性決定部をボックスで示した。該VLはマウスκＶ亜族の一員であり、該Ｖ遺伝子セグメントはＪκ5(第6A図の下線部)で再配列されている。該VHはマウスIII(D)亜群の一員である。重鎖Ｖ遺伝子はJH2(第6B図の下線部)で再配列されている。第７図は、７VLに対する核酸配列(Seq．ID# 15)およびその推定アミノ酸配列( Seq．ID# 16)である。第2B図は、７VHに関する核酸配列(Seq．ID# 17)およびその推定アミノ酸配列(Seq．ID# 18)である。該リーダー配列は丸で囲まれ、また相補性決定部はボックスで示す。該VLはマウスκII亜族の一員であり、該Ｖ遺伝子セグメントはＪκ4(第7A図の下線部)で再配列されている。該VHはマウスII(A) 亜群の一員である。重鎖V遺伝子はJH2(第7B図の下線部)で再配列されている。第8AおよびＢ図は、固定化されたヒトgp39に結合している、106 sFv-Igおよび７sFv-Ig COS細胞トランスフェクション上澄の力価を示す。抗−マウスLyt-2aおよびLyt-2a-gp39 融合タンパクで被覆した平底96−ウエルプレートを使用して、 COS細胞上澄を、機能性の抗−gp39106 および7 sFv-Igにつきスクリーニングした。各sFv-Igに対する代表的なクローンの２倍希釈液を示す。模擬トランスフェクション上澄(COS細胞にDNA を添加せず)が活性を示さないのに対して、106 sFv -Ig および7 sFv-Igは、1:100を越える希釈率にて、固定化されたgp39と結合した（106 sFv-Ig結合については、トランスフェクション上澄の1:1000まで検出できた）。これとは対照的に、抗−マウスgp39sFv(MR1 sFv-Ig)は、ヒトgp39と結合しなかったが、抗−マウスLyt-2aおよびLyt-2a−マウスgp39融合タンパクで被覆したプレートに対しては、良好に結合した。106 sFv-Igおよび7 sFv-Igは、抗 −マウスLyt-2aおよびLyt-2a−マウスgp39融合タンパクで被覆したプレート上で殆どまたは全く反応性を示さなかった。第9Aおよび9B図は、２価の106 モノクローナル抗体および106 sFv-Igの、本質的にgp39を発現するジャーカット細胞に対する結合性の比較を示す。ヨウ素化された２価の106mAbを、BMS-10ジャーカット細胞上で発現されたgp39に対する結合性につき、ヨウ素化された106 sFv-Igと比較した。計算されたアフィニティーは２価の106mAbに対してKd=4x10^-10±6x10^-11(第9A図)また106 sFv-Igに対してKd= 4x10^-9±6x10¹¹（第9B図）であった。スキャッチャード形質転換は、２価の106m Abおよび106 sFv-Ig両者が、細胞１個当たり約10,000サイトで結合することを示した（第9Aおよび9B図）。第10図は、106 VLヒト化用の鋳型を図示したものである。元のマウスの配列は第４列目(m106，Seq．ID# 27)に示され、その下にはマウス生殖系列配列が与えられている。この選択されたヒト鋳型配列は、第二列目に示され(ヒト鋳型，Seq ．ID# 29)、その上部にはヒト共通配列が示されている。このヒト化106 VL配列( h106，Seq．ID# 28)は、該ヒト鋳型と該マウス106 VL配列との間に示されている。これは本質的にヒトフレームワーク部とマウス超可変部とからなる。カバット (Kabat)等（シーケンスズオブプロテインズオブイムノロジカルインタレスト(Se quences of Proteins of Immunological Interest),第４版，U.S.ヘルス＆ヒューマンサービスズ(U.S．Health and Human Services)，ワシントンD.C.(1987)）により定義されたような、該超可変領域は二重線で輪郭を与えて図示されている。L1、L2およびL3ループは単線の枠で囲まれており、チョシア(Chothia)により定義された構造決定因子は、星印で示されている（チョシア＆レスク(Chothia a nd Lesk)，J．Mol．Biol.，1987，196:901）。該ヒト化された106 VLと異なっているヒトまたはマウス残基は二重の下線が付されている。該ヒトＪκは該106 Ｊ κとの相同を基にして選択した。第11図は、106 VHのヒト化鋳型を図示したものである。元のマウス配列は第４列目(m106，Seq．ID# 30)に示され、その下には最近接マウス配列（該H2ループ中の僅かに３個の残基をもつ適当な生殖系配列は利用できないが、代わりに106 VHに対して全体的に高い相同性をもち、かつ３残基のH2ループをももつ、再配置された配列を選択した）が示されている。この選択されたヒト鋳型配列は第二列目に与えられ(ヒト鋳型，Seq．ID# 32)、その上にはヒト共通配列が与えられている（ヒトVHIII/JH4 共通配列）。このヒト化された106 VH配列(h106，Seq．ID # 31)は、該ヒト鋳型と該マウス106 VH配列との間に示されている。これは本質的にヒトフレームワーク部とマウス超可変部（二重線によって囲まれた領域）からなる。該H1、H2およびH3ループは単一線の枠で囲まれ、かつチョシア(上記文献)により定義された構造決定因子は、星印で示されている。該ヒト化された106 VHと異なっているヒトまたはマウス残基は二重の下線が付されている。該ヒトJH は106 JHとの相同を基にして選択した。第12図は、８種のヒト化した106 VHの集合を示す図である。２つのDNA フラグメントは、該マウス106 VHの最初の149 塩基をPCR により増幅した。ここでは、該マウス残基とヒト残基との間で、３つ(106 vh T-5')または４つ(106 vhA-5') の変更を含む、106 VH配列直前のHindIII サイトをコードするセンスプライマーおよび固有の制限サイト(Nhel，EcoRI，PstIおよびXbaI)をコードするアンチセンスプライマーを使用した。これらのフラグメントをHindIII およびXbaIで消化し、かつpUC19 と連結して、２種のベクター106 vhA-NEP および106 vhT-NEP を生成した。合成オリゴヌクレオチドの３つの対は、１または２つの位置(106 vhS Y，106 vh DY，106 vh SS)における変更をコードし、一方で106 vh DS は残基55 および56における元のマウス配列を維持していた。また、４種全ての対は、Ile 57、Ala 60、Lys 64およびLys 75なる、ヒト化された追加の残基をコードし、これらは簡単化のために図示されていない。更に、これらを、NheIおよびPstIオーバーハング(O/H)および診断上の消化のために、固有のXhoIサイトにより処理した。これらのオリゴヌクレオチドにより生成した該DNA フラグメントを連結して、NheIおよびPstIサイトにて、106 vhA-NEP および106 vhT-NEP ベクターとした。最終的なPCR フラグメントを、106 vh Pst5'センスプライマーおよび106 vh X ba3'アンチセンスプライマーを使用し、かつ鋳型としてマウス106 VHを使用して生成した。これら２つのオリゴヌクレオチドは、マウスからヒト配列への、更に４つの変更をコードする。このDNA フラグメントは、PstIおよびXbaI制限サイトを利用して、前の構築体にクローニングした。第13図は、内皮細胞上でのE-セレクチン発現の阻害を示す図である。黒色の棒は、E-セレクチンの発現レベルを示している。該マウス106 sFv-Igは強力な阻害を示し、該L6 sFv-Ig 負コントロールは阻害を示さない。HuVL/106 vhA-DY(“AD Y”)、huVL/106 vhA-SY(“ASY”)およびhuVL/106 vhT-DS(“TDS”)は、E-セレクチンの発現を阻害するが、該マウス106 sFv-Ig程効果的ではない。huVL/106vhT- SY(“TSY”; タンパクなし)およびhuVL/106vhT-SS(“TSS”; 異常なタンパク)トランスフェクション由来の上澄は、如何なる活性をも示さなかった。第14図は、ヒトgp39と結合したヒト化された106 sFv-Igタンパクのビアコア(B iacore; 登録商標)分析を示す。ヒトgp39をチップ上に塗布し、種々のヒト化された106 sFv-Igトランスフェクション上澄を、結合についてテストした。元のマウス106 sFv-Igは極めて緊密に結合した（水平線により示されるように、比率のズレは観測されなかった）。huVL/106 vhA-DY(“ADY12-3”)、huVL/106 vhA-SY( “ASY21-7”)およびhuVL/106 vhT-DS(“TDS46-17”)トランスフェクション上澄由来のタンパクも、緊密に結合し、検知可能な比率のズレはなかった。huVL/106 vhT-SY(“TSY26-9”; タンパクなし)およびhuVL/106vhT-SS(“TSS36-13”;異常なタンパク)トランスフェクション由来の上澄は、gp39-被覆チップに結合しなかった。第15図は、完全なh106軽鎖発現プラスミド、pD16-hK8.L1、を図示したものである。第16図は、該h106シグナルペプチド、可変領域および結合フランキング領域をコードする、該h106免疫グロブリン軽鎖挿入断片についての、核酸配列(Seq．ID #76)およびアミノ酸残基配列(Seq．ID#77)を示す図である。第17図は完全なh106重鎖発現ベクターpD17-hK1.H1 を図示したものである。第18図は、該h106シグナルペプチド、可変領域および結合フランキング領域をコードする、該h106重鎖挿入断片についての、核酸配列(Seq．ID#78)およびアミノ酸残基配列(Seq．ID#79)を示す図である。第19図は、抗−ヒトIgM の存在下で、sgp39 によるＢ細胞増殖の阻害に関するデータを与える。休止扁桃Ｂ細胞を、sgp39 、ウサギ抗−ヒトIgM イムノビーズおよび指示した量のモノクローナル抗体の存在下で、72時間培養した。次いで、プレートを、[³H]- チミジンでパルス処理し、更に16時間インキュベートした。このインキュベートの後、該細胞を収穫し、[³H]- チミジンの取り込み量を測定した。全てのテストは、３回宛て実施した。結果は、培地のみを含む培養物と比較した、％阻害率として表示した。第20図は、種々のヒト化された106 抗体タンパクの、活性化されたＴ細胞で刺激されたヒトＢ細胞による該抗体の生産を阻害する能力を比較した図である。ヒト末梢血単核細胞は、単球およびナチュラルキラー細胞に欠乏しているので、次にＥロゼット正(T細胞)とＥロゼット負(B細胞)に分離した。Ｔ細胞は引き続きマイトマイシンＣで処理し、指定した量のモノクローナル抗体の存在下で、96ウエルをもつプレートの抗-CD3モノクローナル抗体被覆ウエル内で、Ｂ細胞と共に同時培養した。全テストを各３回実施した。結果は、培地のみを含む（抗−gp39モノクローナル抗体を含まない）培養物に対する％阻害率として表した。第21図は、種々のヒト化された106 抗体タンパクの、gp39⁺Ｔ細胞系による、内皮細胞上でのE-セレクチン発現の誘発を阻害する能力を比較した図である。ヒト臍帯静脈内皮細胞をBMS-2 細胞、gp39を発現することが知られているジャーカット細胞系と共に、指定された量の抗体の存在下で培養した。４時間後に、E-セレクチン発現レベルをELISA 法により測定した。誤差バーはグラフ記号よりも小さい。発明の詳細な説明ここに記載する発明をより一層十分に理解するために、以下のような説明を与える。本発明は、一連のモノクローナル抗体およびハイブリドーマを目的とし、該モノクローナル抗体はＴ細胞膜糖タンパクgp39のエピトープを特異的に識別し、また該ハイブリドーマはこれらのモノクローナル抗体を生成または分泌する。本発明は、またその他のモノクローナル抗体をも包含し、該抗体はここに具体的に記載されるモノクローナル抗体の、そのエピトープに対する結合を競合的に阻害するように作成できる。該モノクローナル抗体のフラグメントおよび該記載されるモノクローナル抗体の可変領域をもつ組み換えタンパクも、本発明に含まれ、また該モノクローナル抗体、フラグメントおよび組み換え結合タンパクの、高IgM 症候群の診断、他の細胞接着およびＴ細胞アッセイ、並びに宿主における免疫応答を変調する方法において利用する方法をも包含する。モノクローナル抗体の調製は、gp39上のエピトープに対して特異的な抗体を生産する細胞系を不死化することにより達成できる。典型的には、本発明のモノクローナル抗体は、最初にケーラー＆ミルシュタイン(Kohler and Milstein)により導入された、十分に確立されたハイブリドーマ技術を利用して生産できる。これについては、ケーラー＆ミルシュタイン(Kohler and Milstein)，Nature，197 5，256:495を参照のこと。また、ブラウン(Brown)等，J．Immunol.，1981，127: 539; イエー(Yeh)等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1979，76:297;ヘルストローム(Hellstrom)等，Cancer Research，1990，50:2183をも参照のこと。これらの技術は、動物に免疫原（例えば、天然タンパク、エピトープサイトを含有するフラグメントまたは融合タンパク何れかとして、該gp39を含有する細胞または細胞抽出物もしくは純粋なgp39）を注入して、該動物中に所定の免疫応答を誘発することを含む。通常使用する動物は、多くの哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウシ、山羊、ヒツジ、ウサギ等を包含する。該免疫原は、通常アジュバント、例えば完全フロインドアジュバント、水酸化アルミニウムゲル等と共に、動物に提示される。次いで、該動物を出血させ、該血液をポリクローナル抗体の単離のために使用する。また、末梢血リンパ細胞、脾臓リンパ細胞(B- 細胞）、またはリンパ節リンパ球を、適当なミエローマ細胞と融合して、gp39に対して特異的なモノクローナル抗体をコードする遺伝子を不死化するのに利用できる。本発明においては、該モノクローナル抗体は、一部には、一連のgp39変異体との結合性により特徴付けられる。該抗体の該変異gp39に対する結合活性（結合強度）を、野性型のgp39に対する該抗体の結合活性と比較した。特定の変異体に対する結合活性を比較した場合に、野性型のgp39に対する結合活性の25-30%未満である場合には、結合活性は低いものとして特徴付けられ、変異体に対する結合活性が、野性型のgp39に対する結合活性の25-30%〜50-55%であった場合には、若干のまたはあまり顕著でない反応性における減少が観測され、該変異体に対する結合活性が、野性型に対する結合活性の50-55%〜75-80%であった場合には、幾分低下した反応性が観測され、また変異体に対する該結合活性が、変異体に対する結合活性の75-80%まそれ以上であった場合には、同様なまたは等価な反応性が観測された。本発明の抗体は、またそのイソタイプ、ウエスタンブロットによるgp39 との結合性、B-細胞増殖を阻害する能力および免疫グロブリン産生を阻害する能力によっても特徴ずけられた。以上本発明をマウスモノクローナル抗体を使用した例により説明してきたが、本発明はこれに制限されず、例えばヒトハイブリドーマを包含し（コート(Cote) 等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1983，80:2026）またはヒトＢ細胞の形質転換(例えば、インビトロでのエプシュタインバールウイルス(EBV))の利用（コート(Cote)等，モノクローナル抗体および癌治療(Monoclonal Antibodies and C ancer Therapy)，1985,アランR.リス(Alan R．Liss)，pp．77-96を参照）を包含する。該モノクローナル抗体は免疫グロブリンの任意のクラスまたはサブクラス、例えばIgM 、IgD 、IgA 、IgE または動物の各種について公知のIgG のサブクラスのものであり得る。一般的に、該モノクローナル抗体は完全な状態で、あるいはエピトープ結合フラグメント、例えばFv、Fab またはF(ab')₂等を使用することも可能である。本発明の細胞系は、該モノクローナル抗体の直接的生産以外の用途も見出すことができる。該細胞系を他の細胞（例えば、薬物−標識したヒトミエローマ、マウスミエローマ、またはヒトリンパ芽球様細胞）と融合して、ハイブリドーマを生成し、かくして該モノクローナル抗体をコードする遺伝子の転移のために利用することも可能である。また、該細胞系は、免疫グロブリン、特に該免疫グロブリンの可変部またはエピトープ結合領域をコードする遺伝子のこれら領域をコードする染色体または遺伝子の源として使用することもできる。これは融合以外の技術によって、単離し、かつ細胞に転移することができる。これは、特に該免疫グロブリンをコードし、かつイントロンを含まない（mRNAからの）cDNAライブラリーを調製し、次いで該DNA を単離し、かつ適当な真核生物または原核生物の発現ベクターに組み込むことにより達成できる。次いで、この発現ベクターを利用する方法によって、免疫グロブリンまたはエピトープ結合フラグメントの生産のために、宿主を形質転換することができる。一般的には、U.S.P．No．4,172,124 4,350,683、4,363,799、4,381,292 および4,423,147 を参照のこと。またケネット(Kennet)等のモノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies),1980，プレナムプレス刊、N.Y.をも参照のこと。より具体的には、ハイブリッドDNA 技術においては、本発明の免疫グロブリンまたはエピトープ結合フラグメントは、バクテリア内で製造することも可能である(ボス(Boss)等，Nucl．Acid Res.，1984，12:3791およびウッド(Wood)等，Nat ure，1985，314:446)。例えば、本発明の細胞系により生産された該モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子から転写されたmRNAは、該親細胞型の成熟免疫グロブリン分子に共通することが知られている、DNA 配列由来の縮重cDNAプローブを使用する判別cDNAハイブリダイゼーションにより単離することができる。ハイブリッド化されない該mRNAは、所定の免疫グロブリン鎖をコードするメッセージに富むであろう。必要に応じて、この工程を繰り返して、所定の mRNAレベルを更に高めることができる。この減じられたmRNA組成物を、次に逆転写させて、該所定の配列に富むcDNA混合物を与えることができる。このRNA を適当なRNA アーゼで加水分解し、また該ssDNA をDNA ポリメラーゼＩおよびランダムプライマー、例えばランダムにフラグメント化したウシ胸腺DNA とともに二本鎖とすることができる。得られたdsDNA を、次に適当なベクター、例えばラムダベクターまたはプラスミドベクター等のウイルスベクター（例えば、pBR322、pA CYC184等）に挿入することによりクローニングすることができる。該軽鎖および重鎖の定常部に対する公知の配列に基づき、プローブを開発することにより、該所定の軽鎖および重鎖をコードする該遺伝子をもつこれらのcDNAクローンが、ハイブリダイゼーションにより同定できる。その後、この遺伝子を該プラスミドから切除し、操作して余分のDNA を除去し、次いで宿主の形質転換および該遺伝子の最終的な発現のために、適当なベクターに導入することができる。当分野で周知の他の方法を利用して、免疫グロブリン分子をコードする遺伝子配列を単離することもできる。本出願において、RNA は単離され、cDNAは、プライマーとして免疫グロブリンの定常部を使用したPCR 技術を利用して生成した。このPCR 増幅されたVHおよび VLフラグメントを、選別し、クローニングし、かつ該可変領域のヌクレオチド配列を決定するのに使用した。有利には、哺乳動物宿主（例えば、マウス細胞）を使用して、該免疫グロブリン鎖を処理して（例えば、該重鎖と軽鎖とを接合して）、完全な免疫グロブリンを生成し、更に必要ならば如何なるリーダー配列も含まない免疫グロブリンを分泌せしめることができる。また、２種の鎖を生成するために単細胞微生物を使用することができるが、ここでは分泌リーダーおよびプロセッシングシグナルをコードするDNA 配列を除去するために更なる操作が必要となる可能性があり、一方で該重鎖をコードする該配列の5'末端に、開始コドンを与えることができる。このようにして、該免疫グロブリンを調製し、かつプロセッシングして、哺乳動物以外の細胞中で組み立て、かつグリコシル化できる。必要ならば、該鎖各々を切頭処理して、該可変領域のみを残すことができ、次に該領域を操作して、該親抗体により識別される該gp39エピトープに対して特異的な、他の組み換え結合タンパクを得ることができる。このような組み換え結合タンパクの一つは、キメラ抗体であり、そこで親抗体の可変領域は、異なる種由来の抗体の定常部と再結合（例えば、ヒトの定常部と再結合したマウス可変領域）される。典型的には、本発明のモノクローナル抗体の該可変領域は、ヒト抗体の定常部と結合しているであろう。組成においてほぼヒトに近いキメラ抗体は、マウス抗体よりも実質上免疫原性が弱い。もう一つの組み換えエピトープ結合タンパクは、単鎖抗体である。しばしばsF v と呼ばれるこのような構築体において、該親抗体の重鎖および軽鎖両者由来の可変領域の一つは、該エピトープ結合領域が再形成されるように、ペプチドリンカーを介して共有結合的に結合している。gp39の１以上のエピトープに対して特異的な、重鎖および軽鎖可変領域を含む多価単鎖抗体も、構築できる。このような組み換え結合タンパクを構築する方法については、EP 0610,046 およびWO 94/ 13806 を参照のこと。更に別の型の組み換え結合タンパクは、ヒト化された抗体であり、ここで非ヒトモノクローナル抗体のフレームワーク領域内のコドンは、アミノ酸残基をコードするように種々の点変異誘発法により変更されて、該マウスフレームワークをヒトフレームワーク領域により類似するものとされる。EP 0578,515、EP 0592,1 06 、ジョーンズ(Jones)等，Nature，1986，321:522およびライヒマン(Riechman n)等，Nature，1988，332:323を参照のこと。また、相補性決定部(CDR)について変更を行って、全可変領域を、ヒト抗体の表面特性により類似するものとすることが可能である。種々の組み換え結合タンパクを製造する意図は、該抗体の免疫原性または該定常領域または該エピトープ結合領域と組み換えられた他の活性部分と関連したアクセサリー活性を変更し、かつ元の親抗体のgp39エピトープ結合特異性を保持することにある。本発明は、更に本発明のモノクローナル抗体および組み換え結合タンパクとの組成物を提供する。これら組成物は、例えば放射性同位元素、酵素、発蛍光団、発色団等の検出可能なマーカーで標識した、本発明のモノクローナル抗体および組み換え結合タンパクを含むことができる。他の組成物は、治療薬物、例えば放射性同位元素、毒素（即ち、シュードモナス外毒素）または化学療法剤等と複合化または結合した本発明のモノクローナル抗体および組み換え結合タンパクを含むことができる。本発明の該抗体または組み換え結合タンパクの、該検出可能なマーカーまたは治療剤との複合化または結合は、共有結合または他の化学的な結合手段により実現できる。該化学的結合手段は、例えばグルタルアルデヒド、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性結合剤を含むことができる。ヘテロ二官能性結合剤は、例えば SMPT（サクシンイミジルオキシカルボニル−α-(2-ピリジルジチオン)トルム(py ridyldition)-tolume）、SPDP(N- サクシンイミジル-3-(2-ピリジリリチオ)プロピオネートおよびSMCC（サクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1- カルボキシレートを含むことができる。ホモ二官能性結合剤は、例えば DMP(ジメチルピメリミデート)、DMA(ジメチルスベリニデート)およびDTBPジメチル3,3'- ジチオビスプロピオンイミデートを含むことができる。幾つかのタンパク検出性マーカーおよび治療剤は、本発明のモノクローナル抗体の可変領域と組み換え的に結合して、融合タンパクとしての組成物を生成することができ、ここで該モノクローナル抗体の可変領域は、その結合特異性を保持し、かつ該検出性マーカーおよび治療剤はその活性を保持する。これら融合タンパクを構築するための組み換え法は当分野で周知である。複合化されたまたは複合化されていない、モノクローナル抗体または組み換え結合タンパクを含有する薬理組成物は、本発明の範囲に含まれる。薬理組成物は該モノクローナル抗体と製薬上許容される担体とを含むことができる。本発明の目的にとって、「製薬上許容される担体」とは、当分野で周知の標準的な担体の何れであってもよい。例えば、適当な担体は燐酸緩衝塩溶液、油／水エマルション等のエマルション、および種々の型の湿潤剤を含むことができる。その他の担体は、また滅菌溶液、錠剤、被覆錠剤およびカプセルを含むことができる。典型的には、このような担体は、賦形剤、例えば澱粉、ミルク、砂糖、種々の型のクレー、ゼラチン、ステリック酸(steric acid)、またはその塩、マグネシウムまたはカルシウムステレート(sterate)、タルク、植物油脂、ガム、グリセロールまたは他の公知の賦形剤を含むことができる。このような担体は、また香味料、着色添加剤、保存剤、または他の成分を含むこともできる。このような担体を含む組成物は周知の手段で処方される。レミントンズファーマシューティカルサイエンス(Remington's Pharmaceutical Science)，第15版，マッチパブリッシング社、イーストン、ペンシルバニア(1980)を参照のこと。本発明の該モノクローナル抗体および組み換え結合タンパクは、多くのインビトロおよびインビボ用途が見出されている。例えば、本発明の組成物は、可溶性ヒトgp39およびヒト疾患、例えばX-結合高IgM 症候群と関連したヒトgp39における変異をもつタンパクの単離のための、インビトロでの用途が見出されている。該組成物は、また高X-結合IgM とCVI との間の識別のための診断法における用途を見出し得る。診断の目的にとって、該モノクローナル抗体および組み換え結合タンパクは、標識されていても、未標識状態であってもよい。典型的には、診断アッセイは、該モノクローナル抗体または組み換え結合タンパクと、細胞表面または活性化Ｔ細胞内での、ヒトgp39との結合を介する、錯体の形成を検出することを要する。未標識の場合、該抗体および組み換え結合タンパクは、凝集アッセイで利用できることが分かる。更に、未標識抗体は、該モノクローナル抗体または組み換え結合タンパクと特異的に反応する、他の標識された抗体（第二の抗体）、例えば免疫グロブリンに対して特異的な抗体と組み合わせて使用することも可能である。また、該モノクローナル抗体および組み換え結合タンパクは直接標識することができる。広範囲の標識が使用でき、これらは例えば放射性核種、蛍光発光体、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、リガンド（特にハプテン）等を包含する。種々の型のイムノアッセイが当分野で周知である。通常、本発明の該モノクローナル抗体および組み換え結合タンパクは、蛍光アッセイで使用され、そこで該対象の抗体または組み換え結合タンパクは、蛍光分子、例えばフルオレセインイソチオシアネート(FITC)と複合化される。多くのヒトgp39の変異型が細胞表面にまで輸送されないので、Ｔ細胞は、対象から単離され、活性化され、次いで該細胞は、該標識抗体または組み換え結合タンパクが該細胞を透過して、該細胞内に存在する場合には常に、変異gp39と結合できるように、透過性とされる。該モノクローナル抗体の細胞内gp39との結合および該細胞表面におけるCD40の可溶性型との非結合性は、該細胞表面に対して、該gp39分子の局在化を阻止している、ヒトgp39におけるある点変異の存在を立証している。これを、ヒト疾患、例えばX-結合高IgM 症候群と関連付けることができる。結合抗体の存在は、過剰の標識抗体または結合タンパクを洗い流した後に、蛍光活性化細胞選別により検出できる。当業者には周知の他の公知の技術を利用することも可能である。溶液中または活性化Ｔ細胞上での変異ヒトgp39分子の存在を検出するための、該抗体および組み換え結合タンパクの組成物と共に使用する、キットを提供することもできる。かくして、本発明の該抗体および組み換え結合タンパク組成物は単独で、または他の特異的にヒトgp39変異体と結合する抗体との組み合わせで、通常凍結乾燥した状態で提供することができる。本発明の標識と複合化された、または複合化されていない抗体および組み換え結合タンパクは、バッファー、例えばトリス(Tris)、燐酸塩、炭酸塩等、安定剤、殺生物剤、不活性タンパク、例えばウシ血清アルブミン等と共に、該キットに含められる。一般的に、これらの物質は、活性抗体の量を基準として、約５重量％未満の量で存在し、かつ通常は再度該抗体濃度を基準として、少なくとも約0.001 重量％なる全量で存在する。しばしば、該活性成分を希釈するための不活性な展開剤または賦形剤を含むことが望ましく、ここで該賦形剤は全組成物基準で、約１〜99重量％の範囲で存在できる。該モノクローナル抗体または組み換え結合タンパクと結合できる第二の抗体を使用する場合、該第二の抗体は、通常別のバイアル中に存在するであろう。該第二の抗体は、典型的には標識と複合化され、かつ上記処方と類似の様式で処方される。本発明のモノクローナル抗体、特に該組み換え結合タンパク、単鎖抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体は、例えば免疫応答（即ち、自己免疫応答またはアレルギー反応）を変調するのに有効な、一定量の結合タンパクを、製薬上許容される担体と共に含有する薬理組成物の成分として組み込むことができる。製薬上許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）も、本発明の薬理組成物に配合することができる。このような組成物は、ヒトgp39に対して特異的な単一のモノクローナル抗体または組み換え結合タンパクを含むことができる。また、薬理組成物は、他の生物学的に活性な分子、例えばリンホカイン類、サイトカイン類、他のモノクローナル抗体類または融合タンパク類（即ち、CD28-Ig 、CTLA4-Ig）を含むことができる。本発明の該モノクローナル抗体、組み換え結合タンパクおよびその薬理組成物は、特に経口または非経口投与するのに有用である。好ましくは、本発明の薬理組成物は非経口経路、即ち皮下、筋肉内または静脈内投与することができる。かくして、本発明は、非経口投与用の組成物を提供し、該組成物は、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された該モノクローナル抗体または組み換え結合タンパクの溶液を含む。種々の水性担体が使用でき、その例は水、緩衝水、マルトース、0.4%塩水、0.3%グリシン等である。これらの溶液は無菌であり、かつ一般的には粒状物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌できる。該組成物は、生理的条件に近づけるのに必要な、製薬上許容される補助物質、例えばpH調節剤および緩衝剤、毒性緩和剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含むことができる。これら処方物中の、抗体または組み換え結合タンパクの濃度は、広範囲、即ち約0.5%未満、通常は約1%または少なくとも約1%から、15または20重量％程度までの範囲で変えることができ、また主として流体の体積、粘度等、好ましくは選択された特定の投与経路に基づいて選択されるであろう。かくして、筋肉内注射用の典型的な薬理組成物は、１mlの滅菌緩衝水と、約50 mgのモノクローナル抗体とを含むように製造することができた。静脈内注入用の典型的な組成物は、例えば250 mlの滅菌リンゲル溶液と、150 mgのモノクローナル抗体または組み換え結合タンパクとを含むように製造できた。非経口投与用の組成物を調製する実際の方法は、公知であるか、当業者には明らかであり、例えばレミントンズファーマシューティカルサイエンス(Remington's Pharmaceutica l Science)，第15版，メックパブリッシング社、イーストン、ペンシルバニア(1 980)に、より詳細に説明されている。これを本発明の参考文献とする。本発明のモノクローナル抗体および組み換え結合タンパクは、保存のために凍結乾燥でき、使用前に適当な担体で再生できる。当業者は、凍結乾燥および再生が種々の程度で抗体活性の喪失に導く可能性があり、かつこれを補償するために使用濃度を調節する必要があることを理解するであろう。本発明の薬理組成物は、CD40／gp39相互作用を阻止するという、インビボでの用途がある。この相互作用の遮断は、T-細胞依存性抗原に対する一次および二次抗体の応答およびこれら抗原に対して特異的な抗体の産生の両者を制限する。従って、該モノクローナル抗体、抗原結合フラグメント、および組み換え結合タンパクは、Ｂ細胞の活性化を阻害して、自己免疫疾患（即ち、乾癬、リウマトイド関節炎、全身紅斑性狼瘡、真正糖尿病等）、アレルギー性応答、器官拒絶反応または移植片−宿主疾患を緩和もしくは阻止するのに使用できる。本発明の組成物は、また検出可能なマーカーで標識した場合には、gp39を発現する腫瘍の像形成のために使用できる。治療剤と複合化、あるいは治療薬との融合タンパクとして使用する場合には、本発明のモノクローナル抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクは、該治療薬を腫瘍細胞に誘導するのに利用することも可能である。本発明の薬理組成物は、またインビボで使用して、CD40／gp39相互作用を阻害するのに利用できることも分かっている。この相互作用の遮断は、T-細胞依存性抗原に対する一次および二次抗体の応答およびこれら抗原に対して特異的な抗体の産生の両者を制限する。以下、本発明を実施例により説明する。この実施例部分は、本発明の理解を助けるために与えられるのであり、以下に記載される請求の範囲に示されたような本発明を何等制限するものではない。実施例１：gp39に対して特異的なモノクローナル抗体の生成および初期特徴付け −融合Ｉ A. 免疫化６〜８週齢の雌BALB/cマウスを、100 μl の完全フロインドアジュバント中の 30μg のgp39-CD8(sgp39，ホーレンボウ(Hollenbaugh)等，EMBO J.，1992，11:4 313-4321)により、腹腔内経路で初期免疫化した。約２週間後、該マウスに、ビヒクルとして不完全フロインドアジュバントを使用した以外は同様にして、該融合タンパクを注入した。３週間後に、100 μl の燐酸緩衝塩水(PBS)中の23μｇのsgp39 で、該マウスを、静脈内予備−融合追加免疫注射した。 B. 融合該予備−融合追加免疫の３日後に、脾臓およびリンパ節（腋窩、膝窩、鼠径部および腸間膜）を収穫した。これらを外科用ナイフで小片に切断し、次いで不完全イスコフ培地（それぞれ最終濃度100U/ml および100 μg/mlのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した、イスコフの改良ドゥルベコ培地）の存在下で顕微鏡のスライドグラスの艶消しガラス端部間で穏やかに圧縮して、連結組織からリンパ細胞をばらした。この懸濁液を穏やかにピペットで処理して、細胞を相互にばらばらにし、次に該懸濁液をセルストレイナー(cell strainer; ファルコン(Falcon)2350)に通し、連結組織デブリスの塊を除去した。この細胞懸濁液を2 00gにて10分間の遠心処理により２回洗浄し、次いで該細胞ペレットを不完全イスコフ培地に再懸濁した。洗浄後、トリパンブルー排除試験により、全生存白血球数を測定した。この融合手順は、レーン(Lane)等，1986(Methods Enzymol.，121:183-192)の方法に基づいて実施した。対数成長期にあるミエローマ細胞(X63-Ag8.653; カーニー(Kearney)等，J．Immunol.，1979，123:1548-1550)を、200gにて５分間の遠心処理により２回洗浄し、次いで得られた細胞ペレットを不完全イスコフ培地に再懸濁した。次に、該細胞を、50mlのプラスチック遠心管中で、ミエローマ細胞対白血球の比1:4 にて、該洗浄した白血球と混合し、200gにて10分間遠心処理した。該培地の吸引除去後、該遠心管を、該細胞ペレットが、残りの少量の培地中に再懸濁されるまで、軽く叩いた。該管を37℃の水浴中で１分間インキュベートした後、1.5 mlの新たに調製した37℃のポリエチレングリコール−ジメチルスルホキシド溶液[50%(w/v)のコダック(Kodak)1450ポリエチレングリコール、5%(v /v)のジメチルスルホキシドおよび45%(v/v)の、カルシウムまたはマグネシウムを含まない燐酸緩衝塩水、pH8.0]を、45秒間かけて、37℃の水浴中で該管を定速で攪拌しつつ、該細胞に添加した。この融合混合物を、次いで37℃の完全イスコフ培地（過剰の2mM L-グルタミンおよび15%(v/v)の子牛血清(FCS)を補充した不完全イスコフ培地）50mlで、初めの30秒間は３ml、次の30秒間は９mlおよび最後の30秒間に残部を添加するというタイムスケジュールに従って90秒間かけて希釈した。この管を37℃にて10分間インキュベートし、その後200gにて５分間遠心処理し、上澄を吸引除去し、得られた細胞を120 mlのハイブリドーマ培地〔ハイポキサンチン(1x10^-4M なる最終濃度)、アミノプテリン(最終濃度4x10^-7M)、チミジン(最終濃度1.6x10^-7M)および10%(v/v)のハイブリドーマクローニング因子(ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim))を補充した完全イスコフ培地〕中に再懸濁した。この細胞懸濁液を、６枚の96−ウエルプレートに塗布(200μl/ウエル)した。塗布密度はウエル当たり243,000 全細胞（予備−融合）であった。ウエルには、融合後３および５日目に、該上澄の半分を新たなハイブリドーマ培地と交換することにより飼育し、８日目に抗−gp39特異的抗体の存在につきアッセイした。 C. スクリーニング成長中の細胞を含む、細胞培養ウエルからの上澄を、まず以下のようにして該 gp39タンパク免疫原との反応性につきスクリーニングした。ダイナテックイムロン(Dynatech Immulon)2 EIAプレートを、0.05Ｍの炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウムバッファー(pH9.6)中の、１μg/ml(100μl/ウエル)の抗体53-6(ラット抗 −マウスCD8，ATCC TIB 105)で被覆した。このプレートを封止し、一夜４℃にてインキュベートした。以下の全工程は室温にて実施した。被覆剤を除去し、ウエルを遮断剤〔試験片希釈剤(ジェネティックシステムズ社(Genetic Systems Corp.),シアトル，WA),脱イオン水中に1:10の比率で希釈したもの〕で１時間遮断した。遮断剤を除去し、sgp39 タンパクを含有し、2%FCS を含有する完全イスコフ培地（2%FCS-イスコフ）中に1:4 の比率で希釈したCOS 細胞上澄を、添加(1 00μl/ウエル)し、１時間インキュベートした。融合タンパクを除去し、該ウエルを、200μl のPBS-ツイーン(Tween)(0.05%(v/v)のツイーン20を含有するPBS) で１回洗浄した。次いで、細胞培養上澄を、添加(50 μl/ウエル)し、１時間インキュベートした。この細胞培養上澄を除去し、該ウエルをPBS-ツイーンで１回洗浄した後、遮断剤で1:100,000 に希釈した、西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP )標識した山羊抗−マウスIgG(ジャクソンイムノロジカルラボラトリーズ(Jackso n Immunological Laboratories))を添加し、次いで１時間インキュベートした。過剰の標識抗体を除去し、該ウエルを３回PBS-ツイーンで洗浄した。次に、0.01 5%の30% H₂O₂を含有する、pH5.5の、0.1Mクエン酸バッファー中に1:100の比で希釈した、100 μl/ウエルのテトラメチルベンジジン(ジェネティックシステムズ社(Genetic Systems Corp.))を添加した。プレートを、15分間インキュベートし、反応を3Nの硫酸溶液(50 μl/ウエル)の添加により停止させた。光学密度を450 /630 nmにて、バイオ−テックインスツルメンツ(Bio-Tek Instruments)EL312 マイクロプレートリーダー(Microplate Reader)で測定した。次いで、sgp39 との結合について正であることが分かっているこれらの細胞培養上澄を、CD72-CD8融合タンパク(sCD72)との結合につきテストして、該融合タンパクのマウスCD8 部分ではなく寧ろgp39に対して特異的な抗体について評価した。sCD72 をコードする該キメラ遺伝子の説明およびCOS 細胞内での一時的な該融合タンパクの発現は、ホーレンボウ等，1992（これ全体を本発明の参考文献とする）に記載されている。sCD72 に対する結合についてのELISA アッセイは、sC D72 を含有する希釈されていないCOS 細胞上澄を、sgp39 の代わりに使用したことを除き、sgp39 につき上記したものと同等であった。 sgp39 とは反応性であるが、sCD72 とは反応性を示さない全ての上澄を、次に CD40−Ig融合タンパクのsgp39 との結合を阻害する能力につきテストした。簡単に言えば、ダイナテックイムロン(Dynatech Immulon)2 EIAプレートを、上記のようにして抗体53-6で被覆した。これらのウエルを遮断し、上記のようにして洗浄し、2%FCS-イスコフ培地中に1:4 の比で希釈した、sgp39 含有COS 細胞上澄を添加(100μl/ウエル)し、１時間インキュベートした。該sgp39 を除去し、該プレートを200 μl のPBS-ツイーンで洗浄した。次いで、培養上澄を添加(50 μl/ ウエル)し、１時間インキュベートし、除去し、該ウエルを１回PBS-ツイーンで洗浄した。精製したCD40−Ig融合タンパク(EP 555880)を、次に2%FCS-イスコフ培地中に２μg/mlまで希釈し、全ウエルに添加(50 μl/ウエル)し、該プレートを１時間インキュベートした。過剰の融合タンパクを除去し、該ウエルを再度１回PBS-ツイーンで洗浄した後、遮断剤で1:10,000に希釈した、HRP 標識した山羊抗−マウスIgG(ジャクソンイムノロジカルラボラトリーズ(Jackson Immunologic al Laboratories))を添加(50 μl/ウエル)した。室温で１時間インキュベートした後、該HRP 標識抗体を除去し、該プレートを３回PBS-ツイーンで洗浄した。結合したHRP 標識試薬の説明および得られる光学密度の測定は上記のELISA アッセイに記載されたものと同じであった。 D. クローニング幾つかのウエルがgp39に対して特異的な抗体を含み、かつELISA においてgp39 とそのリガンドCD40との相互作用を阻害することが分かった。次いで、これらのウエルにて増殖した細胞をクローニングし、付随的なスクリーニング基準にかけた。クローニングは、「ミニ−クローニング(mini-cloning)」手順で開始したが、この手順においては、指定されたマスターウエルからの細胞を、96ウエルの平底細胞培養プレート内に、ウエル宛て10〜20細胞なる密度にて塗布した。各マスターウエルに対して、１または２つのプレートで、10%(v/v)のハイブリドーマクローニング因子（クローニング培地）を補充した完全イスコフ培地中で、200 μl/ ウエルなる体積にて育成した。細胞は７または８日間培養し、この時点で上澄を再度gp39反応性およびCD40−Igとgp39-CD8融合タンパクとの結合を阻害する能力につき、ELISA(上記の)によりテストした。これらの基準を満足した各ミニクローニング群中のウエルのうちの１ウエルをクローニングした。細胞を選択したウエルから取り出し、各２つのウエルにつき１細胞なる計算上の密度を与えるような、クローニング培地中での濃度まで希釈した。該細胞を、２種のハーフエリア 96ウエル細胞培養プレート（コスター(Costar)中に、100または150 μl/ウエルなる体積で塗布した。培養の４または５日後に、該ウエルを倒立顕微鏡で調べ、単一のクローンを含むウエルをマークした。培養の更に３〜４日後に、全ウエルからの上澄を、gp39 反応性（上記のELISA 法によるgp39-CD8融合タンパクの検出）およびCD40−Igの gp39-CD8との結合を阻害する能力（上記ELISA 法による）についてテストした。 gp39-CD8と反応性であり、CD40−Igとgp39-CD8との相互作用が遮断され、単一のクローンを含むものとしてマークされたウエル由来の上澄を、更にジャーカットＴ細胞系との結合能力およびCD40−Ig融合タンパクのこれら細胞との結合を遮断する能力について検査した。該ジャーカットＴ細胞系は構造的にその表面上でgp 39を発現する（BMS-10，R.ミッター(Mittler),ブリストルマイヤースキブ(Brist ol-Myers Squibb)）。後者の２つの基準を満たすクローンを更なる研究のために選択した。抗体のBMS-10細胞との結合は、経口細胞分析により測定した。簡単に説明すれば、250,000 個のBMS-10細胞を計数して、各管に添加し、250gにて５分間遠心処理した。培地を吸引除去し、ELISA によりgp39-CD8と反応性であることが分かった抗体を含む各上澄100 μｌを管に添加した。コントロールは培地のみ、または負のコントロールマウスモノクローナル抗体を含む培地を含むものであった。この混合物を氷上で30分間インキュベートし、次いで２mlの2%FCS-イスコフ培地を添加した。これらの管を250gにて５分間遠心処理し、上澄を除去した。FITC標識したF(ab')₂山羊抗−マウスIgG F(ab')₂(ジャクソンイムノロジカルラボラトリーズ)を2%FCS-イスコフ培地で1:500 に希釈し、100 μｌを各管に添加した。氷上で30分間インキュベートした後、細胞を１mlの2%FCS-イスコフで２回洗浄し、 250 μｌの2%FCS-イスコフ培地中に再懸濁し、次いでベクトンディッキンソン(B ecton Dickinson)FACSカン(FACScan; 登録商標)上で分析した。 CD40−IgのBMS-10細胞に対する結合を遮断する能力の評価においては、未結合抗−gp39抗体を洗い流した後に、10% FCS-イスコフ培地中に20μg/mlで希釈した CD40−Igを、100 μl/管にて添加したこと以外は、上記手順を利用した。氷上で 30分間インキュベートした後、２mlの2%FCS-イスコフ培地を各管に添加し、該管を250gにて５分間遠心処理し、上澄を吸引して、未結合のCD40−Igを除去した。次いで、FITC−標識した抗−マウスIg試薬の代わりに、適当に希釈したPE- またはFITC標識したF(ab')₂山羊抗−ヒトIgG(ジャクソンイムノロジカルラボラトリーズ)を各管に添加して、結合CD40−Igを検出した。あるいはまた、該アッセイを完了し、該細胞を上記のように分析した。上に概説した手順に従って、全体で23種のマウス抗−ヒトgp39モノクローナル抗体を誘導した。該モノクローナル抗体の各々を、イソタイプ化(isotyped)してそのIgG サブクラスを同定し、更にそのgp39を識別する能力を特徴付けした。該モノクローナル抗体間のエピトープ特異性における差異の分析をも、該抗体のＴ細胞依存性Ｂ細胞増殖および免疫グロブリン産生の阻害能力の分析と同様に実施した。実施例２：gp39に対して特異的なラットモノクローナル抗体の生成および初期特徴付け−融合５ A. 免疫化４週齢の雌ルイス(Lewis)ラットを、製造業者の指示通りに、50μｇのgp39-CD 8融合タンパク（ホーレンボウ等）を、リビ(Ribi)アジュバント(リビイムノケム (Ribi Immunochem))中に全体が400 μｌとなるように懸濁したもので免疫化した。この体積のうちの200 μｌを、腹腔内(IP)投与し、残りの体積を２箇所の皮下部位に等しく分配した。３週間後に、この動物を、50μｌのgp39-CD8融合タンパクを含有する300 μｌのPBS でIP経路で免疫処理した。その１カ月後に、該ラットを再度30μg のgp39-CD8融合タンパクを含有する300 μｌのPBS でIP経路で免疫処理した。3.5 週間後に、300 μｌのPBS 中の30μｇのgp39-CD8で、該マウスを、静脈内予備−融合追加免疫注射した。 B. 融合およびスクリーニング３日後に、以下に記載する変更を除き、実施例１に記載した融合Ｉと同様にして、収穫、調製および該ラット脾臓およびリンパ節細胞とマウスミエローマ細胞との融合を実施した。該ラットの白血球を、G⁴¹⁸耐性遺伝子で形質転換され、H1 0 と命名された、X63-Ag8.653 マウスミエローマ細胞系の変異型と融合した。各融合体の細胞懸濁液を７枚の96−ウエル細胞培養プレートに、ウエル当たり236, 000 個の全細胞（予備−融合体）なる塗布密度にて、播種し、最終濃度0.25mg/m l のジェネチシン(geneticin)を補充したハイブリドーマ培地中で培養した。融合39-5の細胞培養ウエル由来の上澄を、以下の２つのの点で変更した実施例１に記載のgp39-CD8およびCD72-CD8融合タンパクELISA 法を利用して、gp39との特異的反応性につきスクリーニングした。即ち、116-13.1(ATCC HB 129)から製造した濃度５μg/mlの、マウス抗−マウスCD8 モノクローナル抗体を、該53-6抗体の代わりに、該融合タンパクの捕獲抗体として使用し、かつ希釈率1:20,000の HRP標識マウス抗−ラットIgG(Fc特異的)(ジャクソンイムノロジカルラボラトリーズ)を、HRP 山羊抗−マウスIgG の代わりに、結合した抗−融合タンパク抗体の検出のためのトレーサ抗体として使用した。４個のウエルが、gp39-CD8融合タンパクに対して特異的であり、かつCD72-CD8融合タンパクに対して非特異的である抗体を含むことが分かった。これらのうち、只一つの抗体(39-5.6E9)のみが、前に記載されたフローサイトメトリーにより調べた場合に、gp39⁺細胞系BMS-10 を染色することが分かった。このウエルライブラリーの上澄については、引き続き以前に記載された遮断ELISA 法を利用して、CD40−Igのgp39-CD8との結合を完全に遮断し、かつフローサイトメトリーにより調べた場合に、CD40−IgのBMS-10 細胞に対する結合を完全に阻害することが決定された。上記特徴全てをもつクローン細胞系を、以前に記載されたミニークローニング／クローニング法により得た。実施例３：gp39に特異的なモノクローナル抗体の生成と初期特徴付け−融合７ A. 免疫化６〜８週齢の雌BALB/cマウスを、完全フロインドアジュバント中の30μg のgP 39-CD8融合タンパク全量を４つのサイトに皮下投与することにより初期免疫化した。約２および５週間後、該マウスに、抗原用ビヒクルとして不完全フロインドアジュバントを使用した以外は同様にして、それぞれgp39-CD8融合タンパク30μ g および25μg を注入した。初期免疫化の５カ月後に、不完全フロインドアジュバント中の融合タンパク10μg を、このマウスに腹腔内注射した。その２週間後に、PBS 中の30μｇのgp39-CD8融合タンパクで、該マウスに、静脈内予備−融合追加免疫注射した。 B. 融合およびスクリーニング３日後に、該細胞を融合するのに僅かに１mlのポリエチレングリコールを使用したことを除き、融合39-1と同様にして、収穫、調製および該マウス脾臓およびリンパ節細胞とマウスミエローマ細胞との融合を実施した。この融合により得た細胞懸濁液を10枚の96−ウエル細胞培養プレートに、ウエル当たり183,000 個なる全細胞数（予備−融合）の塗布密度にて播種した。ウエルには、融合後３日および６日目に、該上澄の半分を新たなハイブリドーマ培地で交換することにより栄養供給し、９日目に抗−gp39特異的抗体につきアッセイした。上澄を、まずELISA を基本とする細胞結合アッセイで、抗−gp39特異性についてスクリーニングした。ファルコン(Falcon)またはコスター(Costar)96- ウエル平底プレートを、pH8.0 の0.1M重炭酸ナトリウムで希釈したセル−タック(Cell- Tak)(コラボラティブバイオメジカルプロダクツ(Collaborative Biomedical Pro ducts))3.5 g/cm²で被覆した。プレートを、室温にて30分間インキュベートした。未結合セルータックを吸引し、該ウエルを150 μl/ウエルの蒸留水で２度洗浄した。BMS-10細胞を遠心処理し、血清を含まないイスコフ培地中に2x10⁶細胞／m lなる濃度で、再懸濁した。この細胞懸濁液15μｌを各ウエルに添加し、該プレートを250gにて５分間遠心処理した。次に、該プレートを室温にて30分間インキュベートし、その後該培地を、８チャンネルをもつマニホルド（ドゥルモンド(D rummond)）を使用して該ウエルから吸引した。次に、培養上澄をアッセイプレートに50μl/ウエルにて塗布し、該プレートを１時間インキュベートした。上澄を吸引し、かつ該プレートを、1% FCS含有PBS 150 μl/ウエルで１度洗浄した。5% FCS含有PBS 中に希釈した、HRP 標識したラット抗−マウスIgG(ザイメッド(Zym ed))を50μl/ウエルにて添加した。室温での１時間のインキュベートの後、HRP 標識した試薬を除去し、該プレートを、1%のウシ胎児血清を含有するPBS で３回洗浄した。結合したHRP 標識試薬の説明および得られる光学密度の測定は、上で詳述した他のELISA アッセイと同様であった。第二のスクリーニングとして、上記のBMS-10細胞ELISA において正のウエル由来の上澄を、上記の各融合タンパクELISA 法を利用して、sgp39 およびsCD72 に対する反応性につきアッセイした。このアッセイにおいては、HRP標識したラット抗−マウスIgG(ザイメッド(Zymed))を、前に記載したアッセイで使用した、山羊抗−マウスIgG と置換した。次いで、gp39正のBMS-10細胞との特異的反応性の確認は、以前に記載されたような間接的免疫蛍光法およびFACS分析を利用して実施した。また、上澄を、以前に記載された遮断ELISA 法を利用した、sgp39 に対するCD40−Igの結合を阻害する能力につきテストした。上澄を更に、１つの点における変更を除き、gp39-CD8 ELISAを利用して、そのイソタイプについて分析した。各上澄を、４回づつテストし、次に結合した抗−gp39抗体を、４種の異なる HRP 標識抗−マウスイソタイプ特異的試薬（ザイメッド(Zymed),それぞれラット抗−マウスIgG1、IgG2a 、IgG2b 、#04-6120、04-6220 および04-6320 並びにウサギ抗−マウスIgG3、#61-0420）により追跡した。この全体としての解析は、細胞表面で発現されたgp39に対して特異的な抗体を含み、かつCD40−Igのgp39-CD8 に対する結合を遮断し、IgG2a イソタイプであった一つのウエルを同定した。39 -7.3E12、39-7.7.7G4および39-7.4C1と命名されたウエル由来の適当な抗体産生細胞を、前に記載されたようにミニクローニングし、かつクローニングした。実施例４：gp39に特異的なモノクローナル抗体の生成と初期特徴付け−融合９ A. 免疫化６〜８週齢の雌BALB/cマウスを、完全フロインドアジュバント中の30μg のgp 39-CD8融合タンパク全量を４つのサイトに皮下投与することにより初期免疫化した。約２、５、28および30.5週間後、該動物を、不完全フロインドアジュバント中のgp39-CD8融合タンパクそれぞれ30μg 、25μg 、25μg および25μg により同様に免疫化した。３週間後に、該動物にPBS 中の35μｇのgp39-CD8による、IV 予備−融合追加免疫注射した。 B. 融合およびスクリーニング３日後に、ミエローマ細胞対白血球の比を1:4 とする代わりに1:3 としたこと以外は、融合39-1と同様にして、収穫、調製および該マウス脾臓およびリンパ節細胞と、X63-Ag8.653 マウスミエローマ細胞との融合を実施した。この融合により得た細胞懸濁液を15枚の96−ウエル細胞培養プレートに、ウエル当たり187,00 0 個なる全細胞数（予備−融合）の塗布密度にて塗布した。融合39-9の細胞培養ウエル由来の上澄を、前に記載されたBMS-10細胞結合ELIS A 法を利用して、抗−gp39抗体についてスクリーニングした。次いで、このスクリーニングにおいて正の全ての上澄を、以前に記載された遮断ELISA 法を利用して、CD40−Igのgp39-CD8に対する結合を遮断する能力につき検査した。これら両基準について正の多数のウエルが記録された。以前に同定された抗−gp39モノクローナル抗体のgp39エピトープ特異性と異なる特異性をもつ抗体を含む、これらのウエルを同定するために、該CD40−Ig遮断 BMS-10正の上澄の各々を、融合Ｉからの抗体のエピトープ分析について前に記載された一連のgp39変異タンパクに関して、ELISA によりスクリーニングした。このスクリーニングは、39-9.27 、39-9.68 、39-9.246および39-9.274を包含する幾つかのウエルを同定し、これらについては調べた変異体の何れに対する結合についても、有意な喪失は観測されなかった。更に、39-9.11 と命名された一つのウエルは、大幅に減じられたK143/Aおよび特にN180/A変異体に対する結合性をもつことが明らかにされ、これは以前に見られなかったパターンであった。また、このアッセイにおいて、これら上澄の各々が天然のsgp39 を識別するが、該負のコントロールsCD72 融合タンパクを識別しないことが示された。これら５つのウエルに対して、適当な抗体分泌クローン細胞系を、前に記載されたような限界希釈クローニング法により得た。引き続き行った、該細胞系各々由来のクローン化したモノクローナル抗体の、フローサイトメトリーによる分析は、これらが全てBMS-10細胞系と特異的に反応し、かつ全てがCD40−Igとこの細胞系との相互作用を遮断することができることを示した。これらモノクローナル抗体の各々は、引き続き前に記載されたようにイソタイプ化され、39-9.36(マウスIgG2b)を除く全てはマウスIgG1であった。実施例５：抗−gp39モノクローナル抗体の特徴付け A. イソタイプ化上記手順により得たマウスモノクローナル抗体の各々をイソタイプ化して、イソタイプAb−スタットキット(Isotype Ab-Stat Kit: 登録商標(サンスタットメジカル社(SangStat Medical Corporation)，メンローパーク,CA))またはイソストリップ(ISOStrip:登録商標)キット(ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mann heim))を使用し、製造業者の指示に従って、IgG サブクラスを同定した。融合５ (39.5.6E9)で得たラットモノクローナル抗体のイソタイプは、ラットIgG1、IgG2 a 、IgG2b およびIgG2c(ザイメッドラボラトリーズ(Zymed Laboratories)，CA) に対して特異的な、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識モノクローナル抗体各々を希釈率1:1000にてトレーサー抗体として使用したことを除き、上記のgp39-CD8融合タンパクELISA 法を利用して設定した。39.5.6E9と結合する唯一のトレーサー抗体は、抗−ラットIgG2a 抗体であり、このことは該モノクローナル抗体がIgG2 a の一つであることを示している。融合７で得たモノクローナル抗体を、一つの変更を除き、sgp39 ELISA 法を利用して、そのイソタイプについて分析した。各上澄は４回テストし、次いで結合した抗−gp39抗体を、４種の異なるHRP-標識抗−マウスイソタイプ−特異的試薬（ザイメッド(Zymed),それぞれラット抗−マウスIgG1、IgG2a またはIgG2b 並びにウサギ抗−マウスIgG3）により追跡した。本発明のモノクローナル抗体のイソタイプを第１表に示す。 B. ウエスタンブロットおよび免疫沈降ウエスタンブロットによる評価を、２つの異なる手順に従って実施した。その一つにおいては、ローディング(loading)染料[250mMのトリス(Tris)，0.002%(v/ v)のブロモフェノールブルー、40%(v/v)のグリセロール、pH6.8、15μl の20%SD S、10μl の2-メルカプトエタノール〕300 μl 中の、精製されたsgp39 融合タンパク1.5 μｇを、12% SDS-ポリアクリルアミドゲル上で、150Vにて１時間電気泳動させた。分離したタンパクを、バイオ−ラド(Bio-Rad)ミニ−ブロット転写装置を、製造業者の指示に従って使用して、ニトロセルロース紙に転写した。この転写後、該ニトロセルロースを室温下で乾燥させ、次いで各レーンを、幅広の縦長ストリップとして該シートから切り出し、これらをバイオ−ラド(Bio-Rad )シャロウウエル装置のウエル中にそれぞれ配置した。該ストリップを、5%(w/v) の脂質を含まない乾燥ミルクを含有するトリス緩衝塩水(Tris Buffered Saline) (TBS-T)の遮断溶液10ml中で、平面ロッカー(rocker)上で室温にて２時間インキュベートした。インキュベート後、該遮断溶液を吸引し、該ストリップをTBS-T で２回濯いだ。抗−gp39モノクローナル抗体をTBS-T中に約12μg/mlなる濃度まで希釈し、３m lの抗体溶液を、ストリップ当たり１抗体で、室温にて２時間ロッキングしつつ各ストリップに添加した。過剰の抗体溶液を、各ウエルから吸引除去し、該ストリップを10mlのTBS-T で５回洗浄した。洗浄後、HRP 山羊抗−マウスIg（タゴ(T ago)）のTBS-T 中の1:3,000 希釈液10mlを各ウエルに添加した。これらストリップを室温にて２時間インキュベートし、次いで５回上記のように洗浄した。結合したHRP 複合化抗体の検出は、ECL 検出試薬（アマーシャム(Amersham)）を、製造業者の指示に従って使用して実施した。この検出溶液を吸引除去し、該ストリップ上の過剰の液体を、ペーパータオル上に、該ストリップの端部を触れることにより除去した。該ストリップを、プラスチック製PAGEプロテクタ内に配置し、該プロテクタを封止した。次に、この封止したプロテクタを、種々の期間 (1秒乃至15分)オートラジオグラフィーフィルムに暴露し、引き続き該フィルムを加工した。第二の手順において、sgp39 でトランスフェクションしたCOS 細胞由来の使用済み上澄200 μｌを、25μｌのローディング染料で希釈し、100℃にて５分間加熱し、氷上で冷却し、10% SDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。分離されたタンパクをバイオ−ラド(Bio-Rad)PVDF（登録商標）膜に、ホーファー( Hoeffer)セミ−ドライ転写装置を、製造業者の指示に従って使用して転写させた。該分離タンパクを該膜に転写した後、該膜を室温にて乾燥させ、次いで上記のような手順に従って、該膜を染色した。また、抗−gp39抗体を、トランスフェクションされたCOS 細胞または活性化Ｔ細胞の何れかから、gp39を免疫沈降する能力につきテストした。簡単に説明すれば、COS 細胞を、約70% の密集率にて、10枚の150 mmプレートを使用して、DEAE −デキストラン手法により、ヒトgp39をコードするcDNAでトランスフェクションした。翌日、該COS 細胞をトリプシン処理し、８個のT-150cm²フラスコ内に再塗布した。培地を一夜インキュベートした後に除去し、該細胞を、システインまたはメチオニンを含まない改良イーグル培地（ギブコセレクト−アミンキット(Gib co Select-amine Kit)）で一度洗浄し、また0.02mCi/mlのトラン(Tran)³⁵S標識( ICN，コスタメサ，CA)を含有する新鮮なシステイン／メチオニンを含まない培地を添加し、該細胞を一夜インキュベートした。翌日、該培地を除去し、該細胞を PBSで一度洗浄し、１nMのフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)および2 5μg/mlのアプロチニンを含有する溶解バッファー(50 mMのトリス(Tris)、150mM のNaCl、1%のNP-40 、0.25% のデオキシコレート)２mlを、各フラスコに添加した。該フラスコを氷上に10分間置き、その後該バッファーを除去した。アリコートを調製し、４℃にて、最大速度で２分間、小型遠心機で遠心処理した。上澄をプールし、-70 ℃にて保存した後、免疫沈降させた。免疫沈降は、氷上のトランスフェクションされたCOS 細胞溶解物を解凍し、全体積を10個のアリコートに分割することにより実施した。８個の管に、10μgの抗−gp39抗体を添加し、一方で１個の管には正のコントロールとしてCD40を添加し、またもう一つの管には負コントロールとして、沈殿剤を添加しなかった。サンプルを氷上で４時間インキュベートし、その後100 μｌのプロテインＧセファロースFF(Protein G Sepharose FF:登録商標；ファルマーシア(Pharmacia))を各管に添加した。これら管を氷上で１時間インキュベートし、一方で10〜15分毎に混合した。サンプルを小型遠心機中でパルス回転させ、上澄を捨てた。得られたペレットを、冷溶解バッファーに再懸濁し、ペレット化する操作を３回繰り返すことにより洗浄し、次いで冷PBS で１回洗浄した。最後の洗浄後、β−メルカプトエタノールを含み、SDS-を添加した30μｌのバッファーを各管に添加した。サンプルを95℃にて５分間加熱し、パルス回転させ、上澄を12% SDS-ポリアクリルアミドゲル上に適用した。この電気泳動の完了後、該ゲルを水中の10% メタノール、10% 酢酸中に、２時間入れた。次に、このゲルを10% のグリセロール含有アンプリファイ(Amplify: 登録商標)フルオログラフィー試薬（アマーシャム(Amer sham)）中に、15分間入れた。該ゲルを、ファットマン(Whatman)3M 紙上で80℃ にて45分間乾燥し、X-線フィルムに-70 ℃にて１〜７日間暴露した。このアッセイの結果を第１表にまとめた。正の免疫沈降は、該CD40−Igコントロールと同一の分子量におけるバンドの存在により示される。活性化ヒト末梢血Ｔ細胞由来のgp39の放射性免疫沈降は、以下のように実施した。新たなヘパリン処理した全血をPBS で1:1 に希釈し、その40mlを、上記のような10mlのリンホサイトセパレーションメディア(Lymphocyte Separation Media :登録商標)オーガノンテクニカ(Organon Teknika)上に展開させた。該サンプルを220gにて30分間遠心処理した。単離したリンパ細胞をPBS で洗浄し、システインおよびメチオニンを含まず、10% の透析したウシ胎児血清および0.02mCi/mlトラン³⁵Sラベル(Tran³⁵S Label:登録商標)を含有する、改良イーグル培地中に、最終的な細胞密度3x10⁶細胞/ml にて再懸濁させた。細胞は、PMA(10ng/ml)およびイオノマイシン(１μg/ml)の添加により９時間活性化し、その後該細胞をペレット化し、該培地を除去し、該細胞をPMSFおよびアプロチニンを含有する溶解バッファーで溶解した。これら細胞を溶解バッファーと共に10分間氷上でインキュベートした後、該サンプルを小型遠心管に移し、４℃にて２分間遠心処理した。上澄をプールし、更に処理するまで-70 ℃にて保存した。沈降は、トランスフェクションしたCOS 細胞について上記した如く実施し、結果を以下の第１表にまとめた。 C. 抗−ヒトgp39モノクローナル抗体と活性化されたまたは活性化されていない正常なヒトＴ細胞との結合の検討種々の抗−ヒトgp39モノクローナル抗体と、活性化されたまたは活性化されていない正常なヒトＴ細胞との結合を、間接的免疫蛍光法および引き続いてのFACS 分析により評価した。ヒト血液単核細胞(PBMCs)は、全血をPBS で1:1 の比率で希釈し、その25mlを10mlのリンホサイトセパレーションメディア(Lymphocyte Se paration Media)(LSM,オーガノンテクニカ(Organon Teknika))上に展開させ、45 0gにて25分間遠心処理することにより単離した。界面における細胞を集め、PBS で一回洗浄した。Ｔ細胞を、氷上で、５〜10分間、該PBMCs と150-倍のAET-SRBC (0.143M の2-アミノエチルイソチオウロニウムブロミドで処理したヒツジ赤血球 (シグマ(Sigma))と共にインキュベートすることにより単離した。E-ロゼット正のＴ細胞(E-T細胞)を、冷LSM 上に配置し、450gにて25分間遠心処理することにより、残りの細胞から分離した。該ペレット（ロゼットＴ細胞を含む）を集め、該ヒツジ赤血球を、0.83% の塩化アンモニウムで、室温にて５分間処理することにより溶解した。得られたＴ細胞を2%FCS-イスコフ培地中で１回洗浄し、10% FC S-イスコフ培地中で、1-3x10⁶細胞/mlなる密度にて、湿潤した37℃/6% CO₂インキュベータ内で一夜インキュベートした。次いで、10ng/ml のホルボール12- ミリステート13- アセテート(PMA: シグマ(Sigma))および１μg/mlのアイオノマイシン(シグマ(Sigma))の添加により活性化し、更に該細胞を5-6 時間インキュベートした。該Ｔ細胞の一部にはPMAおよびアイオノマイシンを添加せずに、5 -6時間インキュベートした。ここでは、これを非−活性化Ｔ細胞と呼ぶ。これら活性化したおよび活性化されていないＴ細胞上の、該抗−ヒトgp39mAbsの間接的免疫蛍光およびFACS分析は、FITC標識した山羊抗−マウスIgG(ベクトンディッキンソン(Becton Dickinson))を第二工程の試薬として使用したこと以外は、BMS-1 0 細胞上の抗−gp39抗体のFACS分析について上記したように実施した。更に、マウス抗−ヒトCD69モノクローナル抗体（ベクトンディッキンソン(BectonDickins on)）を、該Ｔ細胞の活性化のための正のコントロールとして使用した。このようにして、全ての抗−gp39mAbsを検討した。全てが活性化Ｔ細胞を染色することが分かり、また非−活性化Ｔ細胞とは全く非−反応性であることも示された。実施例６：gp39変異融合タンパクの構築 A. 置換のターゲットとしてのgp39残基の選択 gp39上に変異形成するためのターゲット残基は、細胞外領域gp39の、以前に誘導された比較タンパクモデル（アルフォ等，Cell，1993，72:291-300）、gp39対 TNF-βの構造に基づく配列整合性、および該TNF-β／TNFR錯体構造における、報告された結晶学的接触（バナー(Banner)等，Cell，1993，73:431-445）に基づいて選択された。このgp39モデルのコンピュータグラフィック解析は、シリコングラフィックスインジゴ(Silicon Graphics Indigo: 登録商標)ワークステーションで、インサイトII(Insight II:登録商標)(ビオシムテクノロジーズ社(BIOSYM Technologies Inc.)、サンジエゴ,CA)を使用して実行した。配列を、まずGCG プログラム(ジェネティックスコンピュータグループ社(Genetics Computer Group Inc.),マジソン,WI)を使用して配置し、TNF-β(エック(Eck)等，J．Biol．Chem. ,1992，267:2119-2122)およびTNF-β／TNFR結晶（バナー(Banner)等の上記文献）構造の三次元情報および束縛を考慮して、手動で変更した。 B. gp39変異体の構築診断用制限酵素開裂サイトについての、アミノ酸置換およびサイレント突然変異を、オーバーレイ伸長(overlay extension)PCR プロトコール（ホー(Ho)等，G ene，1989，77:51-59）を利用して、細胞外ドメインをコードするcDNAフラグメントに導入した。該変異可溶性gp39(sgp39)タンパクをコードする該融合遺伝子を、マウスCD8(Lyt 2a)(ホーレンボウ(Hollenbaugh)等，EMBO J.，1992，11:431 3-4321)の細胞外ドメインをコードする、cDNAを含有する哺乳動物発現ベクターに、該PCR 増幅されたgp39細胞外ドメイン変異をサブクローニングすることによって調製した。該gp39構築物に対して使用する該前進および復帰PCR プライマーは、以前に記載されている（ホーレンボウ等の上記文献）。該gp39変異のために使用したPCRプライマーは以下の通りである：該対応する復帰プライマーは、上記配列の復帰コンプリメント(compliment)である。アラニンをコードする基本的な変化は、太字で示されている。付加されたまたは削除された診断制限サイトに下線を施した。 C. 野性型および変異gp39タンパクの製造および特徴付け野性型および変異gp39タンパクは、いたるところに記載されている（ホーレンボウ等の上記文献，1992; ノエル(Noelle)等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A., 89:6550-6554)ように一時的にトランスフェクションされたCOS 細胞から生成した。COS 細胞は、DEAE−デキストランを使用してトランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後に、可溶性野性型gp39または可溶性変異gp39を含有する培養上澄を、収穫し、モノクローナル抗体結合アッセイおよびヒトgp39上のエピトープ特異性を決定するのに使用した。 D. gp39変異タンパクに対するモノクローナル抗体結合についての酵素−結合イムノアッセイウエスタンブロットアッセイの結果は、ヒトgp39-CD8融合タンパク上の少なくとも２つの異なるエピトープが、識別されることを示した。モノクローナル抗体 39-1.29、39-1.52、39-1.61、39-1.77、39-1.93、39-1.106 、39-1.109、39-1.1 24、39-1.134、39-1.156、39-7.7G4、39-9.274、39-9.27、39-7.4C1、39-9.68および39-9.246は、ウエスタンブロットにおいてgp39-CD8と結合することが分かっており、一方で残りの抗体は結合しなかった。生成したモノクローナル抗体により識別されるエピトープを更に定義するために、その各々を、ELISA 法により元のアミノ酸残基の一つがアラニンと置換している、単一のまたは二重の点変異を含む一連のgp39変異タンパクとの結合につきテストした。使用したELISA アッセイは、以下のように実施した。イムロン2 EIA プレートを、100 μl/ウエルの、マウスLyt ２または2.1(融合５については、53-6(ATCC TIB 105)または116.13-1(ATCC HB 129))に対して特異的なモノクローナル抗体の 0.8 μg/ml(0.05Mの炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム，pH 9.6で希釈)溶液で被覆した。これらのプレートを封止し、４℃にて一夜インキュベートした。インキュベート後、未結合抗体を除去し、該プレートを、脱イオン水で1:10に希釈した検体希釈剤（ジェネティックシステムズコーボレーション(Genetic Systems Corporation))で１時間遮断した。遮断剤の除去後、野性型または変異gp39-CD8 融合タンパクもしくは負のコントロールsCD72 融合タンパクを含有する、適当に希釈された（以下を参照）COS 細胞上澄50μl/ウエルを添加した。室温で２時間のインキュベート後、融合タンパクを除去し、該プレートをPBS-ツイーン200 μ l/ウエルで１回洗浄した。gp39−特異的抗体を含有する培養上澄を、10% FCS-イスコフ中に適当に希釈（以下を参照）し、各々を、該gp39またはコントロール融合タンパクを含有するウエルに２回添加（50μl/ウエル）した。コントロールとしては、50μl/ウエルのビオチン処理したラット抗−マウスCD8(以下を参照)を、異なる融合タンパクを含有するウエル各々に添加して、ほぼ等しい量の各融合タンパクが全てのウエル中に存在することを確認した。室温にて２時間のインキュベート後、未結合の抗体を除去し、該プレートをPBS-ツイーンで洗浄した。融合１、７および９由来の抗体に対して、HRP-標識したラット抗−マウスIgG(ザイメッド(Zymed))およびHRP-標識したストレプタビジン(ベクターラボラトリーズ( Vector Laboratories))を、遮断試薬で適当に希釈し、その50μl/ウエルを、それぞれ前に添加された、抗−gp39抗体および抗−マウスCD8 をもつウエルに添加した。融合５由来の抗体に対しては、遮断試薬中に1:40,000なる比率で希釈した、HRP-標識したマウス抗−ラットIgG(ジャクソンイムノロジカルラボラトリーズ )を添加した。室温での１時間のインキュベート後、HRP-標識した試薬を除去し、該プレートを３回PBS-ツイーンで洗浄した。結合したHRP-標識試薬の説明および得られた光学密度の測定は、上で他のELISA アッセイにおいて記載した如くであった。上記アッセイの２つの重要なパラメータは、該異なる融合タンパク各々の同様な量を該アッセイプレート上で使用（即ち、これに結合）したことおよび抗−gp 39抗体の非−飽和濃度を使用して、光学濃度の読みが応答カーブの線形部分の範囲内になるようにしたことを明らかにすることであった。全ウエル中の融合タンパクの量を規格化するために、COS 細胞上澄を含有する各融合タンパクの一連の希釈率を、上記のアッセイで評価し、各々の希釈率を、該応答カーブの線形部分（通常0.3 〜0.9 吸光度単位の範囲内）内の光学密度値を与える、最終アッセイについて選択した。該光学密度値は、ビオチン処理したラット抗−マウスCD8、次いでHRP 標識したストレプタビジンにより追跡した場合に、野性型gp39について観測される値の±10% 以内であった。最終アッセイで使用する上澄を含有する該抗体各々の最適の希釈率は、上記のELISA アッセイにおける、野性型gp39融合タンパクについて、各上澄の周期的希釈を評価することにより測定した。最適の希釈率は、後の２倍希釈が得られる光学密度値の低下を生ずる希釈率として定義された。該最適希釈率およびその２度の周期的な２倍希釈率は、上記のように、各々の融合タンパクについて、最終アッセイで評価した。該抗−gP39mAbs各々の６種の変異sgp39 融合タンパクとの反応性は第２表に示されている。表中の値は野性型につき観測された結合強度に相対的な各変異体の結合強度（％で表示）を示し、また２回の測定の平均値士該平均の標準偏差(SEM )を表す。該アッセイプレート上の種々の融合タンパクの量が、実際に同一（抗- CD8追跡により示されるように）であり、かつ抗−gp39mAbsの非−飽和濃度で達成され（上記のように、通常該最適希釈の２倍希釈）、これらアッセイから得られる唯一のデータが示されている。ウエスタンブロットの結果と組み合わせた、該gp39変異体各々に関する結合プロフィールの全体的類似性に基づいて、該32個の抗−gp39mAbsを12の群に分割した。各組は固有の結合パターンにより特徴付けられ、該パターンは抗体各群の識別されたエピトープが異なっていることを示唆している。mAbs39-1.3、39-1.21 、39-1.25、39-1.63、39-1.122、39-1.123および39-1.138を含む群１は、変異体 E129/AおよびS131/A-T135/A の識別における顕著な欠陥をもつ。これらのmAbsは、また変異体K143/Aに対する幾分低い結合性をも示す。これらのmAbsと変異体Y1 45/A、N180/AおよびF201/A-E202/A との反応性は野性型gp39と類似する。群２は単一のmAb 39-1.59 によって代表される。この抗体は、E129/A、S131/A-T135/A およびK143/Aに対して著しく低い結合性を示す点で、群１の抗体類と類似するが、これが同様に変異体Y145/A、N180/AおよびF201/A-E202/A との幾分弱い反応性をも示す点で異なる。群３(39-1.37および39-1.132)および群４(39-1.124 および39-1.156)の抗体は、これらがE129/A変異体を殆ど識別せず、K143/A変異体に対して著しく低い結合性を示す点で、相互に極めて類似している。これらmAbsと他の変異体との反応性は、野性型のgp39ついて観測された反応性よりも僅かに弱いか、あるいは等価であった。しかしながら、群３および４は明らかに相互に異なっており、これはウエスタンブロット分析にみられる離散性の結果により示されている。該結果において、39-1.37および39-1.132はブロット負であり、一方で3 9-1.124および39-1.156はブロット正である。群５の抗体は、39-1.7、39-1.128 および39-1.26 を包含する。これらは、変異体K143/Aに対して相対的に低い結合性をもつ点において、群３および４のmAbsと類似するが、E129/A変異体の良好な識別性により立証されるように異なっている。これらの抗体の変異体S131/A-T13 5/A、Y145/A、N180/AおよびF201/A-E202/A との結合性は、本質的に野性型gp39 について観測されるものと等価であった。群６はmAbs39-1.52 、39-1.61 、39-1 .77 、39-1.93 、39-1.106、39-1.109および39-1.134を含み、これらは変異体F2 01/A-E202/A との結合性を殆ど完全にもたないことにより、他の抗−gp39mAbsと区別される。更に、これらの抗体は、明白であるが、有意ではない、変異体K143 /Aに対する低い反応性をもつことが明らかにされている。この群の抗体の、パネル中の他の変異体との反応性は、野性型のgp39について観測されたものと類似していた。群７は単一の抗体39-1.29 を含む。このmAb は、殆ど野性型gp39と同程度にK143/A変異体を識別するように考えられること以外は、群６の抗体と極めて類似している。単一の抗体39-7.3E12 が群８を代表する。この抗体は、全ての他の抗体とは、野性型gp39と比較して、K143/A変異体との反応性が僅かに喪失されること以外は、全ての変異体と全く良好に反応した点で、著しく異なっている。〔群９-12 の説明加入〕。群９は単一の抗体39-5.6E9を含む。この抗体は、野性型gp39について観測されたものと同様な、E129/A変異体に対する結合活性を示し、かつ野性型gp39につき観測された活性よりも、幾分低い、変異体S131/A-T135/A 、N180/AおよびF201/A -E202/A に対する結合活性を示す。特にこの群を他の群から区別している点は、 K143/AおよびY145/A変異体に対する、野性型gp39の結合活性と比較した場合に、低い結合活性をもつことである。この抗体は、またウエスタンブロットにおいて gp39と結合することができなかった。抗体39-7.7G4、39-9.27 、39-7.4C1、39-9.68 および39-9.246により具体化される群10は、野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、同等なまたは幾分低い該全変異体に対する結合活性をもつことにより特徴付けられる。該抗体全体は、またウエスタンブロットにおいてgp39と結合できた。群11および12、即ち抗体39-9.11 および39-9.274は、その変異gp39タンパクに対する反応性のパターンにおいて類似するが、ウエスタンブロットにおけるgp39 との結合能力において異なっている。ウエスタンブロットにおいて、抗体39-9.1 1 は、gp39と結合できないが、抗体39-9.274は結合できる。変異gp39タンパクに対するこれら両抗体の反応性パターンは、E129/A、S131/A-T135/A 、Y145/AおよびF201/A-E202/A に対して、野性型gp39のパターンと類似することにより特徴付けられる。この結合活性は、野性型gp39についての結合活性と比較した場合、変異体K143/Aに対しては幾分低く、変異体N180/Aについては低い。集合的に、該ウエスタンブロットの結果と組み合わせた、該gp39変異体との反応性のデータは、少なくとも12個の異なる識別プロフィール、従って32の抗−ヒトgp39mAbs中の、12の異なるエピトープ特異性を基底する。上で定義した如く、群１、２、３、５、８、９および11のmAbsは不連続または本来的に立体配座性のエピトープを識別し、一方群４、６、７、10および12におけるこれらの特異性は連続または洗浄のgp39に対して特異的であると考えられる。実施例７：Ｔ−細胞依存性Ｂ−細胞増殖の阻害および免疫グロブリン産生活性化されたＴ細胞は、静止期にあるＢ細胞の増殖および免疫グロブリン分泌細胞への分化を誘発する。更に、活性化Ｔ細胞とＢ細胞との間の細胞接触が、Ｂ細胞のIgM からIgG 、IgA またはIgE 産生へのスイッチングのために必要とされる。CD40とそのリガンドとの間の相互作用が、これらの過程において決定的な役割を演じていると考えられるので、抗−gp39モノクローナル抗体がＴ細胞の「援助」のこれらの様式を妨害できるであろうことが予想された。ヒトＢ細胞の活性化および分化に及ぼす、抗−gp39モノクローナル抗体の阻害作用は、インビトロＴ細胞依存性Ｂ細胞増殖および免疫グロブリン合成アッセイ系で評価した。この系において（ヒロハタ(Hirohata)等，J．Immunol.，1988，1 40:3736-3744）、活性化Ｔ細胞は、MHC-非制限、Ag非特異的様式で、Ｂ細胞の活性化、増殖およびポリクローナル抗体産生(IgG 、IgM およびIgA)を誘発する。これは、該観測されたＢ細胞事象が起こるためには、ＢとＴ細胞との間の直接的接触が必要とされ、かつこれはAb生産へと導く、Ｂ細胞／Ｔ細胞相互作用を研究するための、関連するインビトロ系を表すと考えられる。簡単に言えば、ヒト血液単核細胞(PBMCs)は、全血を1:1 なる比率でPBS で希釈し、その25mlを10mlのリンホサイトセパレーションメディウム(LSM，オーガノンテクニカ)上に展開し、450gにて25分間遠心処理することにより単離した。この界面における細胞を集め、かつPBS で１回洗浄した。単離した細胞を0.25mMの L-ロイシル-L- ロイシンメチルエステルハイドロブロミド(Leu-LeuOMe,シグマ社 )を含有する2%FCS-イスコフ培地中に5x10⁶/mlまで希釈し、室温にて15分間インキュベートして、単球およびNK細胞を殺した（オーリン(Ohlin)等，Immunology，1 989，66:485-490）。処理した細胞を2%FCS-イスコフ培地で２回洗浄した後、Ｔ細胞とＢ細胞とを分離した。Ｔ細胞は、該Leu-LeuOMe処理細胞を、150-倍のAET-SRBC（0.143Mの2-アミノエチルイソチオウロニムブロミド（シグマ）で処理したヒツジ赤血球）と共に、5- 10分間氷上でインキュベートすることにより単離した。E-ロゼット正のＴ細胞(E -T細胞)を、冷LSM 上に展開し、450gにて25分間遠心処理することにより、残りの細胞から分離した。（ロゼット処理したＴ細胞を含む）該ペレットを集め、該ヒツジ赤血球を、室温にて５分間、0.83% の塩化アンモニウムで溶解した。得られたＴ細胞を2%FCS-イスコフ培地で１回洗浄した。次いで、これら細胞を37℃にて40分間マイトマイシンC(5x10⁶E-T細胞および40μg マイトマイシンC/ml)で処理し、次に2%FCS-イスコフ培地で３回洗浄した。該管の界面からＢ細胞を得、そこでE-T 細胞がAET-SRBC処理したPBMCs から、LSM クッション（上記の通り）上で遠心処理することにより単離した。これらの細胞を2%FCS-イスコフ培地で１回洗浄し、上記のようにAET-SRBCで再度ロゼット処理して、あらゆる残留Ｔ細胞を除去し、LSM クッション上で再度遠心処理した。界面における細胞を集め、2%FC S-イスコフ培地で１回洗浄した。これをここではＢ細胞と呼ぶ。コスター96ウエルプレートを、50μl/ウエルの抗-CD3モノクローナル抗体64.1 (ハンセン(Hansen)等，In Leucocyte Typing,スプリンガー−フェアラグ社(Spri nger-Verlag Inc.)，1984，pp．195-212)の、血清を含まないイスコフ培地中の２μg/ml溶液で、室温にて最低４時間被覆した。過剰の抗体を該ウエルから除去し、全体積150 μｌの培地（10%FCSを補充したイスコフの改良ドゥルベコ培地）中で、100,000 個のマイトマイシン処理したＴ細胞および2,000 個の２回ロゼット処理したＢ細胞を、該ウエル各々に添加した。次いで、抗−gp39モノクローナル抗体または負コントロールモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから集めた上澄を、３つのウエルの各々に、100 μl/ウエルにて添加した。付随的なウエルには、等体積の培地のみを添加した。6%のCO₂を含有する37℃のインキュベータ中で、培養開始後６日目に、３個のウエルからなる各組を、Ｂ細胞増殖および全ヒトIgG およびIgM につき評価した。Ｂ細胞増殖は、トリチウム処理したチミジンの取り込みにより測定した。IgG およびIgM の分析用の培養上澄100 μl/ウエルを取り出した後（以下を参照）、１μCi[³H]チミジン(ニューイングランドヌクレアー(New England Nuclear))を含有する培地50μｌを、各ウエルに添加した。更に37℃で18時間培養した後、該プレートを凍結し、解凍し、TOMTECフルプレート細胞収穫装置を使用して、ガラス遷移フィルタマット上に細胞を収穫した。[³H]チミジンの組み込みは、LKB ウォラスベータプレート(Wallace Beta-Plate)液体シンチレーションカウンタにより測定した。３つのウエルについての計数値を平均し、第３表に培地のみのコントロールウエルについて見られた値に対する％±ISD として示した。ヒトIgG およびIgM は、pH 9.6の0.05 M炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウムバッファー中の山羊抗−ヒトIg(サウザンバイオテクノロジーアッソシエーツ(Sout hern Biotechnology Associates))の１μg/ml溶液100 μl/ウエルで、イムロン( Immulon) 2 EIA プレート（ダイナテック(Dynatech)）を被覆することにより定量化した。プレートを封止し、４℃にて一夜インキュベートした。過剰の抗体を除去し、プレートを前にELISA アッセイにおいて記載したように遮断した。遮断後、全てのウエルに50μl/ウエルの2XPTB(2%のウシ血清アルブミン（インテルゲン(Intergen)）および1%のツイーン20を含有する2XPBS)を添加した。培地中に1: 10（IgM 分析）および1:40（IgG 分析）の比率で希釈した培養上澄をこれらウエルに50μl/ウエルなる量で添加し、室温にて１時間インキュベートした。これらの希釈率は、培地のみのウエル由来の培養上澄の連続希釈を利用し、IgG および IgM に対する応答カーブの最も直線に近い部分の上端部近傍の光学密度値を与える希釈率を選択する予備実験により達成した。上澄を除去し、該プレートをPBS- ツイーンで２回洗浄し、適当にIXPTB(PBS で1:1 に希釈した2XPTB)中に希釈した HRP 標識した山羊抗−ヒトIgG またはIgM(ジャクソンイムノロジカルラボラトリーズ)を、各ウエルに100 μl/ウエルで添加した。室温にて１時間インキュベートした後、HRP 標識試薬を除去し、該プレートをPBS-ツイーンで３回洗浄した。結合したHRP 標識試薬の説明および得られる光学密度の測定は上記の他のELISA アッセイで記載したように実施した。３つのウエルについて測定した光学密度値を平均し、第３表に培地のみのコントロールウエルについて見られた値に対する％±ISD として示した。第３表に示されたように、テストした抗−gp39モノクローナル抗体各々は、該Ｔ細胞誘発性Ｂ細胞増殖を有意に阻害することができ、これはgp39特異的抗体を添加しなかったウエルについて見られた値の僅かに2-4%に過ぎない値を与えた。付随的に、IgG およびIgM の生産も大幅に抑制された。Ｔ細胞依存性ヒトＢ細胞免疫グロブリン生産に及ぼす、種々の抗−gp39モノクローナル抗体の阻害作用を、より定量的な様式で、精製された抗体の定義された濃度を使用して更に検討した。プロテインＡセファロース(Protein A Sepharose )またはガンマバインドプラスセファロース(GammaBind Plus Sepharose)カラム( ファルマーシア(Pharmacia))上で製造業者の指示に従って、培養上澄からアフィニティー精製し、かつ吸光係数1.4 を使用した光学密度吸光度により定量化した。実験は上記のように実施したが、以下のような変更を行った。ハーフエリアコスタ96ウエルプレートを使用し、該ウエルを被覆するのに使用した抗-CD3抗体濃度は４μg/mlであった。全てのウエルに、全培地体積100μｌで、150,000 個のマイトマイシンＣ処理したＴ細胞および20,000個のＢ細胞を添加した。抗−gp39 および負のコントロール抗体を、培地中に60、６および0.6 μg/mlに希釈し、各希釈液50μｌを、各３つのウエルに添加して、培養ウエル中の各抗体の最終濃度を20、２および0.2 μg/mlとした。コントロールウエルには、50μl/ウエルの培地のみを添加した。細胞を、全体で10日間、37℃/6%CO₂インキュベータ中で培養し、この時点で各３つのウエルの上澄をプールし、全ヒトIgG およびIgM について評価した。ヒトIgG およびIgM の測定は、上記のように実施したが、各プールした上澄を３回アッセイし、該上澄を2%FCS-イスコフ培地でより高い希釈率まで希釈して、細胞培養時間（および結果として抗体生産時間）をより長くし、該アッセイプレート上のウエルには2XPTB を添加せずに、希釈した上澄を添加し、HR P 試薬を遮断バッファー中に希釈した。これら実験からのデータを第４表に示す。使用した最大の抗体濃度20μg/mlにおいて、全ての抗−gp39抗体は、IgG およびIgM 両者の生産を有意に阻害した。この濃度において、生成するヒト抗体レベルは、一貫して培地のみの存在下で観測された値の10-30%であった。抗−gp39抗体の濃度が減少するにつれて、一般的には阻害レベルも減少した。使用した最小の２つの抗−gp39抗体濃度、２および 0.2 μg/mlにおいて、幾つかの抗−gp39抗体、特に39-1.7、39-1.26、39-1.77、 39-1.106、39-1.134、39-7.3E12 および39-5.6E9は、他のものと比較して、ヒト IgG およびIgM 産生の阻害においてより一層効果的である。この観測は、エピトープ特異性および／または抗体結合活性が、gp39を指向するモノクローナル抗体がgp39−CD40相互作用を妨害する程度を示す重要なパラメータであることを示唆している。実施例８：X-結合高IgM 症候群患者における変異gp39の検出変異ヒトgp39との種々の結合特性をもつモノクローナル抗体を使用して、gp39 における点変異が、X-結合高IgM 症候群患者から採取した血液サンプル中で識別できるか否かを決定した。このようにして、細胞はgp39特異的モノクローナル抗体による正の染色を示すが、CD40Igでは染色できなかった患者は、非機能性であり、かつX-HIM であると診断できる、gp39タンパクを発現することがわかるであろう。エピトープにおける既知の差異をもつ、モノクローナル抗体のパネルを使用すれば、X-HIM 中で検出できる多数の異なる変異が得られる。このアッセイを利用した場合、診断法として分類不能型免疫不全症を完全に排除することは不可能であるが、X-HIM 患者の有意な割合がこの方法により検出できることが期待される。gp39欠陥が、例えばgp39コード配列における初めの停止コドンに対する変異によって、内部発現が欠損したHIM 患者の亜群も、この方法によって確認することはできなかった。簡単に言えば、Ｔ細胞は患者の末梢血リンパ細胞のサンプルから、フィコール (Ficoll)濃度勾配遠心分離、引き続いて行われるヒツジ赤血球を使用したロゼット法により単離される。固定化され、透過性とされた細胞の染色は、記載のように変更したユング(Jung)等の方法(J．Immunol．Methods，1993，159:197-207)を利用して実施した。単離したＴ細胞を、３mMのモネンシンの存在下で、PMA(10ng/ml)およびアイオノマイシン(1μg/ml)で３時間刺激した。次いで、これらの刺激した細胞をPBSで洗浄し、ハンクスの平衡化塩溶液中の4%パラホルムアルデヒド中で4℃にて10分間インキュベートすることにより固定した。この固定した細胞をPBS で１回洗浄し、次いで透過性とし、遮断バッファー(PBS中の0.1%サポニン、10%山羊血清)中で室温にて10分間インキュベートすることにより遮断した。細胞をペレット化し、PBS 中の0.1%サポニン、2%ウシ胎児血清溶液中に再懸濁し、染色用のアリコートを、約1x10⁷細胞/ml なる密度で調製した。モノクローナル抗体を最終濃度10μg/mlにて添加し、該細胞を室温にて30分間インキュベートした後、遮断バッファーで２回洗浄し、FITC−複合化山羊抗−マウスFcを含有する遮断バッファー中に再懸濁した。更に20分間室温にてインキュベートした後に、該細胞をPBS 中の2% FBSで２回洗浄し、フローサイトメトリーによって解析した。コントロールとしておよび細胞内部におけるgp39の検出可能性をテストするために、正常なＴ細胞を単離し、かつ上記のように処理した。但し、該細胞を固定する前に、トリプシンで５分間処理して、表面発現されたgp39を除去した。次いで、該細胞を上記のように固定し、かつ染色した。非−活性化Ｔ細胞と活性化Ｔ細胞との比較は、正常なＴ細胞中の特異的染色の存在を明らかにすることを可能とする。以下の第５表には、X-HIM 患者から単離したＴ細胞を使用して得た、抗−gp39 モノクローナル抗体による染色をまとめた。実施例９：カニクイザル中の抗−gp39モノクローナル抗体の生物学的活性本例においては、ヒトgp39の異なるエピトープに結合する２種のマウスモノクローナル抗体を、活性化Ｔ細胞に対する結合能、ヒトCD40−Igの活性化Ｔ細胞との結合を遮断する能力およびＴ細胞依存性めいえきグロブリン産生の阻害能を、カニクイザルマカッカファシキュラリス(Macacca fascicularis)およびマカッカネメストリーナ(Macacca nemestrina)から単離した末梢血リンパ細胞を使用して検討した。これらのヒト以外の霊長類由来のPBLを使用して得た結果は、ヒトPBL を使用して得た結果と類似しており、このことはこのマカック族の、適当な動物モデルとしての使用を支持している。該抗体のマカックＴ細胞に対する結合能をテストするために、マカッカファシキュラリスおよびマカッカネメストリーナの末梢血単核細胞(PBMC)を、その全血をPBS 中に1:1 の比率で希釈し、その25mlを、10mlの95% リンパ細胞分離培地( オーガノンテクニカ)/5%PBS 上に展開させ、450gにて25分間遠心処理することにより単離した。界面における細胞を集め、PBS 中で１回洗浄した。該PBMCを氷上で150xAET-SRBC(0.143M 2-アミノエチルイソチオウロニウムブロミド臭化水素酸塩（シグマ社）で5〜10分間処理したヒツジ赤血球)と共にインキュベートすることにより、Ｔ細胞を単離した。E-ロゼット正Ｔ細胞を、冷LSM上に載せ、450gにて25分間遠心処理することにより分離した。該ペレット中のSRBCを0.83% の塩化アンモニウムで室温にて５分間処理して溶解した。得られたＴ細胞を洗浄し、37 ℃、6%CO₂の湿潤インキュベータ中で1-3x10⁶細胞/ml にて、10% FCS-イスコフ培地内で一夜インキュベートした。次いで、Ｔ細胞を、10% FCS-イスコフ培地中それぞれ10 ng/mlおよび１μg/mlのPMA(シグマ)およびアイオノマイシン(シグマ) によって、５〜６時間、37℃にて湿潤インキュベータ中で刺激した。11x75mmの管当たり2.5x10⁵個の活性化Ｔ細胞を250gにて５分間遠心処理し、培地を吸引除去した。次に、抗体106 または７もしくは負のコントロール抗体を含有する増殖中のハイブリドーマから集めた上澄(100μl)を、各管に添加し、30分間氷上でインキュベートした。2%FCS-イスコフ培地２mlを各管に添加し、該管を250gにて５分間遠心処理した後、上澄を吸引した。2%FCS-イスコフ培地で1:50の割合で希釈した、 FITC−標識したラット抗−マウスIgG ポリクローナル抗血清（ザイメッド）を、 100 μl/管にて各管に添加し、氷上で30分間インキュベートした。各管内の細胞を１mlの2%FCS-イスコフ培地で２回洗浄した。次に、細胞をフィコエリスリン− マウス抗−ヒトCD4 モノクローナル抗体で染色し、洗浄し、最後に2%FCS-イスコフ培地250 μl/管にて懸濁させた後、ベクトンディッキンソンFACSカン(Becton Dickinson FACScan)上で分析した。第１図に見られるように、モノクローナル抗体７(39-1.7)および106(39-1.106)は、両者共に活性化されたヒト（第1Aおよび1 B図）およびマカック（第1Cおよび1D図）CD4⁺Ｔ細胞を識別できた。モノクローナル抗体７および106 は、またCD40−Ig融合タンパクと活性化したマカック細胞との結合を遮断する能力についてもテストした。Ｔ細胞は上記のように単離し、かつ活性化した。活性化後、2.5x10⁵個のＴ細胞を、11x75 mmの管に添加し、250gにて５分間遠心処理した。該培地を吸引により除去し、次いで抗 −gp39モノクローナル抗体７または106 、培地のみまたは負コントロール抗体を含有する上澄100 μｌを各管に添加し、氷上で30分間インキュベートした。次いで、上澄を２mlの2%FCS-イスコフ培地で希釈し、該管を250gにて５分間遠心処理し、該上澄を吸引により除去した。10% FCS-イスコフ培地で20μg/mlに希釈した CD40−Igを、次に各管に100 μl/管にて添加し、氷上で30分間インキュベートした。2%FCS-イスコフ培地２mlを各管に添加し、該管を250gにて５分間遠心処理した。該上澄を吸引により除去し、フィコエリスリンまたはフルオレセインで標識したF(ab')²山羊抗−ヒトIgG(Fc)(ジャクソンラボラトリーズ(Jacjson Laborato ries))を、それぞれ10% FCS-イスコフ培地中に1:5,000 または1:500 の比率で希釈し、該細胞に添加した。30分間氷上でインキュベートした後、該細胞を各１ml の2%FCS-イスコフ培地で２回洗浄し、最後に各管当たり250 μｌの2%FCS-イスコフ培地中に懸濁させた後、ベクトンディッキンソンFACSカンで解析した。これらのデータを第２図にプロットしたが、これらはマウス抗−gp39モノクローナル抗体７および106 両者が、ヒトCD40−Igの活性化したヒト（第2Aおよび2B図）およびマカック（第2Cおよび2D図）Ｔ細胞との結合を阻害できることを立証している。モノクローナル抗体７および106 の、活性化Ｔ細胞と接触後のＢ細胞の抗体生産能力を阻止する能力をテストするために、末梢血単核細胞(PBMC)を、上記のようにマカッカファシクラリスサルから単離した。Ｔ細胞画分をマイトマイシンＣ(1ml当たり5x10⁶細胞40μｇマイトマイシンＣ( シグマ))で40分間処理し、10% FCS-イスコフ培地で３回洗浄した。該Ｂ細胞画分 (LSM遠心分離によりえた界面層)を、AET-SRBCで再度ロゼット処理して、あらゆる残留Ｔ細胞を除去した。96−ウエルのハーフエリアプレート（コスター）を50 μｌの抗-CD3抗体(FN-18，クラーク(Clark),E.A.等，Eur．J．Immunol.，1987,1 7:1799-1805)を血清を含まないイスコフ培地に分散した４μg/mlの溶液で、室温にて最低４時間処理することにより被覆した。過剰の抗体をウエルから吸引除去し、10% FCS-イスコフ培地中の1.5x10⁵個のマイトマイシンＣ処理したＴ細胞と5 x10³個の２度ロゼット処理したＢ細胞とを添加した。精製した抗−gp39およびコントロール抗体を、培地中での最終濃度10、１、0.4 および0.1 μg/mlとなるように10% FCS-イスコフ培地で希釈し、該ウエルに添加した。10日後に、３つのウエルからの培養上澄をプールし、希釈し、かつ全マカックIgG およびIgM につき評価した。マカックIgG およびIgM を、ヒトIgG およびIgM と同様にして定量化したが、但し上澄をそれぞれIgG およびIgM 分析に対して1:640 および1:40の割合で希釈した。0.4 μg/mlの濃度を使用した場合のこのアッセイの結果は、第３図に示されており、これらは抗体の不在下で培地のみで処理した培養物と比較した、全Ig G およびIgM の割合として表されている。抗体Exa およびIVA7は、それぞれモノクローナル抗体106 および７に対する、イソタイプの一致したコントロールである。上記のモノクローナル抗体106 および７両者は、マカックＢ細胞による、Ｔ細胞依存性IgG およびIgM 抗体産生を、ヒト細胞について観測されるものと極めて類似する様式で、阻害することができた。これらのデータは、カニクイザルが抗−ヒトgp39モノクローナル抗体のインビボ活性を評価するのに適した、ヒト以外の動物モデルであろうことを示唆している。実施例１０：マウス抗−ヒトgp39モノクローナル抗体の、カニクイザル中のＴ細胞依存性抗体応答を抑制する能力本例においては、３種の、gp39−結合タンパク、マウスモノクローナル抗体10 6 および７、並びにヒト組み換えCD40−Ig融合タンパクを、カニクイザルマカッカファシクラリスに静脈内投与したことに伴う、一次Ｔ細胞依存性抗体応答を阻害する能力について評価した。最適でない投与レベルでのテストにおいて、モノクローナル抗体106 は体液性の応答を阻害したが、このことは霊長類におけるＴ細胞依存性体液性応答を抑制する上で、抗−gp39投与が有効であることを立証している。一群の雄および３群の雌からなる４群を、4mg/kgのモノクローナル抗体７または106 もしくはコントロール抗体1G1(シュードモナスエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)タンパクＦに対して特異的なもの)またはCD40−Igで、１、３、５、８、10および12日目（コース１）および50、52、54、57、59および61日目（コース２）に処理した。更に、各動物を１日目（一次免疫）および50日目(二次免疫)に、Ｔ細胞依存性抗原としてのヒツジ赤血球との10% 混合物1.7ml/kgで、静脈内経路で免疫付与した。該動物の血清から全てのgp39−結合タンパクを、検出限界以下まで除去した後に、各動物をヒツジ赤血球で再度免疫化し、かつネオ抗原キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)10 mg/動物で同時免疫化した。血清を各週に採取し、抗−ヒツジ赤血球抗体および抗−KLH 抗体(IgGおよびIg M)をELISA 法によりアッセイした。ヒツジ赤血球に対する抗体力価を、PBS 中５ μg/mlの濃度で、イムロン(Immulon)ＩプレートをSRBC膜で被覆し、４℃にて12 〜18時間インキュベートすることによりアッセイした。過剰の溶液を除去し、該プレートをPBS-ツイーンで洗浄した。洗浄後、該プレートをPBS-ツイーンで、室温にて１時間遮断した。血清サンプルをPBS-ツイーンで逐次希釈し、その60μｌを該抗原塗布したプレートの各ウエルに移した。この希釈した血清サンプルを該抗原と共に1.5 時間インキュベートし、過剰のサンプルを除去した後に、PBS-ツイーンで該プレートを洗浄した。1:10,000の比率で希釈した、山羊抗−ヒトF(ab ')₂フラグメントIgG およびIgM(ジャクソンラボラトリーズ)100 μｌを適当なウエルに添加し、室温にて１時間インキュベートした。インキュベート後、該ウエルをPBS-ツイーンで洗浄し、基質バッファー（ジェネティックシステムコーポレーション）中に1:100 にて希釈したテトラメチルベンジジン（ジェネティックシステムコーポレーション）を添加した。基質を室温にて15分間インキュベートし、その後1N H₂SO₄を添加して、この反応を停止させた。吸光度値を、マイクロタイタープレートリーダーを使用して、450nm/630nm にて読み取った。 KLH に対する抗体力価は、上記と同様のアッセイで測定した。簡単に言えば、イムロンIIプレートを、pH 9.6の0.05 M炭酸／重炭酸バッファー中の10μg/mlの KLH(パシフィックバイオマリンラブズ(Pacific BioMarine Labs))で、４℃にて1 2〜18時間被覆した。これらプレートをPBS-ツイーンで洗浄し、該プレートを蒸留水で1:100 に希釈したスペーシメンダイリューエント(Specimen Diluent;ジェネティックシステムコーポレーション)で、室温にて１時間遮断処理した。血清サンプルを、1/50から出発して、スペーシメンダイリューエントで連続的に４倍に希釈した。各サンプル希釈液60μl/ウエルを、該抗原で被覆したプレートに移し、室温にて１時間インキュベートした。該アッセイの残りは上記の如く実施したが、山羊抗−ヒトF(ab')₂フラグメントIgG およびIgM は1:5,000 なる比率で希釈した。第4Aおよび4B図にはデータが示されているが、これらは最適化されていない投与量でのテストにおいて、モノクローナル抗体106 が、インビボにおいて、マカックが該ヒツジ赤血球に対する一次応答を開始する能力を抑制できることを立証している。この抑制は完全ではないが、テストした他の抗−gp39遮断タンパクについて観測されたレベルよりも、約10〜15倍高いレベルであった。該二次免疫化後には、何れのタンパクも抑制の明確な証拠を示さなかったが、該抗体106 で処理した群における抗−SRBC力価は、他の処理群と比較して著しく低かった。これら群全てのサルに、106 日目に一次免疫として10mgの KLHを筋肉内投与して、該サルの新たな抗原に対して応答する能力を検討した。第５図は、サルの全群がKL Hに対して強力な応答を開始できたことを示しており、このことは抗−gp39結合タンパクでの処理が、非特異的な免疫抑制ではないことを立証している。もう一つの研究においては、抗−ヒトgp39モノクローナル抗体106 を１、３および５日目に、20mg/kg にてカニクイザルに投与した。抗−腫瘍関連マウスモノクローナル抗体、L6 ATCC HB 8677 を負のコントロールとして使用した。全ての動物を一日目に、該テスト化合物を投与する直前に、ヒツジ赤血球懸濁液(10%懸濁液1.7ml/kg)で、静脈内経路で免疫化した。血液サンプルを、該ヒツジ赤血球またはマウスモノクローナル抗体の投与前、および投与後の８、15、22、29、36 および43日目に採取した。血清サンプルを、ヒツジ赤血球に対するIgGおよびIgM 抗体の力価につきテストした。第６および７表に見られるように、この実験のデータは、マウス抗−ヒトgp39 モノクローナル抗体106 が、該サルが該ヒツジ赤血球に対するＴ細胞依存性免疫応答を開始する能力を大幅に減ずることを立証している。これらのデータは、マウスgp39に対して特異的な抗体106 を使用して実施した実験の結果およびマウス抗−ヒトgp39モノクローナル抗体とサルおよびヒト末梢血リンパ細胞を使用したインビトロ研究の結果を確証している。実施例１１：組み換え抗−gp39単鎖可変領域本実施例において、２種の抗−ヒトgp39モノクローナル抗体[39-1.7(7)および 39-1.106(106)]の、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)のヌクレオチド配列を決定し、かつ単離する。次いで、各モノクローナル抗体のVHおよびVLをコードするDNA フラグメントを、(Gly₄Ser)₃リンカーをコードする介在配列を使用して、連続した発現カセットに組み立てた。これらカセットを哺乳動物内で発現させ、該組み換え単鎖抗体(sFv)分子の機能的活性を測定した。 A. RNA の単離、cDNA合成およびPCR 増幅 RNA を、mRNA単離キット（ストラタジーヌ(Stratagene)，ラジョラ，CA）を使用して、5x10⁷個のクローン106 またはクローン７ハイブリドーマ細胞から単離した。cDNAを、ストラタスクリプト(StrataScript)RT-PCR キット（ストラタジーヌ(Stratagene)，ラジョラ，CA）および免疫グロブリン定常部特異的アンチセンスプライマーを使用して、該RNA から生成した。このＣκ−特異的プライマーは、マウスκ軽鎖定常部のヌクレオチド配列228 〜257 と相補的である。このプライマーは、該クローン106 およびクローン７VLcDNA両者の第一ストランド合成に使用された。IgG₁−特異的アンチセンスプライマーまたはIgG_2b−特異的アンチセンスプライマーを使用して、それぞれクローン106 およびクローン７VHcDNA を生成した。該IgG₁−特異的アンチセンスプライマーは、マウスIgG₁CHI 領域のヌクレオチド100 〜121 と相補的であり、また該IgG_2b−特異的アンチセンスプライマーは、マウスIgG_2bCHI 領域のヌクレオチド101 〜123 と相補的である。第一のストランド反応は、300 ngのアンチセンスプライマーと0.5 μｇのmRNAとを使用して組み立てた。該cDNAは、ジェネクリーン(Geneclean; 登録表彰)(Bio101，ラジョラ，CA)を使用して精製し、10mMのdGTPおよび末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ストラタジーヌ(Stratagene)）により37℃にて１時間ポリG-末端化した。ポリG-末端化したcDNAをジェネクリーンの使用により再度精製した。各cDNA2μ ｌをアンカーPCR(サイキ(Saiki)等，Science，1988，239:487-491)により、各dN TPを20μＭ、センスおよびアンチセンスプライマーを100 pMおよび2UのTaqポリメラーゼを使用して、全体積100μｌにて増幅した。該センスプライマーは、該ポリＧ末端（ロー(Loh)等，Science，1989，243:217-220）およびXbaIサイト（下線部）と相補的な領域を含んでいた。該アンチセンスプライマーは、HindIII サイト（下線部）を含むネステッド(n ested)プライマーであり、かつマウスＣκのヌクレオチド101-125 と、またはマウスIgG₁CH1 のヌクレオチド47-69 またはマウスIgG_2bCH1 のヌクレオチド38-62 の何れかに対してアニーリングされていた。反応はパーキン−エルマーセタス(P erkin-Elmer Cetus)サーマルサイクラー(ノアウォーク(Norwalk)，CT)中で、94 ℃での変性30秒、45℃でのアニーリング90秒、および72℃での延長90秒を33サイクルなるプログラムで実施した。 PCR-増幅されたVLおよびVHフラグメントをXbaIおよびHindIII で消化し、pUC1 9 ベクターに連結し、DH5 αE.コリ内で形質転換させた。VLまたはVHを含有するクローンをDNA配列決定により同定した。クローン106(第6A図および第6B図)またはクローン７（第7A図および第7B図）に対する共通配列を、多数のVLまたはVHクローンの配列および以前に公開されたVLおよびVH配列(カバット(Kabat)等，U.S. デパートメントオブヘルス＆ヒューマンサービスズ(Department of Health and Human Services))との、推定されたアミノ酸配列との整合性を解析することによって決定した。クローン106 VLおよびVHの核酸および推定アミノ酸配列を第6A図および第6B図に示し(Seq ID Nos．11〜14)、またクローン７VLおよびVHの核酸および推定アミノ酸配列を第7A図および第7B図に示した（Seq ID Nos．15〜18）。 B. クローン７およびクローン106 sFv 発現カセットの構築単鎖sFv を、７および106 両者に対するVL−VH配向で構築した。各カセットは介在(Gly₄Ser)₃リンカーを含む(ハストン(Huston)等，Proc．Natl．Acad．Sci． U.S.A.，1988，85:5879-5883)。該106 VL−VHカセットを製造するために、該クローン106 VL遺伝子を、成熟VLの第一残基をコードする配列の直前のSalIサイトをコードするセンスPCR プライマー(106γ1 SalI)を使用して、pUC19 配列決定構築物から、再度増幅した。該アンチセンスプライマー(106γ1vlLK3')は、該VL の最後の９残基および該(Gly₄Ser)₃リンカーの最初の12残基をコードする配列に対して相補的であった。また、106 VHは、成熟VHの最初の９残基を伴う、該(Gly₄ Ser)₃リンカーの最後の11残基をコードするセンスプライマー(106γ1vhLK5')および該VH領域の最後の９残基およびBclIサイトをコードする配列と相補性のアンチセンスプライマー(106vhBclI)を使用して、pUC19 配列決定構築物から、再度増幅した。次いで、変性VLおよびVHPCR 生成物をジェネクリーン(Geneclean;登録商標)(Bio101，ラジョラ，CA)を使用して精製し、過剰のセンスVL(106γ1SalI )およびアンチセンスVH(106vhBclI)プライマーの存在下で、単一のPCR 反応に添加して、個々の106 VHおよびVLドメインをコードするDNA を、重複伸長 (overlap extension)PCRにより、単一のコード領域に連結した。同様に、該７VL−VHsFv カセットを製造するために、該７VL遺伝子を、成熟７ VLの最初の残基をコードする配列の直前の、SalIサイトをコードするセンスPCR プライマー(7γ2bSalI)および該VLの最後の９残基および該(Gly₄Ser)₃リンカーの最初の12残基をコードする配列に対して相補的であるアンチセンスプライマー (7γ2bvlLK3')を使用して、該pUC19 配列決定構築物から、再度増幅した。７VH をコードするDNA は、成熟VHの最初の９残基を伴う、該(Gly₄Ser)₃リンカーの最後の11残基をコードするセンスプライマー(7γ2bvhLK5')および該VH領域の最後の９個のアミノ酸残基およびBclIサイトをコードする配列と相補性のアンチセンスプライマー(7γ2bvhBclI)を使用して、pUC19 配列決定構築物から、再度増幅した。７VLおよびVHをコードするDNA を、VLセンス(7γ2bSalI)およびVHアンチセンス(7γ2bvlBclI)PCRプライマーを使用した、重複伸長 PCRにより、単一のコード領域に連結した。該106 および７VL−結合−VHsFv 遺伝子カセットを、pUC-Igと呼ばれるpUC19 の変異体内でのsFv-Igの発現のために組み立てた。該pUC-IgはE.コリ(NEB 208) のdam 株に通されて、そのBclIサイトにて制限酵素切断されている。このベクターは、HindIII-SalIフラグメントとして挿入されたL6Ｖκリーダー配列およびcD NAとして、ヒトIgG₁のヒンジ-CH₂CH₃をコードするBclIサイトの先行配列、それに伴う停止コドンおよびXbaIサイトを含んでいた。該ヒンジ領域におけるシステイン残基がセリンに変異されて、モノマー型のsFvIg(ハイデン(Hayden)等，Ther apeutic Immunol.，1994，1:3-15)の生産を好都合にした。該106 および７VL− 結合−VHsFv 遺伝子カセットを、SalIおよびBclIで切断し、pUC-Igに連結した。 DH５αE.コリをこの構築物で形質転換し、コロニーをこの挿入物につきスクリーニングした。該106 および７sFv 両者に対するL6Ｖκリーダー／VL−結合−VHsFv/ヒトIgカセットを、HindIII およびXbalを使用して、pUC-Igから切取り、pCDM8 哺乳動物発現ベクターに転移させた。７および106sFv発現カセットの変性されたpCDM8 ベクターへの結合後、該プラスミドをMC1061/p3 E.コリ細胞内で増幅させ、かつDN A を回収し、COS 細胞にトランスフェクションするために精製した。 C. COS 細胞のトランスフェクション、精製、およびsFv-Ig融合タンパクの特徴付け COS 細胞を、前に記載されたように（リンスレイ(Linsley)等，J．Exp．Med., 1991，173:721-730;アルホ＆シード(Aruffo and Seed)，Proc．Natl．Acad．Sci .U.S.A.，1987，84:8573-8577）、発現プラスミドでトランスフェクションした。プラスミドDNAを、全体積12ml/150mmプレートで、１μg/mlにてトランスフェクション培地に添加した。７〜10日後に、使用済みの培養上澄をプールし、細胞デブリスを、低速遠心分離処理によって除去した。７および106 sFv-Igを、pH 8.0の0.05M クエン酸ナトリウムで平衡化した固定化プロテインA(レプリゲン社(Repligen Corp.)ケンブリッジ，MA)のカラムに、浄化した上澄を適用することにより精製した(リンスレイ(Linsley)等，J．Exp.M ed.，1991，173:721-730)。上澄500 mlに対して、プロテインAの充填床体積１ml を使用した。該カラムに流下させた(1ml／分)後、該カラムをpH 8.0の100 mM燐酸カリウムで洗浄し、結合したタンパクを、pH3.0の0.05M クエン酸ナトリウムで溶出した。画分を中和し、プールし、PBS に対して透析した。タンパク濃度を、市販品として入手できるタンパクアッセイキット（バイオ−ラド(Bio-Rad),リッチモンド，CA）を用い、ローリー(Lowry)の技術に基づいて測定した。該融合タンパクの発現レベルおよび分子サイズを、プロテインＡおよびSDS-PA GEによる免疫沈降、引き続き行われるウエスタンブロットにより測定した。4%の重層体を有する線形の6-15% 勾配を形成するポリアクリルアミドゲルを、10mAにて一夜稼働させた。ゲルを、ウエスタンセミ−ドライ転移装置（エラードインスツルメンツ(Ellard Instruments)，シアトル，WA）を、3mA/cm²にて１時間使用して、ニトロセルロース膜上に免疫ブロット処理した。ブロットを、PBS(遮断バッファー)中の2%の脱脂ミルク＋0.1%ツイーン(Tween)により、１〜２時間遮断し、次いで遮断バッファー中に1:1500なる比率で希釈した、アルカリンホスファターゼ結合山羊抗−ヒトIgG(ベーリンガー−マンハイム(Boehringer-Mannheim),インジアナポリス，IN)と共に１時間インキュベートした。次いで、ブロットを遮断バッファーで３回洗浄し、ウエスタンブルー（プロメガ(Promega),マジソン， WI）中で5-15分間現像し、蒸留水で洗浄することにより発色を停止させた。これらの７sFv-Igおよび106 sFv-Igタンパクを、ELISA アッセイによりヒトgp 39との結合につきテストした。簡単に言えば、平底型可撓性96−ウエルのマイクロタイタープレート（ファルコン）を、PBS 中２μg/mlのラット抗−マウスLyt2 a モノクローナル抗体53-6により４℃にて一夜被覆した。過剰の抗−マウスLyt2 a 抗体を除去した後、上記のようにsgp39 を該プレートに添加(ウエル当たり100 μl)し、4℃にて一夜インキュベートした。過剰のsgp39 を洗浄によって除去し、クローン７sFv-Igまたは106 sFv-Igタンパクを添加(ウエル当たり100μl)した。プレートを室温にて２時間インキュベートし、0.1%のBSA を含有するPBS で２回洗浄した。結合バッファー（ジェネティックスシステムズ(Genetic Systems), シアトル，WA）中の、西洋ワサビパーオキシダーゼ（アメリカンカレックス(American Qualex),アナハイム，CA）と結合した山羊抗−ヒトIgG を添加 (ウエル当たり100μl)し、室温にて１時間インキュベートした。未結合の複合体を0.1%のBSA を含有するPBS で２回洗浄することにより除去し、EIA バッファードサブストレート(Buffered Substrate;ジェネティックスシステムズ)の1:100 希釈液を、ウエル当たり100 μｌの量で該ウエルに添加した。発色反応を、ウエル当たり30μｌの3M H₂SO₄の添加により停止させ、タイターテック(Titertek)マルチウエルプレートリーダーによって、450-595 nmにおける光学密度を測定した。幾つかの106 sFv-Igおよびクローン７sFv-Igのトランスフェクション上澄は良好にヒトgp39と結合し、マウスgp39に対しては極僅かに反応する(106)か、あるいは全く反応性を示さなかった(7)。106 および７sFv-Ig結合の代表的結果は、第８図に示した。精製し放射性標識したタンパクを使用した、天然の106 モノクローナル抗体に対する106 sFv-Igの結合アフィニティーの測定を実施した。第９図に示した飽和結合カーブは、標識された天然の106 モノクローナル抗体（第9A 図）は、本質的にgp39を発現するジャーカット細胞と結合し、106 sFv-Ig（第9B 図）の約３倍高いアフィニティーを有していた。しかしながら、該106 sFv-Igのアフィニティーは、依然としてかなり高かった（測定されたKd=1.6x10^-9）。天然の106 モノクローナル抗体が細胞当たり10,000サイトと結合することが、スキャッチャード形質転換により測定され、これは106 sFv-Igの結合する細胞当たりのサイト数と完全に一致する（第9Aおよび9B図）。７sFv-Igおよび106 sFv-Igの、インビトロでのＴ細胞依存性Ｂ細胞抗体産生系におけるIgG およびIgM 産生を阻害する能力の評価およびこの効果と、親39-1.7 および39-1.106抗体につき観測された効果との比較を、幾つかの些細な変更を行って、親抗体につき前に記載したように実施した。細胞の培養を、コスターハーフエリアプレート中で、100,000 個のマイトマイシンＣ処理したＴ細胞と2,000 個のＢ細胞とを使用して開始した。精製した親抗体およびそのそれぞれの精製したsFv-Igを、バイオ−ラドプロテインアッセイキット(Bio-Rad Protein Assay k it)を使用して定量した。各親抗体は最終濃度１、0.5 、0.25および0.125 μg/m lにてテストした。各sFv-Igは、最終濃度0.68、0.34、0.17および0.085μg/ml にて評価した。親抗体およびその各sFv-Igのμg/mlで表した濃度は、相互に異なっているが、抗原結合フラグメントの数についての各濃度は、全体としての抗体価（親抗体１つ当たり２、そのsFv-Igに対して１）および分子量（親抗体については160,000kD 、そのsFv-Igに対しては55,000kD）を考慮すると、等価である。かくして、本実施例において比較した、抗原結合フラグメント（結合サイト）の最終濃度は7.53、3.76、1.88および0.94x10¹²結合サイト／mlであった。該抗体およびsFv-Igの添加に続き、該プレートを湿潤した37℃/6%CO₂インキュベータ中で10日間培養し、その後各３つのウエルからの培養上澄をプールし、上記のようにして、全ヒトIgG およびIgM について評価した。データは第９表に示すが、ここでIgレベルは、培地のみ（抗−gp39抗体を含まない）コントロールについて観測された値に対する割合として表した。第９表に示したように、７sFv- Igおよび106 sFv-Ig両者は、ヒトＢ細胞によるIgG およびIgM 両者の産生を実質的に阻止することができた。興味深いことに、これらの阻害能力は、該親抗体について観測された能力と等価であるか、また幾つかの濃度においてはより良好でさえあった。実施例１２：抗−gp39モノクローナル抗体のヒト化 A. 106 VLおよびVHに対するヒト鋳型の決定マウス106 VL（κ）およびVH配列を使用して、成熟ペプチドをコードするヌクレオチドのみを使用したFASTA 探索により、106 VLと最も高い相同性をもつ、マウス生殖系ヌクレオチド配列に関するゲンバンク(GenBank)からの免疫グロブリン配列のサブセットを探索した。この探索により、多くのヒト配列をもつ２つのマウス配列を得た。最も一致するものは“Musigkva”(承認番号J00545)と命名された。翻訳された106 VLと翻訳されたJ00545(106の生殖系)との間の相同性は第1 0図に示されている。差異のみが該生殖系配列に対して印されている。これらの差異は体細胞変異の可能なサイトである。しかしながら、106 VLは未だ同定されていないマウス生殖系遺伝子から誘導することも可能である。 106 VLに対して最高の相同性をもつヒト生殖系アミノ酸配列を、免疫グロブリンタンパク配列のデータベースにつき、FASTA 探索を実施することにより決定した。このデータのセットは、生殖系および再配置された配列を含んでいた。該再配置された配列を捨て、最良の相同性の一致は生殖系配列に見られ、これを“02 ”（承認番号X59312）と命名した。CDR ループに対する構造決定基の一つ(Leu90 )を除く全てが、マウス106 VLと該ヒト鋳型との間の該CDR ループのサイズと同様に、保存されることに注意すべきである。また、該マウス配列およびヒト鋳型の軽鎖中のCDR ループ全てが、同一の規定構造群に属することにも注意すべきである。 106 VHに対して最大の相同性をもつマウスヌクレオチド配列も、クエリー(que ry)配列として成熟ペプチドをコードするヌクレオチドのみを使用して、ゲンバンクの免疫グロブリン配列のサブセットの、FASTA 検索を実施することにより決定した。この検索により、多くのヒト配列に伴う２つのマウス配列の位置の決定をもたらした。“Musighin”(承認番号M21520)と命名されたマウス配列は、他のマウス配列よりもかなり良好な相同性を示した。ゲンバンクのM21520に対する注釈は、これを再配置された配列として掲載している。体細胞変異の可能なサイトを見出す目的で、M21520を生殖系置換体として使用した。これと106 VHとの間の相違は第11図の最も下の列に示されている。 106 VHに対して最も高い相同性をもつ、該ヒト生殖系アミノ酸配列を、該免疫グロブリン配列データのサブセットについて、FASTA 検索を実施することにより決定した。該再配置された配列を捨てると、最良の相同性の一致は、“Hhg4”生殖系配列（承認番号X62129）について観測された。該CDR ループのサイズは、106 VHと該ヒト鋳型との間で保存され、またCDR ループに対する構造決定基の二つを除く全てが保存されていたことに注意すべきである。高度に相同性の他の配列の何れも、該構造決定基におけるより良好な一致を与えなかった。該マウス配列およびヒト鋳型のH1ループも、同一の規定構造群に属することが分かった。 B. 106 VLおよびVHヒト化鋳型の精製 VLドメインの抗原結合ループL1、L2およびL3並びにVHドメインの該ループH1およびH2に対する規定ループ構造を同定し、かつ構造決定基として定義された残基（チョシア＆レスク(Chothia and Lesk)，J．Mol．Biol.，1987，196:901; レスク＆トラモンタノ(Lesk and Tramontano),アンチボディーエンジニアリング(Ant ibody Engineering)，W.H.フリーマン＆コ(W.H．Freeman and Co.)，pp．1-38(1 992)）はマウス残基として保存された。該マウス106 VLおよびVHアミノ酸配列を使用して、結晶構造が解明されている相同性配列につき、ブルックヘブン(Brookhaven)データバンクを探索した。抗− リゾチーム結合モノクローナル抗体D1.3由来のVLを、該106 VLをモデル化するための構造鋳型として選んだ。抗−ペプチドモノクローナル抗体17/9由来のVHを、該106 VHをモデル化するための構造鋳型として選択した。これらの構造を組み合わせて、該VL-VH 界面における非変異残基の組を使用して、106 のモデル化のための組み合わせ鋳型を得た。このモデルから、該抗原結合サイトの構造を維持するのに重要であると考えられる、３次元フレームワーク残基を同定した。該VLにおいて、Ile48 が構造的に重要であることが分かり、かつマウス配列として残した。該VHにおいても、２つの残基(Ala49およびIle77)がマウス配列として残された。この106 モデルは、あるヒトまたはマウス残基が106 VHの位置24、55および 56において適当であるか否かの決定因ではなかった。 C. J-領域鋳型の決定最良のヒトＪκ配列は、カバット(Kabat)等(シーケンスズオブプロテインズオブイムノロジカルインタレスト(Sequences of Proteins of Immunological In terest),第４版，U.S.ヘルス＆ヒューマンサービス，ワシントン,DC(1987))におけるマウスＪκ配列に対する相同性により選択した。同様に、最良のヒトJH配列は、カバット等の上記文献における、マウスJH配列に対する相同性によって選択した。 D. 106 VLのヒト化 106 VLをヒト化するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーを、第８表に列挙した。初めの三つの変更（位置９におけるAla のSer への変更、位置17におけるGlu のAsp への変更および位置18におけるThr のArg への変更）は、Hu10 6VLAre2 センスPCR プライマー上にコードされた。HindIII サイトを、該最終的にヒト化さたVLをpUC19 にクローニングするために、成熟VLをコードする配列の 5'に付加した。次の４つの変更は、Hu106VLB2 アンチセンスPCR プライマーにコードされた（位置40におけるGln のPro への変更、位置42におけるArg のLys への変更、位置43におけるSer のAla への変更および位置45におけるGln のLys への変更）。鋳型として、マウス106sFv-Ig/CDM8と共にHu106VLAre2 およびHu106V LB2 を使用して、第一のヒト化フラグメントをPCR により得た。該センスPCRプライマーHu106VLCおよびアンチセンスPCR プライマー2Hu106 VLD を使用して、第二のフラグメントをヒト化した。Hu106VLCの該配列は、同じ４つの変更（位置 40におけるGln のPro への変更、位置42におけるArg のLys への変更、位置43におけるSer のAla への変更および位置45におけるGln のLys への変更）がHu106V LC上にコードされるようにHu106VLB2 とオーバーラップされている。更に、SpeI サイトを、診断サイトとして、Hu106VLCに組み込んだ。この変更は、該タンパク配列を変更しなかった。該2Hu106VLD プライマーは、次の４つの変化をコードした（位置70におけるGln のAsp への変更、位置72におけるSer のThr への変更、位置74におけるLys のThr への変更および位置76におけるAsn のSer への変更）。鋳型として、マウス106sFv-Ig/CDM8と共にHu106VLCおよび2Hu106VLD を用いて、PCR によって該第二のヒト化フラグメントを得た。該最終のヒト化VLフラグメントは、鋳型としてマウス106sFv-Ig/CDM8と共に、 Hu106VLEセンスPCR プライマーおよびHu106VLFアンチセンスPCR プライマーを使用して得た。Hu106VLEを、同一の４つの変化（位置70におけるGln のAsp への変更、位置72におけるSer のThr への変更、位置74におけるLys のThr への変更および位置76におけるAsn のSer への変更）をコードするように、2Hu106VLD と部分的にオーバーラップさせた。付随的にHu106VLEは、２つの付随的な変化（位置 84におけるGly のAla への変更および位置85におけるSer のThr への変更）をもコードした。Hu106VLFは、最後の４つの変更（位置100 におけるThr のGly への変更、位置104 におけるLeu のVal への変更および位置106 におけるLeu のIle への変更）をコードした。Hu106VLFは、またクローニングのための、該VL配列の 3'近傍のXbaIサイトをもコードする。次いで、ヒト化されたフラグメント２および３を組み立て、Hu106VLCセンスプライマーおよびHu106VLFアンチセンスプライマーの存在下で、これら２つのヒト化したDNA を混合することにより、PCR により増幅した。この片を精製し、ヒト化されたフラグメント１と混合し、かつセンスプライマーHu106VLA2 およびアンチセンスプライマーHu106VLF2 の存在下で、単一のPCR フラグメントが得られるように、PCR によって再度増幅した。この増幅したヒト化106 VLをHindIII およびXbaIで切断し、pUC19 に結合した。E.コリ（株DH５α）を定法に従って形質転換し、個々のクローンからのプラスミドDNA を配列決定し、該ヒト化106 VLの適当なフラグメント集団を確認した。個々のクローンの一つをhu106VL クローン10と命名し、後の構築のために使用した。 E. 106 VHのヒト化該マウス106 モデルは、あるヒトまたはマウス残基が該ヒト化されたVH鎖の位置24、55および56において適当であるか否かの決定因ではないので、全ての23のバージョンを作成することを試みた。該ヒト化したVH遺伝子は、３段階で組み立てた。その第一段階では、位置１から位置51までのアミノ酸配列の２つのバージョン（アミノ酸位置24におけるAla またはThr に対応する）の何れかをコードするPCR フラグメントを生成し、pUC19 の該HindIII XbaIサイトに挿入した。これらPCR 生成物は、固有のNheI（ヌクレオチド位置146 における）サイトを含み、他のフラグメントの後の挿入のためのEcoRI 、PstIおよびXbaIサイトを伴う。これら変化は、106 VHのタンパク配列に影響を与えなかった。第二段階において、アミノ酸残基49〜80の、４つの異なるバージョン（アミノ酸残基位置55および56 におけるAsp-Ser 、Asp-Tyr 、Ser-Ser およびSer-Tyr に対応する）の何れかをコードするオリゴヌクレオチドをアニーリングし、該段階１で生成したベクター両者のNheIおよびPstIサイトに挿入した。可能な８種の異なるベクターのうちの７つを単離した（該Ala-Asp-Ser 形ではない）。第三段階では、アミノ酸残基80 〜112(これはヒト化106 VH（第12図）の残りの残基をコードするヌクレオチド配列を含む)をコードする単一のPCR 生成物が生成され、これを第二段階で製造した７つのベクターのPstIおよびXbaIサイトに挿入した。より詳細には、これら２つのベクターの構築は、鋳型として106sFv-Ig/CDM8、およびセンスプライマーとして106vhT-5’または106vhA-5’並びにアンチセンスプライマーとして106vhNEP-3’を使用して、２つのPCR フラグメントを生成することにより開始した。該センスプライマーは、該VHの5'近傍のHindIII およびヒト化されたVHの初めの３つの変化（位置３におけるLys のGln への変更、位置19 におけるLys のArg への変更および位置23におけるThr のAla への変更）をコードした。更に、該106vhA-5’センスプライマーは位置24における残基をAla にヒト化し、一方で106vhT-5’センスプライマーは該残基をマウス(Thr)として保持した。該アンチセンスプライマーは、残基40、42および44における変化（それぞれThr からAla 、Glu からGly およびArg からGly への変化）をコードし、また４つの固有の制限サイト(NheI 、EcoRI 、PstIおよびXbaI)をコードした。次いで、これら２つのPCR 処理したDNA を、HindIII-XbaIフラグメントとして、pUC1 9 にクローニングし、DH５αE.コリを形質転換するのに使用した。両インサートを含むクローンを単離(106vhA-NEP および106vhT-NEP)し、かつDNA 配列決定により確認した。次に、これらのプラスミドをNheI、EcoRI およびPstIで消化し、線状DNA を単離し、かつ精製した。位置55および56における変化をコードする、４対のオリゴヌクレオチドの各々におけるセンスオリゴヌクレオチドをホスホリル化し、アニーリングして対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドとした。これは、5'NheIオーバーハングおよび3'PstIオーバーハングをもち、かつ固有のXbaIサイトを含むdsDNA フラグメントを生成した。プライマー対106vhDS-5'および106vhDS-3'は、位置55および56におけるマウス残基(Asp-Ser)をコードし、対106vhDY-5'および106vhDY-3'は、それぞれ位置55および56におけるヒトおよびマウスの残基(Asp-Tyr)をコードし、1 06vhSS-5'と106vhSS-3'との対は、それぞれ位置55および56におけるヒトおよびマウスの残基(Ser-Ser)をコードし、また対106 vhSY-5'および106vhSY-3'は、位置55および56におけるヒトの残基(Ser-Tyr)をコードした。これらプライマー対全ては、またマウスの配列およびヒトの配列の付随的な４つの変更（即ち、位置 57におけるThr からIle への変更、位置60におけるPro からAla への変更、位置 64におけるArg からLys への変更および位置75におけるArg からLys への変更）をコードした。生成された４種のフラグメントを、次に前もって制限酵素で消化した、106vhA-NEP/pUC19および106vhT-NEP/pUC19に結合した。該プラスミドを使用して、DH５αE.コリを形質転換し、XhoIで切断したクローン由来のDNA を単離し、DNA 配列決定によりその存在を確認した。該８種の組み合わせのうちの７種が得られた（位置24、55および56におけるヒト、マウス、マウス配列を表す106v hA-DS はpUC19 からは単離されなかった）。該７種のプラスミドを、PstIおよび XbaIで消化し、最終のフラグメントを受け入れる状態とした。該クローンのうちの３つを後の使用のために選択し、以下のように命名した。即ち、VHASY 24-17 (hhh); VHTDS 15-34(mmm); およびVHADY 7-8(hmh)。ヒト配列に変えられた残りの残基は、センスプライマー106vhPst5’（位置82a におけるSer からAsn への変更、位置84におけるSer からAla への変更および位置89におけるMet からVal への変更）およびアンチセンスプライマー106vhPst3' （位置108におけるSer からLeu への変更）上にコードされた。クローニングのために、プライマー106vhPst5'は、またPstIサイトをコードし、かつ106vhPst3' はXbaIサイトをコードし、その直前にはBclIサイトが存在する。このフラグメントは、鋳型として106sFv-Ig/CDM8を使用したPCR 法により得た。このフラグメントをPstIおよびXbaIによって消化し、該７種のプラスミドに結合した。再度、該プラスミドを使用して、DH５αE.コリを形質転換し、クローン由来のDNA を配列決定し、挿入されたことを確認した。 F. ヒト化された106sFv遺伝子カセットの組み立て 106 に対するヒト化した単鎖Fv発現カセットを、元のマウス106sFvと同様にして、但し以下のプライマーを使用して組み立てた。簡単に言えば、該ヒト化した106 VLをコードするDNA を、これが組み込まれた該pUC19 ベクターから切り取った。該７種のヒト化した106 VHをコードするDNA も、pUC19 から切り取った。このDNA フラグメントを精製し、以下のPCR 反応で使用した。該ヒト化した106 VLを増幅したが、ここでは成熟VLの第一の残基の直前にあるSalIサイトをコードする、該hu106V_LSalIセンスPCR プライマーおよび該VLの最後の９残基および該(Gly₄Ser)₃リンカーの最初の12残基をコードする配列と相補的なアンチセンスプライマー(hu106V_LLK3')を使用した。更に、該７種のヒト化した106 VHを増幅したが、ここでは成熟VHの初めの９残基を伴う、該(G ly₄Ser)₃リンカーの最後の11残基をコードするセンスプライマー(hu106V_HLK5') および該VH領域の最後の９残基およびBclIサイトをコードする配列と相補性である、アンチセンスプライマー(hu106V_HBclI)を使用した。この変性した106VLを、過剰のVLセンスプライマー(hu106V_LSalI5')およびVHアンチセンスプライマー(hu 106V_HBclI)の存在下で、該修飾した106 VH各々と混合して、個々のヒト化した10 6 VLを、オーバーラップ伸長PCR によって、該各ヒト化した106 VHと結合して、７種のVL−結合−VH単一コード領域とした。該ヒト化した106 VL−結合−VH sFv遺伝子カセットを、次いで該pUC-Ig中でsF v-Igを発現させるために組み立てた。このベクターはL6Ｖκリーダー配列を包含し、更にヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3をコードする、SalIサイトおよびBclIサイト先行配列およびXbaIと隣接した停止コドンを含む。該ヒンジシステインはセリンに変異されて、sFv-Ig融合タンパクのモノマー発現を有利にした。該ヒト化した 106 VL−結合−VH sFv遺伝子カセットをSalIおよびBclIで切断し、同様に消化したpUC-Igと連結した。DH５αE.コリをこの構築物で形質転換し、コロニーを該挿入物につきスクリーニングした。該７種のVH構築物のうちの６種がpUC-Ig内に適当に挿入された。この全体としてのL6Ｖκリーダー／ヒト化106 VL−結合−VH s Fv／ヒトIgカセットを、HindIII およびXbaIを使用して該pUC-Igから切取り、該pCDM8 哺乳動物発現ベクターに転移させ、形質転換により、E.コリ菌株MC1061 /p3中で増幅した。該６種中の５種がpCDM8 内に適当に挿入された。DNA を、COS 細胞のトランスフェクションのために、各々から回収した。小規模のCOS 細胞のトランスフェクションを、DEAE−デキストラン法によって 60mmの組織培養プレート内で実施した。該培養の３日後に、３mlのトランスフェクション上澄を各々から回収し、ウエスタンブロットおよびELISA 法によって、可溶性sFv-Ig融合タンパクの存在についてテストした。更に、抗−ヒトIgサンドイッチELISA 法を実施して、各構築体により発現されたタンパクの量を定量し、 gp39に対する種々のタンパク結合のオン−レート(on-rates)を、ビアコア(Biaco re)分析により測定した。 G. COS 細胞における一時的なトランスフェクションにより発現されたヒト化10 6sFvの予備的分析該トランスフェクション上澄のSDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析は、CO S 細胞をトランスフェクションするのに使用した５種の構築体（106 VHフラグメント106vhT-DS 、106vhT-SS 、106vhT-SY 、106vhA-DY および106vhA-SY を含有するヒト化された106sFv）のうちの４種が、該上澄中にタンパクを分泌した。10 6vhT-SY(huVL/106vhT-SY)を含有するヒト化された106sFvによるタンパクの発現は観測されなかった。これら４種の発現体のうちの３種が、sFv-Ig融合タンパクに関する正確なサイズをもつ(55kDa)タンパクを発現した。HuVL/106vhT-SSは、異常なサイズ(約97kDa)のタンパクを生成した。HuVL/106vhT-DSについての発現レベルは、マウス106sFvと同様であると思われ、一方でHuVL/106vhA-DYおよびHu VL/106vhA-SYは、低レベルで発現された。該タンパクのレベルを、サンドイッチELISA を使用して定量化し、ヒトIg端部を検出した。ELISAプレートを、PBS中の山羊抗−ヒトIgで被覆し、PBS+0.1% BSA 中で遮断した。該トランスフェクション上澄をそのままおよび1:5 の希釈率にて、室温で１時間インキュベートした。次いで、該プレートを洗浄し、ELISA 複合化バッファー中の山羊抗−ヒトIg−西洋ワサビパーオキシダーゼと共に室温で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、EIA バッファードサブストレート(EIA Buffered Substrate;ジェネティックシステムズコーポレーション)の1:1 00 希釈物を添加した。発色反応を、3M H₂SO₄の添加により停止させ、タイターテック(Titertek)マルチウエルプレートリーダーを用いて、450-595 nmにおける光学密度を測定した。おおよそのタンパク濃度を、バイオ−ラド(Bio-Rad)プロテイン濃度測定キットで測定しておいた、既知濃度のCD40R γ1(CD40-Ig)と比較することにより測定した。タンパク濃度は以下の通りであった。 huVL/106vhA-DY（クローン10） 0.62μg/ml huVL/106vhA-DY（クローン12） 0.82μg/ml huVL/106vhA-SY（クローン21） 0.77μg/ml huVL/106vhT-SY（クローン26） 0 μg/ml huVL/106vhT-SS（クローン36） 0.15μg/ml huVL/106vhT-DS（クローン46） 1.20μg/ml 該上澄を、内皮細胞上での、E-セレクチン発現を阻止する能力につきテストした。ヒト臍帯静脈の内皮細胞(HUVECs,クローンティックスコーポレーション(Clo netics Corporation))を培養し、M199(メディウム(Medium)199，ギブコ(Gibco)B RL)内で、以下のような最終濃度で添加して刺激した。即ち、４mMのL-グルタミン、48.5μg/mlのペニシリン、80μg/mlのストレプトマイシン、１mMのピルビン酸ナトリウム（シグマ）、90μg/mlのヘパリン（シグマ）、30μg/mlの内皮成長補充物(コラボラティブバイオメディカルプロダクツ(Collaborative Biomedical Products))および20% のウシ胎児血清。内皮細胞を、1%のゼラチンで処理した組織培養フラスコ中で増殖させ、１μg/ウエルのフィブロネクチン（コラボラティブバイオメディカルプロダクツ）で被覆された平底型96−ウエルコスター組織培養プレート中に、1.5x10⁴細胞／ウエルにてプレーティングした。内皮細胞を、プレーティングの1-2 日後に刺激した。細胞は、継代４または５にて使用した。 sgp39 およびヒト化106sFv-Ig を含有する上澄をM199＋添加物に、ウエル当たり100 μｌで添加し、37℃にて４時間インキュベートした後、E-セレクチン発現についてアッセイした。次いで、プレートを冷PBS で２回洗浄し、４℃にてPBS 中の0.5%グルタルアルデヒドで10分間固定し、４回3%山羊血清／PBS/20mMEDTA（遮断バッファー）で洗浄し、同一のバッファー中で37℃にて１時間または４℃にて一夜遮断した。細胞を、遮断バッファー中0.25μg/mlの抗−E-およびP-セレクチン(R & Dシステムズ(Systems))100μｌで37℃にて１時間処理した。プレートを遮断バッファーで４回洗浄し、37℃にて１時間、遮断バッファー中の西洋ワサビパーオキシダーゼと複合化した抗−マウスIgG(ジャクソンイムノリサーチ(Jac kson ImmunoResearch)，100 μl/ウエル，1:2000希釈液)と共にインキュベートし、次いで４回洗浄した。プレートを、EIA 緩衝基質中のEIA クロマゲン(chrom agen)(両者共ジェネティックシステムズ(Genetic Systems)製，100μl/ウエル， 1:100 希釈液)を使用して現像し、100μl/ウエルの1N H₂SO₄で停止させた。吸光度を２種の波長450 nmおよび630 nmにて測定した。 huVL/106vhA-DY、huVL/106vhA-SYおよびhuVL/106vhT-DSは、全てE-セレクチン発現を阻害したが、元のマウス106 sFv-Ig（第13図）ほど有効ではなかった。差異はhuVL/106vhA-DYおよびhuVL/106vhA-SYにおける低いタンパク発現によるものと思われるが、huVL/106vhT-DSは該元のマウス106 sFv-Igに匹敵するレベルで発現されるものと考えられた。 gp39と結合する種々のタンパクのオン−レートは、バイオコアを使用して測定した。huVL/106vhA-SYおよびhuVL/106vhT-DS両者は、該元のマウス106 sFv-Igの活性に匹敵する活性で、gp39で被覆したチップと密接に結合した（第14図）。これらタンパクは剥がれないので、これらsFv-Igのアフィニティーが非常に高いか否か（プロフィールはKd=〜10^-10Mまたはそれ以上に相当するアフィニティーを示した）、または該タンパクが凝集し、かつ多価原子価状に結合するか否かは不明であった。huVL/106vhA-DYは剥がれてしまった。そのプロフィールから、アフィニティーは約Kd =10^-7〜10^-8M であると評価された。該元のマウス106 sFv-Ig のアフィニティーはKd =1.6x10^-9M であると測定さており、従ってhuVL/106vhA- SYおよびhuVL/106vhT-DSは、高アフィニティーヒト化抗−gp39sFv であると考えられる。 huVL/106vhA-SYおよびhuVL/106vhT-DSは、ヒトgp39と密に結合することが分かっており、また内皮細胞上でのE-セレクチン発現を阻害する機能的活性を示す。 huVL/106vhA-SYは、huVL/106vhT-DSよりも低いレベルで発現されるようにみえるが、これが該ヒト化106sFvのうちで「最もヒトに近い」ものである。実施例１３：全抗体としてのヒト化モノクローナル抗体106 該ヒト化106 sFv-Igを鋳型として使用して、可変軽鎖および３つの型の可変重鎖をPCR 法により増幅した。但し、該ヒト抗体鋳型のシグナル配列をコードする配列を導入したプライマーを使用した。これらのPCR 生成物を、ヒトカッパ(κ) またはヒトガンマ1(γ1)の定常部をコードする配列を含有するベクター中に挿入して、それぞれ完全な軽鎖または重鎖を生成した。これらのベクターは、また該タンパクを発現する安定な細胞系を発生かつ増幅するための適当な薬物耐性遺伝子を含んでいた。該３種の構築物（その名称については第13表を参照のこと）からのタンパクは、COS 細胞中での一時的な発現により製造された。これらのタンパクを、粗製上澄として、抗−ヒトIgM の存在下で、可溶性gp39(sgp39)を使用したＢ細胞増殖の阻害、活性化Ｔ細胞の刺激によるＢ細胞の抗体産生、およびgp 39⁺Ｔ細胞系による内皮細胞上でのE-セレクチン発現の誘発に関するアッセイにおいてテストした。以下の記載は、それぞれ位置24、55および56にアミノ酸Thr 、Asp およびSer を有するヒト化抗−gp39モノクローナル抗体106(h106-2と命名)用の発現ベクターの構築について説明する。この発現ベクターの構築は、一連の中間体プラスミドを経、該プラスミドにおいては種々の機能性領域および制限サイトが操作された。また、所定の可変および他の免疫グロブリンドメインをコードする種々の領域が組み立てられた。簡単に言えば、該最終的なベクターおよび発現カセットを構築するのに使用した３種のプラスミドpD13、pD16およびpD17を先ず構築した。 A. pD13の構築プラスミドpD13は、２段階で、pcDNA3プラスミド（インビトロゲン(Invitroge n)）から構築かつ誘導した。まず、SV40プロモータ／エンハンサーおよびネオマイシン耐性遺伝子を、NaeIによる消化および3.82kbのフラグメントの単離によって取り出した。これを、該SV40プロモータ／エンハンサーおよびpSV2-dhfr からのdhfr遺伝子で置換した。該pSV2-dhfr 配列は、PvuII およびBamHI による消化後の1.93kbフラグメントとして単離された。該3.82および1.93kbのフラグメントを、一緒に結合して、pSV2-dhfr からの該1.93kbフラグメントの突出端部を満たした後に、MC1061バクテリアを形質転換するのに使用した。正確な生成物（pD12 と命名）を、HindIII 消化後、890 bpのフラグメントを遊離させることにより確認した。該第二の段階においては、上で得たベクターをAsp718およびBsp1201 によって消化することにより、該ポリリンカーを交互制限サイトで置換した。オリゴヌクレオチドLH7(SEQ ID #64)およびLH8(SEQ ID #65)をアニーリングし、ExoIIIによりクローニングした。クローニング(K．Hsio，Nucl．Acid．Res.，1993，21:552 8-5529)は、プラスミドpD13を完成するのに利用した。得られたプラスミドを能力細胞E.コリDH５αを形質転換するのに使用し、正しい生成物を該ポリリンカー領域を配列決定することにより確認した。 B. pD16およびpD17の構築プラスミドpD16は、一連の工程により、pcDNA3プラスミド（インビトロゲン(I nvitrogen)）から誘導した。該一連の工程は、(1) 線状化用のCMV プロモータの上流のポリリンカー配列を添加し、(2) SV40プロモータ／エンハンサーおよびネオマイシン耐性遺伝子を削除し、かつこれらをヒストンH3転写終止配列、SV40プロモータ（エンハンサーは削除）およびDHFR遺伝子で置換し、(3) 該CMV プロモータの上流に、ガストリン転写終止配列を挿入する工程を含む。プラスミドpD 17は、線状化ポリリンカーからNheIサイトを除去することにより、pD16から誘導した。プラスミドpD16は、pcDNA3プラスミド（インビトロゲン(Invitrogen)）から、まずBglII で消化し、オリゴヌクレオチドLH1(SEQ ID #58)およびLH2(SEQ ID #5 9)をアニーリングした後、該オリゴヌクレオチドに連結することにより誘導した。連結後、得られたプラスミド(pcDNA3-LSI)を使用して、能力細胞E.コリDH５α を形質転換し、正しい構築物を、NheIおよびNruIによる制限酵素消化に伴う、23 0 bpフラグメントの遊離によって確認した。プラスミドpcDNA3-LSIを、次にNgoMI 、PvuIおよびBsmIで消化した。この消化後、2.0 kbNgoMI-PvuIフラグメントを単離した。プラスミドpD12（上記した）を PvuIおよびSphIで消化して、該SV40エンハンサーを除去し、3.6 kbフラグメントを単離した。該ヒストンH3転写終止配列をコードする、オリゴヌクレオチドLH3 （SEQ ID #60）およびLH4(SEQ ID #61)をアニーリングし、次いで2.0kbNgoMI-Pv uI フラグメントおよび3.6 kbPvuI-SphI フラグメントと連結した。得られたプラスミドpcTwD-LS1 は、NheI＋NciIによる消化後の3.3 、0.95、0.82および0.63 kbのフラグメントの生成により、およびSphI＋BstEIIによる消化後の4.2 、1.0 、0.26および0.23kbのフラグメントの生成により確認された。プラスミドpD16を生成するための、該ガストリン転写終止配列の挿入は、pcTw D-LS1 をBssHIIおよびNarIで消化し、5.7 kbのフラグメントを単離し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドLH5(SEQ ID #62)およびLH6(SEQ ID #63)と接合することにより達成された。結合後に、該生成物を使用して、能力細胞E.コリMC1061 を形質転換し、正しい構築物であることは、NgoMI ＋SpeIによる消化後における 4.8 、0.66および0.31kbのフラグメントの生成およびNgoMI ＋NcoIによる消化後における3.3 、1.0 、0.82および0.67kbのフラグメントの生成によって確認した。プラスミドpD17は、pD16から、BstII およびNheIで消化し、クレノウ(Klenow) ポリメラーゼを使用して、その突出した末端を満たすことにより誘導した。この反応混合物を自己−接合して、能力細胞E.コリDH５αを形質転換するのに使用した。この段階では該NheIサイトを、該線状化ポリリンカーから除去し、かつ以下に説明する、pD17-hGla およびpD17-hK8.H1 の構築における、後の工程のために重要である。 C. 軽鎖発現ベクターの構築ヒト化106 の軽鎖に対する発現ベクターは、２段階で構築した。先ず、ヒトＣ κ遺伝子を含む軽鎖発現カセットを生成し、次いで完成された軽鎖発現ベクター pD16-hK8.L1 の構築を行う（第15図）。簡単に説明すると、2.9 kbEcoRI フラグメントをpGk.11(ウォールズ(Walls)等，Nucl．Acid Res.，1993，21:2921-2029)から単離し、これを予めEcoRI で消化したプラスミドpD13（上記した）に接合した。該ヒトＣκエキソンおよびフランキングイントロン配列を含有するこの構築物(pD13-hCka)を使用して、E.コリCH ５αを形質転換し、正しい生成物が得られたことは、制限消化によって確認した。EcoRI による消化は、5.7 、2.8 および0.3 kbのフラグメントを与え、またSa cIによる消化は7.1 、1.1 および0.5 kbのフラグメントを与えた。該軽鎖発現カセットの構築は、pD13から該フランキングポリリンカー配列と共に該Ｃκフラグメントを取り出して、これをpD16に挿入することによって完了した。プラスミドpD13-hCka をAsp7181 およびBsp1201 で消化して、該Ｃκフラグメントおよびポリリンカー配列を遊離させた。同一の酵素を使用して、pD16を線状化し、該Ｃκ含有フラグメントをpD16と結合してpD16-hCka を形成した。E.コリCH５αの形質転換および増幅後、正しい構築物であることは、Asp7181 および Bsp1201 による消化後の2.9 kbのフラグメントの遊離、およびpD16には存在するがpD13には存在しない制限酵素での消化後の線状化により確認した。該ヌクレオチド配列は、また該構築体の種々の領域の配列決定によっても確認した。該軽鎖発現ベクターの構築の第二段階において、シグナルペプチドおよび該h1 06Vk配列をコードするオリゴヌクレオチド配列を組み立て、pD16-hCkaのEcoRVおよびXhoIサイトに挿入した。該シグナル配列および該h106Vk配列をコードするオリゴヌクレオチド配列は、鋳型としてh106VLクローン10を、およびプライマーLH 9(SEQ ID #66)、LH10(SEQ ID #67)、LH11(SEQ ID #68)およびLH12(SEQ ID #69) を使用して、PCR ソーイング(SOEing)(オーバーラップ伸長反応によるスプライシング)(ホー(Ho)，S.N.等，Gene，1989，77:51-59)により組み立てた。これらの組み合わせで、プライマーLH9、LH10およびLH11はEcoRV 制限サイト、シグナルペプチド、およびhu106Vk の5'末端をコードする。プライマーLH12はＪκ、イントロン配列、およびXhoI制限サイトをコードする。この完成した構築物を使用して、E.コリCH５α能力細胞を、相同組み換え(ベーベック(Babek)等，Nucl．Ac idRes.，1993，21:3601-3602)によって形質転換した。コロニーからのプラスミドDNA を、Asp7181 およびXhoIによる消化後、PCR によって441bp のインサートの存在につきスクリーニングした。該プラスミドの最終的な構築物を第15図に示す。これは、更に完全なＶ領域インサートおよび該フランキング領域の幾つかを、配列決定することによっても確認した。正確なサイズのフラグメントを含有するクローンをpD16-hK8.L1A、pD16 -LK8.L1B、pD16-hK8.L1Cと命名した。クローンpD16-hK8.L1Aの配列決定により、該クローンのヌクレオチド配列中に１つの変異が見つかったが、これは該配列のタンパク発現能を妨害するとは考えられず、実際に成熟軽鎖を与えた。該核酸配列(SEQ ID #76)およびアミノ酸残基配列(SEQ ID #76)を第16図に示す。この変異は開始メチオニンシグナル配列をATCに変えたが、２アミノ酸コドン下流側でコードされるもう一つのメチオニンが存在する。 D. 重鎖発現ベクターの構築ヒト化した全抗体106 重鎖に対する発現ベクターも、２段階で構築した。第一段階においては、ヒトガンマ１定常部のCH1 、CH2 およびCH3 のエキソンをコードするDNA を、pD17に挿入した。第二段階においては、モノクローナル抗体106 の可変部を組み立て、接合して、該重鎖定常部に対する配列を含有するベクターを得た。鋳型としてpNγ1.12(ウォールズ(Walls)等，Nucl．Acid Res.，1993，21:2921 -2929)を使用して、ヒトガンマ１遺伝子を、プライマーLH13(SEQ ID #70)および LH14(SEQ ID #71)を使用して、PCR 法により増幅した。該センスプライマー(LH1 3)は、pIC20RにクローニングするためのClaIサイトを含み、これはヒト γ15'CH1ドメイン配列を伴っていた。最初の２つのアミノ酸残基（アラニンおよびセリン）をコードするヌクレオチドを、NheI制限サイト(GCTAGC)をコードするように変異誘発された。LH14、即ちアンチセンスプライマーは、CH1 中の固有の BstEIIサイトをもち、これはpIC20R内にクローニングするためのXhoIサイトを伴っていた。該0.2kb PCR フラグメントおよびpIC20R（予めClaIおよびXhoIで消化されたもの）を、簡単にエキソヌクレアーゼIII で処理し、E.コリCH５αの形質転換に用いた。挿入断片を含有するコロニーをPCR で決定し、そのDNA 配列を明らかにした。得られたプラスミドをpIC-hGINhe.Bstと命名した。該ヒトゲノム免疫グロブリンガンマ１遺伝子の残りの部分を、pNg1.16(ウォールズ(Walls)等の上記文献)のHindIII およびBamHI で消化することにより、発現カセット中に挿入した。該HindIII サイトはまさにCH1の5'であり、一方BamHIサイトは該CH3 ドメインの3'である。pIC-hGINhe.Bstを、HindIII およびBamHIで消化し、pNg1.16 のHindIII-BamHI フラグメントと接合した。形質転換は、完全なガンマ１遺伝子に続く、該ガンマ１遺伝子の5'末端をもつプラスミドを与える。このことは、該プラスミドをEcoRI で消化した場合に、3.1 および2.6 kbのフラグメントを遊離することにより確認した。該ガンマ１遺伝子の繰り返し部分を、BstEIIによる消化、該プラスミドの自己接合および軽震転換により除去した。該繰り返し体の削除は、該BstEIIサイト近傍の領域のDNA 配列決定により確認した。得られたベクターはpIC-hG1Nhe.Bamと命名され、該ヒトガンマ１CH3 ドメインの該BstEIIサイト3'を介して、コドン１（人工的なNheIサイトをもつ）で開始するヒトガンマ１遺伝子を含む。次いで、pIC-hG1Nhe.Bamを、NheIおよびBamHI で消化して、ガンマ１挿入断片を放出させた。該ガンマ１挿入断片を、前もってNheIおよびBamHI で消化しておいた（上記の）pD13と接合し、E.コリCH５αを形質転換するのに使用した。pD13 -hGla と命名された正しい生成物は、BglII により消化した後の5.1 および3.25 kbのフラグメント生成、およびBglII およびBamHI で消化した後の3.55、3.25および1.54kbのフラグメントを生成により確認した。 pD17-hGla と命名した該発現カセットは、pD13-hGla から、pD13-hGla をAsp7 181 およびBamHI で消化し、2.7 kbのフラグメントを単離することにより構築した。このフラグメントは、ヒトガンマ１遺伝子およびフランキングポリリンカー配列を含む。DM1(Dam)バクテリアを使用して、pD17を増幅し、該単離されたプラスミドを、Asp7181 およびBclIで消化して、5.6 kbのベクターフラグメントを得た。該2.7 kbのヒトガンマ１コードフラグメントを該単離したベクターフラグメントと接合し、能力細胞E.コリCH５αを形質転換するのに使用し、適当な構築が行われたかは、BstEIIによる消化後の、7.13および1.26kbのフラグメントの遊離により確認した。この重鎖発現ベクターの構築は、シグナルペプチドおよび該h106 Vh 配列ASY をコードするPCR フラグメントを、pD17-hGla のNheIおよびXhoIサイトに挿入することにより完了した。該PCR フラグメントは、鋳型としてVHASY 24-17(hhh)をおよびプライマーLH15(SEQ ID #72)、LH16(SEQ ID # 73)、LH17(SEQ ID # 74)およびLH18(SEQ ID # 75)を使用して、スプライシングオーバーラップ伸長(splice overlap extension)により構築した。この組み合わせにおいて、プライマーLH1 5、LH16およびLH17はEcoRV 制限サイト、シグナルペプチドおよびh106Ｖκの5' 末端をコードする。プライマーLH16は、CH1 ドメインの5'末端における人工的Nh eIサイトを介して、該可変重鎖遺伝子のJH部分をコードする。この構築は、該JH 部分とCH1 ドメインとの間にイントロンを与えない。該PCR 反応を２種の外部プライマー（LH15およびLH18）を使用して繰り返して、完全長さの生成物の形成を保証した。該外部プライマーは、また該ベクターのターゲット領域で、該ベクター配列との十分な重なりを与えて、相同組み換えによるクローニングを可能とした。該PCR フラグメントをpD17-hGla に挿入するために、EcoRV およびNheIを使用して、該ベクターを線状化し、該フラグメントを連結し、能力細胞E.コリCH５α を、相同性組み換え(ベイベック(Babeck)等，Nucl．Acid Res.，1993，21:3601- 3602)により形質転換した。挿入断片の存在は、PCR および該可変領域の配列決定により決定した。第17図は、pD17-hK8.H1 についての最終濃度を示すものである。DNA 配列決定は、該挿入断片およびフランキング領域について実施して、該最終生成物を確認した。該配列決定された領域に対する核酸(SEQ ID #78)およびアミノ酸残基(SEQ ID #79)配列を第18図に示した。該可変重鎖領域の位置24、55および56(pD17-hK1.H1)におけるマウスアミノ酸残基、および位置24および56におけるヒトアミノ酸残基、並びに位置55(pD17-hK 6.H1)におけるマウスアミノ酸残基をコードする、コドンを含む他の２つの構築体をも形成した。これらの構築は、pD17-hK8.H1 について上記した方法と同様な方法で実施した（但し、それぞれPCR 用鋳型VHTDS 15-34(mmm)およびVHADY 7-8 (hmh)を使用した）。実施例１４：ヒト化モノクローナル抗体106 の生物学的活性のテスト本実施例においては、ヒト化モノクローナル抗体106 の３種の型を、COS 細胞からの一時的発現により製造した。これらの抗体を(1) Ｂ細胞増殖の阻害、(2) 活性化されたＴ細胞で刺激したＢ細胞による抗体産生、および(3) 内皮細胞上でのE-セレクチン発現の誘発についてテストした。 COS 細胞のトランスフェクションは、以前に記載されたように実施した（リンスレイ(Linsley)等，J．Exp．Mrd.，1991，173:721-730;アルフォ＆シード(Aruf fo and Seed)，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1987，84:8573-8577）。プラスミドDNA を、全体積12ml/150mmプレート中で、１μg/mlの量で、トランスフェクション培地に添加した。７〜10日後に、該培地を集め、遠心処理して、清浄化し、上記のようにプロテインＡセファロースカラムに通した。次いで、このカラムをPBS で洗浄し、結合した抗体を、pH 3.0の0.05M クエン酸ナトリウムで溶出した。画分を中和し、プールし、かつ冷PBS に対して透析した。該透析した溶出物をセントリプレプ(Centriprep)濃縮器（アマーシャム(Amersham)）を使用して濃縮し、またタンパク濃度を、1.35mlmg^-1cm^-1なる吸光係数を使用して、 280 nmにおける吸光度により決定した。可溶性gp39(sgp39)および抗−ヒトIgM によるＢ細胞増殖の阻害を、sgp39 、ウサギ抗−ヒトIgM 免疫ビーズおよび変動する量の該ヒト化した106 モノクローナル抗体の存在下で、96−ウエルプレート中で、72時間、37℃、6% CO₂の条件下で、5x10⁵個の静止期ヒト扁桃細胞を培養することにより測定した。次いで、該プレートを１μCi／ウエル[³H]- チミジンで18時間パルス処理し、かつ[³H]の取り込み量を測定した。全てのテストは３回実施し、結果は、培地のみの中に維持した培養物と比較した％阻害率として表した。第19図に見られるように、モノクローナル抗体106 の全体で３つの完全抗体構築物は、可溶性gp39および抗−ヒト IgM による、Ｂ細胞増殖の刺激を阻害することができた。位置24、55および56におけるマウス配列由来のアミノ酸残基を含有する構築物は、元のマウス106 抗体と最も高い類似性を有していた。活性化されたＴ細胞で刺激したヒト末梢Ｂ細胞による抗体産生を、上記のようにテストした。簡単にいえば、ヒト末梢血単核細胞は、単球およびナチュラルキラー細胞に乏しく、従ってＥロゼット処理により、Ｔ細胞とＢ細胞とに分離された。この単離されたＴ細胞をマイトマイシンＣで処理し、次いで変動する濃度の種々の形状のヒト化した106 モノクローナル抗体の存在下で、96ウエルプレートの、抗-CD3モノクローナル抗体を被覆したウエル内で、Ｂ細胞と同時に該Ｔ細胞を培養した。全てのテストは３回宛て実施し、得られた結果は、如何なる抗−gp 39モノクローナル抗体をも含まない培地を含む培養物と比較した％阻害率として表した。第20図から理解されるように、該抗体は全て、活性化Ｔ細胞のＢ細胞による抗体産生を刺激する能力を少なくとも部分的に遮断できた。該ヒト化した抗体の何れも、抗体産生の遮断において、マウス抗−gp39モノクローナル抗体106 程には効果的ではなかった。位置24、55および56にマウスアミノ酸残基を含有する該抗体、h106-2は最も上首尾のものであった。また、該ヒト化した完全抗体構築物を、gp39⁺Ｔ細胞系による、内皮細胞上でのE-セレクチン発現の誘発を阻止する能力についてもテストした。上記のようにして、但しヒト臍帯静脈内皮細胞は、該ヒト化した抗−gp39モノクローナル抗体の存在下で、sgp39 の代わりに、BMS-2 細胞（本質的にgp39を発現することが知られているジャーカット細胞系）と共に、同時培養した。４時間後に、E-セレクチン発現のレベルをELISA 法により測定した。結果は第21図に示す。前の実験と同様に、このアッセイの結果は、該ヒト化した全ての完全抗体構築物が、gp39とCD40との間の相互作用を阻止することを立証しており、従ってこの場合においては、活性化Ｔ細胞による、内皮細胞上でのE-セレクチン発現の誘導を防止した。また、上記アッセイによって立証されたように、位置24、55および 56にマウスアミノ酸残基を含有する該構築体、h106-2は、該親マウスモノクローナル抗体106 と最も類似していた。細胞系の寄託以下のハイブリドーマ細胞系は、12301 パークローンドライブ，ロックビル，メリーランド20852-2776，USA のアメリカンタイプカルチャーコレクション(Ame rican Type Culture Collection: ATCC)に、ブダペスト条約に基づいて寄託された。ハイブリドーマ ATCC名称 39-1.29 HB 11808 39-1.132 HB 11809 39-1.134 HB 11810 39-1.106 HB 11811 39-1.7 HB 11812 39-1.37 HB 11813 39-1.77 HB 11814 39-1.59 HB 11815 39-1.122 HB 11816 39-1.156 HB 11817 39-1.128 HB 11818 39-1.124 HB 11819 39-1.26 HB 11820 39-1.138 HB 11821 39-1.3 HB 11822 39-7.3E12 HB 11823 39-5.6E9 39-9.246 39-9.11 39-9.274

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者ホーレンボーダイアンアメリカ合衆国ワシントン州 98117− 2235 シアトルトゥエルヴスノースウェスト 9612 (72)発明者ギリーランドリサケイイギリスオックスフォードオーエックス２８エルエイチハーバードロード 23 (72)発明者ゴードンマーシアエルアメリカ合衆国ワシントン州 98117− 2523 シアトルノースウェストナインティエイスストリート 2612 (72)発明者バヨラートユルゲンアメリカ合衆国ワシントン州 98037− 7542 リンウッドサーティセヴンスアベニューウェスト 17406 (72)発明者アルッフォアレヤンドロアアメリカ合衆国ワシントン州 98020− 3334 エドモンズスプラース 1012 (72)発明者ハーリスリンダジェイアメリカ合衆国ワシントン州 98112− 3313 シアトルシックスティーンスアベニューイースト 1214

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトgp39に対して特異的であり、(a) ヒトgp39の変異型および野性型gp39に対して同様な結合活性にて結合し、ここで該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸202 およびチロシン145 、アスパラギン180 、またはフェニルアラニン 201 を含み、(b) 野性型gp39に対する結合活性と比較して、変異gp39に対する低い結合活性を有し、ここでgp39の該変異型はアラニンで置換されたリジン143 、またはグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 を含み、かつ(c) ウエスタンブロットによってはgp39と反応しないことを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。２．該抗体がATCC HB 11822 と命名されたハイブリドーマ39-1.3、ATCC HB 1181 6 と命名されたハイブリドーマ39-1.122、またはATCC HB 11821 と命名されたハイブリドーマ39-1.138により分泌されるものである、請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。３．該フラグメントが、ATCC HB 11822 と命名されたハイブリドーマ39-1.3、AT CC HB 11816 と命名されたハイブリドーマ39-1.122、またはATCC HB 11821と命名されたハイブリドーマ39-1.138により分泌される抗体から誘導されたものである、請求の範囲第１項に記載の抗原結合フラグメント。４．該フラグメントが、Fab、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第３項に記載の抗原結合フラグメント。５．該タンパクがsFv、請求の範囲第２項に記載の抗体の可変部を含有する組み換えタンパクまたはヒト化抗体である、請求の範囲第１項に記載の組み換え結合タンパク。６．ヒトgp39に対して特異的であり、(a) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、幾分低い結合活性でヒトgp39の変異型と結合し、ここでgp39の該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸202 およびチロシン145 、アスパラギン 180 またはフェニルアラニン201 を含み、(b) 野性型gp39に対する結合活性と比較して、変異gp39に対する低い結合活性を有し、ここでgp39の該変異型はアラニンで置換されたリジン143 、またはグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 を含み、かつ(c) ウエスタンブロットによってはgp39と反応しないことを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。７．該抗体が、ATCC HB 11815 と命名されたハイブリドーマ39-1.59 により分泌されるものである、請求の範囲第６項に記載のモノクローナル抗体。８．該フラグメントが、ATCC HB 11815 と命名されたハイブリドーマ39-1.59 により分泌される抗体から誘導される、請求の範囲第７項に記載の抗原結合フラグメント。９．該フラグメントが、Fab、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第８項に記載の抗原フラグメント。 10．該タンパクがsFv または請求の範囲第７項に記載の抗体の可変部を含有する組み換えタンパクである、請求の範囲第６項に記載の組み換え結合タンパク。 11．ヒトgp39に対して特異的であり、(a) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、幾分低い結合活性でヒトgp39の変異型と結合し、ここでgp39の該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸202 およびセリン131 およびスレオニン 135 、チロシン145 、アスパラギン180 、またはフェニルアラニン201 を含み、 (b) 野性型gp39に対する結合活性と比較して、変異gp39に対する低い結合活性を有し、ここでgp39の該変異型はアラニンで置換されたリジン145 、またはグルタミン酸129 を含み、かつ(c) ウエスタンブロットによってはgp39と反応しないことを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 12．該抗体が、ATCC HB 11813 と命名されたハイブリドーマ39-1.37 またはATCC HB 11809 と命名されたハイブリドーマ39-1.132により分泌されるものである、請求の範囲第11項に記載のモノクローナル抗体。 13．該フラグメントが、ATCC HB 11813 と命名されたハイブリドーマ39-1.37 またはATCC HB 11809 と命名されたハイブリドーマ39-1.132により分泌される抗体由来のものである、請求の範囲第11項に記載の抗原結合フラグメント。 14．該フラグメントが、Fab 、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第11項に記載の抗原結合フラグメント。 15．該タンパクがsFv、請求の範囲第12項に記載の抗体の可変部を含有する組み換えタンパクまたはヒト化抗体である、請求の範囲第11項に記載の組み換え結合タンパク。 16．ヒトgp39に対して特異的であり、(a) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、幾分低い結合活性でヒトgp39の変異型と結合し、ここでgp39の該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸202 およびセリン131 およびスレオニン 135 、チロシン145 、アスパラギン180 、またはフェニルアラニン201 を含み、 (b) 野性型gp39に対する結合活性と比較して、変異gp39に対する低い結合活性を有し、ここでgp39の該変異型はアラニンで置換されたリジン143 、またはグルタミン酸129 を含み、かつ(c) ウエスタンブロットによってgp39と反応することを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 17．該抗体が、ATCC HB 11819 と命名されたハイブリドーマ39-1.124またはATCC HB 11817 と命名されたハイブリドーマ39-1.156により分泌されるものである、請求の範囲第16項に記載のモノクローナル抗体。 18．該フラグメントが、ATCC HB 11819 と命名されたハイブリドーマ39-1.124またはATCC HB 11817 と命名されたハイブリドーマ39-1.156により分泌される抗体由来のものである、請求の範囲第16項に記載の抗原結合フラグメント。 19．該フラグメントが、Fab 、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第18項に記載の抗原結合フラグメント。 20．該タンパクがsFv 、請求の範囲第17項に記載の抗体の可変部を含有する組み換えタンパクまたはヒト化抗体である、請求の範囲第16項に記載の組み換え結合タンパク。 21．ヒトgp39に対して特異的であり、(a) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、幾分低いか同等な結合活性でヒトgp39の変異型と結合し、ここでgp39 の該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸202およびグルタミン酸129、セリン131 およびスレオニン135 、チロシン145 、アスパラギン180 またはフェニルアラニン201 を含み、(b) アラニンで置換されたリジン143 を含む変異gp39に対する低い結合活性を有し、かつ(c) ウエスタンブロットによってはgp39と反応しないことを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 22．該抗体が、ATCC HB 11812 と命名されたハイブリドーマ39-1.7、ATCC HB 11 818 と命名されたハイブリドーマ39-1.128またはATCC HB 11820 と命名されたハイブリドーマ39-1.26 により分泌されるものである、請求の範囲第21項に記載のモノクローナル抗体。 23．該フラグメントが、ATCC HB 11812 と命名されたハイブリドーマ39-1.7、AT CC HB 11818 と命名されたハイブリドーマ39-1.128またはATCC HB 11820 と命名されたハイブリドーマ39-1.26により分泌される抗体由来のものである、請求の範囲第21項に記載の抗原結合フラグメント。 24．該フラグメントが、Fab 、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第23項に記載の抗原結合フラグメント。 25．該タンパクがsFv 、請求の範囲第22項に記載の抗体の可変部を含有する組み換え結合タンパクまたはヒト化抗体である、請求の範囲第21項に記載の組み換え結合タンパク。 26．ヒトgp39に対して特異的であり、(a) 野性型gp39およびヒトgp39の変異型と同等な結合活性で結合し、ここでgp39の該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 、チロシン145 、またはアスパラギン180 を含み、(b) アラニンで置換されたフェニルアラニン201 およびグルタミン酸202 を含む、野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、変異gp39に対する低い結合活性を有し、(c) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、変異gp39に対する幾分低い結合活性を有し、ここでgp39の該変異型はアラニンで置換されたリジン143 を含み、かつ(c) ウエスタンブロットによってgp39と結合することを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 27．該抗体が、ATCC HB 11814 と命名されたハイブリドーマ39-1.77、ATCC HB 1 1811 と命名されたハイブリドーマ39-1.106またはATCC HB 11810 と命名されたハイブリドーマ39-1.134により分泌されるものである、請求の範囲第26項に記載のモノクローナル抗体。 28．該フラグメントが、ATCC HB 11814 と命名されたハイブリドーマ39-1.77、 ATCC HB 11811 と命名されたハイブリドーマ39-1.106またはATCC HB 11810 と命名されたハイブリドーマ39-1.134により分泌される抗体から誘導される、請求の範囲第26項に記載の抗原結合フラグメント。 29．該フラグメントが、Fab 、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第26項に記載の抗原結合フラグメント。 30．該タンパクがsFv 、請求の範囲第27項に記載の抗体の可変部を含有する組み換え結合タンパクまたはヒト化抗体である、請求の範囲第26項に記載の組み換え結合タンパク。 31．該タンパクが、106 sFv-Ig、7 sFv-Ig、ヒト化106 sFv-Igまたはヒト化7 sF v-Igである、請求の範囲第30項に記載の組み換え結合タンパク。 32．該タンパクがヒト化モノクローナル抗体106 である、請求の範囲第30項に記載の組み換え結合タンパク。 33．ヒトgp39に対して特異的であり、(a) 野性型gp39およびヒトgp39の変異型に対して、同等な結合活性で結合し、ここでgp39の該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 、リジン143 、チロシン 145 、またはアスパラギン180 を含み、(b) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、変異gp39に対する低い結合活性を有し、ここでgp39の該変異体はアラニンで置換されたフェニルアラニン201 およびグルタミン酸202 を含み、かつ (c) ウエスタンブロットによってgp39と結合することを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 34．該抗体が、ATCC HB 11808 と命名されたハイブリドーマ39-1.29 により分泌されるものである、請求の範囲第33項に記載のモノクローナル抗体。 35．該フラグメントが、ATCC HB 11808 と命名されたハイブリドーマ39-1.29 により分泌される抗体由来のものである、請求の範囲第33項に記載の抗原結合フラグメント。 36．該フラグメントが、Fab 、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第35項に記載の抗原結合フラグメント。 37．該タンパクがsFv 、ATCC HB 11808 と命名されたハイブリドーマ39-1.29 により生成される抗体の可変部を含有する組み換えタンパクまたはヒト化抗体である、請求の範囲第33項に記載の組み換え結合タンパク。 38．ヒトgp39に対して特異的であり、(a) 野性型gp39およびヒトgp39の変異型に対して、同等な結合活性で結合し、ここでgp39の該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 、チロシン145 、またはアスパラギン180 を含み、(b) 野性型gp39と比較した場合に、変異gp39に対して幾分低い結合活性を有し、ここで該変異体はアラニンで置換されたリジン143 を含み、かつ(c) ウエスタンブロットによってはgp39と結合しないことを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 39．該抗体が、ATCC HB 11823 と命名されたハイブリドーマ39-7.3E12 により分泌されるものである、請求の範囲第38項に記載のモノクローナル抗体。 40．該フラグメントが、ATCC HB 11823 と命名されたハイブリドーマ39-7.3E12 により分泌される抗体由来のものである、請求の範囲第38項に記載の抗原結合フラグメント。 41．該フラグメントが、Fab 、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第40項に記載の抗原結合フラグメント。 42．該タンパクがsFv 、ATCC HB 11823 と命名されたハイブリドーマ39-7.3E12 により生成される抗体の可変部を含有する組み換えタンパクまたはヒト化抗体である、請求の範囲第38項に記載の組み換え結合タンパク。 43．gp39に対して特異的であり、(a) 野性型gp39およびヒトgp39の変異型に対して、同等な結合活性で結合し、ここで該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸129 を含み、(b) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、幾分低い結合活性でヒトgp39の変異型に対して結合し、ここでgp39の該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸202 およびセリン131 およびスレオニン135 、アスパラギン180 、またはフェニルアラニン201 を含み、(c) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、変異gp39に対する低い結合活性をもち、ここでgp39の該変異体はアラニンによって置換されたチロシン145またはリジン143を含み、かつ (d) ウエスタンブロットによってはgp39と反応しないことを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 44．該抗体が、ATCC HB と命名されたハイブリドーマ39-5.6E9により分泌れるものである、請求の範囲第43項に記載のモノクローナル抗体。 45．該フラグメントが、ATCC HB と命名されたハイブリドーマ39-5.6E9により分泌される抗体由来のものである、請求の範囲第43項に記載の抗原結合フラグメント。 46．該フラグメントが、Fab 、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第45項に記載の抗原結合フラグメント。 47．該タンパクがsFv 、請求の範囲第44項に記載の抗体の可変部を含有する組み換えタンパクまたはヒト化抗体である、請求の範囲第43項に記載の組み換え結合タンパク。 48．ヒトgp39に対して特異的であり、(a) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、同等または幾分低い結合活性で、ヒトgp39の変異型と結合し、ここで gp39の該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸202 およびグルタミン酸12 9 、セリン131 およびスレオニン135 、リジン143 、チロシン145 、アスパラギン180 、またはフェニルアラニン201 を含み、かつ(b) ウエスタンブロットによってgp39と反応することを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 49．該抗体が、ATCC HB と命名されたハイブリドーマ39-9.246により分泌されるものである、請求の範囲第48項に記載のモノクローナル抗体。 50．該フラグメントが、ATCC HB と命名されたハイブリドーマ39-9.246により分泌される抗体由来のものである、請求の範囲第48項に記載の抗原結合フラグメント。 51．該フラグメントが、Fab 、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第50項に記載の抗原結合フラグメント。 52．該タンパクがsFv 、請求の範囲第49項に記載の抗体の可変部を含有する組み換えタンパクまたはヒト化抗体である、請求の範囲第48項に記載の組み換え結合タンパク。 53．ヒトgp39に対して特異的であり、(a) 野性型gp39およびヒトgp39の変異型に対して、同等な結合活性で結合し、ここで該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸202 およびグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 、チロシン145 またはフェニルアラニン201 を含み、(b) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に幾分低い結合活性をもち、ここでgp39の該変異型はアラニンで置換されたリジン143 を含み、(c) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、変異gp39に対する低い結合活性を有し、ここで該変異型はアラニンで置換されたアスパラギン180 を含み、かつ(d) ウエスタンブロットによってはgp39と反応しないことを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 54．該抗体が、ATCC HB と命名されたハイブリドーマ39-9.11 により分泌されるものである、請求の範囲第53項に記載のモノクローナル抗体。 55．該フラグメントが、ATCC HB と命名されたハイブリドーマ39-9.11 により分泌される抗体由来のものである、請求の範囲第53項に記載の抗原結合フラグメント。 56．該フラグメントが、Fab 、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第55項に記載の抗原結合フラグメント。 57．該タンパクがsFv 、請求の範囲第54項に記載の抗体の可変部を含有する組み換えタンパクまたはヒト化抗体である、請求の範囲第53項に記載の組み換え結合タンパク。 58．ヒトgp39に対して特異的であり、(a) 野性型gp39およびヒトgp39の変異型に対して、同等な結合活性で結合し、ここで該変異体はアラニンで置換されたグルタミン酸202 およびグルタミン酸129 、セリン131 およびスレオニン135 、チロシン145 またはフェニルアラニン201 を含み、(b) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に幾分低い結合活性をもち、ここでgp39の該変異型はアラニンで置換されたリジン143 を含み、(c) 野性型gp39に対する結合活性と比較した場合に、変異gp39に対する低い結合活性を有し、ここで該変異型はアラニンで置換されたアスパラギン180を含み、かつ(d) ウエスタンブロットによってgp39と反応することを特徴とする、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 59．該抗体が、ATCC HB と命名されたハイブリドーマ39-9.274により分泌されるものである、請求の範囲第58項に記載のモノクローナル抗体。 60．該フラグメントが、ATCC HB と命名されたハイブリドーマ39-9.274により分泌される抗体由来のものである、請求の範囲第58項に記載の抗原結合フラグメント。 61．該フラグメントが、Fab 、F(ab')₂またはFvである、請求の範囲第60項に記載の抗原結合フラグメント。 62．モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクであって、該抗体がヒトgp39と反応性であるが、変異ヒトgp39とは高い反応性をもたず、位置129におけるグルタミン酸がアラニンで置換されていることを特徴とする上記のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 63．該抗体、結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、更にウエスタンブロットによってgp39と結合することによって特徴付けられる、請求の範囲第62 項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 64．該抗体、結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、更にウエスタンブロットによってはヒトgp39を識別することができないことによって特徴付けられる、請求の範囲第62項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 65．モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクであって、該抗体がヒトgp39と反応性であるが、ヒトgp39の変異体とは高い反応性をもたず、位置131 におけるセリンおよび位置135 におけるスレオニンがアラニンで置換されていることを特徴とする上記のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 66．該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、更にウエスタンブロットによってヒトgp39と、該抗体またはその抗原結合フラグメントとの結合によって特徴付けられる、請求の範囲第65項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 67．該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、更にウエスタンブロットによってはヒトgp39を識別することができないことによって特徴付けられる、請求の範囲第65項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 68．モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクであって、該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクがヒト gp39と反応性であるが、ヒトgp39の変異体とは同様な反応性をもたず、位置143 におけるリジンがアラニンで置換されていることを特徴とする上記のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 69．該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、更にウエスタンブロットによってgp39と結合できないことによって特徴付けられる、請求の範囲第68項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 70．該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、更にウエスタンブロットによってgp39と結合できることによって特徴付けられる、請求の範囲第68項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 71．モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクであって、該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクがヒト gp39と反応性であるが、ヒトgp39の変異体とは高い反応性をもたず、位置145 におけるチロシンがアラニンで置換されていることを特徴とする上記のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 72．該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、更にウエスタンブロットによってgp39と結合できないことによって特徴付けられる、請求の範囲第71項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたはその組み換え結合タンパク。 73．モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクであって、該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクがヒト gp39と反応性であるが、ヒトgp39の変異体とは同様な反応性をもたず、位置 180 におけるアスパラギンがアラニンで置換されていることを特徴とする上記のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 74．該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、更にウエスタンブロットによってgp39と結合できないことによって特徴付けられる、請求の範囲第73項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 75．該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、更にウエスタンブロットによってgp39と結合できることによって特徴付けられる、請求の範囲第73項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 76．モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクであって、該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクがヒト gp39と反応性であるが、ヒトgp39の変異体とは高い反応性をもたず、位置201 におけるフェニルアラニンおよび位置202 におけるグルタミン酸がアラニンで置換されていることを特徴とする上記のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 77．該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、更にウエスタンブロットによってgp39と結合できないことによって特徴付けられる、請求の範囲第76項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 78．該抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、更にウエスタンブロットによってgp39と結合できることによって特徴付けられる、請求の範囲第76項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 79．X-結合高IgM 症候群の検出法であって、 a) 患者から末梢血リンパ細胞を単離し、 b) 該単離された末梢血リンパ細胞を活性化し、 c) 該単離しかつ活性化した末梢血リンパ細胞を固定化しかつ透過性とし、 d) 請求の範囲第１〜78項の何れか１項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクを、該活性化し、固定しかつ透過性とされた末梢血リンパ細胞と混合し、 e) 該細胞と結合した抗体を検出する、各工程を含むことを特徴とする、上記方法。 80．該抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクが、検出可能な標識と複合化されている、請求の範囲第79項に記載の方法。 81．該方法が、更に該工程(d) の後に、該抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクに対して特異的である、標識された第二の抗体を添加する工程をも含む、請求の範囲第79項に記載の方法。 82．該標識が、発蛍光団、放射性同位元素、酵素または発色団である、請求の範囲第81項に記載の方法。 83．検出可能なマーカーと複合化されている、請求の範囲第１〜78項の何れか１項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 84．該検出可能なマーカーが発蛍光団、放射性同位元素、酵素または発色団である、請求の範囲第83項に記載のモノクローナル抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 85．抗体が治療薬と複合化されている、請求の範囲第１〜78項の何れか１項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 86．該治療薬が、放射性同位元素、毒素または化学療法剤である、請求の範囲第 85項に記載のモノクローナル抗体、抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク。 87．該組み換え結合タンパクが、抗原およびタンパク毒素または治療薬と、融合タンパクとして結合することができる、可変部を含むことを特徴とする、請求の範囲第１〜78項の何れか１項に記載の組み換え結合タンパク。 88．アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されているハイブリドーマ HB 11808、HB 11809、HB 11810、HB 11811、HB 11812、HB 11813、HB 11814、 HB 11815、HB 11816、HB 11817、HB 11818、HB 11819、HB 11820、HB 11821、HB 11822、HB 11823、HB 、HB 、HB およびHB 。 89．SEQ ID #12のアミノ酸残基配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変部をコードする、単離されかつ精製された核酸配列。 90．該核酸配列がSEQ ID #11で示されるものである、請求の範囲第89項に記載の核酸配列。 91．SEQ ID #14のアミノ酸残基配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変部をコードする、単離されかつ精製された核酸配列。 92．該核酸配列がSEQ ID #13で示されるものである、請求の範囲第91項に記載の核酸配列。 93．SEQ ID #16のアミノ酸残基配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変部をコードする、単離されかつ精製された核酸配列。 94．該核酸配列がSEQ ID #15で示されるものである、請求の範囲第93項に記載の核酸配列。 95．SEQ ID #18のアミノ酸残基配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変部をコードする、単離されかつ精製された核酸配列。 96．該核酸配列がSEQ ID #17で示されるものである、請求の範囲第95項に記載の核酸配列。 97．請求の範囲第１〜78項の何れか１項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクと、製薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、薬理組成物。 98．検出可能なマーカーと複合化された、請求の範囲第１〜78項の何れか１項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクと、製薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、薬理組成物。 99．治療薬と複合化された、請求の範囲第１〜78項の何れか１項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパクと、製薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、薬理組成物。 100．動物に、有効量の請求の範囲第76項に記載の薬理組成物を投与する工程を含む、動物中のＢ細胞の活性化を阻害する方法。 101．該動物がヒトである、請求の範囲第100 項に記載の方法。 102．動物に、有効量の請求の範囲第78項に記載の薬理組成物を投与する工程を含む、動物中のＢ細胞の活性化を阻害する方法。 103．該動物がヒトである、請求の範囲第102 項に記載の方法。 104．動物に、腫瘍阻害量の請求の範囲第99項に記載の薬理組成物を投与する工程を含む、gp39抗原を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。 105．該動物がヒトである、請求の範囲第104 項に記載の方法。 106．該治療薬が放射性同位元素または毒素である、請求の範囲第104 項に記載の方法。 107．該Ｂ細胞の活性化の阻害が自己免疫応答、移植された器官の拒絶反応、移植片−宿主疾患、アレルギー性応答、または炎症性応答を防止する、請求の範囲第102 項に記載の方法。 108．該自己免疫疾患が、乾癬、リウマトイド関節炎、全身紅斑性狼瘡または真正糖尿病である、請求の範囲第107 項に記載の方法。 109．患者において、表面上でgp39を発現する細胞の像形成方法であって、 (a) 患者に、該gp39を発現する細胞の表面上に、結合タンパク／抗原錯体の形成を可能とする条件下で、請求の範囲第97項に記載の薬理組成物を投与し、 (b) 該検出可能なマーカーの存在によって示される、該細胞表面上の、該結合タンパク／抗原錯体の存在を検出する、工程を含むことを特徴とする、上記方法。