JPH1052261A - 再構成動物組織 - Google Patents
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- JPH1052261A JPH1052261A JP8211102A JP21110296A JPH1052261A JP H1052261 A JPH1052261 A JP H1052261A JP 8211102 A JP8211102 A JP 8211102A JP 21110296 A JP21110296 A JP 21110296A JP H1052261 A JPH1052261 A JP H1052261A
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生体外に取り出して培養した肝細胞について
解析し、生体内と類似の再構成組織を提供する。 【解決手段】 生体外に取り出して培養した肝細胞につ
いて電子顕微鏡による詳細な観察、解析を行うことによ
り生体内と類似の再構成組織を提供することが可能とな
る。
解析し、生体内と類似の再構成組織を提供する。 【解決手段】 生体外に取り出して培養した肝細胞につ
いて電子顕微鏡による詳細な観察、解析を行うことによ
り生体内と類似の再構成組織を提供することが可能とな
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体外で肝細胞を
培養することによって得られる再構成動物組織に関する
ものである。
培養することによって得られる再構成動物組織に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、肝細胞を体外に取り出して生体内
と類似の環境を保つための三次元培養法としてスフェロ
イド培養法（日本動物実験代替法学会第５回大会要旨集
p30-33('91)、第２回肝細胞研究会抄録集p11('95)他）
やマトリゲル培養法（日本動物実験代替法学会第５回大
会要旨集p38-41('91)、第２回肝細胞研究会抄録集p24('
95)他）等が開発されている。しかしながら、スフェロ
イド培養法の場合、２〜３週間以上の長期培養によるス
フェロイド中心部の細胞壊死や内部の細胞への物質の浸
透性に問題があり肝臓組織に特徴的な胆管様構造がはっ
きりと見られない。また、マトリゲル培養法の場合、形
成された細胞凝集塊の内部に生体内と類似の胆管様の腔
所が認められるが、基材のマトリゲルとの接触部位で細
胞表面の微絨毛が基材内部に入り込まず細胞、基材間の
相互作用が見られないために機能が低下する。更に、特
開昭６１−２６００２２号公報の人工肝臓様の組織では
再集合した細胞間には毛細胆管様の間隙は認められるも
のの細胞表面の微絨毛の形態や細胞内小器官の状態につ
いては記述がなく生体内と類似の肝臓組織まで発達・分
化しているとは考えられない。以上の理由により生体内
の環境が生体外で充分に反映されないために動物実験代
替法や人工肝臓、薬物代謝研究などへの応用が充分に出
来ない状況にある。
と類似の環境を保つための三次元培養法としてスフェロ
イド培養法（日本動物実験代替法学会第５回大会要旨集
p30-33('91)、第２回肝細胞研究会抄録集p11('95)他）
やマトリゲル培養法（日本動物実験代替法学会第５回大
会要旨集p38-41('91)、第２回肝細胞研究会抄録集p24('
95)他）等が開発されている。しかしながら、スフェロ
イド培養法の場合、２〜３週間以上の長期培養によるス
フェロイド中心部の細胞壊死や内部の細胞への物質の浸
透性に問題があり肝臓組織に特徴的な胆管様構造がはっ
きりと見られない。また、マトリゲル培養法の場合、形
成された細胞凝集塊の内部に生体内と類似の胆管様の腔
所が認められるが、基材のマトリゲルとの接触部位で細
胞表面の微絨毛が基材内部に入り込まず細胞、基材間の
相互作用が見られないために機能が低下する。更に、特
開昭６１−２６００２２号公報の人工肝臓様の組織では
再集合した細胞間には毛細胆管様の間隙は認められるも
のの細胞表面の微絨毛の形態や細胞内小器官の状態につ
いては記述がなく生体内と類似の肝臓組織まで発達・分
化しているとは考えられない。以上の理由により生体内
の環境が生体外で充分に反映されないために動物実験代
替法や人工肝臓、薬物代謝研究などへの応用が充分に出
来ない状況にある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、以上のような従来技術の問題点を解決するために、
以前に提案した動物細胞培養方法、即ち、基質材料とし
てテロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲンを使用
すると共に培地中に特定の物質を添加する方法（特願平
１-１３７３６２号公報）や還元剤で処理したタイプＩ
コラーゲンを使用する方法（特願平５-７８５８５号公
報）を用いて、培養動物細胞を生体内と類似の環境に保
つことにより、生体内と類似の細胞集合形態を４週間以
上維持できることを見い出し、更に細胞集合体について
詳細な観察を行い生体内と類似の組織が再構成出来るこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発
明の目的は、生体外で肝細胞を培養することによって得
られる生体内と類似の再構成動物組織を提供することで
ある。
は、以上のような従来技術の問題点を解決するために、
以前に提案した動物細胞培養方法、即ち、基質材料とし
てテロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲンを使用
すると共に培地中に特定の物質を添加する方法（特願平
１-１３７３６２号公報）や還元剤で処理したタイプＩ
コラーゲンを使用する方法（特願平５-７８５８５号公
報）を用いて、培養動物細胞を生体内と類似の環境に保
つことにより、生体内と類似の細胞集合形態を４週間以
上維持できることを見い出し、更に細胞集合体について
詳細な観察を行い生体内と類似の組織が再構成出来るこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発
明の目的は、生体外で肝細胞を培養することによって得
られる生体内と類似の再構成動物組織を提供することで
ある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意検討
し、さらに電子顕微鏡による詳細な形態観察を行った結
果、以下の本発明をなすに至ったものである。即ち、本
発明は、生体外で培養される肝細胞が楕円体状の凝集塊
を形成し、その細胞間には毛細胆管様の空隙及び凝集塊
内部には胆管様の腔所を有し、かつ、培養基材に接着し
ている細胞表面の微絨毛が基材内部に入り込んでいるこ
とを特徴とする再構成動物組織である。以下、本発明を
詳細に説明する。
し、さらに電子顕微鏡による詳細な形態観察を行った結
果、以下の本発明をなすに至ったものである。即ち、本
発明は、生体外で培養される肝細胞が楕円体状の凝集塊
を形成し、その細胞間には毛細胆管様の空隙及び凝集塊
内部には胆管様の腔所を有し、かつ、培養基材に接着し
ている細胞表面の微絨毛が基材内部に入り込んでいるこ
とを特徴とする再構成動物組織である。以下、本発明を
詳細に説明する。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明に使用される培養基材は特
に限定されるものではないが、テロペプチドを取り除い
たタイプＩコラーゲンもしくは還元剤で処理されたタイ
プＩコラーゲンをゲル化してなるコラーゲンゲルを用い
るのが効果的である。培養基材の主成分として使用され
るタイプＩコラーゲンとしては、その由来として仔牛真
皮、ブタ皮膚やラット尾腱等があるが、特に、由来動物
種や由来組織に限定されるものではなく、適宜のタイプ
Ｉコラーゲンを使用することができる。テロペプチドを
取り除く方法としては、生体由来の酵素であるペプシン
を使用する方法がある。また、還元剤処理に使用できる
還元剤としては、水素化ホウ素ナトリウム等水溶液で利
用できるものであって、エステルやアミド（ペプチド結
合）の還元は起こさずアルデヒド基の還元を起こすもの
は全て使用可能であり、このような作用を有するもので
あればその種類を問わず、適宜のものを使用することが
出来る。
に限定されるものではないが、テロペプチドを取り除い
たタイプＩコラーゲンもしくは還元剤で処理されたタイ
プＩコラーゲンをゲル化してなるコラーゲンゲルを用い
るのが効果的である。培養基材の主成分として使用され
るタイプＩコラーゲンとしては、その由来として仔牛真
皮、ブタ皮膚やラット尾腱等があるが、特に、由来動物
種や由来組織に限定されるものではなく、適宜のタイプ
Ｉコラーゲンを使用することができる。テロペプチドを
取り除く方法としては、生体由来の酵素であるペプシン
を使用する方法がある。また、還元剤処理に使用できる
還元剤としては、水素化ホウ素ナトリウム等水溶液で利
用できるものであって、エステルやアミド（ペプチド結
合）の還元は起こさずアルデヒド基の還元を起こすもの
は全て使用可能であり、このような作用を有するもので
あればその種類を問わず、適宜のものを使用することが
出来る。
【０００６】本発明に効果的に使用される培養基材は、
テロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲンまたは還
元剤で処理されたコラーゲンを主成分として含有するも
のであり、当該コラーゲンを単独使用するものもしくは
適宜の基質材料を共存せしめたもののいずれであっても
使用することが可能であり、その主要成分であるコラー
ゲンをゲル化させて、コラーゲンゲルの状態で細胞培養
基質として使用することを特徴とするものである。
テロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲンまたは還
元剤で処理されたコラーゲンを主成分として含有するも
のであり、当該コラーゲンを単独使用するものもしくは
適宜の基質材料を共存せしめたもののいずれであっても
使用することが可能であり、その主要成分であるコラー
ゲンをゲル化させて、コラーゲンゲルの状態で細胞培養
基質として使用することを特徴とするものである。
【０００７】ゲル形成の方法は、テロペプチドを取り除
いたタイプＩコラーゲンまたは還元剤で処理されたタイ
プＩコラーゲンを主成分とする所望濃度のコラーゲン溶
液を調製し、当該溶液をリン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ-水
酸化ナトリウム水溶液等を用いて中性にし、２０℃以
上、望ましくは３７℃で静置すると、数時間でゲル化す
る。得られたゲルをリン酸緩衝液や培養液で十分洗浄し
たものを細胞培養基質材料に用いるが、これを長期に保
存する場合は、ゲル化する前の溶液状態で、約４℃で保
管することにより長期保存することが出来る。
いたタイプＩコラーゲンまたは還元剤で処理されたタイ
プＩコラーゲンを主成分とする所望濃度のコラーゲン溶
液を調製し、当該溶液をリン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ-水
酸化ナトリウム水溶液等を用いて中性にし、２０℃以
上、望ましくは３７℃で静置すると、数時間でゲル化す
る。得られたゲルをリン酸緩衝液や培養液で十分洗浄し
たものを細胞培養基質材料に用いるが、これを長期に保
存する場合は、ゲル化する前の溶液状態で、約４℃で保
管することにより長期保存することが出来る。
【０００８】本発明に使用される培養基材を使用して、
肝細胞を培養する方法は、肝細胞を培養基材の上に播く
だけでよく、播種後、数時間〜１日で肝細胞は培養基材
の上面に接着する。肝細胞については、初代培養肝細
胞、株化肝細胞に適用可能であり、肝由来の細胞であれ
ばその種類は特に限定されるものではない。これら肝細
胞を培養基材上で２〜３日間以上培養すると細胞凝集塊
が形成され、細胞間には毛細胆管様の空隙及び凝集塊内
部には胆管様の腔所が形成される。また、培養基材と接
着している細胞表面の微絨毛は基材内部に入り込み生体
内と類似の微絨毛の形態が認められる。更に、細胞内部
には細胞内小器官のミトコンドリア、核、核小体が認め
られ、生体内と類似の組織の再構成が可能となる。
肝細胞を培養する方法は、肝細胞を培養基材の上に播く
だけでよく、播種後、数時間〜１日で肝細胞は培養基材
の上面に接着する。肝細胞については、初代培養肝細
胞、株化肝細胞に適用可能であり、肝由来の細胞であれ
ばその種類は特に限定されるものではない。これら肝細
胞を培養基材上で２〜３日間以上培養すると細胞凝集塊
が形成され、細胞間には毛細胆管様の空隙及び凝集塊内
部には胆管様の腔所が形成される。また、培養基材と接
着している細胞表面の微絨毛は基材内部に入り込み生体
内と類似の微絨毛の形態が認められる。更に、細胞内部
には細胞内小器官のミトコンドリア、核、核小体が認め
られ、生体内と類似の組織の再構成が可能となる。
【０００９】
【実施例】以下、実施例により本発明について更に具体
的に説明する。仔牛真皮よりｐＨ３の塩酸で溶出したテ
ロペプチドを有するタイプＩコラーゲン（無処理コラー
ゲン）０.３％溶液（ｐＨ３）とペプシン３％溶液（ｐ
Ｈ３）を９：１の割合で混合し、４℃で約１日間撹拌を
行なった。この反応溶液と１０倍濃度のリン酸緩衝生理
食塩水と再構成用緩衝液（２.２％ＮａＨＣＯ3、４.７７
％Ｈｅｐｅｓ、０.０５％ＮａＯＨ溶液）を８：１：１
の割合で混合し、３７℃に加温して約１日放置しコラー
ゲンをゲル化させた後、遠心分離にてコラーゲンゲルの
みを分離し、１ｍＭ塩酸に溶解させペプシン処理コラー
ゲン溶液を得た。同じく、仔牛真皮よりｐＨ３の塩酸で
溶出したテロペプチドを有するタイプＩコラーゲン０.
３％溶液（ｐＨ３）と１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩
水と１％水素化ホウ素ナトリウム水溶液を１０：１.
２：１の割合で混合し、４℃で約１日間撹拌を行なっ
た。その後、３７℃に加温して約１日放置しコラーゲン
をゲル化させた後、遠心分離にてコラーゲンゲルのみを
分離し、１ｍＭ塩酸に溶解させ還元処理コラーゲン溶液
を得た。
的に説明する。仔牛真皮よりｐＨ３の塩酸で溶出したテ
ロペプチドを有するタイプＩコラーゲン（無処理コラー
ゲン）０.３％溶液（ｐＨ３）とペプシン３％溶液（ｐ
Ｈ３）を９：１の割合で混合し、４℃で約１日間撹拌を
行なった。この反応溶液と１０倍濃度のリン酸緩衝生理
食塩水と再構成用緩衝液（２.２％ＮａＨＣＯ3、４.７７
％Ｈｅｐｅｓ、０.０５％ＮａＯＨ溶液）を８：１：１
の割合で混合し、３７℃に加温して約１日放置しコラー
ゲンをゲル化させた後、遠心分離にてコラーゲンゲルの
みを分離し、１ｍＭ塩酸に溶解させペプシン処理コラー
ゲン溶液を得た。同じく、仔牛真皮よりｐＨ３の塩酸で
溶出したテロペプチドを有するタイプＩコラーゲン０.
３％溶液（ｐＨ３）と１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩
水と１％水素化ホウ素ナトリウム水溶液を１０：１.
２：１の割合で混合し、４℃で約１日間撹拌を行なっ
た。その後、３７℃に加温して約１日放置しコラーゲン
をゲル化させた後、遠心分離にてコラーゲンゲルのみを
分離し、１ｍＭ塩酸に溶解させ還元処理コラーゲン溶液
を得た。
【００１０】得られたペプシン処理コラーゲンあるいは
還元処理コラーゲン０.３％溶液（ｐＨ３）と１０倍濃
度のリン酸緩衝生理食塩水と再構成用緩衝液（２.２％
ＮａＨＣＯ3、４.７７％Ｈｅｐｅｓ、０.０５％ＮａＯＨ
溶液）を８：１：１の割合で混合し、プラスチック培養
皿の底面に１ないし２mmの厚さに敷いた後、３７℃イン
キュベータ中でゲル化させた。
還元処理コラーゲン０.３％溶液（ｐＨ３）と１０倍濃
度のリン酸緩衝生理食塩水と再構成用緩衝液（２.２％
ＮａＨＣＯ3、４.７７％Ｈｅｐｅｓ、０.０５％ＮａＯＨ
溶液）を８：１：１の割合で混合し、プラスチック培養
皿の底面に１ないし２mmの厚さに敷いた後、３７℃イン
キュベータ中でゲル化させた。
【００１１】得られた各種コラーゲンゲルをＬ−１５培
地で洗浄し培養に用いた。初代培養肝細胞をラットより
コラゲナーゼ灌流法にて分離し、上記コラーゲンゲル上
に５×１０５/cm2の濃度で播種し、３７℃、５％炭酸ガ
スインキュベータ内で培養した。培養液はＬ−１５培地
に牛胎児血清１０％、インシュリン１０−７M、デキサ
メサゾン１０−７M、ＥＧＦ（Epidermal Growth Fact
or）１０ｎｇ/ｍｌ、プロリン３０μｇ/ｍｌ、ジメチル
スルフォキシド２％を加えたものを用い、ゲル上面１な
いし２mm以上の高さまで培養液を加え、２〜３日毎に培
地交換をしながら培養を続けた。
地で洗浄し培養に用いた。初代培養肝細胞をラットより
コラゲナーゼ灌流法にて分離し、上記コラーゲンゲル上
に５×１０５/cm2の濃度で播種し、３７℃、５％炭酸ガ
スインキュベータ内で培養した。培養液はＬ−１５培地
に牛胎児血清１０％、インシュリン１０−７M、デキサ
メサゾン１０−７M、ＥＧＦ（Epidermal Growth Fact
or）１０ｎｇ/ｍｌ、プロリン３０μｇ/ｍｌ、ジメチル
スルフォキシド２％を加えたものを用い、ゲル上面１な
いし２mm以上の高さまで培養液を加え、２〜３日毎に培
地交換をしながら培養を続けた。
【００１２】培養７日目に培養液を取り除き、リン酸緩
衝液で洗浄後、２％グルタールアルデヒド・２％パラホ
ルムアルデヒド混合溶液で細胞及びコラーゲンゲルを固
定処理後、２％オスミウム酸による電子染色、アルコー
ル系列脱水処理を行った。その後、走査電子顕微鏡観察
用のサンプルは、tert - ブチルアルコール置換後、凍
結乾燥を行い、金蒸着して作製した。
衝液で洗浄後、２％グルタールアルデヒド・２％パラホ
ルムアルデヒド混合溶液で細胞及びコラーゲンゲルを固
定処理後、２％オスミウム酸による電子染色、アルコー
ル系列脱水処理を行った。その後、走査電子顕微鏡観察
用のサンプルは、tert - ブチルアルコール置換後、凍
結乾燥を行い、金蒸着して作製した。
【００１３】透過電子顕微鏡用のサンプルは、プロピレ
ンオキサイド置換後、ＥＰＯＮ包埋を行い、超薄切片作
製後、酢酸ウラン、クエン酸鉛の二重染色を施して作製
した。それぞれのサンプルについて電子顕微鏡観察を行
い、図１に示すとおり、楕円体状の細胞凝集塊が形成さ
れ、細胞間には毛細胆管様の空隙及び凝集塊内部には胆
管様の腔所が認められ、細胞内部には細胞小器官のミト
コンドリア、核、核小体も認められ、細胞内部の構造は
生理的な状態と変わらず変性像も見られなかった。ま
た、図２に示すとおり、培養基材と接着する細胞表面の
微絨毛は基材内部に入り込んでいるのが認められた。
ンオキサイド置換後、ＥＰＯＮ包埋を行い、超薄切片作
製後、酢酸ウラン、クエン酸鉛の二重染色を施して作製
した。それぞれのサンプルについて電子顕微鏡観察を行
い、図１に示すとおり、楕円体状の細胞凝集塊が形成さ
れ、細胞間には毛細胆管様の空隙及び凝集塊内部には胆
管様の腔所が認められ、細胞内部には細胞小器官のミト
コンドリア、核、核小体も認められ、細胞内部の構造は
生理的な状態と変わらず変性像も見られなかった。ま
た、図２に示すとおり、培養基材と接着する細胞表面の
微絨毛は基材内部に入り込んでいるのが認められた。
【図１】楕円体状の細胞凝集塊の断面の透過電子顕微鏡
像で、細胞間には毛細胆管様の空隙及び凝集塊内部には
胆管様の腔所が認められる。
像で、細胞間には毛細胆管様の空隙及び凝集塊内部には
胆管様の腔所が認められる。
【図２】培養基材に接着する細胞表面の微絨毛が基材内
部に入り込んでいることを示す図。
部に入り込んでいることを示す図。
Claims (2)
- 【請求項１】 生体外で培養される肝細胞が楕円体状の
凝集塊を形成し、その細胞間には毛細胆管様の空隙及び
凝集塊内部には胆管様の腔所を有し、かつ、培養基材に
接着している細胞表面の微絨毛が基材内部に入り込んで
いることを特徴とする再構成動物組織。 - 【請求項２】 培養される肝細胞が初代培養肝細胞であ
る請求項１記載の再構成動物組織。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8211102A JPH1052261A (ja) | 1996-08-09 | 1996-08-09 | 再構成動物組織 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8211102A JPH1052261A (ja) | 1996-08-09 | 1996-08-09 | 再構成動物組織 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1052261A true JPH1052261A (ja) | 1998-02-24 |
Family
ID=16600450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8211102A Pending JPH1052261A (ja) | 1996-08-09 | 1996-08-09 | 再構成動物組織 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1052261A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006088029A1 (ja) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | School Juridical Person Kitasato Gakuen | 高密度培養組織の製造方法及び高密度培養組織 |
-
1996
- 1996-08-09 JP JP8211102A patent/JPH1052261A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006088029A1 (ja) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | School Juridical Person Kitasato Gakuen | 高密度培養組織の製造方法及び高密度培養組織 |
| JPWO2006088029A1 (ja) * | 2005-02-15 | 2008-07-03 | 学校法人北里学園 | 高密度培養組織の製造方法及び高密度培養組織 |
| JP4671365B2 (ja) * | 2005-02-15 | 2011-04-13 | 学校法人北里研究所 | 高密度培養組織の製造方法及び高密度培養組織 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050107 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050510 |