JPH1054831A

JPH1054831A - 免疫学的分析装置

Info

Publication number: JPH1054831A
Application number: JP16617797A
Authority: JP
Inventors: Sachiko Karaki; 幸子唐木
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1997-06-23
Filing date: 1997-06-23
Publication date: 1998-02-24

Abstract

(57)【要約】【課題】この発明の課題は、免疫複合体の大きさや形
状にばらつきがあっても高精度に測定できると共に、多
項目の分析を短時間で実施できる免疫学的分析装置を提
供しようとするものである。【解決手段】サンプルと、複数種類の分析項目に対応
する抗原又は抗体の夫々を標識抗原又は標識抗体と、複
数の異なる粒径を有し、粒径毎に異なる分析項目に対応
する抗原又は抗体を固相化した複数の担体とを反応させ
る反応装置２７と、該反応装置２７で反応後の担体を含
む反応液２３をフローセル２１に導入して流しながら、
反応液２３中の物質の粒径情報及び標識物質の有無情報
を順次検出するディテクタ２５，２６と、該ディテクタ
２５，２６で検出した２つの検出情報を粒径毎に分別し
て対応させる検出情報分別処理部２９とを備え、この粒
径毎に分別対応させた情報に基づいて複数種類の分析項
目を分析する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、サンプル中の抗原
または抗体と反応する抗体または抗原を固相化した担体
を用いた免疫学的分析装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】血液、体液等に含まれるグロブリン、酵
素等の蛋白質、ホルモン、細菌、ウイルス等はその分子
構造が類似していたり、ごく微量であるために、通常の
分析方法を用いた分析装置では同定、定量が困難であ
る。そこで、これらの物質の分析には、抗原または抗体
を粒子状の担体に固相化して抗原抗体反応を起こすよう
にした免疫学的な分析方法が一般に用いられている。

【０００３】免疫学的分析方法には、例えば、標識物質
を用いるものとして、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセ
イ）、ＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＦＩＡ
（フルオロイムノアッセイ）等がある。また、これらの
標識物質を用いる分析方法は、測定系において、例えば
標識物質で標識した抗体（抗原）とサンプル中の抗原
（抗体）とが抗原抗体反応を起こした免疫複合体（Ｂou
nd）と、抗原抗体反応に関与せず、自由（Ｆree ）な状
態で残余する未反応成分としての標識抗体（抗原）とを
分離する操作、いわゆるＢ−Ｆ分離を必要とするヘテロ
ジニアス法と、必要としないホモジニアス法とに分類さ
れる。

【０００４】上記のヘテロジニアス法による分析方法と
しては、特開昭53-10495号公報において、カラムクロマ
トグラフィーを利用してＢ−Ｆ分離を行うようにしたも
のが提案されている。これは、例えば溶液中の遊離物質
（Ｆree ）を選択的に吸着し、免疫複合体（Ｂound）を
吸着しないイオン交換樹脂や、分子ふるい効果を有する
ゲルクロマトグラフィー用の充填剤を吸着剤として用い
て、所要の反応時間後にサンプルを含む遊離成分を未反
応成分として、Ｂ−Ｆ分離するというものである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、このようにＢ
−Ｆ分離にカラムクロマトグラフィーを用いて行うもの
において、多項目の分析を行うとすると、項目毎にカラ
ムを作成しなければならないと共に、反応液を項目毎に
異なるカラムに吸着させる操作が必要となる。したがっ
て、反応液の所要量が増すと共に、分析操作が煩雑にな
ってしまう。また、各カラムにおいて免疫複合体の大き
さや形状にばらつきがあったり、免疫複合体と遊離物質
との大きさが近接していると、Ｂ−Ｆ分離自体が困難と
なって精度が悪くなるとともに、Ｂ−Ｆ分離によってそ
れ以降の反応が起こらなくなるので、サンプルを効率良
く利用できない。しかも、例えば免疫グロブリン等の試
薬として用いる抗体と同じ分子や、化学的、物理的に類
似した分子の測定には使用できず、分析項目が極めて制
限される。

【０００６】一方、特開昭52-15815号公報に記載された
技術は、複数異なる粒径の担体を用いて２回のＢ−Ｆ分
離工程後に、緩衝液中に懸濁させた担体をフローセルに
導入し、さらにレーザ光によって発生させた蛍光を検出
している。しかし、この技術は、Ｂ−Ｆ分離のための遠
心分離機を要するので、構成が複雑で且つ分析全体にか
かる時間が非常に長くなる上に、２回のＢ−Ｆ分離工程
の前には夫々充分で過剰量のサンプルと標識抗体とを反
応させる必要があるので分析効率が悪い。

【０００７】本発明の目的は、上述した不具合を解決
し、免疫複合体の大きさや形状にばらつきがあっても高
精度に測定できると共に、多項目の分析を短時間で実施
できる免疫学的分析装置を提供しようとするものであ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】請求項１に係る本発明
は、サンプルと分析項目に対応する抗原または抗体を固
相化した多数の担体とを含む混合液を得て反応させるた
めの反応部と、前記反応部で混合後の混合液を前記反応
部から採取しフロ−サイトメータのニードル中に導入す
るためのサンプラと、フロ−セル内を流れる混合液に対
してレ−ザ光を照射してその受光デ−タを得る検出部
と、受光デ−タを粒径で表現される個別デ−タに分別し
粒径毎のデ−タ総量を求めるデ−タ処理部とを有するこ
とを特徴とする。

【０００９】また、請求項２に係る本発明は、サンプル
と分析項目に対応する抗原または抗体を所定の標識物質
で標識した標識抗原または標識抗体と、分析項目に対応
する抗原または抗体を固相化した多数の担体とを含む混
合液を同時または逐次に得て反応させるための反応部
と、前記反応部で混合後の混合液を前記反応部から採取
しフロ−サイトメータのニードル中に導入するためのサ
ンプラと、フロ−セル内を流れる混合液から粒径に関す
る情報と標識物質に関する情報を示す受光デ−タを得る
検出部と、受光デ−タを粒径で表現される個別デ−タに
分別し粒径毎の標識物質量を求めるデ−タ処理部とを有
することを特徴とする。

【００１０】請求項２に係る発明の標識物質は、レ−ザ
光によって蛍光を発生する物質であり、検出部は、レ−
ザ光を照射する手段と共通のレーザ光から散乱光と蛍光
とをそれぞれ受光する手段とを具備することを特徴とす
る。

【００１１】

【発明の実施の形態】図１は本発明の分析装置における
反応模式図の一実施形態を示すものである。本形態にお
いて、符号１，２および３はそれぞれ担体に用いるポリ
スチレン製のラテックスで粒径は例えばラテックス１が
0.5μｍ、ラテックス２が 1.0μｍ、ラテックス３が
1.5μｍというように、各径で均一なものを用いる。符
号４，５および６は各径のラテックス１，２および３に
それぞれ物理的吸着により固相化した固相抗体である。
また、符号７，８および９はサンプルである血清等に含
まれている抗原で、符号１０，１１および１２はそれぞ
れの抗原７，８および９に特異的に結合する抗体をＦＩ
ＴＣ等の蛍光物質で標識した標識抗体である。

【００１２】以下、ヒト免疫グロブリンクラスの特異性
分析を例にとって説明する。粒径 0.5μｍのラテックス
１には抗ヒトIgＧ抗体４を、粒径 1.0μｍのラテックス
２には抗ヒトIgＡ抗体５を、粒径 1.5μｍのラテックス
３には抗ヒトIgＭ抗体６をそれぞれ固相化する。なお、
これらの固相抗体には、ラテックス同志の非特異吸着を
なくす意味と、抗原との特異性を増強する意味で、モノ
クローナル抗体の使用が望ましい。反応は、反応用緩衝
液 200μｌにこれらの抗体結合ラテックス溶液50μｌ
と、ヒトIgＧ７、IgＡ８、IgＭ９等の抗原が含まれたサ
ンプル10μｌと、それぞれＦＩＴＣで標識した抗ヒトIg
Ｇ抗体１０、抗ヒトIgＡ抗体１１、抗ヒトIgＭ抗体１２
の混合溶液50μｌとを添加して行わせる。ここで、標識
抗体１０，１１，１２は非特異吸着を少なく、また反応
速度を高める目的でＦabフラグメントを用いることが望
ましい。また、これらの試薬類は全て同時に添加して反
応液を得るようにしても良いし、また、共通のサンプル
に対して各種の固相抗体および標識抗体を逐次添加した
反応液を得るようにしても良い。

【００１３】ここで、例えば37℃、10分間反応させる
と、各固相抗体ラテックス−抗原−標識抗体の免疫複合
体（Ｂound）１３，１４，１５と残余の標識抗体（Ｆre
e ）１６とが生成される。本形態では、このようにして
サンプルと試薬とを混合して反応させた反応液を採取し
て図２に示すようなフロ−サイトメ−タに導入すること
により、フロ−セル２１内で反応液を流すことができ
る。

【００１４】フローサイトメータは既に知られているよ
うに、細胞の分析専用機であり、フローセル２１中のニ
ードル２２に反応液２３を流し、レーザ光２４をその流
れに照射して細胞から発する散乱光や蛍光を測定する。
通常、前方散乱光はレーザ入射光とほぼ水平に位置する
ディテクタ２５で検知され、主に細胞サイズの測定に用
いられる。蛍光は、レーザ光２４の入射角に対して垂直
方向に位置するディテクタ２６で検知され、細胞表面の
蛍光物質等の測定に用いられる。レーザ光２４は単一波
長であるため、使用できる蛍光色素に制限があるが、本
形態の分析装置において用いる蛍光色素ＦＩＴＣは波長
489nm近くの光を吸収して波長 515nmの蛍光を発するの
で、この場合は波長 488nmのＡｒレーザを用いれば良
い。

【００１５】なお、フローサイトメータとしては、例え
ば米国特許4325706号明細書に記載のものが使用可能で
ある。このようにして、反応後の図１に示す免疫複合体
１３，１４，１５と残余の標識抗体１６とが混ざり合っ
た反応液２３をニードル２２からフローセル２１中に導
入し、ニードル２２中を流れる各免疫複合体と残余の標
識抗体等の各成分のレーザ光２４による散乱光および蛍
光をディテクタ２５および２６でそれぞれ検知すれば、
ディテクタ２５によって各免疫複合体の大きさが測定さ
れ、しかもその大きさは各ラテックスの径が１μｍ前後
であれば、せいぜい数ｎｍの固体抗体−抗原−標識抗体
結合部は誤差範囲となるから、殆どラテックスの粒径に
依存する。また、同時にディテクタ２６により、各ラテ
ックス上に乗った蛍光量／１ラテックスが測定され、こ
れら２つのパラメータに基づいて検出情報分別処理部２
９が図３に示すサイトグラムを出力する。なお、図３に
おいて縦軸は蛍光量を、横軸は粒子径を表す。

【００１６】ここで、抗原抗体反応に関与しなかった残
余の標識抗体は微径であるから、１標識抗体あたりの蛍
光量の位置３１に集中する。また、径が１番小さいラテ
ックスにより結合した図１の免疫複合体１３は位置３２
に、２番目に小さいラテックスにより結合した図１の免
疫複合体１４は、抗原濃度が高かったのでラテックス１
個あたりの蛍光量としてもかなり高い位置３３に示され
る。また、一番ラテックス径が大きかった図１の免疫複
合体１５は、抗原濃度が薄かったので位置３４に示され
ることになる。

【００１７】このようにして蛍光量測定値が得られれ
ば、予めIgＧ，IgＡ，IgＭ等各抗原の既知濃度系列から
同様にして求めた蛍光強度と抗原濃度との関係を表す検
量線に基づいてサンプル中の各抗原濃度を求めることが
できる。

【００１８】以上のように、フローサイトメータと、各
抗原に応じて異なる抗体を固相化したラテックスを用い
るラテックスイムノアッセイとを組み合わせたことによ
り、１台の分析装置で多項目の分析を高速かつ高精度に
実施できる。また、Ｂ−Ｆ分離に伴う反応量の制約が無
いため、１０μｌ程度の少量のサンプルと反応させた大
量のラテックスに関する免疫複合体の大きさを、Ｂ−Ｆ
分離なしにレ−ザ光によりもれなく測定するので、正確
なデ−タを効率良く得られる。また、抗原の種類毎に粒
径が異なるラテックスを同時に用いるようにすれば抗原
別の識別が容易な表示も可能となる。

【００１９】なお、本発明は上述した実施形態にのみ限
定されるものではなく、幾多の変更または変形が可能で
ある。例えば、担体はラテックスに限らず、分子量の均
一な人工細胞等、測定対象に応じて任意の形状や大きさ
のものを用いることができる。また、フローサイトメー
タにソーティング機能を付加して、測定後に免疫複合
体、残余の標識抗体をそれぞれ分離することもできる。
このようにすれば、残余の標識抗体を分離して取り出す
ことができるから、これを再使用することができる。更
に、フローサイトメータに反応装置２７やオートサンプ
ラ２８等を付加することによって自動測定を容易に行う
ことができる。この場合、フローサイトメータにおける
測定速度は約500 粒子／sec であるから、１つのサンプ
ルについて１×10６粒子を測定したとしても、３分前
後で高速に分析することができる。また、本発明は競合
法による分析にも有効に適用することができる。

【００２０】さらに、上述したような構成によれば、一
般のフロ−サイトメ−タを用いた細胞分析のように、担
体同士が結合するような反応に関する分析についても実
施するように設定できる。また、標識物質も、免疫学的
分析において一般に知られているような化学発光用の物
質を用いてもよい。

【００２１】

【発明の効果】本発明によれば、フロ−セル内を流れる
混合液中の免疫複合体をレ−ザ光によりもれなく測定し
てその個別デ−タを粒子径毎に総量でもって表示するの
で、免疫学的反応結果を短時間でかつ高精度に分析でき
る。しかも、反応部で反応させた混合液をサンプラによ
って採取してフローサイトメータのニードル中へ導入す
ることにより、フローセル内で流通させるだけの構成で
あるから、多数の分析を１台の自動化装置で効率良く分
析できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明における一実施形態の反応模式図
である。

【図２】図２はフローサイトメータを説明するための図
である。

【図３】図３は測定データのサイトグラムを示す図であ
る。

【符号の説明】

１，２，３ラテックス４，５，６固相抗体７，８，９抗原１０，１１，１２標識抗体１３，１４，１５免疫複合体１６残余の標識抗体２１フローセル２２ニードル２３反応液２４レーザ光２５，２６ディテクタ２７反応装置２８オートサンプラ２９検出情報分別処理部

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプルと分析項目に対応する抗原また
は抗体を固相化した多数の担体とを含む混合液を得て反
応させるための反応部と、前記反応部で混合後の混合液
を前記反応部から採取しフロ−サイトメータのニードル
中に導入するためのサンプラと、フロ−セル内を流れる
混合液に対してレ−ザ光を照射してその受光デ−タを得
る検出部と、受光デ−タを粒径で表現される個別デ−タ
に分別し粒径毎のデ−タ総量を求めるデ−タ処理部とを
有することを特徴とする免疫学的分析装置。
【請求項２】サンプルと分析項目に対応する抗原また
は抗体を所定の標識物質で標識した標識抗原または標識
抗体と、分析項目に対応する抗原または抗体を固相化し
た多数の担体とを含む混合液を同時または逐次に得て反
応させるための反応部と、前記反応部で混合後の混合液
を前記反応部から採取しフロ−サイトメータのニードル
中に導入するためのサンプラと、フロ−セル内を流れる
混合液から粒径に関する情報と標識物質に関する情報を
示す受光デ−タを得る検出部と、受光デ−タを粒径で表
現される個別デ−タに分別し粒径毎の標識物質量を求め
るデ−タ処理部とを有することを特徴とする免疫学的分
析装置。
【請求項３】標識物質は、レ−ザ光によって蛍光を発
生する物質であり、検出部は、レ−ザ光を照射する手段
と共通のレーザ光から散乱光と蛍光とをそれぞれ受光す
る手段とを具備することを特徴とする請求項２記載の免
疫学的分析装置。