JPH1057063A5 - - Google Patents

Description

【０００４】
Tofler とWoodings ( O. B. Tofler and T. L. Woodings, Med. J. Aust., Vol.2, 479-481, 1981. )は、ビール摂取量別に調査対象集団をグループ分けして13年間の追跡調査を実施し、ビール摂取量と痛風発症頻度との間に正の相関があることを指摘した 。このように疫学研究上では現在、ビールはアルコール飲料の中で高尿酸血症や痛風の罹患リスクの最も高い酒類とみなされている。しかるに、ビールを含め、食品中のプリン体を減少させるような技術は開発されていない。

【００３０】
例えば、DEAE sephacel カラムクロマトグラフィー、硫安沈澱、Phenyl-Sepharose CL-4B、Sephacryl S-200HR 、Mono Q HR 5/5 クロマトグラフィーなどを用いて、プリンヌクレオシダーゼを精製することができる。精製したプリンヌクレオシダーゼからは公知の方法により、N 末端アミノ酸配列、あるいは部分アミノ酸配列などを決定することができる。また、上記出発微生物からの染色体ＤＮＡの単離、ジェノミックライブラリーの作成、スクリーニングは公知の方法によって行うことが出来る。そのような方法は、例えばSambrookらのMolecular Cloning 第2 版（Cold Spring Harbor．1989）に記載されている。

【００３３】
そしてアガロースゲルよりそのＤＮＡ断片を切り出して回収し、ｐＵＣ等のクローニング用プラスミドに組み込み、大腸菌等の宿主を形質転換する。このようなクローンの中から、やはり上述のようにプリンヌクレオシダーゼの部分アミノ酸配列に対応する合成ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることより目的のプリンヌクレオシダーゼをコードするＤＮＡ断片を含む陽性クローンを得ることが出来る。これらのクローンの挿入されたＤＮＡを適当な制限酵素で消化して得られるＤＮＡ断片を、適当なベクター、例えばpUC18あるいはpUC19 にサブクローニングして、その挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をダイデオキジシークエンス法等によって決定することが出来る。

【００４８】
Sephacryl S-200 HRカラム クロマトグラフィー 活性画分（7.5ml ）を5 ｌのバッファーに対して、12時間透析したのち、バッファーにて平衡化したMonoQ HR5/5 カラム（0.5 x 5 cm, 1 ml）に供した。吸着した蛋白質を0 から0.5MのNaClの塩濃度勾配にて溶出し、活性画分を回収した。得られた精製酵素はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて単一なバンドとして検出された。表２にアデノシンを基質として測定した精製表を示す。なお、精製表において無細胞抽出液よりもDEAE-Sephacel カラム クロマトグラフィー後の方が総活性が高くなっており、無細胞抽出液中にヌクレオシダーゼ活性を阻害する物質が含まれている可能性を示唆している。ゲル濾過クロマトグラフィー（TSK-G 3000SW) より分子量172,000 、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動よりサブユニット43,000のホモテトラマーであることが確認された。

【００６２】
実施例１２．プリンヌクレオシダーゼの部分アミノ酸配列の決定
還元カルボキシメチル化プリンヌクレオシダーゼ48 nmole（2.0mg ）を100 μl の0.01Ｍトリス／塩酸緩衝液pH9.0 に懸濁した。ここにリシルエンドペプチダーゼのl ％溶液(0.1Ｍトリス／塩酸緩衝液pH9.0 中）2 μl を添加し、35℃で6 時問インキュベートした。液体中の白濁物は酵素添加後ただちに消え、溶液は透明になった。反応後、反応液を凍結。乾燥することにより反応を停止した。凍結乾燥後、残査を70％蟻酸に溶解しHPLCに供した。

【００７４】
ハイブリダイゼーション溶液を取り除いた後、メンブレンフィルターを洗浄用緩衝液〔2 ×SSC 、0 ．l ％SDS （W ／V ）〕中48℃で15分間の洗浄を4 回行なった。このメンブレンフィルターを乾燥した後、X 線フィルムと増感紙を用いて‐80℃でオートラジオグラフィーを行なった。その結果、EcoRI 断片を挿入したものとHindIII 断片を挿入したものから各々数個の陽性クローンが得られた。
これらの陽性クローン（E1，E2，E3：EcoRI 断片を挿入、H1，H2，H3：HindIII 断片を挿入）からプラスミドＤＮＡを調製しEcoRI,HindIII,EcoRV などの制限酵素で消化して0.8 ％のアガロースゲルにて電気泳動を行ったところ、E1，E2及びE3とH1，H2及びH3はそれぞれ同じ制限酵素パターンを示した。また、そのアガロースゲルからナイロンメンブレンにＤＮＡをトランスファーしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、E1，E2及びE3とH1，H2及びH3はそれぞれ同じ断片にハイブリダイズした。