JPH1059996A - 白血病性芽細胞のアポトーシスをもたらす分化誘導物質と結合した、人のｃ−ｆｅｓ プロト癌遺伝子の一次転写に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用法 - Google Patents
白血病性芽細胞のアポトーシスをもたらす分化誘導物質と結合した、人のｃ−ｆｅｓ プロト癌遺伝子の一次転写に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用法Info
- Publication number
- JPH1059996A JPH1059996A JP9129183A JP12918397A JPH1059996A JP H1059996 A JPH1059996 A JP H1059996A JP 9129183 A JP9129183 A JP 9129183A JP 12918397 A JP12918397 A JP 12918397A JP H1059996 A JPH1059996 A JP H1059996A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fes
- oncogene
- cells
- oligonucleotide
- retinoic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000013518 transcription Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000035897 transcription Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 101001026790 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Fes/Fps Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- 102000053252 human FES Human genes 0.000 title claims abstract description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title abstract description 24
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 title abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 3
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims abstract description 38
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N retinoic acid group Chemical group C\C(=C/C(=O)O)\C=C\C=C(\C=C\C1=C(CCCC1(C)C)C)/C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 claims description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 claims description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 108010015967 Proto-Oncogene Proteins c-fes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002146 Proto-Oncogene Proteins c-fes Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims 1
- -1 phosphate ester Chemical class 0.000 claims 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000004856 capillary permeability Effects 0.000 abstract description 6
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 16
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 16
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 15
- 208000033826 Promyelocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 9
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 5
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 3
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 206010024378 leukocytosis Diseases 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 206010001029 Acute pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101150066717 Rara gene Proteins 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000011861 acute hypotension Diseases 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N atrazine Chemical compound CCNC1=NC(Cl)=NC(NC(C)C)=N1 MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000003674 cytoplasmic vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L methylphosphonate(2-) Chemical compound CP([O-])([O-])=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108700008272 transferrin-polylysine conjugate Proteins 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/311—Phosphotriesters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/312—Phosphonates
- C12N2310/3125—Methylphosphonates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/313—Phosphorodithioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 急性前骨髄球白血病の芽細胞を全トランスレ
チノイン酸で分化誘導して治療する場合、白血球増加症
や毛細管透過性症候群などの副作用が観察される。白血
病のアジュバント治療用に、前記副作用を避けて新製品
と新治療法を開発する。 【解決手段】 人の c-fesプロト癌遺伝子の一次転写と
交雑可能なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
（ＡＳ−ＯＤＮs ）及びそれらを前記転写を不活性化す
るのに使用する。全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）
は白血病性芽細胞のアポトーシスを誘発するために、前
記ＡＳ−ＯＤＮs で前処理された細胞への分化誘導物質
として使用される。更にＡＳ−ＯＤＮs 及びＡＴＲＡを
夫々小瓶に入れて治療用のキットを構成する。
チノイン酸で分化誘導して治療する場合、白血球増加症
や毛細管透過性症候群などの副作用が観察される。白血
病のアジュバント治療用に、前記副作用を避けて新製品
と新治療法を開発する。 【解決手段】 人の c-fesプロト癌遺伝子の一次転写と
交雑可能なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
（ＡＳ−ＯＤＮs ）及びそれらを前記転写を不活性化す
るのに使用する。全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）
は白血病性芽細胞のアポトーシスを誘発するために、前
記ＡＳ−ＯＤＮs で前処理された細胞への分化誘導物質
として使用される。更にＡＳ−ＯＤＮs 及びＡＴＲＡを
夫々小瓶に入れて治療用のキットを構成する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、人のc-fes プロト
癌遺伝子の一次転写に相補的な新しいアンチセンスのオ
リゴヌクレオチド及び上記一次転写を特効的に不活性化
するためのそれらの用法に関する。本発明は又、白血病
性芽細胞のアポトーシスを誘導する特異なc-fes アンチ
センスオリゴヌクレオチドで前処理された細胞への分化
誘導物質全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の用法に
も関する。
癌遺伝子の一次転写に相補的な新しいアンチセンスのオ
リゴヌクレオチド及び上記一次転写を特効的に不活性化
するためのそれらの用法に関する。本発明は又、白血病
性芽細胞のアポトーシスを誘導する特異なc-fes アンチ
センスオリゴヌクレオチドで前処理された細胞への分化
誘導物質全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の用法に
も関する。
【０００２】
【従来の技術】急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）では、白血
病性芽細胞集団の微小環境制御は殆ど完全に効果はな
い、それ故白血病性芽細胞は恐らく幾つかの表示された
遺伝的変性に起因する自律特性を獲得したのであろう
（Seminars in Hematol 32:201−219, 1995 ）。数年前
に証明された如く、大多数のＡＭＬ芽細胞は活動的に増
殖しないので白血病性の個体群の成長分画は極端に低
い。実際、ＡＭＬ芽細胞は静止性、即ちＧ0 状態、では
ないが、細胞周期のＧ1 期で遮断され、Ｓ期を通して従
って全周期を通して進行する能力が緩くなることが観察
された（Cancer Res. 46: 5162-5166, 1986; Leukemia
3:423-430, 1989 ）。Ｇ1 での白血病性芽細胞の蓄積は
周期中の細胞のプールと末期分化に入って周期を離れた
細胞の間の不平衡を決定する。それ故芽細胞増殖の優勢
は増加した増殖能力によって引き起されるのではなく、
主に分化の遮断、増加した半減期（約２５−３５日）
（Eur.J.Clin.In-vest., 2:259, 1972）及びアポトーシ
スの減少率によることは明らかである。それ故、急性骨
髄性白血病では、高い数値の循環芽細胞は増加した細胞
の生存度の結果である（NYAS 663: 202-214, 1992 ）。
病性芽細胞集団の微小環境制御は殆ど完全に効果はな
い、それ故白血病性芽細胞は恐らく幾つかの表示された
遺伝的変性に起因する自律特性を獲得したのであろう
（Seminars in Hematol 32:201−219, 1995 ）。数年前
に証明された如く、大多数のＡＭＬ芽細胞は活動的に増
殖しないので白血病性の個体群の成長分画は極端に低
い。実際、ＡＭＬ芽細胞は静止性、即ちＧ0 状態、では
ないが、細胞周期のＧ1 期で遮断され、Ｓ期を通して従
って全周期を通して進行する能力が緩くなることが観察
された（Cancer Res. 46: 5162-5166, 1986; Leukemia
3:423-430, 1989 ）。Ｇ1 での白血病性芽細胞の蓄積は
周期中の細胞のプールと末期分化に入って周期を離れた
細胞の間の不平衡を決定する。それ故芽細胞増殖の優勢
は増加した増殖能力によって引き起されるのではなく、
主に分化の遮断、増加した半減期（約２５−３５日）
（Eur.J.Clin.In-vest., 2:259, 1972）及びアポトーシ
スの減少率によることは明らかである。それ故、急性骨
髄性白血病では、高い数値の循環芽細胞は増加した細胞
の生存度の結果である（NYAS 663: 202-214, 1992 ）。
【０００３】フェラリほか（British J.Haematol 59: 2
1-25, 1985）は c-fesプロト癌遺伝子が顆粒球性分化の
末期段階で高いレベルで発現するが、機能はこのプロト
癌遺伝子の産生のせいには出来ないことを見つけた。フ
ェラリほか（Cell growth Diff. 1: 543-548, 1990）と
マンフレディニほか（J.Exp.Med., 178: 381-389, 199
3）も又 c-fesプロト癌遺伝子発現の抑制は c-fesプロ
ト癌遺伝子ｍＲＮＡに特有のアンチセンスオリゴデオキ
シヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮs ）によって得られるこ
とを見出した。然し、ｍＲＮＡに特有のＡＳ−ＯＤＮs
の使用は幾つかの不便な点、特に不十分な不活性化効率
を有する。急性前骨髄球白血病（ＡＰＬ）芽細胞は、生
体の内外で、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）で分
化誘導され得る（New Engl. J. Med., 234: 1385, 199
1）。現在、ＡＴＲＡは生体内でＡＰＬ芽細胞分化を得
るために治療目的で使用される。然し、分化の効果に加
えて、幾つかの不都合な副作用、例えば白血球増加症
（Blood, 76:260, 1990 ）及び毛細管透過性症候群（A
m. Int. Med., 117:292, 1992）が観察された。急性肺
水腫、腎不全、低血圧症により特徴付けられるこの症候
群は、最初ＩＬ−２で治療中の患者で観察された。内皮
の損傷と周辺組織への白血球の浸潤が毛細管透過性症候
群で観察された。
1-25, 1985）は c-fesプロト癌遺伝子が顆粒球性分化の
末期段階で高いレベルで発現するが、機能はこのプロト
癌遺伝子の産生のせいには出来ないことを見つけた。フ
ェラリほか（Cell growth Diff. 1: 543-548, 1990）と
マンフレディニほか（J.Exp.Med., 178: 381-389, 199
3）も又 c-fesプロト癌遺伝子発現の抑制は c-fesプロ
ト癌遺伝子ｍＲＮＡに特有のアンチセンスオリゴデオキ
シヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮs ）によって得られるこ
とを見出した。然し、ｍＲＮＡに特有のＡＳ−ＯＤＮs
の使用は幾つかの不便な点、特に不十分な不活性化効率
を有する。急性前骨髄球白血病（ＡＰＬ）芽細胞は、生
体の内外で、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）で分
化誘導され得る（New Engl. J. Med., 234: 1385, 199
1）。現在、ＡＴＲＡは生体内でＡＰＬ芽細胞分化を得
るために治療目的で使用される。然し、分化の効果に加
えて、幾つかの不都合な副作用、例えば白血球増加症
（Blood, 76:260, 1990 ）及び毛細管透過性症候群（A
m. Int. Med., 117:292, 1992）が観察された。急性肺
水腫、腎不全、低血圧症により特徴付けられるこの症候
群は、最初ＩＬ−２で治療中の患者で観察された。内皮
の損傷と周辺組織への白血球の浸潤が毛細管透過性症候
群で観察された。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】或著者達は、一方では
ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＴＮＦαの様な炎症
性サイトカイン類（Leukemia, 8:1750, 1994; Exp. Hem
atol 23: 117-125, 1995）が、又他方ではインテグリン
が毛細管透過性症候群の病因の役割を果すかも知れない
と云う仮説を提唱している。事実、ＡＴＲＡがＡＰＬ芽
細胞の活性化、及び炎症性サイトカインの発現の結果の
誘導をもたらすことを示した（Exp. Hematol,23:117, 1
995 ）。分化治療法は数ヶ月続けねばならないが、その
間治療効果を危うくする合併症が屡々起る。既述の如
く、ＡＴＲＡによる長期治療で生じる最も厳しい不都合
の一つは毛細管透過性症候群の症例の約２０% に（屡々
重症白血球増加症と結合して）発症がある。ＡＴＲＡ療
法のこれら副作用は治療の中断に又は患者の死にさえも
導くことが出来る。ＡＴＲＡによる長期分化治療中に屡
々起る尚一層の不都合は薬剤耐性機構の発現である、そ
こでは治療は明らかに無効である（Blood 82: 2175-218
1, 1993 ）。それ故、白血病のアジュバント治療用に、
前述の障害を避ける能力のある、又は既知の生成物を改
良して、新製品を見つけるか又は新治療戦略を開発する
ことは極めて重要である。
ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＴＮＦαの様な炎症
性サイトカイン類（Leukemia, 8:1750, 1994; Exp. Hem
atol 23: 117-125, 1995）が、又他方ではインテグリン
が毛細管透過性症候群の病因の役割を果すかも知れない
と云う仮説を提唱している。事実、ＡＴＲＡがＡＰＬ芽
細胞の活性化、及び炎症性サイトカインの発現の結果の
誘導をもたらすことを示した（Exp. Hematol,23:117, 1
995 ）。分化治療法は数ヶ月続けねばならないが、その
間治療効果を危うくする合併症が屡々起る。既述の如
く、ＡＴＲＡによる長期治療で生じる最も厳しい不都合
の一つは毛細管透過性症候群の症例の約２０% に（屡々
重症白血球増加症と結合して）発症がある。ＡＴＲＡ療
法のこれら副作用は治療の中断に又は患者の死にさえも
導くことが出来る。ＡＴＲＡによる長期分化治療中に屡
々起る尚一層の不都合は薬剤耐性機構の発現である、そ
こでは治療は明らかに無効である（Blood 82: 2175-218
1, 1993 ）。それ故、白血病のアジュバント治療用に、
前述の障害を避ける能力のある、又は既知の生成物を改
良して、新製品を見つけるか又は新治療戦略を開発する
ことは極めて重要である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】c-fesプロト癌遺伝子の
一次転写（hn−ＲＮＡ）と交雑できる新しいアンチセン
ス（ＡＳ）オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮs ）が
c-fesプロト癌遺伝子の良い不活性化を与えて且つ業界
で知られているシステムに内在する障害を除去できるこ
とは驚くべき発見であった。それ故、c-fes プロト癌遺
伝子の一次転写を不活性化するのに有用な、前記新ＡＳ
−ＯＤＮs を提供することは本発明の一面である。本発
明は又急速アポトーシス（細胞死）（２４乃至７２時
間）を生じさせるＡＳ−ＯＤＮs で前処理された細胞へ
の分化誘導物質としてのＡＴＲＡにも関する。本発明は
又ＡＳ−ＯＤＮs の中の少なくとも一つとＡＴＲＡを含
む混合物にも関する。白血病性細胞の急速アポトーシス
を誘導するためにＡＳ−ＯＤＮs での前処理とＡＴＲＡ
の投与より成る治療的処理を提供することは本発明の更
なる特徴である。更に、本発明はＡＳ−ＯＤＮs の一つ
又はそれ以上の小瓶とＡＴＲＡの一つ又はそれ以上の小
瓶を含むキットに関する。
一次転写（hn−ＲＮＡ）と交雑できる新しいアンチセン
ス（ＡＳ）オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮs ）が
c-fesプロト癌遺伝子の良い不活性化を与えて且つ業界
で知られているシステムに内在する障害を除去できるこ
とは驚くべき発見であった。それ故、c-fes プロト癌遺
伝子の一次転写を不活性化するのに有用な、前記新ＡＳ
−ＯＤＮs を提供することは本発明の一面である。本発
明は又急速アポトーシス（細胞死）（２４乃至７２時
間）を生じさせるＡＳ−ＯＤＮs で前処理された細胞へ
の分化誘導物質としてのＡＴＲＡにも関する。本発明は
又ＡＳ−ＯＤＮs の中の少なくとも一つとＡＴＲＡを含
む混合物にも関する。白血病性細胞の急速アポトーシス
を誘導するためにＡＳ−ＯＤＮs での前処理とＡＴＲＡ
の投与より成る治療的処理を提供することは本発明の更
なる特徴である。更に、本発明はＡＳ−ＯＤＮs の一つ
又はそれ以上の小瓶とＡＴＲＡの一つ又はそれ以上の小
瓶を含むキットに関する。
【０００６】本発明のよりよい理解のために、ここで図
面とヌクレオチド配列付きで記述する。本発明の新しい
アンチセンスオリゴヌクレオチドはc-fes プロト癌遺伝
子の一次転写（即ち hn-ＲＮＡ）に相補的な全てのオリ
ゴヌクレオチドを含む、それ故、c-fes 蛋白質、特に１
６から４０ヌクレオチドまで変化する長さのＡＳ−ＯＤ
Ｎs そして更に特に３２−３３ヌクレオチドより成るＡ
Ｓ−ＯＤＮs を抑制する。好ましいＡＳ−ＯＤＮs は配
列 5′−ＧＴＣＣＣＡＴＡＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＡ
ＣＴＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧ-3′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:
１）と 5′−ＡＧＴＧＣＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＴ
ＧＧＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣ-3′（ＳＥＱＩＤ ＮＯ:
２）を持つ図１と２で記述される。前記ＡＳ−ＯＤＮs
は夫々エクソン２／イントロン２及びエクソン３／イン
トロン３の二つの５′領域で見出された。遺伝子配列に
ついては、前記領域は夫々残基 1211-1243 及び 1537-1
568に対応する（Onco−gene, 5:267, 1990 ）。本発明
のオリゴヌクレオチドは既知の方法により調製できる、
例えば Cell Growth Diff., 1:543 (1990)に記載されて
いる。
面とヌクレオチド配列付きで記述する。本発明の新しい
アンチセンスオリゴヌクレオチドはc-fes プロト癌遺伝
子の一次転写（即ち hn-ＲＮＡ）に相補的な全てのオリ
ゴヌクレオチドを含む、それ故、c-fes 蛋白質、特に１
６から４０ヌクレオチドまで変化する長さのＡＳ−ＯＤ
Ｎs そして更に特に３２−３３ヌクレオチドより成るＡ
Ｓ−ＯＤＮs を抑制する。好ましいＡＳ−ＯＤＮs は配
列 5′−ＧＴＣＣＣＡＴＡＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＡ
ＣＴＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧ-3′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:
１）と 5′−ＡＧＴＧＣＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＴ
ＧＧＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣ-3′（ＳＥＱＩＤ ＮＯ:
２）を持つ図１と２で記述される。前記ＡＳ−ＯＤＮs
は夫々エクソン２／イントロン２及びエクソン３／イン
トロン３の二つの５′領域で見出された。遺伝子配列に
ついては、前記領域は夫々残基 1211-1243 及び 1537-1
568に対応する（Onco−gene, 5:267, 1990 ）。本発明
のオリゴヌクレオチドは既知の方法により調製できる、
例えば Cell Growth Diff., 1:543 (1990)に記載されて
いる。
【０００７】本発明のオリゴヌクレオチドは、その半減
期を長くする目的で、なるべくなら構造修飾により安定
化される。前記修飾は特に、ホスホン酸メチル、チオ燐
酸−、ジチオ燐酸−基、燐酸エステル類などに変換でき
る、ヌクレオチド間燐酸塩ブリッジに関している（Anti
sense Research and Applications, Cr-ooke and Leble
u, eds.,CRC Press, p.189-205, 1993）。特に、非常に
好ましいものは、３′と５′端点で、チオホスホロン酸
残基と置換された誘導体である。本発明のオリゴヌクレ
オチドはトランスフェリン−ポリリジン共役と非共有結
合で複合しても良い（Natl. Acad. Sci. USA, 89:703
1, 1991）。従って、これらは細胞膜を通って比較的容
易に輸送されて酸性ｐＨを持つ細胞質小胞内で活性オリ
ゴヌクレオチドに分割する。細胞膜を通る輸送はリポソ
ームによっても得られる。本発明に従うＡＳ−ＯＤＮs
の混合物も又効果的にc-fes 一次転写の阻害を許すこと
が見出された。
期を長くする目的で、なるべくなら構造修飾により安定
化される。前記修飾は特に、ホスホン酸メチル、チオ燐
酸−、ジチオ燐酸−基、燐酸エステル類などに変換でき
る、ヌクレオチド間燐酸塩ブリッジに関している（Anti
sense Research and Applications, Cr-ooke and Leble
u, eds.,CRC Press, p.189-205, 1993）。特に、非常に
好ましいものは、３′と５′端点で、チオホスホロン酸
残基と置換された誘導体である。本発明のオリゴヌクレ
オチドはトランスフェリン−ポリリジン共役と非共有結
合で複合しても良い（Natl. Acad. Sci. USA, 89:703
1, 1991）。従って、これらは細胞膜を通って比較的容
易に輸送されて酸性ｐＨを持つ細胞質小胞内で活性オリ
ゴヌクレオチドに分割する。細胞膜を通る輸送はリポソ
ームによっても得られる。本発明に従うＡＳ−ＯＤＮs
の混合物も又効果的にc-fes 一次転写の阻害を許すこと
が見出された。
【０００８】治療的用法をもくろむために、特に急性前
骨髄球白血病のアジュバント治療には、本発明は又、単
独でか又は経口又は非経口投与に適した賦形剤と結合し
て、活性成分として本発明のＡＳ−ＯＤＮs を含んでい
る薬学的合成品も含む。特に、本発明のＡＳ−ＯＤＮs
は、白血球増加症及び毛細管透過性症候群のような副作
用を避けるために、ＡＰＬs の分化誘導物質での治療中
に単独でか又は混合物の形で、投与しても良い。
骨髄球白血病のアジュバント治療には、本発明は又、単
独でか又は経口又は非経口投与に適した賦形剤と結合し
て、活性成分として本発明のＡＳ−ＯＤＮs を含んでい
る薬学的合成品も含む。特に、本発明のＡＳ−ＯＤＮs
は、白血球増加症及び毛細管透過性症候群のような副作
用を避けるために、ＡＰＬs の分化誘導物質での治療中
に単独でか又は混合物の形で、投与しても良い。
【０００９】通常の方法で調製された本発明の合成品
は、人用には、以下の部品と数量を含む市販用キットの
形で提供される： i) 本発明の二つのＡＳ−ＯＤＮs の一つか又はそれの
混合物が各々100 乃至 500mg入っていて、前治療の初め
の数日間毎日投与されるべき日数と投与の数に依存す
る、一つ又はそれ以上の小瓶。前述の数量は患者の体表
に依存するだろう。 ii) 続く治療の日数の間毎日投与するために、前述の如
く、二つのＡＳ−ＯＤＮs の中少なくとも一つが各々10
0 乃至500mg 入っている一つ又はそれ以上の小瓶と 5乃
至50mgのＡＴＲＡが入っている一つ又はそれ以上の小
瓶。
は、人用には、以下の部品と数量を含む市販用キットの
形で提供される： i) 本発明の二つのＡＳ−ＯＤＮs の一つか又はそれの
混合物が各々100 乃至 500mg入っていて、前治療の初め
の数日間毎日投与されるべき日数と投与の数に依存す
る、一つ又はそれ以上の小瓶。前述の数量は患者の体表
に依存するだろう。 ii) 続く治療の日数の間毎日投与するために、前述の如
く、二つのＡＳ−ＯＤＮs の中少なくとも一つが各々10
0 乃至500mg 入っている一つ又はそれ以上の小瓶と 5乃
至50mgのＡＴＲＡが入っている一つ又はそれ以上の小
瓶。
【００１０】成人患者用には、本キットはなるべくなら
以下を含むであろう： i) 前治療の初めの５日間一日二回投与されるとして、
二つのＡＳ−ＯＤＮs の等分子量混合物が各々500mg 入
っている小瓶１０個； ii) 続く３日の治療の間、一日に二回ほぼ同じ時刻に投
与されるとして、二つのＡＳ−ＯＤＮs の等分子量混合
物が各々500mg 入っている小瓶６個と、50mgのＡＴＲＡ
が各々入っている小瓶６個。
以下を含むであろう： i) 前治療の初めの５日間一日二回投与されるとして、
二つのＡＳ−ＯＤＮs の等分子量混合物が各々500mg 入
っている小瓶１０個； ii) 続く３日の治療の間、一日に二回ほぼ同じ時刻に投
与されるとして、二つのＡＳ−ＯＤＮs の等分子量混合
物が各々500mg 入っている小瓶６個と、50mgのＡＴＲＡ
が各々入っている小瓶６個。
【００１１】治療期間中、ＡＳ−ＯＤＮs とＡＴＲＡを
別々に投与する代りに、少なくとも一つのＡＳ−ＯＤＮ
とＡＴＲＡの混合物を投与することは可能である。それ
故、本発明のキットは、ii) 期では、ＡＴＲＡ（ 5乃至
50mg）と結合した少なくとも一つのＡＳ−ＯＤＮs （ 1
00乃至500mg ）が各々入っている一つ又はそれ以上の小
瓶を含む。本発明の著者は、ＡＴＲＡがＡＳ−ＯＤＮs
で前処理されたＡＰＬ細胞に投与された時、急速な細胞
アポトーシスが起ったことを見出した。従来の技術で獲
得した知識、即ち前骨髄球の表現型を有する細胞へのＡ
ＴＲＡの投与はかなり長い時間、即ち６乃至９日以内の
分化（アポトーシスを伴う）を誘発することとは違っ
て、本発明のＡＳ−ＯＤＮs で前処理された細胞への分
化誘導物質（出来ればＡＴＲＡ）の投与は急速なアポト
ーシス、即ち２４乃至７２時間以内、を引き起す。本発
明は又前述の手順に従ってＡＰＬを持つ患者の治療も含
む。事実、ＡＰＬを持つ患者へのＡＴＲＡの投与はかな
り長い時間（９乃至１２日）以内で分化（アポトーシス
を伴う）を引き起すことに反して、本発明のＡＳ−ＯＤ
Ｎs で前処理された患者への誘導物質の投与は、極短時
間での白血病性クローンの根絶と共に、非常に急速なア
ポトーシス（２４乃至７２時間以内）を引き起す。
別々に投与する代りに、少なくとも一つのＡＳ−ＯＤＮ
とＡＴＲＡの混合物を投与することは可能である。それ
故、本発明のキットは、ii) 期では、ＡＴＲＡ（ 5乃至
50mg）と結合した少なくとも一つのＡＳ−ＯＤＮs （ 1
00乃至500mg ）が各々入っている一つ又はそれ以上の小
瓶を含む。本発明の著者は、ＡＴＲＡがＡＳ−ＯＤＮs
で前処理されたＡＰＬ細胞に投与された時、急速な細胞
アポトーシスが起ったことを見出した。従来の技術で獲
得した知識、即ち前骨髄球の表現型を有する細胞へのＡ
ＴＲＡの投与はかなり長い時間、即ち６乃至９日以内の
分化（アポトーシスを伴う）を誘発することとは違っ
て、本発明のＡＳ−ＯＤＮs で前処理された細胞への分
化誘導物質（出来ればＡＴＲＡ）の投与は急速なアポト
ーシス、即ち２４乃至７２時間以内、を引き起す。本発
明は又前述の手順に従ってＡＰＬを持つ患者の治療も含
む。事実、ＡＰＬを持つ患者へのＡＴＲＡの投与はかな
り長い時間（９乃至１２日）以内で分化（アポトーシス
を伴う）を引き起すことに反して、本発明のＡＳ−ＯＤ
Ｎs で前処理された患者への誘導物質の投与は、極短時
間での白血病性クローンの根絶と共に、非常に急速なア
ポトーシス（２４乃至７２時間以内）を引き起す。
【００１２】本発明の顕著なる利点はＡＴＲＡでの処理
から起る前述の副作用の発現の予防に合わせて白血病性
芽細胞のアポトーシス誘発の可能性である：前記戦略は
ＡＰＬの効果的な支援治療を表現できる。本発明の特別
な実施例は以下の例で記述される。
から起る前述の副作用の発現の予防に合わせて白血病性
芽細胞のアポトーシス誘発の可能性である：前記戦略は
ＡＰＬの効果的な支援治療を表現できる。本発明の特別
な実施例は以下の例で記述される。
【００１３】
【実施例】請求項記載のＡＳ−ＯＤＮs の混合物による
ＨＬ６０細胞とＡＰＬ芽細胞の処理ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:
１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２で示される二つの非修飾オ
リゴデオキシヌクレオチドは自動固相ＤＮＡ合成装置で
合成された（Mod. 394, Applied Biosystems Inc. ）。
前記オリゴマーは抽出（NH4OH で３乃至４回）続いて56
℃で16時間の定温培養、そしてエタノールでの沈澱又は
ＰＡＧＥにより精製される（Cell Growth Diff., 1:54
3, 1990）。遺伝子不活性化戦略に使われるオリゴマー
は凍結乾燥され使用に先立って細胞培養液中に再懸濁さ
れる。合成されたオリゴマーは、オリゴマーと他の既知
の配列間の相同が７０% 以上を排除するために、前もっ
て米国国立衛生研究所の遺伝子データバンク（ソフトウ
ェアドナシス、日立、ブリスベーン、ＣＡ、ＵＳＡ）と
比較された。培養液中のオリゴマーの安定性を検査した
らすぐに、ＨＬ６０細胞はマイクロウェル中で１０μＭ
のＡＳ−ＯＤＮ 混合物と共に培養された、各々は１０
% の熱処理された死んだ子牛の血清（ＦＣＳ）（予め最
小ヌクレアーゼ活性で選別されている）と２ｍＭのL−
グルタミンを補給されたＲＰＭＩ １６４０中に 7×105
細胞／mlを含んでいる。ｐｍｌとＲＡＲａ遺伝子を含
んでいて、白血病性細胞の％量に関して高い均一性があ
り又代表的な t（15;17 ）（即ち人の染色体15と17の間
の転座）を表わしている、ＡＰＬ芽細胞は同一条件下で
培養された。ＡＳ−ＯＤＮs は約１０μＭの一定濃度を
維持するために２４時間毎に培養器に加えられた。c-fe
s ｍＲＮＡと蛋白質の消失の速度を見積るために或一定
の細胞標本が２４時間間隔で集められた。逆転写ポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われたメッセ
ンジャー発現の研究は、ＡＳ−ＯＤＮs 処理の９６時間
後にc-fes ｍＲＮＡレベルに鋭い減少があり、それは両
不活性化戦略処理の９６時間後にはもはや検出されなか
ったことで確立された（図３）。ウェスタンブロッティ
ング法により決定されたc-fes 蛋白質（即ちp92c-fes蛋
白質）の発現は、処理の７２時間後実質上減少して１２
０時間後には完全に消滅した（図４）。トリパンブルー
排除試験により決定された、細胞の死は５% より低かっ
た。ＨＬ６０細胞とＡＰＬ芽細胞が１０μＭのＡＳ−Ｏ
ＤＮs で前処理されたらすぐ（即ち前記プロト癌遺伝子
の蛋白質が完全に不活性化したらすぐに）、細胞は１μ
ＭのＡＴＲＡでの処理により分化を引き起した（常にＡ
Ｓ−ＯＤＮs の存在下）。得られた結果はこれらの細胞
が顆粒球性分化の道に沿って進む能力がないことを示し
た。
ＨＬ６０細胞とＡＰＬ芽細胞の処理ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:
１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２で示される二つの非修飾オ
リゴデオキシヌクレオチドは自動固相ＤＮＡ合成装置で
合成された（Mod. 394, Applied Biosystems Inc. ）。
前記オリゴマーは抽出（NH4OH で３乃至４回）続いて56
℃で16時間の定温培養、そしてエタノールでの沈澱又は
ＰＡＧＥにより精製される（Cell Growth Diff., 1:54
3, 1990）。遺伝子不活性化戦略に使われるオリゴマー
は凍結乾燥され使用に先立って細胞培養液中に再懸濁さ
れる。合成されたオリゴマーは、オリゴマーと他の既知
の配列間の相同が７０% 以上を排除するために、前もっ
て米国国立衛生研究所の遺伝子データバンク（ソフトウ
ェアドナシス、日立、ブリスベーン、ＣＡ、ＵＳＡ）と
比較された。培養液中のオリゴマーの安定性を検査した
らすぐに、ＨＬ６０細胞はマイクロウェル中で１０μＭ
のＡＳ−ＯＤＮ 混合物と共に培養された、各々は１０
% の熱処理された死んだ子牛の血清（ＦＣＳ）（予め最
小ヌクレアーゼ活性で選別されている）と２ｍＭのL−
グルタミンを補給されたＲＰＭＩ １６４０中に 7×105
細胞／mlを含んでいる。ｐｍｌとＲＡＲａ遺伝子を含
んでいて、白血病性細胞の％量に関して高い均一性があ
り又代表的な t（15;17 ）（即ち人の染色体15と17の間
の転座）を表わしている、ＡＰＬ芽細胞は同一条件下で
培養された。ＡＳ−ＯＤＮs は約１０μＭの一定濃度を
維持するために２４時間毎に培養器に加えられた。c-fe
s ｍＲＮＡと蛋白質の消失の速度を見積るために或一定
の細胞標本が２４時間間隔で集められた。逆転写ポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われたメッセ
ンジャー発現の研究は、ＡＳ−ＯＤＮs 処理の９６時間
後にc-fes ｍＲＮＡレベルに鋭い減少があり、それは両
不活性化戦略処理の９６時間後にはもはや検出されなか
ったことで確立された（図３）。ウェスタンブロッティ
ング法により決定されたc-fes 蛋白質（即ちp92c-fes蛋
白質）の発現は、処理の７２時間後実質上減少して１２
０時間後には完全に消滅した（図４）。トリパンブルー
排除試験により決定された、細胞の死は５% より低かっ
た。ＨＬ６０細胞とＡＰＬ芽細胞が１０μＭのＡＳ−Ｏ
ＤＮs で前処理されたらすぐ（即ち前記プロト癌遺伝子
の蛋白質が完全に不活性化したらすぐに）、細胞は１μ
ＭのＡＴＲＡでの処理により分化を引き起した（常にＡ
Ｓ−ＯＤＮs の存在下）。得られた結果はこれらの細胞
が顆粒球性分化の道に沿って進む能力がないことを示し
た。
【００１４】Ａ．形態的且つフローサイトメトリー分析 未成熟の特性を維持していながら、細胞は数時間後には
死に始め、又２４時間後には＞５０% の細胞の死が観察
された。ＡＴＲＡとＡＳ−ＯＤＮs による誘導から４８
時間で、死んだ細胞の量は７０% に増加し１２０時間後
には９０% に達した。日を追って観察された前記細胞の
形態はアポトーシス過程：細胞質と核の凝縮（核凝
縮）、縮窄物質を含む小胞の形成による核の断片化（核
崩壊）、周辺細胞による食細胞化、により誘発された典
型的変形を示した。アポトーシス過程の存在と進行は、
未処理及びオリゴマー処理の細胞の種々の部分標本が、
ＡＴＲＡでの誘導後２４時間毎にＤＮＡ含有量決定のた
めに、ＦＡＣＳかん（Becton Dick-inson ）を用いて一
母数のフローサイトメトリー分析を受けることで特徴付
けられた。ＡＴＲＡでの誘導から早くも２４時間、ＡＳ
−ＯＤＮ前処理の細胞のフローサイトメトリー分析は、
アポトーシス集団のＤＮＡに対応する不完全二倍体の蛍
光ピークの出現を明らかにした。続く数日間、不完全二
倍体のピークは、ＡＴＲＡでの誘導後７２時間でピーク
２Ｃと４Ｃ（二倍体の含有量）が殆ど全部消失して、ア
ポトーシス細胞が９７乃至９８% を数えるまで徐々に増
加した。
死に始め、又２４時間後には＞５０% の細胞の死が観察
された。ＡＴＲＡとＡＳ−ＯＤＮs による誘導から４８
時間で、死んだ細胞の量は７０% に増加し１２０時間後
には９０% に達した。日を追って観察された前記細胞の
形態はアポトーシス過程：細胞質と核の凝縮（核凝
縮）、縮窄物質を含む小胞の形成による核の断片化（核
崩壊）、周辺細胞による食細胞化、により誘発された典
型的変形を示した。アポトーシス過程の存在と進行は、
未処理及びオリゴマー処理の細胞の種々の部分標本が、
ＡＴＲＡでの誘導後２４時間毎にＤＮＡ含有量決定のた
めに、ＦＡＣＳかん（Becton Dick-inson ）を用いて一
母数のフローサイトメトリー分析を受けることで特徴付
けられた。ＡＴＲＡでの誘導から早くも２４時間、ＡＳ
−ＯＤＮ前処理の細胞のフローサイトメトリー分析は、
アポトーシス集団のＤＮＡに対応する不完全二倍体の蛍
光ピークの出現を明らかにした。続く数日間、不完全二
倍体のピークは、ＡＴＲＡでの誘導後７２時間でピーク
２Ｃと４Ｃ（二倍体の含有量）が殆ど全部消失して、ア
ポトーシス細胞が９７乃至９８% を数えるまで徐々に増
加した。
【００１５】制御オリゴマーでの未処理か又は処理済の
どちらかの細胞で行われた同じ分析は蛍光ピーク２Ｃと
４Ｃだけの存在を示した、それはＤＮＡ集団の無傷状
態、従ってＡＳ−ＯＤＮ効果の特効性を証明した。顆粒
球性成熟特性は死の前には観察されない：このことはＡ
Ｓ−ＯＤＮs での処理が顆粒球性分化過程を簡単に高め
る可能性を排除するように見える。それ故、進行する細
胞死は顆粒白血球への分化を完全に阻止している。制御
オリゴマーは、形態的且つフローサイトメトリー解析で
証明された如く、重大な細胞死無しで行われ、ＡＴＲＡ
誘導の顆粒球性分化を絶対に妨害していない。
どちらかの細胞で行われた同じ分析は蛍光ピーク２Ｃと
４Ｃだけの存在を示した、それはＤＮＡ集団の無傷状
態、従ってＡＳ−ＯＤＮ効果の特効性を証明した。顆粒
球性成熟特性は死の前には観察されない：このことはＡ
Ｓ−ＯＤＮs での処理が顆粒球性分化過程を簡単に高め
る可能性を排除するように見える。それ故、進行する細
胞死は顆粒白血球への分化を完全に阻止している。制御
オリゴマーは、形態的且つフローサイトメトリー解析で
証明された如く、重大な細胞死無しで行われ、ＡＴＲＡ
誘導の顆粒球性分化を絶対に妨害していない。
【００１６】Ｂ．ＤＮＡ分子解析 ＡＴＲＡとＡＳ−ＯＤＮ処理した細胞では、ＤＮＡ断片
化は形態学的に観察された染色質の小型化と同調して、
約 185乃至200 塩基対（bp）の多量体を作り出す。この
特徴的な“梯子形”断片形状はＡＳ−ＯＤＮs とＡＴＲ
Ａでの処理の２４時間と４８時間後に細胞から抽出され
たＤＮＡで明示された。これに反し、高分子量のＤＮＡ
は単独か又は制御オリゴマーと組合わせた誘導物質で処
理した細胞で見出された。
化は形態学的に観察された染色質の小型化と同調して、
約 185乃至200 塩基対（bp）の多量体を作り出す。この
特徴的な“梯子形”断片形状はＡＳ−ＯＤＮs とＡＴＲ
Ａでの処理の２４時間と４８時間後に細胞から抽出され
たＤＮＡで明示された。これに反し、高分子量のＤＮＡ
は単独か又は制御オリゴマーと組合わせた誘導物質で処
理した細胞で見出された。
【００１７】Ｃ．ＡＴＲＡによるc-fes 抑制と処理後に
誘発される細胞死への造血増殖因子の効果 ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−Ｃ
ＳＦが、顆粒球性分化の間c-fes 不活性化の後誘発され
たアポトーシス過程と競合する能力を検査された。ＡＳ
−ＯＤＮs による c-fes不活性化の後、以下のサイトカ
イン類、即ちＩＬ−３（5ng/ml）、ＩＬ−６（10U/m
l）、幹細胞因子（ＳＣＦ、10ng/ml ）、ＧＭ−ＣＳＦ
（20ng/ml ）、Ｇ−ＣＳＦ（1000 U/ml ）、がＡＳ−Ｏ
ＤＮs の存在下でＡＴＲＡの添加と同時に添加された。
上述の如く行われたフローサイトメトリー分析により明
らかにされた如く、ＩＬ−３、ＩＬ−６及びＳＣＦはど
んな保護効果も生み出さない。逆に、ＧＭ−ＣＳＦとＧ
−ＣＳＦの添加により、夫々約７０% の細胞が保護され
た、３日以上続いた保護：実際、処理の１２０時間後、
４０% 以上の細胞が未だ生存可能であった。各実験は３
回繰返されたそしてその変動性は決して＞１０％ではな
かった。
誘発される細胞死への造血増殖因子の効果 ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−Ｃ
ＳＦが、顆粒球性分化の間c-fes 不活性化の後誘発され
たアポトーシス過程と競合する能力を検査された。ＡＳ
−ＯＤＮs による c-fes不活性化の後、以下のサイトカ
イン類、即ちＩＬ−３（5ng/ml）、ＩＬ−６（10U/m
l）、幹細胞因子（ＳＣＦ、10ng/ml ）、ＧＭ−ＣＳＦ
（20ng/ml ）、Ｇ−ＣＳＦ（1000 U/ml ）、がＡＳ−Ｏ
ＤＮs の存在下でＡＴＲＡの添加と同時に添加された。
上述の如く行われたフローサイトメトリー分析により明
らかにされた如く、ＩＬ−３、ＩＬ−６及びＳＣＦはど
んな保護効果も生み出さない。逆に、ＧＭ−ＣＳＦとＧ
−ＣＳＦの添加により、夫々約７０% の細胞が保護され
た、３日以上続いた保護：実際、処理の１２０時間後、
４０% 以上の細胞が未だ生存可能であった。各実験は３
回繰返されたそしてその変動性は決して＞１０％ではな
かった。
【００１８】その代り、ＩＬ−３、ＩＬ−６及びＳＣＦ
での処理はどんな保護効果も結果しなかった。得られた
データは、c-fes 機能の完全な抑制の後、顆粒球性分化
への誘導が緩やかな細胞死に導く、ＨＬ６０細胞とＡＰ
Ｌ芽細胞は前記分化プログラムを完成させる能力のない
ことを示す。それ故、前記条件下で行われた細胞生存率
の損失は加速された分化によるよりも寧ろプログラム細
胞死の過程の活性化に起因することが立証された。事
実、ＡＳ−ＯＤＮs とＡＴＲＡで処理したものを種々の
時間間隔（２４時間から９６時間まで）で調製した細胞
遠心分画物は決して成熟した顆粒球性表現型を持つ細胞
の存在を明らかにしなかった。細胞化学的分析は顆粒球
性又は単球性成熟のどんな徴候も明らかにしなかった。
分化しているＡＰＬ芽細胞とＨＬ６０細胞中の c-fes抑
制の効果の形態学的又分子的様相は未成熟細胞の死がア
ポトーシス過程の活性化の結果であることを示唆する。
この結論は、分化しているＡＰＬ芽細胞とＨＬ６０細胞
中のＧＭ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦプロモート細胞の生存
が、前記プロト癌遺伝子の不活性化を阻害し、従って例
えc-fes 抑制によって誘導されたアポトーシス過程に含
まれている分子機構が未だ明瞭になるべきだとしても、
アポトーシスを抑制しているという事実によって強く支
持される。
での処理はどんな保護効果も結果しなかった。得られた
データは、c-fes 機能の完全な抑制の後、顆粒球性分化
への誘導が緩やかな細胞死に導く、ＨＬ６０細胞とＡＰ
Ｌ芽細胞は前記分化プログラムを完成させる能力のない
ことを示す。それ故、前記条件下で行われた細胞生存率
の損失は加速された分化によるよりも寧ろプログラム細
胞死の過程の活性化に起因することが立証された。事
実、ＡＳ−ＯＤＮs とＡＴＲＡで処理したものを種々の
時間間隔（２４時間から９６時間まで）で調製した細胞
遠心分画物は決して成熟した顆粒球性表現型を持つ細胞
の存在を明らかにしなかった。細胞化学的分析は顆粒球
性又は単球性成熟のどんな徴候も明らかにしなかった。
分化しているＡＰＬ芽細胞とＨＬ６０細胞中の c-fes抑
制の効果の形態学的又分子的様相は未成熟細胞の死がア
ポトーシス過程の活性化の結果であることを示唆する。
この結論は、分化しているＡＰＬ芽細胞とＨＬ６０細胞
中のＧＭ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦプロモート細胞の生存
が、前記プロト癌遺伝子の不活性化を阻害し、従って例
えc-fes 抑制によって誘導されたアポトーシス過程に含
まれている分子機構が未だ明瞭になるべきだとしても、
アポトーシスを抑制しているという事実によって強く支
持される。
【００１９】SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) NAME: Istituto Biochimico Italiano Giovanni Lo
renzini S.p.A. (B) STREET: Via G. Ripamonti, 332/4 (C) CITY: Milan (D) STATE: Milan (E) COUNTRY: ITALY (F) POSTAL CODE (ZIP): 20141 (G) TELEPHONE: 02/57482440 (H) TELEFAX: 02/57482425 (ii) TITLE OF INVENTION: Antisense oligonucleotide
s complementary tothe primary transcript of the hu
man c-fes protooncogene and their use, combined wi
th a differentiation inducer, to cause apoptosis o
f leukemic blast cells. (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2 (v) CURRENT APPLICATION DATA: (A) FILE REFERENCE: FD-1617 (B) FILING DATE: 20-MAY-1997 (vi) EARLIER APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: MI96A001011 (B) FILING DATE: 20-MAY-1996 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (ix) FEATURE: (D) OTHER INFORMATION: Antisense oligonucleotide s
equence complementary to the primary transcript of
the c-fes protooncogene. (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: GTCCCATAGA GACCCACCTG ACTGATGGGG CTG 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 32 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (ix) FEATURE: (D) OTHER INFORMATION: Antisense oligonucleotide s
equence complementary to the primary transcript of
the c-fes protooncogene. (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: AGTGTCGCCC GCTCACCTTG GTGAGCTCCT GC 32
renzini S.p.A. (B) STREET: Via G. Ripamonti, 332/4 (C) CITY: Milan (D) STATE: Milan (E) COUNTRY: ITALY (F) POSTAL CODE (ZIP): 20141 (G) TELEPHONE: 02/57482440 (H) TELEFAX: 02/57482425 (ii) TITLE OF INVENTION: Antisense oligonucleotide
s complementary tothe primary transcript of the hu
man c-fes protooncogene and their use, combined wi
th a differentiation inducer, to cause apoptosis o
f leukemic blast cells. (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2 (v) CURRENT APPLICATION DATA: (A) FILE REFERENCE: FD-1617 (B) FILING DATE: 20-MAY-1997 (vi) EARLIER APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: MI96A001011 (B) FILING DATE: 20-MAY-1996 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (ix) FEATURE: (D) OTHER INFORMATION: Antisense oligonucleotide s
equence complementary to the primary transcript of
the c-fes protooncogene. (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: GTCCCATAGA GACCCACCTG ACTGATGGGG CTG 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 32 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (ix) FEATURE: (D) OTHER INFORMATION: Antisense oligonucleotide s
equence complementary to the primary transcript of
the c-fes protooncogene. (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: AGTGTCGCCC GCTCACCTTG GTGAGCTCCT GC 32
【図１】c-fes プロト癌遺伝子の遺伝子座と本発明で例
示された関連するオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ: １及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２で書かれた）。エキソ
ン２とイントロン２の間、及びエキソン３とイントロン
３の間の５′スプライス部位に相補的な二つのＡＳ−Ｏ
ＤＮs は、ＦＥＳ−ＡＳ-sj1とＦＥＳ−ＡＳ-sj2と名付
けられる。
示された関連するオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ: １及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２で書かれた）。エキソ
ン２とイントロン２の間、及びエキソン３とイントロン
３の間の５′スプライス部位に相補的な二つのＡＳ−Ｏ
ＤＮs は、ＦＥＳ−ＡＳ-sj1とＦＥＳ−ＡＳ-sj2と名付
けられる。
【図２】図１に従ってＦＥＳ−ＡＳ-sj1とＦＥＳ−ＡＳ
-sj2及び対応するセンスと名付けられた（ＦＥＳ−Ｓ）
と逆極性（ＦＥＳ−ＩＰ）制御オリゴマー。
-sj2及び対応するセンスと名付けられた（ＦＥＳ−Ｓ）
と逆極性（ＦＥＳ−ＩＰ）制御オリゴマー。
【図３】図１と２のＦＥＳ−ＡＳ-sj1とＦＥＳ−ＡＳ-s
j2及び関連する制御オリゴマーの逆転写ポリメラーゼ連
鎖反応技術による検出。実験の完璧を期すために、マン
フレディニほかに従って（
j2及び関連する制御オリゴマーの逆転写ポリメラーゼ連
鎖反応技術による検出。実験の完璧を期すために、マン
フレディニほかに従って（
【従来の技術】の項を参照）Ｓ（ｍＲＮＡ）、ＩＰ（ｍ
ＲＮＡ）及びＡＳ（ｍＲＮＡ）と名付けられた、ｍＲＮ
Ａに相補的なＡＳ−ＯＤＮs も又分析された。 列１: ＤＮＡ標識VIII（ベーリンガー、マンハイム、ド
イツ）; 列２: 未処理のＨＬ６０細胞; 列３: ＦＥＳ−
Ｓ-sj1と2 ［Ｓ(sj)］の混合物で処理されたＨＬ６０細
胞; 列４: ＦＥＳ−ＩＰ-sj1と2 ［IP(sj)］の混合物で
処理されたＨＬ６０胞; 列５: ＦＥＳ−ＡＳ-sj1と2
［AS(sj)］の混合物で処理されたＨＬ６０細胞; 列６:
ＦＥＳ−Ｓ［Ｓ(mRNA)］の混合物で処理されたＨＬ６０
細胞; 列７: ＦＥＳ−ＩＰ［IP(mRNA)］の混合物で処理
されたＨＬ６０細胞; 列８: ＦＥＳ−ＡＳ［AS(mRNA)］
の混合物で処理されたＨＬ６０細胞; 列９: ＨＬ６０細
胞のゲノムＤＮＡへの負の制御; 列１０: 相補ＤＮＡの
鋳型無しで行われた負の制御。
ＲＮＡ）及びＡＳ（ｍＲＮＡ）と名付けられた、ｍＲＮ
Ａに相補的なＡＳ−ＯＤＮs も又分析された。 列１: ＤＮＡ標識VIII（ベーリンガー、マンハイム、ド
イツ）; 列２: 未処理のＨＬ６０細胞; 列３: ＦＥＳ−
Ｓ-sj1と2 ［Ｓ(sj)］の混合物で処理されたＨＬ６０細
胞; 列４: ＦＥＳ−ＩＰ-sj1と2 ［IP(sj)］の混合物で
処理されたＨＬ６０胞; 列５: ＦＥＳ−ＡＳ-sj1と2
［AS(sj)］の混合物で処理されたＨＬ６０細胞; 列６:
ＦＥＳ−Ｓ［Ｓ(mRNA)］の混合物で処理されたＨＬ６０
細胞; 列７: ＦＥＳ−ＩＰ［IP(mRNA)］の混合物で処理
されたＨＬ６０細胞; 列８: ＦＥＳ−ＡＳ［AS(mRNA)］
の混合物で処理されたＨＬ６０細胞; 列９: ＨＬ６０細
胞のゲノムＤＮＡへの負の制御; 列１０: 相補ＤＮＡの
鋳型無しで行われた負の制御。
【図４】c-fes ＯＤＮで処理されたＨＬ６０細胞中のp9
2c-fes蛋白質のウェスタンブロッティング法分析による
検出。用語は図３に用いられたのと同じである。ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ: １はアンチセンスオリゴヌクレオチド、特
に人のc-fes プロト癌遺伝子の一次転写に関し、又エキ
ソン２／イントロン２部位の５′領域に対応し、又前記
プロト癌遺伝子の残基1211-1243 に対応する出版された
遺伝子配列（Oncogene, 5:267, 1990 ）に関係する。Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２はアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド、特に人のc-fes プロト癌遺伝子の一次転写に関し、
又エキソン３／イントロン３部位の５′領域に対応し、
又前記プロト癌遺伝子の残基1537-1568 に対応する出版
された遺伝子配列に関係する。
2c-fes蛋白質のウェスタンブロッティング法分析による
検出。用語は図３に用いられたのと同じである。ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ: １はアンチセンスオリゴヌクレオチド、特
に人のc-fes プロト癌遺伝子の一次転写に関し、又エキ
ソン２／イントロン２部位の５′領域に対応し、又前記
プロト癌遺伝子の残基1211-1243 に対応する出版された
遺伝子配列（Oncogene, 5:267, 1990 ）に関係する。Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２はアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド、特に人のc-fes プロト癌遺伝子の一次転写に関し、
又エキソン３／イントロン３部位の５′領域に対応し、
又前記プロト癌遺伝子の残基1537-1568 に対応する出版
された遺伝子配列に関係する。
Claims (14)
- 【請求項１】 人のc-fes プロト癌遺伝子の一次転写に
相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 エキソン２／イントロン２又はエキソン
３／イントロン３のスプライス部位に対応する領域部分
で前記一次転写と交雑できる、請求項１に記載のオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項３】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １又はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ: ２で示される配列を有する、請求項１に記載の一
次転写に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 その半減期を延ばすために修飾と安定化
を行った、請求項３を経て請求項１に記載のアンチセン
スオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５】 ３′又は ５′端点をチオ燐酸誘導体で修
飾した、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】 ヌクレオチド間の燐酸塩ブリッジがホス
ホン酸メチル又はチオ燐酸- 又はジチオ燐酸−基又は燐
酸エステルに変換されるような、請求項４に記載のオリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項７】 トランスフェリン−ポリリジンと非共有
結合で複合した、請求項４に記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項８】 c-fes 蛋白質を抑制するために、請求項
７を経て請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの使用法。 - 【請求項９】 全トランスレチノイン酸と結合した、請
求項７を経て請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌク
レオチド類の中少なくとも一つを含む製剤形態。 - 【請求項１０】 細胞分化と前記細胞のアポトーシスを
誘発するために、請求項７を経て請求項１に記載のアン
チセンスオリゴヌクレオチド類の少なくとも一つで前処
理された、細胞に使用する全トランスレチノイン酸。 - 【請求項１１】 請求項１乃至７に記載のオリゴヌクレ
オチド類の中少なくとも一つの入った一つ又はそれ以上
の小瓶と全トランスレチノイン酸の入った一つ又はそれ
以上の小瓶を含むキット。 - 【請求項１２】 下記を含む請求項１１に記載のキッ
ト： i) 治療の最初の５日間、一日二回投与される請求項１
乃至７に記載のオリゴヌクレオチド類の中少なくとも一
つが 100乃至500mg 各々に入った小瓶１０個； ii) 続く治療の３日間、一日二回同じ時刻に投与され
る、請求項７を経て請求項１に記載のオリゴヌクレオチ
ド類の中少なくとも一つが 100乃至500mg 各々に入った
小瓶６個と、全トランスレチノイン酸が 5乃至50mg各々
に入った小瓶６個。 - 【請求項１３】 請求項７を経て請求項１に記載のオリ
ゴヌクレオチド類の中少なくとも一つが入った一つ又は
それ以上の小瓶と、前記オリゴヌクレオチド類の中少な
くとも一つと全トランスレチノイン酸の混合物の入った
一つ又はそれ以上の小瓶、より成るキット。 - 【請求項１４】 下記を含む請求項１３に記載のキッ
ト： i) 治療の最初の５日間、一日二回投与される二つのＡ
Ｓ−ＯＤＮs の等分子量混合物が各々 100乃至500mg 入
っている、小瓶１０個； ii) 続く治療の３日間一日二回投与される、全トランス
レチノイン酸 5乃至50mgと結合した請求項７を経て請求
項１に記載のオリゴヌクレオチド類の中少なくとも一つ
が 100乃至500mg 各々に入っている、小瓶６個。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT96A001011 | 1996-05-20 | ||
| IT96MI001011A IT1282734B1 (it) | 1996-05-20 | 1996-05-20 | Oligonucleotidi antisenso di sequenza complementare al trascritto primario del protooncogene umano c-fes e loro uso in combinazione |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1059996A true JPH1059996A (ja) | 1998-03-03 |
Family
ID=11374288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9129183A Pending JPH1059996A (ja) | 1996-05-20 | 1997-05-20 | 白血病性芽細胞のアポトーシスをもたらす分化誘導物質と結合した、人のｃ−ｆｅｓ プロト癌遺伝子の一次転写に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5968825A (ja) |
| EP (1) | EP0808844A3 (ja) |
| JP (1) | JPH1059996A (ja) |
| IT (1) | IT1282734B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100753473B1 (ko) | 2004-12-10 | 2007-08-31 | 주식회사 엘지생활건강 | 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 주름개선제 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990014440A1 (en) * | 1989-05-18 | 1990-11-29 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | RNA PROBE FOR DETECTING c-fes mRNA |
| US6958148B1 (en) | 1998-01-20 | 2005-10-25 | Pericor Science, Inc. | Linkage of agents to body tissue using microparticles and transglutaminase |
| US6919076B1 (en) | 1998-01-20 | 2005-07-19 | Pericor Science, Inc. | Conjugates of agents and transglutaminase substrate linking molecules |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990014440A1 (en) * | 1989-05-18 | 1990-11-29 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | RNA PROBE FOR DETECTING c-fes mRNA |
-
1996
- 1996-05-20 IT IT96MI001011A patent/IT1282734B1/it active IP Right Grant
-
1997
- 1997-05-20 EP EP97108119A patent/EP0808844A3/en not_active Withdrawn
- 1997-05-20 US US08/859,389 patent/US5968825A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-20 JP JP9129183A patent/JPH1059996A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100753473B1 (ko) | 2004-12-10 | 2007-08-31 | 주식회사 엘지생활건강 | 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 주름개선제 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0808844A2 (en) | 1997-11-26 |
| IT1282734B1 (it) | 1998-03-31 |
| US5968825A (en) | 1999-10-19 |
| ITMI961011A1 (it) | 1997-11-20 |
| EP0808844A3 (en) | 1999-09-15 |
| ITMI961011A0 (ja) | 1996-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU693097B2 (en) | Method for treating kaposi's sarcoma with antisense oligonucleotides | |
| US6414134B1 (en) | Regulation of bcl-2 gene expression | |
| US5734033A (en) | Antisense oligonucleotides inhibiting human bcl-2 gene expression | |
| US6005095A (en) | Antisense transcript associated to tumor cells having a T(14;18) translocation and oligodeoxynucleotides useful in the diagnosis and treatment of said tumor cells | |
| AU641636B2 (en) | Antisense oligonucleotides to C-MYB proto-oncogene and uses thereof | |
| KR0171210B1 (ko) | 암치료용 항감작 올리고뉴클레오티드 | |
| US5652222A (en) | Selective inhibition of leukemic cell proliferation by bcr-abl antisense oligonucleotides | |
| WO1996038176A1 (fr) | Inhibiteur de la croissance de cellules leucemiques contenant des derives oligonucleotidiques antisens agissant contre le gene de la tumeur de wilms (wt1) | |
| EP0640143A1 (en) | Senescent cell derived inhibitors of dna synthesis | |
| JPH1052264A (ja) | Ｎ‐ｒａｓ発現阻害剤およびその方法 | |
| WO1997020924A1 (en) | A class of oligonucleotides, therapeutically useful as antitumoural agents | |
| US6429308B1 (en) | HIV infection inhibitors | |
| EP0851919A1 (en) | Antisense oligonucleotide chemotherapy for benign hyperplasia or cancer of the prostate | |
| DE69330137T2 (de) | Die kombination von antineoplastischen mitteln und antisense-oligonukleotiden bei der behandlung von krebs | |
| JPH1059996A (ja) | 白血病性芽細胞のアポトーシスをもたらす分化誘導物質と結合した、人のｃ−ｆｅｓ プロト癌遺伝子の一次転写に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用法 | |
| AU646643B2 (en) | Antisense oligonucleotides to C-ABL proto-oncogene | |
| JPH09104629A (ja) | ウイルムス腫瘍遺伝子（ｗｔ１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る白血病細胞増殖阻害剤 | |
| CA2223109A1 (en) | Use of antisense oligonucleotides to il-6 receptor mrna to inhibit cellular proliferation | |
| EP0585399A1 (en) | Treatment of colorectal carcinoma with antisense oligonucleotides to c-myb proto-oncogene | |
| CA2211877A1 (en) | Human immunodeficiency virus transcription inhibitors and methods of their use | |
| CN1323344A (zh) | 治疗再狭窄的DNAzyme和方法 | |
| WO1997038097A1 (en) | Cooperative oligonucleotides | |
| EP0580795A1 (en) | Antisense oligonucleotides to c-kit proto-oncogene and uses thereof | |
| JP2719060B2 (ja) | アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする固形癌治療剤 | |
| JPH11285391A (ja) | 抗ｈｉｖ剤 |