JPH1059999A - 抗体の分離精製法 - Google Patents
抗体の分離精製法Info
- Publication number
- JPH1059999A JPH1059999A JP8238650A JP23865096A JPH1059999A JP H1059999 A JPH1059999 A JP H1059999A JP 8238650 A JP8238650 A JP 8238650A JP 23865096 A JP23865096 A JP 23865096A JP H1059999 A JPH1059999 A JP H1059999A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- separating
- purifying
- separating agent
- agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 60
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 34
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 20
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 6
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 claims abstract 2
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 claims abstract 2
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 claims abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 58
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 17
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 5
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052684 Cerium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N cerium Chemical compound [Ce] GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052746 lanthanum Inorganic materials 0.000 claims description 2
- FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N lanthanum atom Chemical compound [La] FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052712 strontium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N strontium atom Chemical compound [Sr] CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N yttrium atom Chemical compound [Y] VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 claims 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical class OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 24
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 8
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 abstract description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 11
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 9
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 8
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 7
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YIXJRHPUWRPCBB-UHFFFAOYSA-N magnesium nitrate Chemical compound [Mg+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O YIXJRHPUWRPCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- BNGXYYYYKUGPPF-UHFFFAOYSA-M (3-methylphenyl)methyl-triphenylphosphanium;chloride Chemical compound [Cl-].CC1=CC=CC(C[P+](C=2C=CC=CC=2)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1 BNGXYYYYKUGPPF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910017702 MgZr Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- HSJPMRKMPBAUAU-UHFFFAOYSA-N cerium(3+);trinitrate Chemical compound [Ce+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O HSJPMRKMPBAUAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N zinc nitrate Chemical compound [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRXTYHSAJDENHV-UHFFFAOYSA-H zinc phosphate Chemical compound [Zn+2].[Zn+2].[Zn+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O LRXTYHSAJDENHV-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- NGDQQLAVJWUYSF-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-phenyl-1,3-thiazole-5-sulfonyl chloride Chemical compound S1C(S(Cl)(=O)=O)=C(C)N=C1C1=CC=CC=C1 NGDQQLAVJWUYSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017119 AlPO Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGTXKIZLOWULDJ-UHFFFAOYSA-N [Mg].[Zn] Chemical compound [Mg].[Zn] PGTXKIZLOWULDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- LUHOXAXJVGSGOO-UHFFFAOYSA-B cerium(4+);tetraphosphate Chemical compound [Ce+4].[Ce+4].[Ce+4].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O LUHOXAXJVGSGOO-UHFFFAOYSA-B 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical class [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- LQFNMFDUAPEJRY-UHFFFAOYSA-K lanthanum(3+);phosphate Chemical compound [La+3].[O-]P([O-])([O-])=O LQFNMFDUAPEJRY-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FYDKNKUEBJQCCN-UHFFFAOYSA-N lanthanum(3+);trinitrate Chemical compound [La+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O FYDKNKUEBJQCCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 125000005341 metaphosphate group Chemical class 0.000 description 1
- UJVRJBAUJYZFIX-UHFFFAOYSA-N nitric acid;oxozirconium Chemical compound [Zr]=O.O[N+]([O-])=O.O[N+]([O-])=O UJVRJBAUJYZFIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- -1 rare earth gold Metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- UXBZSSBXGPYSIL-UHFFFAOYSA-K yttrium(iii) phosphate Chemical group [Y+3].[O-]P([O-])([O-])=O UXBZSSBXGPYSIL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 免疫グロブリンクラスの抗体を、その生理活
性を損なうことなく、効率よく安価に分離精製する方法
を提供する。 【解決手段】 マグネシウム、カルシウム、ストロンチ
ウム、チタン、マンガン、鉄、ニッケル、銅、亜鉛、イ
ットリウム、ジルコニウム、ランタン、セリウムから選
ばれた金属のオルトリン酸塩からなる分離剤を用いる分
離精製法。
性を損なうことなく、効率よく安価に分離精製する方法
を提供する。 【解決手段】 マグネシウム、カルシウム、ストロンチ
ウム、チタン、マンガン、鉄、ニッケル、銅、亜鉛、イ
ットリウム、ジルコニウム、ランタン、セリウムから選
ばれた金属のオルトリン酸塩からなる分離剤を用いる分
離精製法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗体の分離精製法に関
する。
する。
【０００２】
【背景の技術】抗体は癌や免疫性疾患などの診断薬、治
療薬、化粧品などへの応用が期待されているが、こうし
た用途に広く利用されるようになるためには抗体を安価
に大量生産できる技術の開発が必要不可欠である。抗体
は化学的に合成するのは難しいため、生物が産生する抗
体を利用せざるを得ない。現在、生物による抗体の産生
方法として、マウス、ウサギ、ヤギなどの動物を免疫
し、その血液を抜き取り、血清成分から抗体を抽出精製
する方法や、免疫された鳥類の血液中に産生される抗体
が卵黄中に濃縮移行する現象を利用し卵黄から抗体を抽
出精製する方法などが一般的に用いられている。
療薬、化粧品などへの応用が期待されているが、こうし
た用途に広く利用されるようになるためには抗体を安価
に大量生産できる技術の開発が必要不可欠である。抗体
は化学的に合成するのは難しいため、生物が産生する抗
体を利用せざるを得ない。現在、生物による抗体の産生
方法として、マウス、ウサギ、ヤギなどの動物を免疫
し、その血液を抜き取り、血清成分から抗体を抽出精製
する方法や、免疫された鳥類の血液中に産生される抗体
が卵黄中に濃縮移行する現象を利用し卵黄から抗体を抽
出精製する方法などが一般的に用いられている。
【０００３】動物の腹水や血液から免疫グロブリンを精
製するにはアフィニティークロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、硫酸アンモニウム塩析などの方法が知られており、
それぞれ精製物の特性に従って適切な方法が用いられ
る。ＩｇＧ抗体の分離精製にはプロテインＡやプロテイ
ンＧを用いた群特異的アフィニティークロマトグラフィ
ーを用いることが多いが、この方法は強酸性の溶離条件
を必要とすることが多く、そのため精製した抗体の生理
活性が損なわれるという問題が起こり易い難点がある。
また、抗体を産生する動物の種類によってはＩｇＧであ
ってもプロテインＡやプロテインＧと親和性を示さず分
離精製を行なうことができないことがある。更に、プロ
テインＡやプロテインＧはＩｇＡやＩｇＭなど他の免疫
グロブリンクラスの抗体には親和性を持たないためＩｇ
Ｇ抗体以外の抗体の分離精製を行なうことはできないな
ど適用範囲が狭い難点がある。
製するにはアフィニティークロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、硫酸アンモニウム塩析などの方法が知られており、
それぞれ精製物の特性に従って適切な方法が用いられ
る。ＩｇＧ抗体の分離精製にはプロテインＡやプロテイ
ンＧを用いた群特異的アフィニティークロマトグラフィ
ーを用いることが多いが、この方法は強酸性の溶離条件
を必要とすることが多く、そのため精製した抗体の生理
活性が損なわれるという問題が起こり易い難点がある。
また、抗体を産生する動物の種類によってはＩｇＧであ
ってもプロテインＡやプロテインＧと親和性を示さず分
離精製を行なうことができないことがある。更に、プロ
テインＡやプロテインＧはＩｇＡやＩｇＭなど他の免疫
グロブリンクラスの抗体には親和性を持たないためＩｇ
Ｇ抗体以外の抗体の分離精製を行なうことはできないな
ど適用範囲が狭い難点がある。
【０００４】近年、動物の血液を用いる代わりにニワト
リなどの鳥類の卵黄を利用する方法が実用化された。一
般に、鳥類の卵黄由来のＩｇＧ抗体〔血液中のＩｇＧ抗
体と区別してＩｇＹ（Immunoglobulin Yolk）と呼ばれ
ている〕の分離精製は、卵黄中にあって脂質と結合して
いるリポタンパク質とＩｇＹ含有液体とを分離する前工
程と、ＩｇＹ含有液体からＩｇＹのみを分離、精製する
後工程からなり、前工程で用いる技術としてはカラギー
ナン等の天然多糖を利用する方法や第２級アルコールを
利用し、脱脂する方法がある。後工程で用いる技術とし
ては、上述したようにアフィニティークロマトグラフィ
ーには様々な問題があるために、一般にイオン交換クロ
マトグラフィーと塩析や脱塩処理を組み合わせた方法が
用いられている（例えば、J. Fichtali et al, Journal
of Food Science, 58 (6), 1282−1285 (1993)）。し
かしながら、後工程に用いられるこれらの方法は複数の
処理工程を必要とし、長時間を要するため、コスト高と
なるなど問題が多い。
リなどの鳥類の卵黄を利用する方法が実用化された。一
般に、鳥類の卵黄由来のＩｇＧ抗体〔血液中のＩｇＧ抗
体と区別してＩｇＹ（Immunoglobulin Yolk）と呼ばれ
ている〕の分離精製は、卵黄中にあって脂質と結合して
いるリポタンパク質とＩｇＹ含有液体とを分離する前工
程と、ＩｇＹ含有液体からＩｇＹのみを分離、精製する
後工程からなり、前工程で用いる技術としてはカラギー
ナン等の天然多糖を利用する方法や第２級アルコールを
利用し、脱脂する方法がある。後工程で用いる技術とし
ては、上述したようにアフィニティークロマトグラフィ
ーには様々な問題があるために、一般にイオン交換クロ
マトグラフィーと塩析や脱塩処理を組み合わせた方法が
用いられている（例えば、J. Fichtali et al, Journal
of Food Science, 58 (6), 1282−1285 (1993)）。し
かしながら、後工程に用いられるこれらの方法は複数の
処理工程を必要とし、長時間を要するため、コスト高と
なるなど問題が多い。
【０００５】免疫性疾患などの診断薬、治療薬として抗
体を広く使用できるようにするためには、抗体を安価に
大量生産することが必要であるが、従来技術には解決し
なければならない多くの問題があり、そうした問題を解
決できる技術の開発が望まれている。
体を広く使用できるようにするためには、抗体を安価に
大量生産することが必要であるが、従来技術には解決し
なければならない多くの問題があり、そうした問題を解
決できる技術の開発が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
の背景の技術に鑑み、様々な免疫グロブリンクラスの抗
体を、その生理活性を損なうことなく、効率よく簡単
に、且つ、安価に分離精製し得る分離精製法ならびに該
分離精製において用いる分離剤を提供することにある。
の背景の技術に鑑み、様々な免疫グロブリンクラスの抗
体を、その生理活性を損なうことなく、効率よく簡単
に、且つ、安価に分離精製し得る分離精製法ならびに該
分離精製において用いる分離剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決する手段】本発明者らは、これまでに、ピ
ロリン酸およびメタリン酸の金属塩がタンパク質、酵
素、核酸などの物質をクロマト的に分離精製するための
固定相材料として好適な性質を有することを明らかにし
てきた（特願平５−２２９７０３）。その後更に研究を
進める中で、特定の金属のオルトリン酸塩からなる分離
剤を使用することにより、驚くべきことにＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＹなど様々な免疫グロブリンクラスの抗体を、
温和な条件下で生理活性を損なうことなく分離精製する
ことができ、前記の課題を一挙に解決できることを見い
だし、本発明を完成するに至った。
ロリン酸およびメタリン酸の金属塩がタンパク質、酵
素、核酸などの物質をクロマト的に分離精製するための
固定相材料として好適な性質を有することを明らかにし
てきた（特願平５−２２９７０３）。その後更に研究を
進める中で、特定の金属のオルトリン酸塩からなる分離
剤を使用することにより、驚くべきことにＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＹなど様々な免疫グロブリンクラスの抗体を、
温和な条件下で生理活性を損なうことなく分離精製する
ことができ、前記の課題を一挙に解決できることを見い
だし、本発明を完成するに至った。
【０００８】即ち、本発明は、血清、腹水、培養上清な
ど、分離精製したい抗体と血清アルブミンなどの夾雑成
分が混在する液体を分離剤と接触させて目的の抗体を分
離剤に吸着させ、次いで液体と分離剤とを分離した後、
分離剤に吸着した抗体を脱離・回収するに当たり、分離
剤として特定の金属のオルトリン酸塩を用いることを特
徴とする抗体の分離精製法に関する。
ど、分離精製したい抗体と血清アルブミンなどの夾雑成
分が混在する液体を分離剤と接触させて目的の抗体を分
離剤に吸着させ、次いで液体と分離剤とを分離した後、
分離剤に吸着した抗体を脱離・回収するに当たり、分離
剤として特定の金属のオルトリン酸塩を用いることを特
徴とする抗体の分離精製法に関する。
【０００９】本発明の分離精製法における抗体の分離
は、アフィニティークロマトグラフィーが被分離生体試
料と分離剤との間の生物学的親和性の差に基づく分離で
あるのとは異なり、主に被分離生体試料と金属のオルト
リン酸塩との間の静電気的相互作用に基づくものと推定
される。このため本分離精製法における分離剤は被分離
生体試料を産生する動物の種類によらず適用することが
できるという特長がある。また、抗体の吸着および脱離
に係わる溶液として中性付近のｐＨに調整した溶液を使
用できるので、分離精製操作により抗体が変性して生理
活性が損なわれるという恐れがなく、このことは当該分
野の分離精製法として格別の利点である。
は、アフィニティークロマトグラフィーが被分離生体試
料と分離剤との間の生物学的親和性の差に基づく分離で
あるのとは異なり、主に被分離生体試料と金属のオルト
リン酸塩との間の静電気的相互作用に基づくものと推定
される。このため本分離精製法における分離剤は被分離
生体試料を産生する動物の種類によらず適用することが
できるという特長がある。また、抗体の吸着および脱離
に係わる溶液として中性付近のｐＨに調整した溶液を使
用できるので、分離精製操作により抗体が変性して生理
活性が損なわれるという恐れがなく、このことは当該分
野の分離精製法として格別の利点である。
【００１０】本発明に係わるオルトリン酸塩の金属とし
ては、アルミニウム、原子番号２１から３０までの遷移
金属、原子番号３９から４７までの遷移金属、希土類金
属から選ばれた金属が好適に使用でき、特に好ましく
は、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、チ
タン、マンガン、鉄、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウ
ム、ジルコニウム、ランタン、セリウムなどが使用でき
る。オルトリン酸塩の態様としては、マグネシウムなど
２価金属のオルトリン酸塩、例えばＭｇ3(ＰＯ4) 2や、
Ａｌなどの３価金属のオルトリン酸塩、例えばＡｌＰＯ
4や、Ｚｒなどの４価金属のオルトリン酸塩、例えばＺ
ｒ3(ＰＯ4)4などの化合物が本発明の分離剤として好適
である。また、上記の金属の２種または２種以上の金属
を組み合わせたオルトリン酸塩、例えば２価の金属同士
を組み合わせた(Ｍｇ1/2Ｆｅ1/2)3(ＰＯ4)2、(Ｍｇ2/3
Ｍｎ1/3)3(ＰＯ4)2、(Ｚｎ2/3Ｍｇ1/3)3(ＰＯ4)2や、２
価と４価の金属を組み合わせたＭｇＴｉ(ＰＯ4)2、Ｍｇ
Ｚｒ4(ＰＯ4)6などのオルトリン酸塩も好適に使用で
き、金属の種類や組み合わせを選択することにより分離
剤が抗体を保持する強さを制御することができる。
ては、アルミニウム、原子番号２１から３０までの遷移
金属、原子番号３９から４７までの遷移金属、希土類金
属から選ばれた金属が好適に使用でき、特に好ましく
は、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、チ
タン、マンガン、鉄、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウ
ム、ジルコニウム、ランタン、セリウムなどが使用でき
る。オルトリン酸塩の態様としては、マグネシウムなど
２価金属のオルトリン酸塩、例えばＭｇ3(ＰＯ4) 2や、
Ａｌなどの３価金属のオルトリン酸塩、例えばＡｌＰＯ
4や、Ｚｒなどの４価金属のオルトリン酸塩、例えばＺ
ｒ3(ＰＯ4)4などの化合物が本発明の分離剤として好適
である。また、上記の金属の２種または２種以上の金属
を組み合わせたオルトリン酸塩、例えば２価の金属同士
を組み合わせた(Ｍｇ1/2Ｆｅ1/2)3(ＰＯ4)2、(Ｍｇ2/3
Ｍｎ1/3)3(ＰＯ4)2、(Ｚｎ2/3Ｍｇ1/3)3(ＰＯ4)2や、２
価と４価の金属を組み合わせたＭｇＴｉ(ＰＯ4)2、Ｍｇ
Ｚｒ4(ＰＯ4)6などのオルトリン酸塩も好適に使用で
き、金属の種類や組み合わせを選択することにより分離
剤が抗体を保持する強さを制御することができる。
【００１１】本発明に係わる分離剤はオルトリン酸の金
属塩が抗体吸着の担い手として機能するものであり、そ
のためには被分離試料と接触する該分離剤表面がオルト
リン酸の金属塩からなることが必要である。一方、被分
離試料と接触しない材料内部の材質は分離機構には関与
しないから、本発明に係わる分離剤は材質表面が上述の
オルトリン酸の金属塩でさえあれば、その材料の内部は
金属やガラス、セラミックスなど他の材料であってもよ
い。また、上述の趣旨から、当然、材料表面も材料内部
も全てがオルトリン酸の金属塩であってもよい。オルト
リン酸の金属塩は結晶学的には非晶質であっても結晶質
であってもよい。また、分離剤の多孔性は静電気的相互
作用による分離機構とは直接には関係ないので無孔質の
材料と多孔性の材料のいずれであってもよいが、実用面
からは時間的にもコスト的にも一回の操作で分離精製で
きる抗体の量が多いほうが望ましい。そのためには多孔
質な分離剤を調製して表面積を大きくし、分離剤の単位
量当たりの抗体の吸着量を大きくするのが良く、少なく
とも１ｍ2／ｇ以上の比表面積を有するようにするのが
好ましい。表面積を大きくするためには、例えば、サブ
ミクロンの微細粒子が凝集した多孔質の凝集体であっ
て、該微細粒子の表面あるいは該微細粒子全体がオルト
リン酸の金属塩からなる凝集体とする方法があり、その
ような多孔質の凝集体は本発明に係わる分離剤材料とし
て極めて好適に使用できる。その場合、該凝集体を分離
剤材料として使用するのに十分な機械的強度を付与する
ために、微細粒子同士を強固に結合させる手段として、
例えば、凝集体を６００〜１０００℃の焼成温度で加熱
して微細粒子同士を燒結させる方法を用いることができ
る。
属塩が抗体吸着の担い手として機能するものであり、そ
のためには被分離試料と接触する該分離剤表面がオルト
リン酸の金属塩からなることが必要である。一方、被分
離試料と接触しない材料内部の材質は分離機構には関与
しないから、本発明に係わる分離剤は材質表面が上述の
オルトリン酸の金属塩でさえあれば、その材料の内部は
金属やガラス、セラミックスなど他の材料であってもよ
い。また、上述の趣旨から、当然、材料表面も材料内部
も全てがオルトリン酸の金属塩であってもよい。オルト
リン酸の金属塩は結晶学的には非晶質であっても結晶質
であってもよい。また、分離剤の多孔性は静電気的相互
作用による分離機構とは直接には関係ないので無孔質の
材料と多孔性の材料のいずれであってもよいが、実用面
からは時間的にもコスト的にも一回の操作で分離精製で
きる抗体の量が多いほうが望ましい。そのためには多孔
質な分離剤を調製して表面積を大きくし、分離剤の単位
量当たりの抗体の吸着量を大きくするのが良く、少なく
とも１ｍ2／ｇ以上の比表面積を有するようにするのが
好ましい。表面積を大きくするためには、例えば、サブ
ミクロンの微細粒子が凝集した多孔質の凝集体であっ
て、該微細粒子の表面あるいは該微細粒子全体がオルト
リン酸の金属塩からなる凝集体とする方法があり、その
ような多孔質の凝集体は本発明に係わる分離剤材料とし
て極めて好適に使用できる。その場合、該凝集体を分離
剤材料として使用するのに十分な機械的強度を付与する
ために、微細粒子同士を強固に結合させる手段として、
例えば、凝集体を６００〜１０００℃の焼成温度で加熱
して微細粒子同士を燒結させる方法を用いることができ
る。
【００１２】分離剤の形状としては、カラムクロマトグ
ラフィー用の充填剤として用いる場合は、粒子とするの
が好ましく、均一な充填を行なうためには特に球状体の
粒子とするのが好ましい。あるいは、０.１μｍ以上の
細孔径の細孔が３次元網目状に連続した一体型の円柱状
の多孔体にしてカラムに装着することもできる。また、
本発明に係わる抗体の分離精製法としてバッチ方式で精
製することも可能であり、その場合も分離剤の形状は実
施状況に合わせて粒子状にしたり、円柱、円盤、厚膜な
ど様々な形状の一体型にして用いたりすることができ
る。
ラフィー用の充填剤として用いる場合は、粒子とするの
が好ましく、均一な充填を行なうためには特に球状体の
粒子とするのが好ましい。あるいは、０.１μｍ以上の
細孔径の細孔が３次元網目状に連続した一体型の円柱状
の多孔体にしてカラムに装着することもできる。また、
本発明に係わる抗体の分離精製法としてバッチ方式で精
製することも可能であり、その場合も分離剤の形状は実
施状況に合わせて粒子状にしたり、円柱、円盤、厚膜な
ど様々な形状の一体型にして用いたりすることができ
る。
【００１３】分離剤を粒子の形にして使用する場合の粒
子の大きさは、使用条件によって適当な大きさを選択す
るのが望ましい。例えば、ＨＰＬＣカラム用充填剤とし
て用いる場合は高い分離度のクロマトグラフィーを実現
するために平均粒子径が０.５〜１５μｍ、殊に望まし
くは３〜１０μｍの範囲の粒子径の粒子を用いるのが好
適である。また、オープンカラム用充填剤として用いる
場合は通液の容易さと充分な試料負荷量を実現するため
には平均粒子径が３０〜１５０μｍ程度の粒子径の粒子
を用いるのが好ましいが、使用条件によっては１５０μ
ｍ以上の大きな粒子径の分離剤を用いることも可能であ
り、例えば数ｍｍの大きさの粒子径の分離剤を用いるこ
とにより、大量の分離剤を充填した大型カラムを用いて
も高い通液性を保つことができる利点がある。更に、分
離剤の粒子径の如何にかかわらず、カラムへの充填を容
易にし、カラムの分離性能を高めるために、分離剤粒子
の形状は球状体とすることが殊に好ましい。
子の大きさは、使用条件によって適当な大きさを選択す
るのが望ましい。例えば、ＨＰＬＣカラム用充填剤とし
て用いる場合は高い分離度のクロマトグラフィーを実現
するために平均粒子径が０.５〜１５μｍ、殊に望まし
くは３〜１０μｍの範囲の粒子径の粒子を用いるのが好
適である。また、オープンカラム用充填剤として用いる
場合は通液の容易さと充分な試料負荷量を実現するため
には平均粒子径が３０〜１５０μｍ程度の粒子径の粒子
を用いるのが好ましいが、使用条件によっては１５０μ
ｍ以上の大きな粒子径の分離剤を用いることも可能であ
り、例えば数ｍｍの大きさの粒子径の分離剤を用いるこ
とにより、大量の分離剤を充填した大型カラムを用いて
も高い通液性を保つことができる利点がある。更に、分
離剤の粒子径の如何にかかわらず、カラムへの充填を容
易にし、カラムの分離性能を高めるために、分離剤粒子
の形状は球状体とすることが殊に好ましい。
【００１４】オルトリン酸の金属塩の製法は特に限定さ
れず、様々な公知の製法を用いることができる。例え
ば、オルトリン酸アルミニウムを調製するのに、硝酸ア
ルミニウム水溶液とリン酸アンモニウム水溶液をアルミ
ニウムとリンの原子比が１：１となるように混合撹拌し
てスラリーを調製し、これを３００℃で噴霧乾燥して球
状粒子とした後、９００℃で焼成することにより、粒子
全体がオルトリン酸アルミニウムからなる本発明の分離
剤を得ることができる。
れず、様々な公知の製法を用いることができる。例え
ば、オルトリン酸アルミニウムを調製するのに、硝酸ア
ルミニウム水溶液とリン酸アンモニウム水溶液をアルミ
ニウムとリンの原子比が１：１となるように混合撹拌し
てスラリーを調製し、これを３００℃で噴霧乾燥して球
状粒子とした後、９００℃で焼成することにより、粒子
全体がオルトリン酸アルミニウムからなる本発明の分離
剤を得ることができる。
【００１５】分離剤の材料表面のみがオルトリン酸の金
属塩からなる態様の分離剤を作製することもできる。例
えば、分離剤材料の内部の材料として使用するために３
次元網目状に連続した細孔を有するアルミナなどのセラ
ミックスの多孔体を公知の技術を用いて作製し、この多
孔体をオルトリン酸亜鉛組成のスラリーに浸漬し、多孔
体の細孔にスラリーを十分に含浸させてから引き上げて
余分なスラリーを除去したのち、乾燥、焼成することに
より、分離剤の表面がオルトリン酸亜鉛で被覆された態
様の分離剤を作製することができる。
属塩からなる態様の分離剤を作製することもできる。例
えば、分離剤材料の内部の材料として使用するために３
次元網目状に連続した細孔を有するアルミナなどのセラ
ミックスの多孔体を公知の技術を用いて作製し、この多
孔体をオルトリン酸亜鉛組成のスラリーに浸漬し、多孔
体の細孔にスラリーを十分に含浸させてから引き上げて
余分なスラリーを除去したのち、乾燥、焼成することに
より、分離剤の表面がオルトリン酸亜鉛で被覆された態
様の分離剤を作製することができる。
【００１６】本発明に係わる抗体の分離精製法で使用す
る溶液は、いずれの場合も、生体試料にとって温和なｐ
Ｈ６〜８の範囲の溶液を用いることができる。溶液のｐ
Ｈを６以下あるいは８以上にしても本発明に係わる抗体
の分離精製を行なうことは可能であるが、一般にアルカ
リ条件下で行なえば生体試料の分離剤への吸着が弱くな
り分離も悪くなる傾向が有り、一方、酸性条件下で行な
えば生体試料の生理活性を損なう恐れがあるなどの問題
が生じ易く、中性付近のｐＨに調製した溶液を用いて行
なう分離精製条件と比較して格別のメリットが得られる
ことは殆どない。従って、本発明に係わる抗体の分離精
製はｐＨ６〜８の条件下で行なうのが好ましい。
る溶液は、いずれの場合も、生体試料にとって温和なｐ
Ｈ６〜８の範囲の溶液を用いることができる。溶液のｐ
Ｈを６以下あるいは８以上にしても本発明に係わる抗体
の分離精製を行なうことは可能であるが、一般にアルカ
リ条件下で行なえば生体試料の分離剤への吸着が弱くな
り分離も悪くなる傾向が有り、一方、酸性条件下で行な
えば生体試料の生理活性を損なう恐れがあるなどの問題
が生じ易く、中性付近のｐＨに調製した溶液を用いて行
なう分離精製条件と比較して格別のメリットが得られる
ことは殆どない。従って、本発明に係わる抗体の分離精
製はｐＨ６〜８の条件下で行なうのが好ましい。
【００１７】
【実施の形態】本発明に係わるオルトリン酸の金属塩を
分離剤に用いた抗体の分離精製は以下のようにして行な
うことができる。
分離剤に用いた抗体の分離精製は以下のようにして行な
うことができる。
【００１８】目的の抗体を含有する血清、腹水、培養上
清などの溶液から目的の抗体を分離精製するに当たり、
カラムクロマトグラフィーを用いる場合は、粒子状特に
好ましくは球状に作製したオルトリン酸の金属塩からな
る分離剤をカラムに充填し、ｐＨ６〜８に調整したリン
酸ナトリウム緩衝液やリン酸カリウム緩衝液、リン酸ナ
トリウムやリン酸カリウムでｐＨ６〜８に調整した塩化
ナトリウム溶液または塩化カリウム溶液などを溶離液に
用いて、溶離液濃度のリニアグラジェント法あるいはス
テップワイズ法で抗体を精製することができる。バッチ
法により精製する場合は、例えば分離剤として、粒子、
一体型多孔体など使用条件に適するように作製したオル
トリン酸塩を適当な容器に入れ、目的の抗体を含有する
溶液を該容器に注いで穏やかに撹拌して充分に抗体を分
離剤に吸着させたのち、濾別、遠心分離などの手段によ
り溶液と抗体が吸着した分離剤とを分離し、次いで目的
の抗体の脱離のために、ｐＨ６〜８に調整した温和な溶
離液の塩濃度を制御して目的の抗体を分離剤から脱離・
回収することができる。
清などの溶液から目的の抗体を分離精製するに当たり、
カラムクロマトグラフィーを用いる場合は、粒子状特に
好ましくは球状に作製したオルトリン酸の金属塩からな
る分離剤をカラムに充填し、ｐＨ６〜８に調整したリン
酸ナトリウム緩衝液やリン酸カリウム緩衝液、リン酸ナ
トリウムやリン酸カリウムでｐＨ６〜８に調整した塩化
ナトリウム溶液または塩化カリウム溶液などを溶離液に
用いて、溶離液濃度のリニアグラジェント法あるいはス
テップワイズ法で抗体を精製することができる。バッチ
法により精製する場合は、例えば分離剤として、粒子、
一体型多孔体など使用条件に適するように作製したオル
トリン酸塩を適当な容器に入れ、目的の抗体を含有する
溶液を該容器に注いで穏やかに撹拌して充分に抗体を分
離剤に吸着させたのち、濾別、遠心分離などの手段によ
り溶液と抗体が吸着した分離剤とを分離し、次いで目的
の抗体の脱離のために、ｐＨ６〜８に調整した温和な溶
離液の塩濃度を制御して目的の抗体を分離剤から脱離・
回収することができる。
【００１９】
【実施例】以下に、本発明の実施例を掲げ、本発明を具
体的に説明する。ただし、本発明は下記の実施例に限定
されるものではない。 実施例１ オルトリン酸アルミニウム組成となるように、硝酸アル
ミニウム水溶液とリン酸アンモニウム水溶液を混合撹拌
して調整したスラリーを、２００℃で噴霧乾燥して４０
〜６０μｍの球状粒子を得た。この生成物を更に９００
℃で４時間熱処理して、オルトリン酸アルミニウムの多
孔質な球状粒子を得た。
体的に説明する。ただし、本発明は下記の実施例に限定
されるものではない。 実施例１ オルトリン酸アルミニウム組成となるように、硝酸アル
ミニウム水溶液とリン酸アンモニウム水溶液を混合撹拌
して調整したスラリーを、２００℃で噴霧乾燥して４０
〜６０μｍの球状粒子を得た。この生成物を更に９００
℃で４時間熱処理して、オルトリン酸アルミニウムの多
孔質な球状粒子を得た。
【００２０】免疫グロブリンクラスＧ２ａ（ＩｇＧ２
ａ）のモノクローナル抗体を含有するラット腹水１０ｍ
ｌを試験管に入れ、オルトリン酸アルミニウム球状粒子
４.０ｇを加えて５分間振盪し、ＩｇＧ２ａ抗体をオル
トリン酸アルミニウムの分離剤に吸着させた。次いで、
孔径１０μｍのフィルターを底部に装着したシリンジに
抗体を吸着した分離剤共々腹水を注ぎ込み、ＩｇＧ２ａ
抗体を吸着させたオルトリン酸アルミニウムと腹水を分
離した。更に、抗体と共に吸着した血清アルブミンなど
の夾雑成分を除去するために、ｐＨ６.８に調整した１
０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液２０ｍｌをシリンジに
注入し、最後に４００ｍＭ塩化カリウム溶液５ｍｌをシ
リンジに注ぎ込み、シリンジ底部から流出する溶出液を
回収して、ラットＩｇＧ２ａ抗体溶液約５ｍｌを得た。
このＩｇＧ２ａ抗体溶液の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動で調べた結果、ＩｇＧ２ａ抗体のＨ鎖及びＬ鎖に由
来する二本のバンドのみが検出された。また、この精製
処理におけるＩｇＧ２ａ抗体の吸光度測定法による回収
率はほぼ１００％であった。このように、オルトリン酸
アルミニウムを用いたバッチ法により、ラット腹水から
モノクローナルＩｇＧ２ａ抗体を高純度に分離精製する
ことができた。 実施例２ ＭｇＺｒ4(ＰＯ4)6組成となるように、オキシ硝酸ジル
コニウムと硝酸マグネシウムとリン酸を混合撹拌し、更
にメタノールを加えて調製したスラリーを７００℃で噴
霧熱分解した。この生成物を８００℃で４時間仮焼した
のち分級して４〜１０μｍのＭｇＺｒ4(ＰＯ4)6の多孔
質な球状粒子を得た。この４〜１０μｍ球状粒子を更に
８００℃で６時間熱処理した後、ステンレススチール管
（８ｍｍφ×１００ｍｍ）に充填した。
ａ）のモノクローナル抗体を含有するラット腹水１０ｍ
ｌを試験管に入れ、オルトリン酸アルミニウム球状粒子
４.０ｇを加えて５分間振盪し、ＩｇＧ２ａ抗体をオル
トリン酸アルミニウムの分離剤に吸着させた。次いで、
孔径１０μｍのフィルターを底部に装着したシリンジに
抗体を吸着した分離剤共々腹水を注ぎ込み、ＩｇＧ２ａ
抗体を吸着させたオルトリン酸アルミニウムと腹水を分
離した。更に、抗体と共に吸着した血清アルブミンなど
の夾雑成分を除去するために、ｐＨ６.８に調整した１
０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液２０ｍｌをシリンジに
注入し、最後に４００ｍＭ塩化カリウム溶液５ｍｌをシ
リンジに注ぎ込み、シリンジ底部から流出する溶出液を
回収して、ラットＩｇＧ２ａ抗体溶液約５ｍｌを得た。
このＩｇＧ２ａ抗体溶液の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動で調べた結果、ＩｇＧ２ａ抗体のＨ鎖及びＬ鎖に由
来する二本のバンドのみが検出された。また、この精製
処理におけるＩｇＧ２ａ抗体の吸光度測定法による回収
率はほぼ１００％であった。このように、オルトリン酸
アルミニウムを用いたバッチ法により、ラット腹水から
モノクローナルＩｇＧ２ａ抗体を高純度に分離精製する
ことができた。 実施例２ ＭｇＺｒ4(ＰＯ4)6組成となるように、オキシ硝酸ジル
コニウムと硝酸マグネシウムとリン酸を混合撹拌し、更
にメタノールを加えて調製したスラリーを７００℃で噴
霧熱分解した。この生成物を８００℃で４時間仮焼した
のち分級して４〜１０μｍのＭｇＺｒ4(ＰＯ4)6の多孔
質な球状粒子を得た。この４〜１０μｍ球状粒子を更に
８００℃で６時間熱処理した後、ステンレススチール管
（８ｍｍφ×１００ｍｍ）に充填した。
【００２１】このようにして作製したカラムを用いて、
塩化ナトリウム水溶液(ｐＨ６.５）の濃度のリニアグラ
ジェント法（流速１ｍｌ／min、濃度勾配：５０分間で
１０ｍＭから５０ｍＭまで増加）により、L. Kwan等の
方法〔Journal of Food Science, 1537−1541 (1991)〕
に基づいて鶏卵卵黄から除脂質処理して得たＩｇＹ含有
液体のクロマトグラフィーを実施した。その結果、はじ
めにＩｇＹ以外のタンパク質成分の大部分がカラムに保
持されずに溶出され、塩化ナトリウム濃度が１８０ｍＭ
まで増加したところでＩｇＹが溶出され、更に塩化ナト
リウム濃度を高めるとその他のタンパク質成分が溶出さ
れた。本実施例で用いたＩｇＹ含有液体中のＩｇＹの含
有率は、精製前が８％であったのが精製後は９９％の純
度となり、また、吸光度測定法による回収率はほぼ１０
０％であった。このように、本発明に係わる抗体の精製
法により、ＩｇＹ含有液体からＩｇＹを損失することな
く高純度に分離精製することができた。 実施例３ マグネシウムと亜鉛の２種の金属を組み合わせた（原子
比で２：１となるように配合）オルトリン酸塩の組成と
なるように硝酸マグネシウムと硝酸亜鉛およびリン酸ア
ンモニウム水溶液を用いて調製したスラリーに、３次元
的に連続した５００μｍの開孔のある円盤状のアルミナ
のセラミックスフォーム（１５ｍｍφ×１０ｍｍ）を浸
漬し、アルミナのフォームを引き上げて余分なスラリー
を除去した後、乾燥させ、次いで、８００℃で６時間加
熱処理してオルトリン酸塩がアルミナのフォームの表面
を覆った態様の多孔質なマグネシウム−亜鉛複合オルト
リン酸塩を得た。次いで、この円盤状のオルトリン酸塩
を内径１５ｍｍ×１００ｍｍのプラスチックチューブの
一端に装着したシリンジを作製した。
塩化ナトリウム水溶液(ｐＨ６.５）の濃度のリニアグラ
ジェント法（流速１ｍｌ／min、濃度勾配：５０分間で
１０ｍＭから５０ｍＭまで増加）により、L. Kwan等の
方法〔Journal of Food Science, 1537−1541 (1991)〕
に基づいて鶏卵卵黄から除脂質処理して得たＩｇＹ含有
液体のクロマトグラフィーを実施した。その結果、はじ
めにＩｇＹ以外のタンパク質成分の大部分がカラムに保
持されずに溶出され、塩化ナトリウム濃度が１８０ｍＭ
まで増加したところでＩｇＹが溶出され、更に塩化ナト
リウム濃度を高めるとその他のタンパク質成分が溶出さ
れた。本実施例で用いたＩｇＹ含有液体中のＩｇＹの含
有率は、精製前が８％であったのが精製後は９９％の純
度となり、また、吸光度測定法による回収率はほぼ１０
０％であった。このように、本発明に係わる抗体の精製
法により、ＩｇＹ含有液体からＩｇＹを損失することな
く高純度に分離精製することができた。 実施例３ マグネシウムと亜鉛の２種の金属を組み合わせた（原子
比で２：１となるように配合）オルトリン酸塩の組成と
なるように硝酸マグネシウムと硝酸亜鉛およびリン酸ア
ンモニウム水溶液を用いて調製したスラリーに、３次元
的に連続した５００μｍの開孔のある円盤状のアルミナ
のセラミックスフォーム（１５ｍｍφ×１０ｍｍ）を浸
漬し、アルミナのフォームを引き上げて余分なスラリー
を除去した後、乾燥させ、次いで、８００℃で６時間加
熱処理してオルトリン酸塩がアルミナのフォームの表面
を覆った態様の多孔質なマグネシウム−亜鉛複合オルト
リン酸塩を得た。次いで、この円盤状のオルトリン酸塩
を内径１５ｍｍ×１００ｍｍのプラスチックチューブの
一端に装着したシリンジを作製した。
【００２２】１０倍希釈したマウス血清１０ｍｌを上記
のオルトリン酸塩を装着したシリンジに注入し、血清中
の抗体をオルトリン酸塩に吸着させた。次いで、ｐＨ
６.８に調整した１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液４
０ｍｌをシリンジに注いで、抗体と共に吸着している血
清アルブミンなどの夾雑成分を除去し、次いでリン酸ナ
トリウムでｐＨ６.８に調整した５００ｍＭ塩化ナトリ
ウム溶液１０ｍｌをシリンジに注ぎ込み、シリンジ下部
から流出してくる溶出液を回収し、マウスＩｇＧ抗体を
含む溶液約１０ｍｌを得た。最後に、ｐＨ６.８に調整
したリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍｌを注入し、シリン
ジ下部から流出してくる溶出液を回収し、マウスＩｇＭ
を含む溶液約１０ｍｌを得た。 実施例４ オルトリン酸ランタン、オルトリン酸セリウム、オルト
リン酸イットリウム組成となるように、硝酸ランタン、
硝酸セリウム、硝酸イットリウム、リン酸アンモニウム
の水溶液を用いて調製したスラリーを実施例１と同様に
噴霧乾燥して、８０〜１２０μｍの球状粒子を作製し、
次いで９００℃で熱処理して３種類の金属の多孔質なオ
ルトリン酸塩を得た。この３種類のオルトリン酸塩の球
状粒子２ｇを３本のＢＩＯ−ＲＡＤエコノカラム（内径
１５ｍｍ）に別々に充填し、３種類の分離カラムを作製
した。
のオルトリン酸塩を装着したシリンジに注入し、血清中
の抗体をオルトリン酸塩に吸着させた。次いで、ｐＨ
６.８に調整した１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液４
０ｍｌをシリンジに注いで、抗体と共に吸着している血
清アルブミンなどの夾雑成分を除去し、次いでリン酸ナ
トリウムでｐＨ６.８に調整した５００ｍＭ塩化ナトリ
ウム溶液１０ｍｌをシリンジに注ぎ込み、シリンジ下部
から流出してくる溶出液を回収し、マウスＩｇＧ抗体を
含む溶液約１０ｍｌを得た。最後に、ｐＨ６.８に調整
したリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍｌを注入し、シリン
ジ下部から流出してくる溶出液を回収し、マウスＩｇＭ
を含む溶液約１０ｍｌを得た。 実施例４ オルトリン酸ランタン、オルトリン酸セリウム、オルト
リン酸イットリウム組成となるように、硝酸ランタン、
硝酸セリウム、硝酸イットリウム、リン酸アンモニウム
の水溶液を用いて調製したスラリーを実施例１と同様に
噴霧乾燥して、８０〜１２０μｍの球状粒子を作製し、
次いで９００℃で熱処理して３種類の金属の多孔質なオ
ルトリン酸塩を得た。この３種類のオルトリン酸塩の球
状粒子２ｇを３本のＢＩＯ−ＲＡＤエコノカラム（内径
１５ｍｍ）に別々に充填し、３種類の分離カラムを作製
した。
【００２３】この３種類のカラムを用いてステップワイ
ズ溶離方式により１０倍希釈したラット血清からのＩｇ
ＧとＩｇＭの分離精製を試みた。各々のカラムに１０ｍ
ｌのラット血清を注入し、血清中の抗体を分離剤に吸着
させた。次いで、リン酸ナトリウムでｐＨ６.８に調整
した１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液４０ｍｌを注入し
て抗体と共に吸着した血清アルブミンなどの夾雑成分を
除去した。次に、ＩｇＧ抗体を分離回収するために、リ
ン酸ナトリウムでｐＨ６.８に調整した５００ｍＭ塩化
ナトリウム溶出液１０ｍｌをカラムに注入し、カラム下
部から流出してくる溶出液を回収し、ラットＩｇＧ抗体
を含む溶液約１０ｍｌを得た。最後に、リン酸ナトリウ
ムでｐＨ６.８に調整した３００ｍＭのリン酸ナトリウ
ム緩衝液１０ｍｌをカラムに注入し、カラム下部から流
出してくる溶出液を回収し、ラットＩｇＭ抗体を含む溶
液約１０ｍｌを得た。
ズ溶離方式により１０倍希釈したラット血清からのＩｇ
ＧとＩｇＭの分離精製を試みた。各々のカラムに１０ｍ
ｌのラット血清を注入し、血清中の抗体を分離剤に吸着
させた。次いで、リン酸ナトリウムでｐＨ６.８に調整
した１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液４０ｍｌを注入し
て抗体と共に吸着した血清アルブミンなどの夾雑成分を
除去した。次に、ＩｇＧ抗体を分離回収するために、リ
ン酸ナトリウムでｐＨ６.８に調整した５００ｍＭ塩化
ナトリウム溶出液１０ｍｌをカラムに注入し、カラム下
部から流出してくる溶出液を回収し、ラットＩｇＧ抗体
を含む溶液約１０ｍｌを得た。最後に、リン酸ナトリウ
ムでｐＨ６.８に調整した３００ｍＭのリン酸ナトリウ
ム緩衝液１０ｍｌをカラムに注入し、カラム下部から流
出してくる溶出液を回収し、ラットＩｇＭ抗体を含む溶
液約１０ｍｌを得た。
【００２４】
【発明の効果】以上のように、オルトリン酸の金属塩を
分離剤に用いた本発明による抗体の分離精製法は、ウイ
ルス感染症の予防薬、診断薬、化粧品などに応用が期待
されている様々な免疫グロブリンクラスの抗体を効率良
く、簡単に、且つ安価に分離することができるため、工
業的に大量生産する方法として有効である。更に、本発
明の方法は抗体を分離剤に吸脱着させるときの溶液とし
て中性付近のｐＨに調整した溶液を使用することができ
るため、生体試料にとって極めて温和な分離精製条件と
なり、得られる抗体の生理活性を損なう恐れがないとい
う優れた効果を発する。
分離剤に用いた本発明による抗体の分離精製法は、ウイ
ルス感染症の予防薬、診断薬、化粧品などに応用が期待
されている様々な免疫グロブリンクラスの抗体を効率良
く、簡単に、且つ安価に分離することができるため、工
業的に大量生産する方法として有効である。更に、本発
明の方法は抗体を分離剤に吸脱着させるときの溶液とし
て中性付近のｐＨに調整した溶液を使用することができ
るため、生体試料にとって極めて温和な分離精製条件と
なり、得られる抗体の生理活性を損なう恐れがないとい
う優れた効果を発する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/06 Ｃ０７Ｋ 16/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ａ６１Ｋ 35/16 Ａ６１Ｋ 35/16 (72)発明者 竹石 順司 埼玉県草加市稲荷１−７−１ 関東化学株 式会社中央研究所内 (72)発明者 吉野 和典 埼玉県草加市稲荷１−７−１ 関東化学株 式会社中央研究所内
Claims (11)
- 【請求項１】 抗体を含有する液体を分離剤と接触させ
て抗体を分離剤に吸着させた後、分離剤と液体とを分離
し、次いで分離剤から抗体を脱離させるに当たり、分離
剤として金属のオルトリン酸塩から成る分離剤を用いる
ことを特徴とする抗体の分離精製法。 - 【請求項２】 前記オルトリン酸塩の金属が、アルミニ
ウム、アルカリ土類金属、原子番号２１から３０までの
遷移金属、原子番号３９から４７までの遷移金属、希土
類金属から選ばれた金属である、請求項１に記載の抗体
の分離精製法。 - 【請求項３】 前記オルトリン酸塩の金属が、マグネシ
ウム、カルシウム、ストロンチウム、チタン、マンガ
ン、鉄、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニ
ウム、ランタン、セリウムから選ばれた金属である、請
求項１に記載の抗体の分離精製法。 - 【請求項４】 前記分離剤が多孔体である、請求項１か
ら請求項３のいずれかに記載の抗体の分離精製法。 - 【請求項５】 前記多孔体が粒子である、請求項４に記
載の抗体の分離精製法。 - 【請求項６】 前記粒子の平均粒子径が０.５〜１５０
μｍである、請求項５に記載の抗体の分離精製法。 - 【請求項７】 前記粒子が球状体である、請求項５また
は請求項６に記載の抗体の分離精製法。 - 【請求項８】 前記多孔体が薄膜状または板状の成形物
である、請求項４に記載の抗体の分離精製法。 - 【請求項９】 前記分離剤への抗体の吸着および分離剤
からの抗体の脱離は、ｐＨ６〜８の範囲のｐＨに調整し
た溶液を用いることを特徴とする、請求項１から請求項
８のいずれかに記載の抗体の分離精製法。 - 【請求項１０】 前記分離剤をカラムクロマトグラフィ
ー用の充填剤として用いることを特徴とする、請求項１
から請求項９のいずれかに記載の抗体の分離精製法。 - 【請求項１１】 前記分離剤をバッチ法に用いることを
特徴とする、請求項１から請求項９のいずれかに記載の
抗体の分離精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8238650A JPH1059999A (ja) | 1996-08-22 | 1996-08-22 | 抗体の分離精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8238650A JPH1059999A (ja) | 1996-08-22 | 1996-08-22 | 抗体の分離精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1059999A true JPH1059999A (ja) | 1998-03-03 |
Family
ID=17033290
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8238650A Pending JPH1059999A (ja) | 1996-08-22 | 1996-08-22 | 抗体の分離精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1059999A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009531401A (ja) * | 2006-03-31 | 2009-09-03 | ラボラトイレ フランケイス デュ フラクションネメント イーティー デス バイオテクノロジース ソシエテ アノニメ | 医薬品としてのチクングニヤ特異性免疫グロブリンの濃縮物、濃縮物の利用及び濃縮物を調整する方法 |
-
1996
- 1996-08-22 JP JP8238650A patent/JPH1059999A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009531401A (ja) * | 2006-03-31 | 2009-09-03 | ラボラトイレ フランケイス デュ フラクションネメント イーティー デス バイオテクノロジース ソシエテ アノニメ | 医薬品としてのチクングニヤ特異性免疫グロブリンの濃縮物、濃縮物の利用及び濃縮物を調整する方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR890000985B1 (ko) | 이뮤노 글로부린 g의 정제 | |
| JP5624476B2 (ja) | アパタイトクロマトグラフィーによるリン酸化生体分子および非リン酸化生体分子の向上した精製法 | |
| CA2825651C (en) | Apatite surface neutralization with alkali solutions | |
| IE53337B1 (en) | A process and apparatus for the recovery of immunoglobulins | |
| JP2020509076A (ja) | 高負荷かつ耐アルカリ性のプロテインａ磁性ビーズ及びその使用方法 | |
| JPH1059999A (ja) | 抗体の分離精製法 | |
| US4232004A (en) | Antibody-specific solid phase immunoadsorbent, preparation thereof, and antibody purification therewith | |
| US4264449A (en) | Antibody-specific solid phase immunoadsorbent, preparation thereof, and antibody purification therewith | |
| US11732004B2 (en) | Compositions and methods for simplified high efficiency isolation of proteins | |
| JPS61233694A (ja) | ウシ脾臓中に含まれる成長因子及びその単離方法 | |
| JPS63157973A (ja) | 液体クロマトグラフイ− | |
| JP3216436B2 (ja) | 塩基性タンパク質吸着剤 | |
| JPH09239203A (ja) | 鳥類のＩｇＹの分離精製法 | |
| JPH1060000A (ja) | 抗体の精製方法 | |
| RU98105411A (ru) | Способ получения препарата альфа-фетопротеина | |
| JPH06217767A (ja) | 風疹ウイルスの精製および濃縮方法 | |
| US5728463A (en) | Stationary phase material for chromatography | |
| EP0607459B1 (en) | Use of a solid material as a stationary phase for chromatography | |
| JP2902274B2 (ja) | クロマトグラフィーの固定相用材料及び生体関連高分子試料の分離精製法 | |
| JP2007238479A (ja) | ハイドロキシアパタイトに吸着された有機物の溶出方法及び該溶出方法を用いた有機物の精製方法 | |
| Fedorchak et al. | Magnetic affine sorbents for the isolation of recombinant proteins | |
| JPH03185000A (ja) | プロテインＡと免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）との結合方法 | |
| JP2739579B2 (ja) | イムノグロブリンの分離精製方法 | |
| EP3854814A1 (en) | Purification of immunoglobulin y and uses thereof | |
| JPS63221844A (ja) | 吸着剤 |