JPH1066562A - リボフラビン過剰生産性細菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 リボフラビンを過剰生産する組換え細胞を提
供する。 【解決手段】 該組換え細菌は、１以上のリボフラビン
生合成タンパク質をコードし、かつ遺伝性であって細菌
による発現が可能な核酸配列の少なくとも１コピーを、
組換え細菌によるリボフラビン生合成がこの核酸配列を
有しない細菌に比較して増加するような様式で染色体内
の１以上の部位に外因的に導入されて含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リボフラビンを過
剰生産する組換え細菌に関する。詳細には、本発明は、
染色体ＤＮＡ内に挿入され増幅された ribオペロンコピ
ーを有する細菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】リボフラビン (ビタミンＢ₂ ) はすべて
の植物および多くの微生物によって合成されるが、高等
動物によっては産生されない。リボフラビンはフラビン
アデニンジヌクレオチドおよびフラビンモノヌクレオチ
ドのような炭水化物の酵素的酸化に要求される補酵素の
前駆体であるため、基礎的な代謝に必須である。高等動
物におけるリボフラビン不足は脱毛、皮膚の炎症、視覚
劣化、および発育不全を引き起こす。

【０００３】リボフラビンはリボースから出発する完全
な化学合成、または真菌類のEremothecium Ashbyiiまた
はAshbya gossypii を用いた発酵のいずれかによって商
業的に生産することができる(The Merck Index, Windho
lzら編、Merck & Co., p.183, 1983) 。プリン類似体で
あるアザグアニンおよびアザキサンチンに曝すことによ
って選択されたバチルス・サブチリス (Bacillus subti
lis)の突然変異体が回収可能な量のリボフラビンを生産
することが報告されている (米国特許第3,900,368号、E
neiら、1975) 。一般に、プリンおよびリボフラビンの
類似体に曝すことによってリボフラビン生合成の増加を
示す調節解除変異株が選択されるが、これはその突然変
異により微生物が生産増大によってその類似体を拮抗的
に排除できるようになるからである (Matsuiら、Agric.
Biol. Chem. 46:2003, 1982) 。リボフラビンを生産す
るSaccharomyces cerevisiaeのプリン要求変異株も報告
されている (米国特許第4,794,081号、Kawaiら、1988)
。Rabinovichら(Genetika14:1696(1978))は、バチルス
・サブチリス (以下B.サブチリスとする) 、リボフラビ
ンオペロン (rib オペロン) が７メガダルトン (Md) Ec
oRI フラグメントに含まれることを報告している (Chik
indas ら、Mol. Genet. Mik. Virusol.No.2:20(1987)に
おいて6.３Mdフラグメントとして後に言及される) 。ア
ンピシリン耐性を付与するプラスミドに ribオペロンを
クローニングしそしてそのプラスミドを含む細菌を漸増
量のアンピシリンに曝すことによって大腸菌 (E. coli)
(以下E.コリとする) でそのオペロンの増幅が達成され
たことが報告されている。 rib増幅の唯一の証拠は、培
地中に存在する緑色蛍光物質が同時に増加することであ
る。著者は観察された現象を説明するためにオペロンの
実際の増幅以外にも多くの他の可能性を提起している。

【０００４】Stepanovらによる仏国特許出願第 2,546,9
07号 (1984年12月７日公告) は、アザグアニンおよびロ
ゼオフラビンに曝され、 ribオペロンのコピーを含有す
るプラスミドで形質転換されたB.サブチリス変異株を利
用したリボフラビンの生産方法を開示している。Morozo
v ら (Mol. Genet. Mik. Virusol. no.7:42 (1984))
は、クローンされたB.サブチリス ribフラグメントがE.
コリリボフラビン要求株を相補する能力、またはB.サブ
チリスリボフラビン要求株をマーカーレスキューする能
力をアッセイすることによるB.サブチリス ribオペロン
のマッピングを記述している。E.コリ rib遺伝子の既知
の機能に基づいて、B.サブチリスについて以下のモデル
が提案された、すなわちribG (デアミナーゼをコードす
る) −ribO (制御エレメント) −ribB (シンセターゼ)
−ribF−ribA (GTP−シクロヒドロラーゼ) −ribT/D(そ
れぞれレダクターゼおよびイソメラーゼ) −ribH (シン
セターゼ) 。

【０００５】Morozov ら (Mol. Genet. Mik. Virusol.
no.11:11 (1984))は、B.サブチリスリボフラビン要求株
を相補する能力をアッセイするために、野生型 (rib
O⁺ ) または構成的 (ribO335)オペレーター領域を有す
るB.サブチリス ribオペロンを含有するプラスミドの使
用を記述している。その結果から、 ribオペロンの修正
モデルが提案され、それによればribOはribGを含むすべ
ての構造遺伝子の上流にあり、そして仮説上の付加的な
オペレーターがおそらくribAのすぐ上流に位置する。Mo
rozov ら (Mol. Genet. Mik. Virusol. no.12:14 (198
5))は、B.サブチリスribオペロンが全部で三個のそれぞ
れ異なったプロモーターを含有することを報告している
(E.コリにおいてのみ活性な第４の「プロモーター」の
他に) 。オペロンの一次プロモーターはribO領域内に存
在することが報告されており、二つの二次プロモーター
は、それぞれ、ribBとribF遺伝子の間および ribTDとri
bH遺伝子領域内にあることが報告されている。Chikinda
s ら (Mol. Genet. Mik. Virusol. no.2:20 (1987)) は
B.サブチリスの ribオペロンを含有する6.3Md ＤＮＡフ
ラグメントの制限酵素地図を提案している。制限酵素 E
coRI、PstI、SalI、EcoRV 、PvuII およびHindIII の部
位が示されている。

【０００６】Chikindas ら (Mol. Genet. Mik. Viruso
l. no.4:22 (1987)) はB.サブチリスribオペロンのすべ
ての構造遺伝子が 2.8Md BglII-HindIIIフラグメントに
あり、 BglII部位はオペロンの一次プロモーターと最初
の構造遺伝子のリボソーム結合部位との間にあることを
報告している。以下に記すように本出願人らはこのBglI
I 部位が実際には ribオペロンの最も5'側の読み取り枠
内にあり、したがって上記の2.８Mdフラグメントはすべ
ての rib構造遺伝子を含むわけではないことを示してい
る。したがって、Chikindas らの報告とは対照的に、1.
3 Md BglIIフラグメントは最初の構造遺伝子のリボソー
ム結合部位を含まない。この部位での挿入はリボフラビ
ン−陰性の表現型を生じる。その結果、例えば5'調節領
域をもっと強力なプロモーターで置き換えることによっ
て発現を増加させるために、この BglII部位を使って r
ibオペロンを工学的につくり出すあらゆる試みは、実際
には最初の構造遺伝子の、従って同様にオペロンの完全
性を破壊する。Chikindas ら (Dokl. Akad. Nauk. 5 SS
SR 298:997(1988)) は、一次プロモーター P₁ および二
つのマイナープロモーター P₂ および P₃ を含有するB.
サブチリス ribオペロンの別のモデル：ribO(P₁)-ribG-
ribB-P₂-ribF-ribA-ribT-ribD-P₃-ribHを開示してい
る。前記したように1.3Md BglIIフラグメントがオペロ
ンの最初の構造遺伝子全部を含有しておりかつこの近位
の BglII部位が一次調節領域内にマップされるという誤
った報告がなされている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明はリボフラビン
を過剰生産する細菌に関する。本発明は ribオペロンお
よびその読み取り枠のヌクレオチド配列および ribオペ
ロンを含有する組換え細菌に関する。詳細には、本発明
はそのリボフラビンおよび／またはプリンの生産が調節
解除されるような突然変異を受けた細菌、および染色体
ＤＮＡ内に挿入され増幅された ribオペロンコピーを有
する細菌に関する。ある実施態様に於ては、構成的な発
現または調節を受けない発現を起こさせる配列を用いて
その制御領域を置き換えることによって、 ribオペロン
自体を調節解除することができる。本発明の細菌、オペ
ロンおよび配列を発酵するリボフラビン大量生産に使用
することができる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明を以下の詳述され
た特定の実施例、例えばリボフラビンおよびプリン生産
に関して調節解除され、その染色体内に増幅された rib
オペロンを有するB.サブチリス1A382 の変異株、RB50::
［pRF8］₆₀(Ade⁺ ) を作製する例により説明する。この
突然変異株は14Ｌ容器中48時間の発酵後で５g/l 以上の
リボフラビンを生産することができる。リボフラビン生
産が同様の条件下で10g/l 以上に増加した他の細菌が記
述される。

【０００９】本発明は一般に、様々な細菌株を作製しそ
の細菌株をリボフラビン生産に適した条件下培地中で増
殖させることによる、リボフラビンの大量生産 (10g/l
以上) を特徴とする。第１の観点においては、本発明
は、染色体内に外因的に導入された核酸の少なくとも１
コピーを包含する組換え細菌を特徴とする。この核酸は
１またはそれ以上のリボフラビン生合成タンパク質をコ
ードし、遺伝することができ、細菌によって発現され得
る。その結果、そのような配列を欠く細菌に比較して細
菌によるリボフラビン生合成が増加する。

【００１０】「組換え細菌」とは、同種のまたは別の生
物に由来する１またはそれ以上の核酸配列を、そのよう
な配列が自然には起こらない部位で、そして／または、
自然には生じないコピー数で含有する細菌を意味する。
したがって、この用語には、正常には１コピーのみの配
列を包含する部位に、２コピーのヌクレオチド配列、例
えば遺伝子またはオペロンが付与された細菌が包含され
る。それにはまた、１またはそれ以上のヌクレオチド配
列コピーが正常にはその配列を包含しない部位に導入さ
れた細菌も包含される。かかる組換え細菌は標準的な組
換えＤＮＡ技法によって作製される。

【００１１】「外因的に導入された」とは、組換えＤＮ
Ａ技法、形質転換、およびトランスフェクションを包含
するなんらかの標準的な方法によって染色体の外の起源
から核酸がその染色体に導入されたことを意味する。そ
れにはまた、かかる細菌の子孫、例えば始めに作製さ
れ、形質転換されまたはトランスフェクションされた細
菌の細胞分裂によって生じた細菌も包含される。「リボ
フラビン生合成タンパク質」とは、グアノシン三リン酸
からのリボフラビン合成に直接関わるペプチド、ポリペ
プチド、またはタンパク質が包含されることを意味す
る。これらのタンパク質は、細菌内に天然に存在し、そ
の細菌内でリボフラビン生合成に関わるタンパク質と同
一であってもよい。あるいはまた、そのタンパク質の修
飾物であってもよく、たとえば、タンパク質の生物学的
活性に有意には影響しない修飾を含むこともできる。例
として、１またはそれ以上のアミノ酸を導入するかまた
は置換することによって天然型のタンパク質を修飾する
ことができ、それは保存的なアミノ酸置換またはタンパ
ク質の非必須領域の除去によるのが好ましい。かかる修
飾は標準的方法により容易に行える。

【００１２】いくつかの実施態様に於て、細菌は２コピ
ーまたはそれ以上の核酸配列を含有する。そして１また
はそれ以上のリボフラビン生合成タンパク質をコードす
る核酸が細菌染色体内の少なくとも２箇所の部位に存在
する。「部位」とは、野生型細菌に関する、生合成タン
パク質をコードする核酸が存在する明確な染色体上の位
置を意味する。例えば、このような核酸はそのようなタ
ンパク質をコードする遺伝子の天然に存在する部位 (す
なわち rib遺伝子座)に存在してもよいし、またはこの
位置から離れた部位に存在してもよい。このような離れ
た部位はリボフラビン生産にとって必須ではないタンパ
ク質をコードする領域のような、組換え細菌に必須では
ない染色体核酸領域から選択されるのが好ましい。この
ような領域の例には、プロテアーゼのようなある種の細
胞外酵素をコードする領域が包含される。このような部
位での挿入は求める性質や特性を損なわない。リボフラ
ビン生産に関する細菌の機能が実質的に影響を受けない
限り、あらゆる部位が好適である。

【００１３】他の実施態様に於て、核酸は１またはそれ
以上の部位で複数コピー状態で存在する。そして核酸は
染色体内の少なくとも３箇所の部位で存在する。異なっ
た部位に核酸を導入することによって、染色体内の核酸
の総コピー数を増加させることができる。コピー数の増
加によりリボフラビン生産量が増加する。概して、リボ
フラビン生合成タンパク質は１またはそれ以上の rib遺
伝子 (例えば、その不活性化はリボフラビン要求株を生
成する) 、好ましくは図３〜21に示されるヌクレオチド
配列から同定できる少なくとも５個の異なった rib遺伝
子によりコードされる。少なくとも５コピーのかかる遺
伝子が存在するのが好ましい。「 rib遺伝子」とは、生
物内で天然に存在するタンパク質、またはかかるタンパ
ク質と同様の機能をするタンパク質をコードする遺伝子
または遺伝子の部分を意味し、ここでかかるタンパク質
は細菌内でのグアノシン三リン酸のリボフラビンへの生
合成的変換に関わっているものを指す。

【００１４】関連する観点に於ては本発明は、１または
それ以上のリボフラビン生合成タンパク質例えば図22で
ORF1およびORF6と同定された遺伝子産物をコードする核
酸を包含する組換え細菌を特徴とし、その少なくとも一
つの発現はその核酸と天然には関連しない転写エレメン
トによって制御される。あるいはまた、この組換え細菌
には、その発現が rib遺伝子と天然には関連しない転写
エレメントによって制御される１またはそれ以上の rib
遺伝子または転写単位が包含される。「転写エレメン
ト」とは、その転写エレメントから下流への核酸の転写
を実行させる (すなわち作動させる) あらゆる核酸を包
含することを意味する。このようなエレメントの例には
プロモーターおよびオペレーターが包含される。かかる
転写エレメントはその核酸と天然には関連がなく、たと
えば非相同の転写エレメントであることができる。すな
わち、それは他の種や属の細菌または他の生物から単離
されてもよい。あるいはまた、転写エレメントはその細
菌に天然に存在するが今それが転写的に連結されようと
している rib遺伝子と通常は関連のないエレメントであ
ってもよい。かかるエレメントには rib遺伝子と天然に
関連があるものは包含されない。

【００１５】別の実施態様に於ては、組換え細菌は少な
くとも３個の (または少なくとも５個の) rib遺伝子を
包含し、３個の rib遺伝子すべての発現がこれら rib遺
伝子と天然には関連がない転写エレメントによって制御
され、少なくとも２個の転写エレメントが付与され、 r
ib遺伝子は組換え細菌の染色体内に付与され、組換え細
菌はリボフラビン遺伝子発現について調節解除され、そ
してその転写エレメントはプロモーターである。たとえ
ば、そのプロモーターは、SPO1ファージに関連したも
の、および／または veg、 amy、およびsacQ−感受性プ
ロモーター、例えば apr、といった構成的プロモータ
ー、増殖により調節されるプロモーター、または誘導し
うるプロモーターである。

【００１６】「調節解除される」とは、天然型のリボフ
ラビン調節システムを持つ細菌 (すなわち野生型細菌)
で観察されるよりもリボフラビン生産レベルが高いこと
を意味する。かかる調節解除された細菌には、様々なプ
リン類似体または拮抗体に対して耐性を有する細菌が包
含され、ここで、かかる類似体または拮抗体は例えば８
−アザグアニン、プシコフラニン、デコイニン、８−ア
ザキサンチン、スルファグアニン、６−チオグアニン、
およびメチオニンスルホキシドからなる群および／また
はロゼオフラビンのようなリボフラビン類似体から選択
できる。調節解除された好ましい細菌は、以下のプリン
類似体または拮抗体すなわち８−アザグアニンまたはデ
コイニン、およびロゼオフラビンの少なくとも一つに対
して耐性である。

【００１７】他の詳細な実施態様に於ては、少なくとも
一つの rib遺伝子にその rib遺伝子と天然には関連がな
いリボソーム結合部位が包含され、 rib遺伝子は染色体
内の２つの部位で存在し、そして rib遺伝子は染色体内
で複数のコピーで存在する。もっと望ましい実施態様に
於ては、 rib遺伝子はバチルス(Bacillus) rib遺伝子例
えば図22に示されるORF3及びORF4であり、転写エレメン
トORF3またはORF5の5'上流域に存在し、そして rib遺伝
子はβ−リボフラビンシンターゼをコードする遺伝子、
ORF2、ORF3、ORF4、およびORF5から選択され、そして細
菌はエシェリヒア (Esherichia) 例えばE.コリ、バチル
ス例えば、B.サブチリス、クレブシェラ(Klebsiella)、
またはコリネバクテリウム (Corynebacterium)種に属す
る。

【００１８】もう一つの関連する観点では、本発明は５
またはそれ以上の rib遺伝子を包含し、その発現がその
rib遺伝子とは天然には関連がない転写エレメントによ
って制御される核酸を特徴とする。さらに別の観点で
は、本発明は、第一に、細菌特にバチルス好ましくはB.
サブチリス、またはE.コリあるいは酵母起源の、１また
はそれ以上の (少なくとも５が望ましい) リボフラビン
生合成タンパク質をコードする核酸配列を、そして第二
に、この核酸配列と天然には関連がない１またはそれ以
上の (１または２が望ましい) 転写エレメントを含んで
なるベクターに関する。転写エレメントが上記のように
すでに特定されたベクターが望ましい。実施例で詳記す
るベクター、例えば pRF50、 pRF69、 pRF70、 pRF71、
pRF78、 pRF81および／またはpRF89 がさらに好まし
い。

【００１９】本発明のもう一つの観点では、上記で特定
されたベクターによって形質転換された細菌を含んでな
る組換え細菌に関する。このものは上述の転写エレメン
トを含む前記核酸配列の少なくとも１コピー、好ましく
は多コピーを染色体内の１またはそれ以上の部位に導入
され、そして該転写エレメントを含む該核酸配列は遺伝
性で、その細菌による発現能を有する。その結果、その
細菌によるリボフラビン生合成は該転写エレメントを含
む核酸配列をもたない細菌に比較して増加する。１また
は２箇所のかかる部位への導入が望ましい。さらに形質
転換される細菌がリボフラビン遺伝子発現に関してすで
に調節解除されているような組換え細菌が好ましい。か
かる調節解除された細菌のうちE.コリまたはバチルス特
にB.サブチリス株が好ましく、B.サブチリス株RB50およ
びRB58が特に好ましい。

【００２０】本発明はまた、組換え細菌の調製方法にも
関する。その方法は１またはそれ以上のリボフラビン生
合成タンパク質をコードする細菌または酵母起源の核酸
配列を含んでなるベクター、または上記で既に特定され
たベクターにより、細菌特に上記で既に特定された細菌
を形質転換するものである。それによって任意に該転写
エレメントを包含する該核酸配列少なくとも１コピー、
望ましくは多コピーが染色体内の１またはそれ以上、好
ましくは１または２箇所の部位に導入され、そして任意
に該転写エレメントを包含する該核酸配列は遺伝性で、
細菌による発現可能である。その結果その細菌によるリ
ボフラビン生合成は該転写エレメントを任意に包含する
核酸配列をもたない細菌と比べて高められる。本発明は
また、そのような細菌の染色体内の rib生合成遺伝子と
天然に関連する１またはそれ以上の転写エレメントが前
記特定の転写エレメントによって置き換えられたここに
特定される細菌にも関する。このような置換は本発明の
記載に基づいて当業者に知られた方法により行われう
る。

【００２１】別の観点に於ては本発明はリボフラビン生
産方法を特徴とする。その方法には細胞特にここで詳細
に言及される組換え細菌を適当な増殖条件下に増殖させ
ることが包含される。この適当な増殖条件は、該組換え
細菌の増殖のための好気的条件が維持されるような様式
で増殖培地および／または供給培地の成分の利用可能性
を限定することを特徴とする。このような条件はまた例
えば溶存酸素レベルを約５％から30％までの間の濃度に
維持することによっても特徴付けることができる。当業
者は、かかる溶存酸素レベルが該組換え細菌の増殖にお
よび該溶存酸素濃度の測定に用いられる特定の技術的装
置の如何により変化する可能性があるということを熟知
している。嫌気的条件下ではリボフラビン合成は減少す
る。いくつかの実施態様に於ては、限定性成分は炭素
源、窒素源、または細胞が要求する成分 (例えば、供給
培地に於て) から選択される。例えば、細胞が例えばメ
チオニン要求株であるならば、増殖培地にはメチオニン
供与レベルが限定される。別の例に於ては、そのような
成分はグルコースまたはカルボン酸、例えばクエン酸や
コハク酸のようなクエン酸回路の酸、またはアミノ酸で
あろう。

【００２２】関連する観点に於ては本発明は細菌による
リボフラビン生産を増加させるためのもう一つの方法を
特徴とする。この方法に於ては、用いられる細菌株はリ
ボフラビン生産について調節解除されている。１または
それ以上のリボフラビン生合成タンパク質をコードする
核酸配列の１コピー以上をこの細菌の染色体ＤＮＡに導
入する。この方法で用いる細菌は前記のうちの一つから
も選ばれるのが好ましい。本発明はまた、上記で特定さ
れた方法により、これもまた上記で特定された条件下で
得られた組換え細菌を増殖させることによるリボフラビ
ン生産方法にも関する。

【００２３】本発明の他の観点に於ては、精製された核
酸およびかかる核酸の組換えポリペプチド産物が提供さ
れる。一般に、精製核酸は本質的に ribオペロンの全体
または一部分、例えば図３〜21に示す特定の読みとり枠
からなる。かかる精製核酸は、プラスミド、ファージ、
またはコスミドのようなベクター内に付与されてもよい
し、または細菌の染色体中に組み込まれてもよい。この
核酸はそれが天然に連結されている核酸から分離され
る。例えば、全 ribオペロンをコードする6.５kb核酸
を、その6.5kb ＤＮＡが通常存在する部位から離れた部
位でB.サブチリス染色体内に挿入することができる。組
換えポリペプチドとは、無関係ポリペプチドを有しない
(すなわち非相同のポリペプチドに融合していない) 生
物学的に活性なタンパク質を意味し、天然で生産される
そのポリペプチドと同等の酵素活性を有する。

【００２４】本発明の他の特徴および利点は、それに関
する好ましい実施態様についての以下の記載および請求
の範囲から明らかであろう。最初に図面を簡単に説明す
る： 図１：Kellerら、Biochem. 27:1117 (1988) から改変さ
れたリボフラビン生合成経路を示す。示されている対応
する中間体はE.コリによって生産されるものである (そ
れらはおそらくB.サブチリスにより生産されるものと同
一である) ：構造１：グアノシン三リン酸 (GTP)；構造
２：2,５−ジアミノ−６− (リボシルアミノ) −４ (3
H) −ピリミジノン−5'−リン酸；構造３：５−アミノ
−６− (リボシルアミノ) −2,４ (1H, 3H) −ピリミジ
ンジオン−5'−リン酸；構造４：５−アミノ−６− (リ
ビチルアミノ) −2,４ (1H, 3H) −ピリミジンジオン−
5'−リン酸；構造５：6,７−ジメチル−８−リビチルル
マジン；構造６：リボフラビン。指示された生合成酵素
はB.サブチリスによってコードされるもの (GTP シクロ
ヒドロラーゼ、リボフラビンシンターゼのαおよびβサ
ブユニット) であるか、またはB.サブチリスによってコ
ードされると提案されたもの (rib-特異的デアミナー
ゼ、およびrib-特異的レダクターゼ) である。

【００２５】図２：プリン生合成の図式的表示である。
リボフラビン生合成に関わる部分を包含するプリン生合
成経路を図示する。遺伝子記号 (E.コリ命名法) によっ
てその経路のそれぞれの酵素が明示される。略号は以下
の通りである、すなわちPRPP：ホスホリシボシルピロリ
ン酸； GAR：グリシンアミドリボヌクレオチド； pur：
GAR ホルミルトランスフェラーゼ； PRA：ホスホリボシ
ルアミン；purA：アデニロコハク酸シンセターゼ；pur
B：アデニロコハク酸シンセターゼ；FGAR：ホルミルグ
リシンアミドリボヌクレオチド；SAICAR：アミノイミダ
ゾールスクシノカルボキサミドリボヌクレオチド；pur
C：SAICARシンセターゼ；FGAM：ホルミルグリシンアミ
ジンリボヌクレオチド；purD：GAR シンセターゼ； AI
R：アミノイミダゾールリボヌクレオチド；purE：AIR
カルボキシラーゼ；CAIR：カルボキシアミノイミダゾー
ルリボヌクレオチド；purF：PRPPアミドトランスフェラ
ーゼ；AJCAR ：アミノイミダゾールカルボキサミドリボ
ヌクレオチド；purH：AICAR ホルミルトランスフェラー
ゼ；purJ：イノシン一リン酸(IMP) シクロヒドラーゼ；
FAICAR：ホルムアミドイミダゾールカルボキサミドリボ
ヌクレオチド；purL：FGARアミドトランスフェラーゼ；
guaA：グアノシン一リン酸 (GMP)シンセターゼ；purM：
AIR シンセターゼ；guaB：IMP デヒドロゲナーゼ。

【００２６】図３〜21：B.サブチリス ribオペロンの完
全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
ヌクレオチド配列は M13クローンのジデオキシ配列決定
法により決定された。推定アミノ酸配列は１文字表記
(Lehninger, Biochemictry, 2d Ed., Worth Publisher
s, Inc., New York, p.72)で示される。 図22： rib遺伝子クラスターの図式的表示である。上の
図は、プラスミドpRF2に於てクローニングされたB.サブ
チリス rib遺伝子を含有する10kb EcoRIＤＮＡフラグメ
ントの制限エンドヌクレアーゼ地図である。リボフラビ
ンシンターゼ遺伝子に特異的な54−量体プローブに対す
る相同領域を太い黒線で示す。網掛けの四角は Rib⁺ ク
ローン化ＤＮＡを示し、一方細い黒線はpBR322ＤＮＡを
表す。下の図は ribオペロンが局在する6.０kbフラグメ
ントの完全なヌクレオチド配列に基づく。読みとり枠は
白ぬきの長方形で表され、それに付されている矢印は転
写方向を示す。黒の長方形は推定リボソーム結合部位を
示す。ありうるσ^A プロモーター領域を示す。試みに同
定された rho−非依存性転写終止部位を「ヘアピン」記
号で示す。すべての制限部位が示されているわけではな
い。

【００２７】図23：RB50の菌株由来を示す。リボフラビ
ン過剰生産株B.サブチリスRB50の由来を示す。様々な親
株をリボフラビンおよびプリン類似体に曝して適当な突
然変異を選択した。 図24： rib⁺ 組換えプラスミドの起源を示す。 ribオペ
ロン含有組換えプラスミドpRF1、pRF2、pRF3、pRF6およ
びpRF7作製の模式図を示す。寸法で選択されたB.サブチ
リスＤＮＡの９−11kbフラグメントのライブラリーを用
いてE.コリプラスミドベクターに於ける遺伝子ライブラ
リーを作製した。クローンはリボフラビンシンターゼ遺
伝子のβサブユニットに特異的な54−量体プローブにハ
イブリッド形成させることによって選択した。

【００２８】図25：B.サブチリスRB53::［pRF8］₉₀の菌
株由来を示す。プラスミドpRF8を中間菌株RB52の染色体
に組み込み、増殖した。その結果生じた菌株をプリン類
似体アザグアニンに曝した。 図26：挿入および欠失を用いたリボフラビン生合成に必
須な領域の同定を示す。図はリボフラビン生合成に必須
の示される領域を含む10kbクローン化EcoRI ＤＮＡフラ
グメントを示す。指示された制限部位に於ける挿入およ
び欠失によってribオペロンの位置を決定することがで
きた。すべての制限部位が示されているわけではない。 図27：ありうる rho−非依存性転写終止部位のヘアピン
ループ構造を示す。図３〜21のヌクレオチド配列に於け
る位置を各構造の下部に示す。Tinocoら (Nature (Lond
on) New Biology 246:40 (1973))に従って決定されたそ
れらの形成自由エネルギーも示す。

【００２９】図28：S-30インビトロ共役転写／翻訳反応
に使用した様々なプラスミド誘導体の構造を示す。模式
図は、S-30反応に用いられたプラスミド誘導体に含まれ
るrib オペロン領域、ならびに発現が予想される読みと
り枠を示す。 図29：リボフラビン生産曲線の比較を示す。様々な発酵
プロトコールについてのリボフラビン生産曲線を示す。
白四角：RB50::［pRF8］₆₀ (Ade^- ) を使用したRBP-1
4。黒四角：RB50::［pRF8］₆₀(Ade^- ) を使用したRBF-2
2。白丸：RB50::［pRF8］₆₀(Ade^- ) を使用したRBF-2
3。黒丸：RB50::［pRF8］₆₀(Ade⁺ ) を使用したRBF-2
9。 図30：pRF40の作製を示す。 図31：pRF50の作製を示す。 図32、図33および図34：種々のベクターの構造を示す。 図35：プラスミド作製に使用される55−量体を示す。 図36：ベクター作製に用いられる様々なオリゴヌクレオ
チドを示す。

【００３０】本発明の実施に際してはリボフラビン生合
成経路の遺伝子にまたは様々なプリン生合成経路にリボ
フラビン過剰生産を招来する１またはそれ以上の突然変
異を含有する宿主細菌株が誘導される。一つの実施態様
に於ては、このような突然変異によりリボフラビン生合
成経路に於ける調節解除ステップによって、リボフラビ
ンが過剰に生産される。別の実施態様に於ては、かかる
突然変異によりリボフラビン生合成の前駆体が代替代謝
経路で用いられるのが阻害されることによってリボフラ
ビン生産が増加する。

【００３１】詳細な実施態様に於ては、宿主の代謝経路
において真正対応物と拮抗するプリンまたはリボフラビ
ンの類似体に曝すことによって、宿主細菌の遺伝的バッ
クグラウンドに於ける望ましい突然変異を誘導すること
ができる。このような暴露を生き残った細菌が、類似体
に対応する真正物質を過剰生産させうる突然変異を有し
ていて、排除しなければ致死的であるプリンまたはリボ
フラビン類似体を拮抗的に排除する。B.サブチリス中に
於けるリボフラビン生合成はグアノシン三リン酸から始
まる (図１、構造１) 。グアノシン三リン酸(GTP) は、
グアノシン一リン酸(GMP) を経由したプリン生合成経路
の産物である (図２) 。好ましい実施態様に於ては、リ
ボフラビンを過剰生産する宿主菌株を得るのに、細胞が
生産するGTP 量を増加させ、かつリボフラビン経路の調
節を解除するために古典的な遺伝学を用いることができ
る。B.サブチリスに於けるプリン過剰生産はプリン類似
体または拮抗体に対して耐性を有する変異株を得ること
により達成できる。使用できるプリン類似体のいくつか
の例には８−アザグアニン (Ishii および Shiio,Abri
c. Biol. Chem. 36:1511, 1972；Konishi およびShiro,
Agric. Biol. Chem. 32: 396, 1968)、プシコフラニン
およびデコイニン (Matsuiら、Agric. Biol.Chem. 43:1
739, 1979; Matsuiら、Agric. Biol. Chem. 43:393, 19
79)、８−アザキサンチン、スルファグアニン、６−チ
オグアニン (Debabov, V. G., TheMolecular Biology o
f the Bacilli第１巻 Bacillus subtilis, D.A. Dubnau
編(Academic Perss, New York) 中の 331-370ページ、
1982) およびその他、および／または拮抗体メチオニン
スルフォキシド (Matsuiら、App. Env. Microbiol.34:3
37, 1977) 、およびそれらの任意の組合せが包含される
がそれらに限定されるわけではない。

【００３２】リボフラビン経路はリボフラビン類似体に
対し耐性を有する突然変異株を得ることによって調節解
除されうる。利用できるリボフラビン類似体の例はロゼ
オフラビン (Matsuiら、Agric. Biol. Chem. 46:2003,
1982) である。本発明の詳細な実施態様に於ては、突然
変異により類似体アザグアニン、デコイニンおよびロゼ
オフラビンに対して耐性となった細菌を使用することが
できる。これらの化合物のそれぞれに対して耐性を有す
る詳細な突然変異株を以下に記述する。その細菌を他の
類似体に対して耐性をなす突然変異を有する細菌も用い
ることができる。上記と同じ類似体に対して耐性となす
ような種々の突然変異を有するか、または他の類似体に
対する様々な突然変異と組合せるかまたは組み合せずし
てこれらの突然変異の種々の組合せを有する細菌の利用
もまた本発明の範囲にあると見なされる。

【００３３】類似体単独に曝すことによっては十分高い
頻度で耐性変異株を生じない場合は一般には突然変異の
頻度を上げるために、従って類似体耐性変異株の数を増
やすために、様々な変異原物質を使用することができ
る。一例としてはエチルメチルスルホネートを使用する
ことができ、またニトロソグアニジンまたはＵＶ照射を
含む他の変異原物質も使用できるがそれらに限定される
わけではない。好適な細菌宿主には、すべてのバチルス
種 (好ましい実施態様としてB.サブチリスを含む) 、E.
コリおよび多くの他のグラム陽性およびグラム陰性細菌
が包含される。ゲノムに挿入すべきクローン化 ribオペ
ロンのプロモーター配列を認識できる種が使用に適す
る。標準的な操作 (例えば形質転換) によって rib遺伝
子を他の細菌に導入するために、後記のプラスミドを用
いることができる。挿入された rib遺伝子の発現は、以
下に記載される分光法によるかまたは後記ＵＶ光下での
細菌の観察により測定できる。

【００３４】プリンやリボフラビン類似体に曝すことに
よって突然変異を生じさせる他に、それらのプリンやリ
ボフラビン生合成経路に影響を与えることが知られてい
る突然変異を既に含有する細菌株を利用することができ
る。例えば本発明はその菌株に限定されるわけではない
がB.サブチリス株IA382 を利用するもので、その菌株は
突然変異pur-60を含有しておりそのせいでアデニン要求
株となっている。この突然変異によりリボフラビン前駆
体イノシン一リン酸 (IMP)がリボフラビン生産以外の代
謝経路で利用されるのが遮断されるため、増加量のIMP
をリボフラビン生合成に利用でき、従ってリボフラビン
生産が増加する。リボフラビン生産を増加させる可能性
のある利用可能な多くの他の突然変異が存在しており、
それらには GuaC3、 his、および本発明の範囲に包含さ
れるその他の変異が包含されるがそれらに限定されるわ
けではない。GuaC3 変異は、 GMPが IMPに戻る変換を阻
止し (図２参照) 、従って利用可能なリボフラビン生合
成前駆体の量を増加させる。

【００３５】当業者に知られた様々な方法によってリボ
フラビン過剰生産に影響を及ぼす好適な変異をマップす
る事ができる。詳細な実施態様に於ては、栄養要求性変
異株の相補性によって、突然変異をマップする事ができ
る。様々な細菌に由来するリボフラビン生合成遺伝子を
クローンして本発明に使用することができる。バチルス
属、E.コリおよび多くの他のグラム陽性およびグラム陰
性細菌を包含するがそれらに限定されない種からの細
菌、または酵母細菌は、 ribオペロンの分子クローニン
グのための核酸源として使用可能である。当業者に周知
の標準的な操作によって、例えば、所望の細菌細胞から
精製された染色体ＤＮＡまたはそのフラグメントを遺伝
子増幅のために適当なベクターにクローニングすること
によって調製されたＤＮＡライブラリーから、 ribオペ
ロンを含有するＤＮＡを得ることができる。 (例とし
て、Maniatisら、1982, MolecularCloning, A Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spr
ingHarbor, New York; Glover, D.M. (編), 1982, DNA
Cloning, A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Ox
ford, U.K. Vol.Ｉ, II参照) 。

【００３６】染色体ＤＮＡからの遺伝子の分子クローニ
ングに於て、フラグメントが生成し、そのうちのいくつ
かは所望の ribオペロンをコードしていよう。このＤＮ
Ａは様々な制限酵素を用いて特異的な部位で切断でき
る。あるいはまた、ＤＮＡを断片化するためにマンガン
存在下でＤＮＡアーゼを使用してもよく、またＤＮＡ
を、例えば音波処理により物理的に切断することもでき
る。つぎに線状ＤＮＡフラグメントを標準的な技術によ
って寸法にしたがって分離することができる。この技術
にはアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動
および密度勾配遠心分離が包含されるがそれらに限定さ
れるわけではない。

【００３７】ひとたびＤＮＡフラグメントが生成される
と、適当なクローニングおよび／または発現ベクターを
用いてＤＮＡライブラリーを調製する。当業上周知の多
数のベクター−宿主系を使用できる。使用可能なベクタ
ーには、プラスミドまたは修飾されたウイルスが包含す
るがそれらに限定されるわけではない。しかしベクター
系は使用する宿主細胞と適合しなければならない。E.コ
リに関しては、かかるベクターにはλ誘導体のようなバ
クテリオファージ、 pBR322 または pUCプラスミドのよ
うな高コピープラスミド、またはシュードモナス (Pseu
domonas)プラスミドRK２から誘導される低コピープラス
ミドが包含されるがそれらに限定されるわけではない。
バチルスに関しては、かかるベクターには、ρ11 (Dean
ら、 J.Virol. 20: 339, 1976; Kawamuraら、Gene 5: 8
7, 1979) または△105 誘導体 (Iijimaら、Gene 9:115,
1980; Errington, J.Gen. Microbiology 130:2615,198
4;Dhaeseら、Gene 32:181, 1984; Errington, J., Baci
llus Molecular Biologyand Biotechnology Applicatio
ns, A.T.Genesan およびJ.A.Hoch, 編 (AcademicPress,
New York), P.217,1986) のようなバクテリオファー
ジ、pUB110(Ehrlich, Proc.Natl. Acad. Sci.(USA) 74:
1680, 1977) または pBD64のような高コピープラスミ
ド、または pE194誘導体 (Gryczan, T.J. The Molecula
r Biology ofthe Bacilli, D,A, Dubnau編 (Academic P
ress, New York), pp.307-329,1982;HorinouchiおよびW
eisblum, J.Bacteriol. 150:804, 1982) のような低コ
ピープラスミドが包含されるがそれらに限定されるわけ
ではない。組換え分子を形質転換、トランスフェクショ
ン、プロトプラスト形成、感染、エレクトロポレーショ
ン、などにより宿主細胞に導入することができる。

【００３８】一旦ＤＮＡライブラリーが生成すると、多
くの方法 (例えば、Maniatisら、上記に記載のような)
によって ribオペロンを含有する組換えＤＮＡを含む特
定のクローンの同定を行いうる。例えば、もし一定量の
オペロンまたはそのフラグメントが別の細菌源から (例
えばE.コリから) 入手でき、かつそれがバチルスのリボ
フラビン生合成遺伝子とハイブリッド形成しうるに充分
に相同であるならば、そのＤＮＡを精製および標識する
ことができ、そして生成したＤＮＡフラグメントのバン
クを標識化プローブに対する核酸ハイブリッド形成によ
って選別することができる (Benton, W.およびDavis,
R., 1977, Science 196:180; Grunstein,M. および Hog
ness, D.,1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:39
61) 。あるいはまた、内因性 ribオペロンの読みとり枠
を含んでなる配列、または約10、好ましくは15またはそ
れ以上のヌクレオチドを含んでなるその配列をハイブリ
ッド形成プローブとして使用することができる。このよ
うなプローブは、オペロンがコードしていることが知ら
れている遺伝子産物の核酸またはアミノ酸配列の一部分
(その例が以下に与えられる) に基づいて合成的に作ら
れうる (「逆向き遺伝学」) 。もし精製された ribオペ
ロン特異的プローブが利用できないならば、制限フラグ
メント (例えば部分的なSau3A 消化物からの) のクロー
ン化遺伝子ライブラリーを細菌、特にB.サブチリスまた
はE.コリ内につくることができ、 ribオペロン含有組換
えクローンはマーカーレスキューまたは既知の rib変異
についての相補性のいずれかによって確認することがで
きる。

【００３９】好ましい実施態様に於ては、B.サブチリス
ＤＮＡのE.コリプラスミドライブラリーからB.サブチリ
スの ribオペロンを単離して使用することができる。特
に、そして下記のように、B.サブチリス ribオペロン
は、B.サブチリスのオペロンがコードすることが知られ
ている遺伝子産物の内部の領域から誘導された放射性標
識合成ヌクレオチドプローブに対するその相同性により
単離できる。β−リボフラビンシンターゼ (Ludwigら、
J. Biol. Chem. 262:1016, 1987)のアミノ酸配列の一部
分がかかるプローブの基礎でありうるが、コドン使用の
頻度からそれぞれのコドンの３番目のヌクレオチドを推
定し、このタンパク質の別の領域、またはribオペロン
に由来する別のタンパク質に基づく同様のプローブを利
用することができ、それらは本発明の範囲にある。本発
明によりさらに、図３〜21に示すヌクレオチド配列から
誘導された合成プローブを使用することによるスクリー
ニングが可能となる。

【００４０】ここで詳述した方法と類似の方法を用い
て、他の細菌、特に他のバチルスまたはE.コリの ribオ
ペロンを単離することができる。詳細な実施態様に於て
は、かかるクローンは標識化B.サブチリス ribオペロン
またはそのハイブリッド形成可能な部分とのハイブリッ
ド形成能をアッセイすることによって選択できる。適当
なｍＲＮＡ調製物から出発してｃＤＮＡを調製できるこ
とは当業上よく知られている。かかるｃＤＮＡを本発明
により用いて、適当な細菌をリボフラビン過剰生産用に
形質転換させるためのベクターを調製することもでき
る。

【００４１】単離された ribオペロンまたはその一部分
を包含する組換えＤＮＡ分子を有する宿主細胞がひとた
び同定されると、そのＤＮＡを大量に得ることができ
る。次に、これによって ribオペロンが操作できそして
そのヌクレオチド配列が当業者によく知られた様々なク
ローニング及び配列決定技術を用いて決定できる。例え
ば、挿入変異原物質を用いて、クローン化ＤＮＡ断片内
に於ける ribオペロン及びその遺伝子の位置を決定し特
性決定することができる。詳細な実施態様に於ては rib
生合成含有領域は、小さな cat (クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ) 含有制限フラグメントを
クローン化ＤＮＡの数個の異なる制限酵素部位に挿入し
そして適当な宿主 (下記参照) に於けるリボフラビン生
合成の挿入による不活性化についてそれぞれの誘導体を
検査することにより確認できる。

【００４２】ribオペロンに相当するクローン化ＤＮＡ
は、サザンハイブリッド形成 (Southern, E.M., 1975,
J.Mol. Biol. 98:503-517)、ノーザンハイブリッド形成
(例えば Freemanら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 80:4094-4098参照) 、制限エンドヌクレアーゼ
マッピング (Maniatisら、1982, Molecular Cloning AL
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, C
old Spring Harbor,New York) 、およびＤＮＡ配列分析
を包含するがそれに限定されない方法により分析でき
る。制限エンドヌクレアーゼマッピングは ribオペロン
の遺伝子構造をおおまかに決定するのに用いられうる。
制限エンドヌクレアーゼ切断により誘導された制限地図
はＤＮＡ配列分析によって確認できる。

【００４３】ＤＮＡ配列分析は当業上知られた任意の技
法によって行うことができる。それら技法にはMaxam お
よびGilbert の方法 (1980, Meth. Enzymol. 65:499-56
0)、Sangerジデオキシ法 (Sanger, F.ら、1977, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5436)、または自動化ＤＮ
Ａシークエネーター (例えば、Applied Biosystema,Fos
ter City, CA)が包含されるがそれに限定されるわけで
はない。一例として、B.サブチリス ribオペロンのＤＮ
Ａ配列を図３〜21に示す。ribオペロンのヌクレオチド
配列が決定されると、つぎにそれらにコードされる産物
の予想アミノ酸配列にしたがって、推定読みとり枠 (OR
F 類) を同定することができる。例えば様々な ORF類を
鋳型として用いてS-30共役インビトロ転写／翻訳反応を
行うことによって、コードされた産物を実際に同定する
ことができる。 ORF類の様々な突然変異誘導体も、コー
ドされた産物の機能を試験するために、S-30反応産物の
機能アッセイにおいて活性を試験することができる。

【００４４】B.サブチリス ribオペロンに関する、そし
て以下の実施例で詳述される本発明の詳細な実施態様に
於ては、上記方法を用いてB.サブチリスリボフラビン生
合成が５個の生合成遺伝子すなわちリボフラビンシンタ
ーゼのβサブユニットおよび２、３、４、及び５と称さ
れる ORF類 (図22参照) を含有する約4.２kbの単一オペ
ロンによって制御されることを確認した。次に、 ORF類
２、３、４、および５が、それぞれ分子量約15kd、47k
d、26kd、および44kdのタンパク質をコードすることが
示された。以下に記述するように、ORF5は、リボフラビ
ン生合成の初期の段階で、脱アミノ化されたピリミジン
のリビチルアミノ−結合への還元を触媒するものであ
る、推定 rib特異的デアミナーゼをコードすることが示
された。本発明者らのデータはまた、ORF4がリボフラビ
ンシンターゼのαタブユニットをコードし、ORF3は GTP
シクロヒドロラーゼをコードし、一方ORF2はおそらく r
ib特異的レダクターゼをコードすることも示している。
ORF1およびORF6は、 ribオペロンの一次転写ユニットの
外側にあることが判明した。 ribオペロン転写開始のた
めの最初の部位は、おそらくオペロンの最初の遺伝子、
ORF5から 290bp上流のある見かけのσ^A プロモーターで
あると判定された (図22、 P₁ ) 。B.サブチリスribオ
ペロンのコード領域、プロモーターおよび転写終止部位
を下記の表VIに示す。

【００４５】本発明は ribオペロン遺伝子のヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列、並びに機能的に活性なペプチド
をコードするその部分配列、およびかかる配列と実質的
に同じ配列を包含する。ここで用いられる機能的に活性
なペプチドは、リボフラビン生合成を招来する反応を触
媒する能力を持つタンパク質またはペプチドを意味す
る。機能的には活性な核酸配列はリボフラビン生合成を
調節しうる配列を意味する。別の配列と実質的に同じ配
列とは、その相補的な配列に対してハイブリッド形成で
きる配列を意味する。さらに、天然には第２の核酸配列
の発現を制御しない核酸配列とは、第２の配列が単離さ
れた細菌に於て第２の配列の発現を制御しない配列を意
味する。

【００４６】ribオペロンの遺伝子構造が明らかになる
と、本発明に於て最適に使用するためにその構造を操作
することが可能である。例えば、リボフラビン生産を最
大限に高めるために ribオペロンを遺伝子工学的に作製
することができる。用いられた宿主−ベクター系の如何
に応じ、多くの適当な転写および翻訳エレメントのうち
の任意の一つを使用することができる。組換えＤＮＡま
たは合成技法によって作られたプロモーターも挿入配列
を転写するために使用することができる。細菌内で増殖
させる場合、 ribオペロンそれ自身の調節配列を用いる
ことができる。全 ribオペロン、またはその１遺伝子よ
り多い遺伝子がポリシストロニックメッセージとして発
現されることが所望される実施態様に於ては、原核生物
の宿主が必要とされる。真核生物宿主を使用する実施態
様に於ては、発現が所望されるそれぞれの遺伝子／ORF
の上流の組換えＤＮＡ中に適当な調節配列 (例えばプロ
モーター) を置く必要がある。

【００４７】挿入されたタンパク質コード配列の効率的
な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要である。
これらのシグナルには、開始コドン(ATG、GTG、またはT
TG)およびリボソーム結合部位 (RBS)のような隣接配列
が包含される。翻訳レベルでそのコード配列をより効率
的に発現させるには、与えられたコード配列のRBS を操
作できることに注意すべきである。それ自身の開始コド
ンおよび隣接する調節配列を含む ribオペロンの全読み
とり枠が適当な発現ベクターに挿入される場合には、何
らそれ以上の翻訳制御シグナルは必要あるまい。しかし
ながら、コード配列の一部分のみが挿入される場合また
は生来の調節シグナルが宿主細胞によって認識されない
場合には、開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが
付与されなければならない。開始コドンはさらに、全挿
入物の翻訳を保証するためにタンパク質コード配列と読
み枠が一致しなければならない。これらの外因性翻訳制
御シグナルおよび開始コドンは天然および合成両者の様
々な起源からなっていることができる。

【００４８】さらに、 ribオペロン遺伝子の発現を調節
するかまたは望ましい特定の方法でその遺伝子産物を修
飾しプロセシングする宿主細胞株を選択できる。ある種
のプロモーターからの発現をある種のインデューサーの
存在下で増加させることができる。従って、遺伝子工学
的に作られた ribオペロンタンパク質の発現を制御する
ことができる。ある実施態様に於ては、 ribオペロンを
調節解除しそれによってリボフラビン生産を増加させる
ために、プロモーターおよび転写終止／抗転写終止調節
配列のようなオペロンの調節領域を操作するかまたは構
成的または増殖により調節されるプロモーターで置き換
えることができる。さらに、発現されたタンパク質の望
ましい修飾およびプロセシングを保証するために、適当
な細胞系列または宿主系を選択することができる。多く
の操作が可能であり、本発明の範囲内にある。

【００４９】本発明のある詳細な実施態様に於ては、B.
サブチリス ribオペロンの5'調節配列を除去していくつ
かのB.サブチリスプロモーターの１またはそれ以上と置
き換えることができる。かかる構築により rib生合成遺
伝子が高レベルに発現されよう。この手段は転写ターミ
ネーターの末端とオペロン内の最初の遺伝子ORF5の RBS
配列との間の20−30bp領域への新たな制限部位の導入を
包含しよう。かかる制限部位は特定部位の突然変異誘発
によるか、またはORF5の最初の30bp内にあるもっとも右
側のBglII (BglII_R ) 部位から上流のすべての調節配列
を欠失させ (図３〜21および図22参照) 、合成オリゴヌ
クレオチドをこの部位に挿入することによって導入する
ことができる。この合成ヌクレオチドは (リボソーム結
合部位を含む) ORF5の5'末端を完了させ、新たな上流の
制限部位を含有するものである。一旦これらの構築がな
されると、新たな制限部位と適合する末端を優するプロ
モーター含有制限フラグメントを導入することができ、
それにより新たなプロモーターの制御下で rib遺伝子を
発現させることができる。構成的で、かつ増殖により調
節されるB.サブチリスプロモーターを用いることがで
き、それらには溶菌バクテリオファージSPO1遺伝子から
の強力なプロモーター、veg 、 amy (アミラーゼ) 、お
よび apr (ズブチリシン) が包含されるがそれらに限定
されるわけではない。

【００５０】本発明の別の観点に於ては、非相同遺伝子
産物の発現を調節するために、転写調節活性 (例えばプ
ロモーター) を有する ribオペロンＤＮＡフラグメント
を用いることができる。本発明によれば、発現が行われ
る場所であり、かつ例えばバチルスおよびE.コリを含む
細菌中に ribオペロンを導入することができる。好まし
い実施態様に於ては、細菌宿主は上記の突然変異宿主の
一つである。詳細な実施態様に於ては、クローン化され
た ribオペロンを宿主染色体ＤＮＡ中に組み込み、そこ
で宿主ゲノムＤＮＡとともに複製し発現させる。最も好
ましい実施態様に於ては、多コピーの ribオペロンを宿
主染色体ＤＮＡ中に組み込み、それによって調節解除さ
れた宿主内での ribオペロン発現を増幅させる。これを
実行する一つの方法は、下記の実施例の項で詳述するよ
うに、 cat含有 ribオペロンの染色体挿入に続くそのオ
ペロンのクロラムフェニコール増幅である。同じ技法を
用いて tet^r 遺伝子、またはバチルス内で発現されるあ
る種の他の薬剤耐性遺伝子を使用することもできる。

【００５１】詳細な実施態様に於ては、宿主染色体内で
ベクターのもっと大きな増幅を得る試みとして、できる
限り小さなＤＮＡフラグメント上に ribオペロンを含む
ように、 ribオペロンフラグメントを含有する組み込み
ベクターを遺伝子工学的に作製することができる。例え
ば、ベクターＤＮＡ配列を欠失させ、および／またはri
bオペロンの側面にある非必須ＤＮＡを欠失させること
ができる。一般的に、リボフラビン原栄養性細菌は最小
培地上でリボフラビン無しで増殖できる。リボフラビン
生産を様々な方法によって検出および定量できる。好ま
しい実施態様に於ては、リボフラビン過剰生産性菌を下
記のように366nm のＵＶ光に曝すと、観察可能な黄色の
蛍光を発し、リボフラビン過剰生産が容易に観察され
る。例えば、本発明の遺伝子工学的に作製されたプラス
ミドの多くはE.コリ内で作られる。これらのプラスミド
の一部について、リボフラビンの過剰生産がこの方法に
より確認されている。例えば、生産されたリボフラビン
量は逆相高性能液体クロマトグラフィー (HPLC) を用い
て定量できる。細菌の無細胞上清をHPLCカラムで後記の
ように分画し、254nm でリボフラビンを監視することが
できる。標準曲線からの外挿により、リボフラビン濃度
をクロマトグラフィーのピーク面積によって測定でき
る。

【００５２】蛍光光度法によってリボフラビンを定量す
ることもできる。例えば、発光波長525nm および励起波
長450nm にセットした蛍光光度計で、リボフラビンを含
有する試料の測定値を読むことができる。さらに、当業
上知られた他の方法を、その物理的および生物学的性質
に基づくリボフラビンの検出及び定量に利用できる。リ
ボフラビン過剰生産性細胞は振盪フラスコから大規模な
「バッチ」発酵器に至るまでの容器内で、当業界で知ら
れた方法により (下記参照) 増殖させることができる。
望ましい実施態様に於ては、培地中の栄養素を変化させ
ることによって最小のコストでリボフラビン生産を最大
にするように栄養供給物を操作することができる。

【００５３】詳細な実施態様に於ては、増幅された rib
−含有遺伝子は接種用種菌株に約60μg/mlのクロラムフ
ェニコールを包含させることによって (発酵器内では必
ずしもそうではない) 細菌染色体内で高コピー数に維持
することができる。シェマップ (Chemap) 14Ｌ発酵器を
1000rpm でヘッド圧0.６気圧で用いることができる。高
い細胞濃度を得るためには、例えばグルコース、スクロ
ース、クエン酸回路の酸、マルトースまたは澱粉のよう
な様々な炭素源、および酵母エキス、コーン浸出液、ア
ンモニア、および／またはタンパク質加水分解物のよう
な様々な窒素源を用いることができる。しかしながら、
リボフラビン生産に好ましくない限定 (例えば、高すぎ
る炭素源濃度が原因で起こる酸素欠乏) を避けるような
方法でこれらの培地成分の部分を添加することが重要で
ある。使用に適した発酵培地および条件を以下に詳述す
る。

【００５４】

【実施例】実施例１ リボフラビン過剰生産性B.サブチリス変異体 本発明者はここでリボフラビンを過剰生産するB.サブチ
リス株の生成について記載する。これを行うために古典
的な遺伝学、遺伝子工学及び発酵を用いた。プリン及び
リボフラビン類似体を使用する選択による古典的遺伝学
を用いてプリン(リボフラビン前駆体) 及びリボフラビ
ン生合成経路を調節解除した。リボフラビン生合成経路
の遺伝子 (rib オペロン) をクローン化および遺伝子操
作により作製することによりリボフラビン生産がさらに
高まり、律速的生合成酵素の本質的な高レベルの生産が
できるようになった。B.サブチリスにおけるリボフラビ
ン生合成はGTP で始まる (図１) 。リボフラビンを過剰
生産する宿主を得るために我々は古典的な遺伝学を使用
して、細胞が生産する GTP量を増大させかつリボフラビ
ン経路を調節解除した。B.サブチリスにおけるプリン過
剰生産はアザグアニンやデコイニンのようなプリン類似
体及びメチオニンスルホキシドのような他の拮抗体に耐
性を有する突然変異体を得ることにより達成できる (例
えば、Ishii 及びShiio 、Agric. Biol. Chem. 36(9):1
511-1522, 1972 ; Matsuiら、Agric. Biol. Chem. 43
(8):1739-1744, 1979) 。リボフラビン経路はリボフラ
ビン類似体ロゼオフラビンに耐性である突然変異体を得
ることにより調節解除できる (Matsuiら、Agric. Biol.
Chem. 46(8):2003-2008, 1982) 。ロゼオフラビン耐性
株は予め突然変異誘発させそして幾つかのプリン類似体
に耐性である株から選択された。以下に、リボフラビン
を過剰生産する株 (RB50) の生成に使用される方法が記
載される。

【００５５】８−アザグアニン耐性突然変異体 B.サブチリスはプリン類似体８−アザグアニン (Sigma
Chemical Co., St.Louis MO) により 500μg/mlの濃度
で効果的に殺され、そして、耐性を有する突然変異体は
自然発生的に10⁸ 分の１以下の頻度で現われる。30μg/
mlのエチルメチルスルホネート(EMS：Sigma)がアザグア
ニン耐性 (Ag^r ) 突然変異の頻度を増大させるための変
異原物質として使用された。突然変異誘発は標準操作(M
iller,1972, Experiments in Molecular Genetics, Col
d Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, Ne
w York)によりB.サブチリス株168 からの細胞に対して
実施した。 500μg/mlのアザグアニンを含有する最少培
地 (Sloma, J.Bact. 170:5557, 1988)に４×10⁶ 個の突
然変異誘発された細胞をプレートし、単一のコロニーを
再画線培養すると、35個のAg^r コロニーが生成した。１
つの突然変異体RB11 (Ag^r -11)をRB50の作製に用いた。

【００５６】デコイニン耐性突然変異体 デコイニン耐性 (Dc^r ) 突然変異体は10⁶ 分の１の頻度
で自然発生的に、又は10⁵ 分の１の頻度で EMS突然変異
誘発の後 100μg/mlのデコイニン(Upjohn Co.,Kalamazo
o, MI)を含有する最少培地に細胞をプレートすることに
より得られた。RB11のDc^r 突然変異体は上述のようにし
て EMSによる突然変異誘発により得られた。１つのDc^r
コロニーであるRB15 (Ag^r -11, Dc^r -15)を用いてRB50
を作製した。

【００５７】Ag及びDc突然変異の転移 これらのプリン類似体耐性突然変異は、望まないEMS-誘
発突然変異からこれを分離するために、そしてAg^r 及び
Dc^r 突然変異が単一の座によるものであることを証明す
るために、異なった株のバックグランドに転移させた。
リボフラビン前駆体イノシン一燐酸(IMP) からの "炭素
流れ (carbon flow)" の一部は又アデニンヌクレオチド
生合成に使用されるので、突然変異pur-60を介してアデ
ノシン一燐酸(AMP) 経路が遮断され、より多くの炭素物
質をIMP からリボフラビンのグアニンヌクレオチド前駆
体に流れるようにさせる宿主株が選択された (図２) 。
B.サブチリス株1A382 (his H2, trp C2, pur-60)がコン
ピテントにされ (Sloma ら、J.Bact. 170:5557 (1988))
そして、Ag^r ／Dc^r 突然変異体RB15から調製した全ＤＮ
Ａを用いて形質転換された (Gryczan ら、J.Bact. 134:
318(1978) の方法による) 。 Trp⁺ (トリプトファン)
復帰細胞コロニーを選択し、それらの3.３％(10/300)
はDc^r であり、2.３％(7/300) がAg^r であった。この結
果は予期しないものではなかった。なぜなら、 "会合
(congression)" （第２の連結されてないマーカーの形
質転換) ゆえに多数の Trp⁺ コロニーはまたデコイニン
又はアザグアニンに耐性でもあるはずだからである。１
つのDc^r コロニーRB36 (his H2, pur-60, Dc^r -15)、１
つのAg^r コロニーRB40 (his H2, pur-60, Dc^r -11)、及
び１つのDc^r ／Ag^r コロニー (これは his⁺でもあるこ
とが判明した) 、RB39 (pur-60, Ag^r -11, Dc^r -15)を
すべて選択してさらに研究した。

【００５８】メチオニンスルホキシド耐性突然変異体 高レベルのメチオニンスルホキシド (MS：10mg／ml, Si
gma)を使用する選択により、 EMSでの突然変異誘発が必
要でない程十分に高頻度で現われる自然発生的な突然変
異体が生じた。Ag^r ／Dc^r 変異体RB39を MS 10μg/mlを
含有する最少培地上に画線培養した。耐性コロニーが得
られ、単一の耐性コロニーを得るために再び画線培養し
た。１つの株RB46 (pur-60, Ag^r -11, Dc^r -15, MS^r
-46)を選択してさらに研究した。

【００５９】ロゼオフラビン耐性突然変異体 Ag^r , Dc^r 及びMS^r の突然変異体の多くが GTP過剰生産
であるように思われるが、それらのいずれも平板培地上
で検出可能なレベルのリボフラビンを生産しなかった。
リボフラビン生合成経路を調節解除するためには、リボ
フラビン類似体はロゼオフラビン (Toronto Research C
hemical)に対する耐性に関して選択する条件が決定され
た。細胞の最大死滅は最少培地又は完全培地において 1
00μg/mlのロゼオフラビンで生じた。濃度を増大しても
更なる死滅は起こらなかった。ロゼオフラビン耐性への
突然変異(RoF^r ) は EMS又は他の化学薬品による突然変
異誘発が必要でない程十分に高い率 (約５×10^-5) で自
然発生的に生じた。上述の株 1A382、RB36、RB39、RB40
及びRB46の各々から約1000個の RoF^r コロニーが得られ
た。これらの株すべてからの RoF^r 突然変異体は長波長
の紫外線 (366nm)に曝露させた場合最少培地のプレート
上で低レベルの蛍光を示し、このことはいくらかのリボ
フラビンの生成を示している。 RB46, RB46Y (pur-60,
Ag^r-11, Dc^r -15, MS^r -46, RoF^r -46)から得られた
RoF^r コロニーの１つは最少培地上で増殖させると、HPL
Cで測定して (既述) 14mg/lのリボフラビンを生成し
た。

【００６０】すべての処理された株の中で、わずかにRB
39とRB46のみが RoF^r コロニーが選択された場合に有意
に異なった表現型を生成した。RB39又はRB46のいずれか
のRoF^r コロニーの約0.５％〜1.０％が強い蛍光の黄色
いコロニーを生成した。これらのコロニーについて、RB
39から生じたRB51 (pur-60, Ag^r -11, Dc^r -15,RoF^r -
51)、及びRB46から生じたRB50 (pur-60, Ag^r -11, Dc
^r -15, MS^r -46,RoF^r -50)がHPLCにより測定して比較
的高レベルのリボフラビン生産に関連する安定な蛍光−
黄色の表現型を生成した。最少培地で増殖させるとRB50
とRB51の双方とも他の RoF^r 株よりも高レベルのリボフ
ラビン、すなわちそれぞれ、約40mg/l及び30mg/lを上清
中に生成した。RB50の系統を図23に示す。強い蛍光 (従
ってリボフラビン過剰生産性) を発するコロニーはRB51
のような非−MS^r 株で得ることができるので、一般にこ
の突然変異はより高い生産をする表現型には有意には寄
与しないかもしれないと思われる。強い蛍光性RoF^r コ
ロニーはAg^r -11(RB40からの) 又はDc^r -15(RB36から
の) 突然変異のみを含有する株には見出せなかったの
で、他の突然変異であるAg^r 及びDc^r (RB39 中のAg^r -1
1 及びDc^r -15)の両方が高レベルのリボフラビン生産に
必要であると思われる。

【００６１】guaC 突然変異 GTPの過剰生産、ひいてはリボフラビンの過剰生産を達
成するためのもう一つの恐らくは重要な突然変異はguaC
３であり、これはGMP はIMP に戻る変換を阻止する (図
２を参照) 。リボフラビンを過剰生産するguaC３を含有
する株を作製するためには、コンピテントなB.サブチリ
ス株62121 細胞 (guaC３, trpC２, metC７)(Endoら、J.
Bact. 15:169, 1983) を RB50 ＤＮＡで形質転換しそし
てデコイニン 100μg/mlを含有するプレート上でDc^r を
選択した。数千個のDc^r コロニーが生成した。Dc^r プレ
ートに貼付された 200個のコロニーのうち、リボフラビ
ン過剰生産表現型 (ＵＶ蛍光に基づく) を示すもの１個
が見出され、これはRoF^rであった。このコロニーをRB52
(guaC３, trpC２, metC７, Dc^r -15, RoF^r -50)と称
し、以後の研究のために保存した。

【００６２】他の類似体耐性突然変異体 最後に、いくつかの付加的なプリン類似体に耐性を有す
る突然変異体もまたプリン代謝で変えられることが報告
されているので、リボフラビン過剰生産株に及ぼすその
作用を調べるためにかかる突然変異体をアッセイした。
８−アザキサンチン500g/ml 、６−チオグアニン１mg/m
l 、又はスルファグアニジン２mg/ml (Sigma)は、野生
型B.サブチリスを効果的に殺すことが判定された。アザ
グアニン耐性リボフラビン過剰生産株RB50::［pRF8］₉₀
及びRB53::［pRF8］₉₀ (下記参照) はすでにアザキサン
チン耐性であることが判明している。異なった特性をも
つ別個のアザグアニン及びアザキサンチン−耐性突然変
異は前に記載されているが、この場合Ag^r -11 及びAg^r
-53 突然変異はアザキサンチン耐性をも伝達すると思わ
れる。

【００６３】B.サブチリスの粗製上清中のリボフラビン
のHPLC分析 B.サブチリス培養物中におけるリボフラビンの蓄積を逆
相HPLCにより定量した。リボフラビン標準物 (Sigma Ch
emical Co., ST Louis, MO) 又は被験株の細胞不含上清
を、１％酢酸アンモニウム (pH6.0)で平衡化した4.６mm
×250mm VydacC₁₈カラム上で分別した。注入後、カラム
をメタノールの直線グラジェントで展開し、254nm でリ
ボフラビンに関して監視した。真正のリボフラビン (即
ちリボフラビン "標準物" ) は、グラジェントの中央点
で溶出する。

【００６４】実施例２ B.サブチリス ribオペロンのクローニング ribオペロンを含有する制限フラグメントを単離するた
めの一般的な方法は、リボフラビンシンターゼのβサブ
ユニットに関する公開されているアミノ酸配列から部分
的に誘導されたＤＮＡ配列 (Ludwigら、J.Biol. Chem.
262:1016, 1987) である合成オリゴヌクレオチドプロー
ブとのハイブリッド形成により、B.サブチリスＤＮＡの
"ミニ" E.コリプラスミドライブラリーを選別すること
であった。このプロトコールの要約を図24に示す。合成
による、54塩基 "guess-a-mer"オリゴヌクレオチドプロ
ーブが、Ludwigら(J.Biol. Chem. 262: 1016-1021, 198
7) により配列決定された 240個アミノ酸リボフラビン
シンターゼタンパク質のアミノ酸84-102に基づいてこの
スクリーニングに使用された。プローブ中の各コドンの
第３番目のヌクレオチドは、例えばジーンバンク (GenB
ank(登録商標)) (Los Alamos Nat. Lab, LosAlamos. N
M) から入手しうる幾つかの配列に基づき、最も高頻度
に使用されるB.サブチリスコドンについてなされた判断
にしたがって選択された。このプローブは次の配列から
成っていた： 5'-GGAGCTACAACACATTATGATTATGTTTGCAATGAAGCTGCTAAAGG
AATTGCT-3'

【００６５】このプローブの特異性を試験するために、
³²P 標識54-merＤＮＡを野生型及び突然変異体B.サブチ
リス株から単離された EcoRI消化染色体ＤＮＡ (Southe
rn,J. Mol. Biol. 98:503, 1975) を含有するナイロン
フィルターにハイブリダイズさせた。このプローブはEc
oRI 消化B.サブチリス(rib⁺ met^- ) ＤＮＡの単一の９
−10kbフラグメントに強力にハイブリダイズし、このこ
とは rib含有フラグメントの予測された寸法と良好に一
致する(Osinaら、FEBS. Lett. 196:75, 1986)。同一の
寸法の標識されたフラグメントはプローブを２個の突然
変異株、RB46 (pur-60, Ag^r -11, Dc^r -15, MS^r -46)
及びRB50 (pur-60, Ag^r -11, Dc^r -15,MS^r -46, RoF^r -
50)、このうち後者はリボフラビン過剰生産体である、
にハイブリッド形成させた場合に検出された。これらの
ハイブリッド形成実験をHindIII切断染色体ＤＮＡを用
いて反復すると、プローブが約1.８kbのより小さな単一
のフラグメントを同定した。この後者の結果はクローン
化されたＤＮＡ内におけるrib生合成オペロンの一般的
位置を決定するのに有用であった。

【００６６】野生型rib生合成遺伝子を含有するプラス
ミドpRF1、pRF2及びpRF3の単離 B.サブチリス株168 (rib⁺ ) ＤＮＡからの９−11kb Eco
RIフラグメントの "ミニ" 遺伝子ライブラリーを、シュ
ードモナス (Pseudomonas)レプリコンRK２に由来する低
コピーベクターであるpRK290を使用して調製した (Ditt
a ら、Plasmid13:149, 1985) 。B.サブチリス(rib⁺ met
^- ) ＤＮＡの EcoRIフラグメント (９−11kb) をスクロ
ース (10〜40％) レートゾーン遠心法により単離した。
４倍過剰のこれらフラグメント (0.22μg）をウシ腸ア
ルカリホスファターゼ(CIAP)で脱燐酸化した EcoRI−切
断pRK290 (0.26μg）に10μg/mlの全ＤＮＡ濃度におい
て結合させた。約10ngの連結されたＤＮＡをE.コリ DH5
(F^- , endA1, hsdR11［ r_k ^- , m_k ⁺ ］, supE₄₄, thi-
1, λ-, recA1, gyrA96, re1A1)に形質転換して、ＤＮ
Ａの１μg 当り7.７×10⁴ の頻度でテトラサイクリン耐
性 (Tc^r ) コロニーを生じた。９−11kb挿入ＤＮＡを含
有する形質転換体のフラクションを決定するために、幾
つかのTc^r 形質転換体からプラスミドミニ溶解物を調製
し、そしてそれらのＤＮＡを制限酵素消化により分析し
た。約40％のTc^r 形質転換体が、EcoRI により生成され
た９−11kbの挿入物１個を含有することが見出された。

【００６７】約1140個のTc^r コロニーをリボフラビンシ
ンターゼ遺伝子に特異的な³²P 標識54-merプローブを用
いて選別した。１個のコロニーが陽性のシグナルを生じ
た。pRF1と命名されたプラスミドＤＮＡをこのクローン
から単離し、そしてリボフラビン欠損突然変異rib-２を
含有するB.サブチリス1A210 中に形質転換して Rib⁺原
栄養性コロニーを選択することにより、 Rib⁺ −マーカ
ー救済活性について検査した。pRF1は1A210 を高頻度で
Rib⁺ 原栄養性に形質転換した。無作為に選ばれたTc^r
形質転換体からのプラスミドＤＮＡはこのマーカーを救
済できなかった。

【００６８】制限酵素分析によればpRF1が実際に10kbと
11kbの２個の EcoRIフラグメント挿入物を含有すること
が明らかになった。いずれのフラグメントが ribオペロ
ンを含有するかを判定するために、EcoRI 消化pRF1を³²
P 標識54-merリボフラビンシンターゼプローブを用いて
調べた。その結果は10kbの小さい方のフラグメントのみ
がこのプローブと交差反応することが示された。さら
に、10kb EcoRIフラグメントをpBR322の EcoRI部位へ再
クローン化すると、組み換えプラスミドpRF2及びpRF3が
生成し、２つのありうる挿入方向を示した。両方のプラ
スミドは高頻度でB.サブチリス1A210 のrib-２突然変異
を原栄養株に戻すことが判明した。

【００６９】RoF^r B.サブチリス株RB50から rib生合成
遺伝子を含有するプラスミドpRF6及びpRF7の単離 RB50は上述のようにして生成された、リボフラビン生合
成が調節解除されているB.サブチリス RoF^r 突然変異体
の１つである。約80％の RoF^r 突然変異がribO座におい
て ribオペロン内に存することが報告されている (Step
anovら、Genetika(USSR)13:490, 1977) 。野生型の rib
オペロンと同様に、RB50中の rib遺伝子も９−10kb Eco
RIフラグメント上に含まれていた。従ってこのフラグメ
ントはクローニングベクターとしてpBR322を用い、図24
に概要が示されるプロトコールを使用してクローン化し
た。RB50からのサイズ選択された９−11kb EcoRIフラグ
メント (0.１μg) は前記のようにして調製し、22μg/m
lの全ＤＮＡ濃度で EcoRI切断、脱燐酸化 pBR322 ＤＮ
Ａ (0.34μg) の末端の２倍過剰に連結した。約９ngの
連結ＤＮＡをE.コリDH５に形質転換すると、3.５×10⁵
／μg ＤＮＡの頻度でアンピシリン耐性 (Ap^r) コロニ
ーを生じた。

【００７０】12個のAp^r コロニーの試料採取から単離さ
れたプラスミドＤＮＡを制限酵素分析すると、50％が９
−11kb EcoRI挿入物を有するプラスミドを含有すること
が判った。約1140個のAp^r コロニーをコロニーハイブリ
ッド形成によりリボフラビンシンターゼ遺伝子に特異的
な³²P 標識54-merプローブを用いて選別した。６個のコ
ロニーが陽性のシグナルを生じた。これらの６個のコロ
ニーの２個から単離されたプラスミドpRF6とpRF7が制限
酵素分析によりそれぞれpRF2及びpRF3と同じ方向の挿入
物を含有することが確認された。加えて、両方のプラス
ミド共高頻度でrib-２突然変異をマーカーレスキューす
ることができた。

【００７１】実施例３ rib⁺ ＤＮＡのB.サブチリス中への導入 上述のようにして、B.サブチリスの野生型の株及び RoF
^r 突然変異体の両方のribオペロンを同一の10kb EcoRI
フラグメントとして、E.コリのレプリコン pBR322 の E
coRI部位にクローン化した。これら組み換えプラスミド
の誘導体形成の概要を図24に示す。 ribオペロンを含有
する10kb EcoRIフラグメントを多コピーでB.サブチリス
に導入し、そしてリボフラビン生産を一層増大させるた
めに、B.サブチリス染色体に組み込み可能なプラスミド
ベクターを作製した。組み込まれたＤＮＡはクロラムフ
ェニコールの高濃度で増殖するコロニーを選択すること
により増幅させた。

【００７２】組み込みribプラスミドpRF4及びpRF8の作
製及びそれを用いる形質転換 組み込みベクターを作製するために、B.サブチリス中で
選択可能な薬剤を耐性遺伝子クロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼを、それぞれ野生型または RoF
^r B.サブチリス株からの10kbフラグメントを有するpBR3
22ベクターであるpRF2及びpRF6に導入した。プラスミド
pRF2とpRF6をpBR322配列内で特異的にプラスミドを切断
するBamHI で消化し、そしてCIAPで脱燐酸した。切断さ
れたＤＮＡを cat遺伝子を含有する1.３kb BamHIフラグ
メントに連結し (Youngmanら、Plasmid 12: 1-9, 198
4)、連結されたＤＮＡを次にE.コリ DH5細胞に形質転換
した (Hanahand, J. Mol. Biol. 166:557, 1983)。約80
〜90％のAp^r 形質転換体がクロラムフェニコール耐性
(Cm^r ) であった。単離されたプラスミドを制限分析す
ると (Maniatisら) 、Cm^r コロニーからのプラスミドＤ
ＮＡは1.３kbフラグメントを含有することが確認され
た。野生型リボフラビンフラグメントおよびcat遺伝子
を含有するプラスミドをpRF4と称した。 RoF^r 株からの
クローン化リボフラビンフラグメントを含有するプラス
ミドはpRF8と呼ばれた(RoF^r 変異はのちにribオペロン
の外にあることが示されたので、これらのプラスミドは
恐らく同一である。)

【００７３】プラスミドpRF4とpRF8を４つの異なったB.
サブチリス株に形質転換した。リボフラビン過剰生産体
RB50 (Ag^r -11, Dc^r -15, MS^r -46, RoF^r -50), RB5
0 親RB46 (Ag^r -11, Dc^r -15, MS^r -46,), RB50 親 1A
382, 及びIS75は共通の実験室株である。コンピテント
なIS75と1A382 細胞をpRF4又はpRF8で形質転換した。こ
れらの同一のプラスミドをプロトプラストの形質転換に
よりRB46及びRB50に導入した (Chang 及びCohen, Mol.
Gen. Genet168: 111-115, 1979) 。これらの４種の株の
それぞれに組み込まれたpRF4又はpRF8ＤＮＡは比較的に
高いクロラムフェニコール濃度で増殖するコロニーを選
択することによって増幅された。各株において、60μg/
mlまでのクロラムフェニコール中で増殖するコロニーを
得ることができた。

【００７４】加えて、guaC3 B.サブチリス株62121 をRB
50からのＤＮＡで形質転換することにより生成させたRB
52 (guaC３, trpC２, metC７, Dc^r -15, RoF^r -50)をコ
ンピテントとなし、pRF8で形質転換した。生じた多くの
Cm^r コロニーの１つにおいて組み込まれたプラスミドを
90μg/mlのクロラムフェニコールを使用して増幅した。
生成した細胞RB52::［pRF8］₉₀を対数増殖期中期まで増
殖させ、 500μg/mlのアザグアニンを含有する最少培地
上にプレートした。約20個のAg^r コロニーが生成した。
かかるコロニーの一つがより強い蛍光を生じるように見
えた。この株、RB52::［pRF8］₉₀の系統を図25に示す。

【００７５】実施例４ pRF4又はpRF8を含有する菌株によるリボフラビン過剰生
産 pRF4またはpRF8を含有するRB50はリボフラビン過剰生産
表現型 (黄色かつＵＶ−蛍光性コロニー) を示した。RB
50の野生型株又は親株中の rib⁺ ＤＮＡの増幅では黄色
またはＵＶ−蛍光性コロニーを生じなかったが、このこ
とはリボフラビンの過剰生産を起こすには RoF^r 突然変
異 (リボフラビンの生合成を調節解除するもの) が野生
型ＤＮＡの染色体増幅にとって必要であることを示して
いる。一連の振盪フラスコ発酵を 300mlのバッフルフラ
スコ (Ballco) 中の25mlのリボフラビン最少培地(RMM,
表Ｉ) 中で実施して組み込まれ増幅された ribオペロン
を含有するRB50からのリボフラビンの生産を測定した。

【００７６】

【表１】 表 Ｉ 培地の組成 RMM g/l グルタミン酸ナトリウム 2.0 カザミノ酸 (Difco) 0.2 酵母エキス (Difco) 0.2 KH₂PO₄ 6.0 K₂HPO₄ 14.0 (NH₄)₂SO₄ 2.0 クエン酸ナトリウム 1.0 MgSO₄・7H₂O 0.2 アデノシン 0.05 (pH7.０に調節しオートクレーブ処理) マルトース 15.0 (オートクレーブ処理後、滅菌20％溶液として添加)

【００７７】発酵は菌株RB46、RB50および30μg/mlのク
ロラムフェニコール (RB50::［pRF4］₃₀) と90μg/mlの
クロラムフェニコール (RB50::［pRF4］₉₀) に対する耐
性を選択することにより増幅されたpRF4を含有するRB50
を用いて行った。24及び48時間で上清試料を取り出して
逆相HPLCによりリボフラビン含量を測定した。表IIに示
されるように、RB50::［pRF4］₃₀は0.３g/l のリボフラ
ビンを、そしてRB50::［pRF4］₉₀は0.７g/l のリボフラ
ビンを48時間で生産し、これはRB46およびRB50のような
rib増幅がない株により生産された量より有意に多かっ
た。

【００７８】

【表２】 表 II B.サブチリスからのリボフラビン含有上清の定量分析 菌 株 培養時間 (時間) リボフラビン(g/l) ^* RB46 24 0.009 RB50 24 0.02 RB50::［pRF4］₃₀ 24 0.1 RB50::［pRF4］₉₀ 24 0.4 RB46 48 0.007 RB50 48 0.05 RB50::［pRF4］₃₀ 48 0.3 RB50::［pRF4］₉₀ 48 0.7 * リボフラビンはHPLCアッセイを使用して測定した。 調節解除された宿主における rib遺伝子の増幅から生ず
るリボフラビン生産の劇的な増加は、クローン化ＤＮＡ
によりコードされる情報がリボフラビン生合成にとって
律速的であることを示している。

【００７９】実施例５ RoF^r-50 突然変異のマッピング RB50における RoF^r-50 突然変異はリボフラビン過剰生
産表現型にとって決定的に重要であると思われる。突然
変異を同定しそして場合により異なる株バックグラウン
ドに移動させるには、B.サブチリス染色体上の RoF^r-50
突然変異の位置を地図にすることが必要であった。pRF
4とpRF8は全ての株バックグラウンドにおいて非常に類
似したリボフラビン生産レベルを生ずるので、 RoF^r-50
突然変異がクローン化10kb EcoRI rib含有フラグメン
ト上に位置することはありえないように思われた。より
ありそうなのは、 RoF^r-50 突然変異がB.サブチリス染
色体のlys-aroD領域においてマップされることが報告さ
れているリプレッサー突然変異である (恐らくribCにお
ける) 非連結リプレッサー型突然変異であることである
(Chernik ら、Genetika (USSR) 15:1569, 1979)。 RoF
^r-50 変異体がリボフラビンオペロンに連結されている
かまたは連結されていないかを判定するために、コンピ
テントなB.サブチリスIA210(rib-2)細胞をRB50ＤＮＡで
形質転換し、rib⁺ を選択した。数千個の rib⁺ クロー
ンが生成し、 200個のコロニーを100μg/mlのロゼオフ
ラビンを含有するトリプトース血液寒天ベース上に貼付
した。RoF^r コロニーは生成せず、コロニーのいずれも
リボフラビン過剰生産性表現型を示さなかった。そのこ
とにより RoF^r-50 突然変異が ribオペロン中に存在し
ないことが確認された。

【００８０】実施例６ CAT 挿入突然変異誘発を使用する rib⁺ 生合成遺伝子の
位置確認 図22は標準操作に従って調製された、pRF2の rib−含有
10kb EcoRIフラグメントの制限地図を含有する。XbaI、
BglII、SstI、HpaI及びNcoIに対する制限酵素部位は挿
入ＤＮＡに対して特有であり、一方SalI及びPstIは挿入
物中で一度そしてベクター中で一度切断される。挿入物
はいかなる BamHI、XhoIまたはNheI制限部位も含まな
い。制限酵素HindIII は多数の部位で挿入物を切断す
る。リボフラビンシンターゼ遺伝子に特異的な54-merプ
ローブは約1.８kbのHindIII フラグメントとハイブリッ
ド形成し、このことは ribオペロンがSalI及び最も左の
BglII(BglII_L ) 部位を囲む一般領域にも存在しなけれ
ばならないことを示唆している。

【００８１】一般に、 ribオペロンの境界を決定するた
めに、小さい cat含有制限フラグメントを用いてpRF2の
rib⁺ クローン化ＤＮＡフラグメント中における挿入お
よび欠失を行った。E.コリプラスミドpEcc１がE.コリお
よびB.サブチリスの両方にクロラムフェニコール耐性を
付与する cat遺伝子を担持する制限フラグメントの主要
源として用いられた。標準的組換えＤＮＡ技術によりプ
ラスミドの非必須領域が除かれたpMI1101 (Youngman
ら、Plasmid 12, 1-9, 1984)の誘導体であるこのプラス
ミドは、M13mp7の "ポリリンカー" により側面を挟まれ
た1.３kb cat含有フラグメントを含有しており、それゆ
えSmaI、 EcoRI、SalIまたはBamHI のいずれかの末端を
有する catカセットを生成しうる。 cat遺伝子を含有す
るSstI又はXvaI−末端フラグメントを生成させるため
に、pEcc１の1.３kb cat含有BamHI フラグメントを単離
し、末端をHindIII リンカーで修飾し、そしてこの修飾
されたフラグメントをpIC20Rのポリリンカー領域内にあ
るHindIII 部位にクローン化してプラスミドpEcc４を生
成させた。

【００８２】組み込みプラスミド誘導体は最初にE.コリ
中において作製され、次いでＤＮＡ形質転換によりB.サ
ブチリスの rib染色体座に移された。これは、クローン
化されたＤＮＡ挿入物の外側で切断する制限酵素により
プラスミドを直線状となし、この切断ＤＮＡでコンピテ
ントなB.サブチリス株1A382 又はPY79 (β^c 、 rib⁺)
細胞を形質転換しそしてCm^r を選択することにより行わ
れた。pRB322レプリコンはB.サブチリス内で複製できず
そして cat遺伝子は rib⁺ 座に相同の配列により両側で
結合されているので、 cat含有挿入又は欠失のみが二重
交叉組み換え事象により染色体に挿入することができ、
Cm^r 形質転換体を生成する。挿入又は欠失がリボフラビ
ン合成を不活化したかどうかを判定するために、Cm^r コ
ロニーをリボフラビン (Rib 表現型) の存在下または非
存在下最少培地寒天プレート上での増殖を評価した。

【００８３】図26に概略が示されているように、標準的
操作により cat−含有制限フラグメントをpRF2のXbaI、
SstI及び BglIIに対する個々の制限部位に連結するか、
一対の BglII又はNcoI部位間に挿入 (2.０kb BglIIフラ
グメントまたは0.8kb NcoIフラグメントのいずれかを除
去する欠失を生ずる) するかまたは rib−特異的ＤＮＡ
プローブにハイブリッド形成する約1.８kb HindIIIフラ
グメントの１個の HaeIII 及び EcoRV部位に挿入した。
その結果を、表IIIに示す。

【００８４】

【表３】 表 III rib⁺ ＤＮＡの挿入または欠失誘導体の特性決定 B. サブチリス ^b 挿入誘導体 ^a リボフラビン表現型 Ａ (XbaI) r + l ND Ｂ (SstI_L ) r + l ND Ｃ (SstI_R ) r -- l -- Ｄ(BglII_L ) r -- l -- Ｅ (SalI) r -- l -- Ｆ(BglII_R ) r -- l -- Ｇ (HaeIII) r ND l + Ｈ (EcoRV) r + l ND 欠失誘導体 Bgl r -- l -- Nco r + l + ａ "r" (右) 及び "l" (左) は、図26の制限地図に対する挿入 cat遺伝子の転写 方向を示す。 ｂ B.サブチリス株1A382 (rib⁺ 、trpC２、pur-60、his H2) またはPY79 (SPβ ^C 、 rib⁺ )

【００８５】図26及び表III 中に要約されているよう
に、SalI、どちらかのBglII 、又は"最も右" SstI (Sst
I_R ) 部位への挿入、又は2.０kb BglIIフラグメントの
欠失のすべてによりリボフラビンを生産できないCm^r コ
ロニー(Rib^- ) が生成し、このことは ribオペロンがク
ローン化ＤＮＡ内の中心に位置していることを示す。重
要なことは、0.８kb NcoI フラグメントの除去は明らか
にリボフラビン生産 (Rib^- ) に何らの影響も及ぼさ
ず、このことは rib遺伝子クラスターの一方の末端が
"最も左の" NcoI (NcoI_L ) 部位の左に存在することを
示唆している。 ribオペロンの他の末端は当初約1.8kb
HindIII フラグメント内にあると判定された、というの
はフラグメント内の２つの部位EcoRV およびHaeIIIでの
挿入、このフラグメントと離れた部位XbaIおよびSstI_L
での挿入すべてがリボフラビンを生産するCm^r コロニー
を生成したからである。

【００８６】実施例７ ribオペロンのヌクレオチド配列 クローン化10kbＤＮＡフラグメントの cat−挿入突然変
異誘発に基づいて、全ribオペロンをSstI_L 及びNcoI_L
部位が境界にある6.０kb領域内に位置が決定した。rib
オペロンおよび側面領域を含有するpRF2の6.０kb領域を
Sangerらのジデオキシ法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74:5463, 1977) により配列決定した。手短にいえば、
特異的な制限フラグメントを M13にサブクローンする
か、一連の重複欠失を起こさせるためにＴ4 ＤＮＡポリ
メラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を用いるか (Dale
ら、Plasmid 13:31, 1985)、又は音波処理された制限フ
ラグメントからの無作為フラグメントを M13中に "ショ
ット−ガン" クローン化することにより、配列決定のた
めの M13クローンを調製した。いくつかの場合には、隣
接フラグメントの制限部位接合部を横断するヌクレオチ
ド配列もプライマーエクステンション配列決定法により
決定された。約5500bpを両ストランドで配列決定し、グ
ラム陽性細菌リボソーム結合部位、グラム陽性プロモー
ター及び rho−非依存性転写終止部位を有する典型的な
読みとり枠に似た配列が分析された。

【００８７】この分析により、６個の完全な非重複読み
とり枠が示された (図３〜21): ORF2 (124アミノ酸) 、
リボフラビンシンターゼのβサブユニットをコードする
遺伝子(154アミノ酸), ORF3 (398アミノ酸), ORF4 (215
アミノ酸), ORF5 (361アミノ酸) 及び ORF6 (105アミノ
酸) 。各ORF6に先行して熱安定性計算値は△G ＝−16〜
−22kcal／モルの範囲内にある強いバチルスリボソーム
結合部位(RBS) が存在し、これらすべては同じ転写方向
に配向されていた。加えて、ORF5のコード領域内には第
２の RBS部位及び ATG開始コドンが確認され、恐らく 2
48アミノ酸の比較的小さいタンパク質をコードしてい
る。しかしながら、インビトロS-30共役転写／翻訳反応
(下記参照) に基づけば、ORF5はわずかに 361個アミノ
酸タンパク質をコードしていると思われる。終りに、タ
ンパク質の最後の 170個のアミノ酸をコードしており、
反対方向に配向しているもう一つのコード領域ORF1の一
部分も確認された。以下の観察に基づけば、バチルス中
にリボフラビン生合成は５個の遺伝子を含有する単一の
オペロンにより制御される。５個の遺伝子とはβ−リボ
フラビンシンターゼ遺伝子、ORF2、ORF3、ORF4及びORF5
でありこのうちの少なくとも４個すなわちβ−リボフラ
ビンシンターゼ遺伝子、ORF3、ORF4及びORF5は明白に生
合成酵素をコードしており、残りの１コードすなわちOR
F2は恐らく生合成酵素をコードしている。

【００８８】１. ORF3、ORF4及びORF5は制限酵素部位と
重なっており、これら部位への cat含有制限フラグメン
トの挿入によりB.サブチリスにおけるリボフラビン生産
が不活化される (図22及び図26) 。 ２. ORF1は制限酵素部位と重なっており、そこでは cat
含有制限フラグメントの挿入により rib⁺ B.サブチリス
株中でのリボフラビンの生産の不活化が起こらず (表II
I 及び図26) 、または調節解除された RoF^r B.サブチリ
ス株RB52におけるリボフラビン生産の低下も起こらなか
った。 ３. ORF2も制限酵素部位EcoRV と重複しており、そこで
は cat含有制限フラグメントの挿入によって rib⁺ B.サ
ブチリス株中におけるリボフラビン生産の不活化が起こ
らなかった (表III 及び図26) 。しかしながらかかる挿
入により、調節解除された RoF^r B.サブチリス株RB52中
におけるリボフラビン生産を検出しうる程度に減少さ
せ、これは突然変異したORF2遺伝子産物がリボフラビン
生産部分的に不活化したことを示している。

【００８９】４. rho−非依存性転写終止部位を示す幹
ループ構造を形成しうる２個のＤＮＡ配列がORF1とORF2
の間、及びORF5とORF6の間のシストロン間ギャップ内で
確認された (図22及び図27) 。ORF5とORF6との間の構造
を除去するとリボフラビンの発現が高まる。この構造は
lacZ−融合構築物にリボフラビン感受性を付与する。従
ってこれらはプロモーターの5'−末端上流でそれらが融
合した場合に相手である任意の他の遺伝子にかかる感受
性を付与するのに使用することができる。 ５. B.サブチリスＲＮＡポリメラーゼのσ^A (栄養型
(vegetative form)により認識されるプロモーターに似
たＤＮＡ配列 TTGCGT-(17bp)-TATAAT がRRF5から約290b
p 上流で、ORF5と同じ転写方向に配列していることが確
認された (図22)。このプロモーター ( P₁、1.１kb Bgl
II-NcoI 制限フラグメント上) をプロモーターのないE.
コリlacZ遺伝子 ( P₁-lacZ)に転写融合させると、プロ
モーターが表IVに示されるように、遺伝子と同じ転写方
向に配向している場合にのみ、rib⁺ B.サブチリス株(62
121) においてリボフラビンにより調節されたβ−ガラ
クトシダーゼ活性の発現、及び rib⁺ 、 RoF^r B.サブチ
リス株 (RB52) において高レベルの構成的 (非調節) β
−ガラクトシダーゼ活性の発現を示した。プライマーエ
クステンション分析により開始部位が確認された。転写
分析及びノーザン分析によれば4.２kbのポリシストロニ
ックＲＮＡが全 ribオペロンを包含することが示され
た。

【００９０】

【表４】 表 IV リボフラビンにより調節された P₁ -LacZ 転写融合体の発現 β−ガラクトシダーゼ比活性 (ミラー単位) ＋リボフラビン −リボフラビン 株 (組み込みプラスミド) (2 μg/ml) B.サブチリス 62121 (P₁ -lacZ ^a ) 1.3 4.2 B.サブチリス RB52 (P₁ -lacZ ^a ) 31 38 B.サブチリス 62121 (P₁ -lacZ ^b ) <0.1 <0.1 B.サブチリス 62121 <0.1 <0.1 ａ P₁ とlacZは同じ方向に配向されている。 ｂ P₁ とlacZは反対方向に配向されている。 これらの結果に基づけば、このσ^A プロモーター P₁ は
ORF5、ORF4、ORF3、β−リボフラビンシンターゼ遺伝子
及びORF2の転写にとって主要なプロモーターである。

【００９１】６. 第２のＤＮＡ配列 TTGAAG-(17bp)-TAC
TAT はB.サブチリスＲＮＡポリメラーゼのσ^A （栄養
型) により認識されるプロモーターに類似しており、こ
のものはORF4の3'−末端内で、ORF3から約295bp 上流に
おいてORF3と同一の転写方向に配向していることが確認
された (図22) 。0.7kb SalI-BglII制限フラグメント上
にこのプロモーター配列を含有するE.コリプラスミドを
キャンベル型組み換えによりB.サブチリス内に組み込む
と、B.サブチリス中におけるリボフラビン生産が不活化
されず、この結果はこの第２の配列(P₂ ) はプロモータ
ー活性を有しており従って (σ^A P₁ プロモーターに加
えて) ORF3、βサブユニットリボフラビンシンターゼ遺
伝子及びORF2の転写を実際に制御しうることを示してい
る。LacZ融合およびノーザン分析により、このプロモー
ターの存在が確認された。 ７. B.サブチリスＲＮＡポリメラーゼのσ^A （栄養型)
により認識されるプロモーターに恐らく類似している第
三のＤＮＡ配列 TTGAAT-(18bp)- TAAAAAがリボフラビン
シンターゼ遺伝子のβサブユニットとORF2の間のシスト
ロン間領域で、ORF2の約83bp上流で同じ転写方向に配向
して存在することが確認された (図22)。このσ^A プロ
モーター P₃ も P₁ および P₂ に加え、ORF2の転写を制
御しうる。

【００９２】８. クローン化ＤＮＡのS-30反応のインビ
トロ共役転写／翻訳分析によれば、ORF2、ORF3、ORF4お
よびORF5すべてがそれぞれの配列から予想される大きさ
のタンパク質を実際にコードしていることが確認され
た。 ９. リボフラビン生合成における５つの推定上の酵素的
工程のうちの３つが、予測されたアミノ酸配列又はその
産物の分子量を GenBank（登録商標）又は既知のタンパ
ク質寸法を使用して、公開されたタンパク質の配列と比
較することにより特定のコード領域に割り当てられた。 ａ. ORF2とORF3の間の読み取り枠によりコードされる推
定タンパク質はリボフラビンシンターゼ酵素のβ−サブ
ユニットの公開された 154個のアミノ酸配列 (Ludwig
ら、J.Biol. Chem. 262:1016, 1987) とほとんど同一で
あった。唯１個のアミノ酸の相異が認められた。グリシ
ンに変えてリジンが残基65で存在していた。この酵素は
５−アミノ−６−リビチルアミノ−2,４ (1H, 3H) −ピ
リミジンジオン−5'−ホスフェート (図１、それぞれ構
造５および４) 及び3,４−ジヒドロキシブタノン−４−
ホスフェートからの6,７−ジメチル−８−リビチルルマ
ジンの生成を触媒することが報告されている。

【００９３】ｂ. ORF5の推定産物と、E.コリのバクテリ
オファージ T₂ (Malayら、J.Biol. Chem. 258:8290, 19
83) によりコードされる 188個のアミノ酸タンパク質で
あるデオキシシチジレートデアミナーゼの間で、88アミ
ノ酸重複の39％の同一性が確認された。この結果に基づ
けば、ORF5は2,５−ジアミノ−６− (リボシルアミノ)
−４ (3H) −ピリミジノン−５−ホスフェートからの５
−アミノ−６− (リボシルアミノ) −2,４ (1H, 3H) −
ピリミジンジオン−5'−ホスフェートの形成を触媒する
rib特異的デアミナーゼをコードしている可能性が最も
大きい (図１、それぞれ構造３および２) 。 ｃ. ORF4遺伝子産物 (26,000Da) の予想された分子量は
リボフラビンシンターゼのα−サブユニットの分子量と
良く一致した (23,000Da: Bacherら、J.Biol. Chem. 25
5:632, 1980)。この結果に基づけば、ORF4は生合成経路
の最終工程：6,７−ジメチル−８−リビチルルマジンの
リボフラビン (図１、それぞれ構造５及び６) および５
−アミノ−６−リビチルアミノ2,４ (1H, 3H) −ピリミ
ジンジオンへの不均化を触媒するリボフラビンシンター
ゼα−サブユニットをコードする。

【００９４】10. リボフラビン合成における残りの酵素
工程は ORF類の位置をオペロン中のrib突然変異の物理
的地図に整列させることにより一時的にコード領域に割
り当てられた (Morozov ら、Mol. Genet. Mik. Viruso
l, no.7：42 (1984))。欠陥GTP シクロヒドロラーゼに
関する突然変異が0.５kb HindIIIフラグメントにマップ
されることが報告された。ORF3はこの制限フラグメント
を包含するので、我々はORF3が GTPからの2,５−ジアミ
ノ−６− (リボシルアミノ) −４ (3H) −ピリミジノン
−5'−ホスフェートの生産を触媒する酵素機能を少なく
とも部分的にコードすると結論した (図１、それぞれ構
造２及び１) 。加えて、 rib−特異的レダクターゼをコ
ードする生合成遺伝子は約1.８kb HindIIIフラグメント
内に完全に包まれることが報告された。このフラグメン
トはわずか２個の完全なコード領域すなわちリボフラビ
ンシンターゼ遺伝子のβ−サブユニット及びORF2しか含
有していないので、ORF2は５−アミノ−６− (リボシル
アミノ) −2,４ (1H, 3H)−ピリミジンジオン−5'−ホ
スフェートからの５−アミノ−６− (リビチルアミノ)
−2,４ (1H, 3H) −ピリミジオン−5'−ホスフェートの
生成を触媒するレダクターゼをコードすると推測する
(図１、構造４および３) 。加えて、類似の rho−非存
在性転写終止部位が推定σ^A P₁ プロモーターの下流で
かつオペロンの最初のコード領域ORF5のすぐ上流でオペ
ロンの見かけのリーダー領域中に見出された (図22及び
図27) 。この機能する可能性のあるターミネーター構造
は転写終止／抗転写メカニズムにより ribオペロンの調
節に関与しうる。加えてロゼオフラビン耐性(RoF^R ) 依
存性の調節領域がORF3の0.７kb SalI-BglII 制限フラグ
メント上に存在する。

【００９５】タンパク質産物への rib ORF類の割り当て rib特異的 ORF類がタンパク質をコードするか否かを確
認する１つの方法は、鋳型としてpRF2およびその種々の
誘導体を使用して、S-30インビトロ共役転写／翻訳反応
において、クローン化ＤＮＡから合成されたタンパク質
の寸法と数を「可視化する」ことである。S-30フラクシ
ョンキット (New England Nuclesr : 製造業者の説明書
に従って使用) が、その強力なリボソーム結合部位の存
在ゆえに特にB.サブチリス遺伝子を翻訳するのに効率的
である。鋳型としてpRF2又はpRF4のクローン化10kb Eco
RIフラグメントを使用して、５つの推定 rib−特異的タ
ンパク質すなわちβリボフラビンシンターゼ、14.7キロ
ダルトン (kd)(Ludwigら、J.Biol. Chem. 262:1016, 19
87) ; 及びORF2、13.6kd；ORF3、43.7kd；ORF4、23kd；
およびORF5、39.7kdからのタンパク質を検出できると予
測した。ORF6 (11.6kd) およびORF1 (少なくとも18.7k
d) によりコードされる少なくとも２個の他のタンパク
質、ならびに10kbクローン化ＤＮＡフラグメントの配列
未決定領域中に存在する遺伝子によりコードされる任意
の付加的なタンパク質が検出されることも予想した。さ
らに、 blaおよび cat抗生物質耐性遺伝子産物を含むベ
クター関連タンパク質も予想された (tet 遺伝子はS-30
反応においては強く発現されない) 。

【００９６】bla−および cat−特異的タンパク質 (そ
れぞれ32kdおよび18kd) 及び他のベクター関連タンパク
質を別にして、６個の主要な³⁵S-標識タンパク質全部が
検出され、これらはpRF2又はpRF4を用いるS-30反応の15
％−SDS ポリアクリルアミドゲルにおいて、47kd、44k
d、38kd、26kd、20kdおよび15kdの分子量を有してい
た。これらのタンパク質産物を相当する rib−特異的 O
RF類に割り当てるために、10kb EcoRIクローン化ＤＮＡ
の種々の利用しうる欠失誘導体、 cat−挿入誘導体およ
びサブクローン化フラグメントを使用してS-30反応を反
復した (図28) 。その結果を表Ｖに示す。

【００９７】

【表５】 表 Ｖ S-30反応で観察されるRIB-特異的タンパク質 47,000 44,000 26,000 15,000 ダルトン ダルトン ダルトン ダルトン プラスミド (ORF３) (ORF５) (ORF４) (ORF２) pRF2 ＋ ＋ ＋ ＋ pRF4 ＋ ＋ ＋ ＋ pRF21 − − ＋ − pRF5 − − − ＋ pRF29 − − − − pRF12 ＋ − ＋ ＋ pRF10 − − − − pRF38 − − − − pRF24/pRF20 − ＋ ＋ ＋ pRF23 ＋ − ＋ ＋

【００９８】これらの結果に基づき、タンパク質産物は
ORF3(47kd); ORF5(44kd); ORF4(26kd) ; およびORF2 (1
5ダルトン) に割当てられ、分子量は予測された寸法と
よく一致した。これら産物をORF2およびβ−リボフラビ
ンシンターゼ遺伝子に割り当てることはこれ以外の ORF
類に割当てることにより簡単ではなかった。pRF2のS-30
反応により、両方の遺伝子によりコードされるタンパク
質の予測される寸法に近接した15kdタンパク質が生成さ
れたので、最初はこのタンパク質バンドは実際には２種
のタンパク質種を含有するものと考えられた。しかしな
がら、プラスミドpRF38のORF2中に catを挿入するとこ
のタンパク質バンドが完全に除去され、はるかに小さい
６kdタンパク質で置き代わり、この寸法は先端が切られ
たORF2の予測寸法とよく一致している。これらの結果に
基づけば、前記15kdタンパク質はORF2によってのみ生成
されると思われる。なぜβ−リボフラビンシンターゼタ
ンパク質がS-30反応のゲルで可視化されないかは明らか
でない。しかしながら全体的に見れば、これらの結果に
より５個のrid特異的なコーディング領域すなわちORF
5、ORF4、ORF3、ORF2およびβリボフラビンシンターゼ
遺伝子の存在が確認された。さらに、ORF1は38kdタンパ
ク質をコードしていると思われるが、ORF6に関しては何
の産物も確認されなかった。

【００９９】ribオペロンの調節メカニズム B.サブチリスにおいては、遺伝子構成の反復パターンお
よび生合成経路の調節が幾人かの研究者により観察され
ている。B.サブチリスのトリプトファン生合成の経路の
ヌクレオチド配列 (Hennem等、 Gene 34:169, 1984) お
よび新たなプリンヌクレオチド経路 (EbboleおよびZalk
in, J.Biol. Chem. 262:8274, 1987) の両方共、生合成
オペロンに連結していない遺伝子によりコードされうる
リプレッサータンパク質を含む新規転写終止／抗転写終
止メカニズムによりポリシストロンメッセージとして転
写され少なくとも部分的に調節される房状の、重複する
遺伝子を含有する (ZalkinおよびEbbole, J.Biol. Che
m. 263:1595, 1988) 。rib生合成遺伝子ならびに調節遺
伝子の構成はB.サブチリス trpおよび pur経路のそれと
非常に類似していることを見出したので、 ribオペロン
が少なくとも部分的には同様の様式で調節される可能性
があると推定した。

【０１００】簡単に言えば、転写終止／抗転写終止モデ
ルの中心的特徴には下記のことが包含される(Shimotsu
等、J.Bacteriol. 166:461, 1986) 、すなわち、（ｉ）
オペロンの第１番目の遺伝子に先行する長いリーダー配
列の存在； (ii) 一方の構造が rho−非依存性転写ター
ミネーターとして作用しそして他方が「抗ターミネータ
ー」(rho−非依存性転写ターミネーター形成阻止) とし
て作用する相互に排他的なＲＮＡ幹ループを形成しうる
ポテンシャルを有する２またはそれ以上の重複２回回転
軸対称の、ＲＮＡリーダー中における存在；(iii) 経路
の最終産物により活性化されたリプレッサータンパク質
が、抑制条件下に、新生ｍＲＮＡに抗ターミネーターの
形成を阻止する部位で結合し、かくして転写を終止させ
るターミネーターが形成されること； (iv) 抑制解除的
条件下では、不活性化されたリプレッサーの結合が予め
排除されて、抗ターミネーターの形成を来し、オペロン
のコード領域に至る読み通し転写を惹起する。

【０１０１】上記に論議したとおり、 ribオペロンの最
も転写開始のありそうな部位はオペロン中の第１番目の
遺伝子から約290bp 上流に位置するσ^A プロモーター P
₁ である。ＲＮＡリーダー配列を予め分析すると、この
ものは転写終止／抗転写終止モデルによる調節に必要な
構造部分の全部でなくとも大部分を含有することが示さ
れた。この領域内には、幹ループ構造に続く rho非依存
性転写ターミネーターに似たチミジンの糸がORF5の約50
bp上流に確認された。この配列は△G-26kcal／モルでヘ
アピンを形成する能力がある (図27) 。さらに加えて、
−13〜−16kcal／モルの範囲の△G を有するいくつかの
幹ループ構造の可能性のあるものが抗ターミネーター配
列としての適性を有しうる rib 5' リーダー内に存在し
ていた。

【０１０２】オペロン中の第１番目の遺伝子から通常上
流にある転写開始の最初の部位に加え、いくつかの生合
成経路中にオペロンの内部領域に位置する二次的なプロ
モーター部位が存在する。 rib遺伝子座内に第２のプロ
モーター部位が存在する可能性は先の ribオペロンのR-
ループヘテロ２重鎖研究によっても示唆されており (Os
ina 等、FEBS Letters196:75-78, 1986)、この研究では
ｍＲＮＡ合成開始にとって２またはそれ以上の部位が示
されている。 ribオペロンのシストロン間のギャップを
先に分析したがかかる二次的プロモーター部位は検出さ
れなかった。しかしながら、この分析をオペロン内の全
配列に拡大したら、SalI制限部位のすぐ下流で、ORF4の
3'末端内にもう一つのつσ^A プロモーター P₂ が確認さ
れた (図22参照) 。すなわちORF2、ORF3、およびリボフ
ラビンシンターゼのためのβ−サブユニットの発現もこ
の第２のプロモーターの制御下にある可能性がある。そ
の上、ありうる第３のσ^A プロモーター P₃ がORF2のす
ぐ上流で確認された。それゆえORF2はまた恐らくこの付
加的なプロモーターの制御下にもある。5.5kb B.サブチ
リス rib特異的領域のＤＮＡ配列の上にある推定コード
領域、プロモーターおよび転写終止部位の位置を表VIに
示す。

【０１０３】

【表６】 表 VI B.サブチリス ribオペロンのコード領域、 プロモーター、および転写終止部位 bp 番号 ^a コード領域 ORF 6 364-678 ORF 5 1101-2183 ORF 4 2197-2841 ORF 3 2859-4052 β−リボフラビン シンターゼ遺伝子 4088-4549 ORF 2 4665-5036 ORF 1 5567-5057 ^b σ^A プロモーター P₁ 771-799 P₂ 2528-2556 P₃ 4545-4574 rho-非依存性 5'プロモーターの上流 708-748 転写終止部位 5'リーダー RNA内 1034-1067 rib オペロンの3'末端 5038-5090 a 図３〜21参照 b コード領域が反対方向に配向

【０１０４】実施例８ 改変されたribオペロンを含有するベクターの作製 ヌクレオチド配列における調節領域および読み取り枠を
初めて明解に記述するものである上記B.サブチリスの r
ibオペロンに関する機能的分析により、リボフラビン産
生の収率を増大させるのに有用な新ベクターを作製でき
る。リボフラビン生合成に要する特定の遺伝子の位置に
関する知見、転写制御領域の位置に関する知見、および
これら遺伝子中における他の関連領域 (例えばＲＢＳ)
により、作製すべきかかる領域を変えることができる。
かかる操作の数例を以下に掲げる。

【０１０５】比較的小さなＤＮＡフラグメント上に rib
オペロンを含有する組み込みプラスミドの作製 リボフラビン過剰生産性菌株RB50::［pRF8］の作製に用
いられる組み込みベクターは ribオペロンを含む10kb E
coRIフラグメントを含有する。 ribオペロンは６kb未満
のＤＮＡしか占めないと考えられるので、より小さいＤ
ＮＡフラグメント上に ribオペロンを含有する新組み込
みベクターを作製した (pRF40)。このクローンの寸法が
より小さいので rib遺伝子をより大きく増幅でき、リボ
フラビンの収率がより高くなる。

【０１０６】図30について言及すると、pRF2の0.8kb Nc
oIフラグメントが cat遺伝子で置換されたプラスミドpR
F36 からpRF40 を作製した。この ribオペロンは6.5kb
XbaI-EcoRIフラグメント上に含有されている。このフラ
グメントを単離しそしてXbaIおよび EcoRIで消化された
pUC19(Yanisch-Perron等、 Gene 33, 103, 1985; NewEn
gland Biolabs, Boston, MA, USA およびBethesda Rese
arch Laboratories,Maryland, USA から入手しうる) に
連結した。この連結されたＤＮＡを DH5αE.コリ中に形
質転換しそして40μg/ml X-galおよび50μg/mlのアンピ
シリンを含有するＬＢプレートにまいた。白色コロニー
から調製されたミニ調製ＤＮＡを分析すると pRF39が前
記6.5kb XbaI-EcoRIフラグメントを含有することが示さ
れた。pRF39をEcoRI で消化し、 CIAPで処理し、次に c
at遺伝子を含有する1.６kbEcoRIフラグメントに連結し
た。この連結されたＤＮＡを次に DH5αE.コリに形質転
換し、ＬＢ＋10μg/mlクロラムフェニコール上にプレー
トして適切なコロニーを選択した。２つのコロニーがク
ロラムフェニコール耐性であった。これらコロニーから
調製されたミニ調製ＤＮＡを分析すると cat遺伝子の存
在が確認された。これらプラスミドの一つがpRF40 であ
る (図32) 。

【０１０７】転写的に改変された ribオペロンを含有す
るプラスミドの作製 前記したとおり、リボフラビンオペロンのプロモーター
およびオペレーター領域を、リボフラビン生合成遺伝子
を構造的に発現させうるプロモーターで置換することが
有用である。次にかかる構築物を含有するプラスミドを
用いてリボフラビン生産レベルの高まった細菌菌株を生
成させることができる。少数例を以下に示すが本発明は
それらに限定されるものではない。図31に関して説明す
ると、リボフラビンプロモーターおよび調節領域を除去
してSPO1プロモーターで置き換えた。ORF3の初めにある
1130位の BglII部位を利用した。オリゴヌクレオチドを
合成し(RB5およびRB6 、図36参照) これらが BglII部位
の5'側にある1058位までのＤＮＡ配列 (ORF5の初めの数
個のアミノ酸およびＳＤ配列) を再生成した。オペロン
の5'−末端の再構成は任意の提案されたＤＮＡ調節構造
物 (図31) の前で停止した。それらの末端ではオリゴヌ
クレオチドはBamHI 、NsiI、およびEcoRI 制限部位を有
していて、それにより種々のプロモーターを ribオペロ
ンの5'側に置くことができる。 ribオペロン中に種々の
制限部位があるゆえにこの新プロモーターを有するオペ
ロンは以下のとおり数段階で作製する必要があった。

【０１０８】1.4kb SalI-BglIIフラグメントをpRF36(図
31) から単離した。このフラグメントを２個のオリゴヌ
クレオチドおよび EcoRI-SalI-消化 pUC19と連結した。
次にこの連結された混合物をE.コリDH５α細胞中に形質
転換しそして５μg/mlアンピシリンおよび40μg/ml X-g
alを含有するＬＢ上にプレートした。Ap^r 白色コロニー
からミニ調製物を調製した。所望の構造を有するプラス
ミドの一つがpRF46(図31) である。pRF46 をBamHI およ
びSalIで消化して1.４kbフラグメントを単離した。次に
このフラグメントpNH 202 の400bp EcoRI-BamHI フラグ
メント (SPO1-15 プロモーターを含有するpUC8およびPe
ro, J.Mol. Biol.,152:247-265, 1981) およびSalIおよ
びEcoRI 切断pUC19 と連結した。この連結されたＤＮＡ
を次に DH5αE.コリに形質転換し、これをＬＢ＋アンピ
シリン＋X-gal 上にプレートした。白色コロニーからミ
ニ調製物ＤＮＡを調製した。 pRF48が所望の構造を有し
ていた (図31) 。

【０１０９】pRF48 をEcoRI およびSalIで消化し、1.８
kbフラグメントを単離した。このフラグメントをpRF2か
らの4.0kb XbaI-SalI フラグメント (rib オペロンの残
分を含有) およびXbaI, EcoRI 切断pUC19 と連結した。
次にこの連結混合物をE.コリDH５α細胞中に形質転換し
てこれをＬＢ＋アンピシリン＋X-gal 上にプレートし
た。白色コロニーからミニ調製物ＤＮＡを調製した。 p
RF49が所望の構造を有しており、そしてこのプラスミド
を含有する培養物から得られる上清は黄色であってこの
ことはリボフラビンが産生されていることを示している
(図31) 。B.サブチリス中において選択できるようにす
るために cat遺伝子をpRF49 中に設置するには、そのプ
ラスミドをXbaIで消化しそしてpEcc４からの1.３kb cat
含有XbaIフラグメントに連結した。連結されたＤＮＡを
E.コリ DH5細胞中に形質転換した。数百個のAp^r コロニ
ーが生成し、これらコロニーをＬＢ＋10μg/mlクロラム
フェニコールを含有するプレートに貼付した。約10％の
コロニーがクロラムフェニコールプレート上で増殖し、
このことは cat遺伝子の存在を示している。cat含有プ
ラスミドの１つをpRF50 と呼ぶ (図32) 。

【０１１０】前記実施例はORF5の上流への新プロモータ
ーの設置を示す。さらにリボフラビン産生を増大させる
ためにはORF3をORF4の間の P₂ のあとにプロモーターを
設置することも有用であることを見出した。かかる構築
例を以下に示す。図32および図33で説明すれば、ORF3の
上流にSPO1-15 プロモーターの１コピーを設置するため
に ORF4-ORF3接合点に隣接した制限部位を用いた。2767
位のClaI部位はORF4の末端に位置しておりそして ribオ
ペロン中で特有である。ORF3の始点付近のもう一つの有
用な制限部位は2892位のDraI部位である。オリゴヌクレ
オチドを合成し、このものが前記DraI部位からORF3の開
始点を通る配列を再形成しそしてORF3の始点の前に特有
の BamHI部位を形成した (リンカーP2-AおよびP2-B、図
36) 。もう一組のオリゴヌクレオチドはClaI部位からOR
F4の末端を通る配列を再形成し、その位置に EcoRI部位
を形成した (リンカーP2-CIIおよびP2-DII、図36) 。次
に EcoRI-BamHIフラグメント上に位置する SPO1-15プロ
モーターを前記オリゴヌクレオチドにより形成された B
amHIおよび EcoRI部位の間に入れた。オペロン全体は次
のようにしてこの付加的な SPO1-15プロモーターと結合
させた。

【０１１１】図33で説明すれば、ORF4-ORF3 機能部分を
含有する750bp SalI-BglIIフラグメントをpIC20R中にサ
ブクローンした(Marsh等、Gene 32, 481-485, 1984) 。
生成するプラスミドpRF47 を次にDraIおよび BglIIで消
化して予測された270bp DraI-BglIIフラグメントを単離
した。このフラグメントおよびリンカーP2-AおよびP2-B
をSalIおよびBglII 切断pIC20Rに連結した。これらリン
カーによりORF3の5'末端の上流にBamHI およびSalI部位
が設置された。（このSalI部位は BglIIおよびBamHI 部
位が適合性でありかつ後程除去されるので便宜上選択さ
れた。) 連結物をE.コリ DH5α細胞中に形質転換した。
ＬＢ培地＋Amp およびX-gal にプレートすると白色コロ
ニーが生成した。pRF58 が所望の構造を有していた。 p
RF58からの 330bp BglII-SalI フラグメントを pRF58か
ら単離しそしてpRF36(図30) からの ribオペロンの3'末
端を含有する3.３kb BglII-XbaI フラグメントおよびXb
aIとSalIで切断した pUC19と連結した。この連結された
ＤＮＡを次にE.コリ DH5α細胞中に形質転換すると白色
コロニーが生成した。pRF62(図33) が所望の構造を有し
ていた。便宜上、3.6kb BamHI-XbaIフラグメントをpRF6
2 から単離して BamHI- 、XbaI- 切断 pUC19 (pRF64,
図33) にサブクローンした。今やこのプラスミドはORF3
に先行する遺伝子工学的に作製された BamHI部位を有す
る ribオペロンの3.6kb の3'−末端を含有していた。

【０１１２】最後の３個の読み取り枠を含有する ribオ
ペロンの3'−半分の前に SPO1-15プロモーターを設置す
るために、 pRF64をEcoRI およびBamHI で消化してこれ
を SPO1-15プロモーターを含有する400bp EcoRI-BamHI
フラグメントに連結した。この連結されたＤＮＡをE.コ
リ DH5細胞中に形質転換してミニ調製物ＤＮＡを調製し
た。 pRF65が所望の構造を有していた。次に SPO1-15プ
ロモーターを遺伝子操作してプロモーターの上流にClaI
部位を設置してORF4の末端を再構築した。SPO1-15 プロ
モーターを含有するpNH202からの EcoRI-BamHIフラグメ
ントをリンカーP2-CIIおよびP2-DII、およびBamHI とCl
aIで消化したpCI20Rと連結した。連結されたＤＮＡを次
にE.コリ DH5α細胞中に形質転換した。白色コロニーが
生成しそしてミニ調製物を分析するとpRF63 が所望の構
造を有することが示された。このpRF63 から470bp ClaI
-BamHIフラグメントを単離して、SPO1-15 プロモーター
および ribオペロンの5'末端を含有するpRF49からの２k
b EcoRI-ClaI フラグメントおよびSPO1プロモーターお
よびオペロンの3'末端を含有しEcoRI およびBamHI で消
化されたpRF64(図33) に連結した。この連結されたＤＮ
Ａを次にE.コリ DH5α細胞中に形質転換した。ミニ調製
物ＤＮＡを調製した。 pRF66が所望の構造を有してい
た。さらに、 pRF66を含有するE.コリはＬＢ培地＋アン
ピシリンプレート上で少量のリボフラビンを生成し、こ
のことによりオペロンがなお完全であることが確認され
た。

【０１１３】最後の段階は cat遺伝子を前記したpRF66
の特有のXbaI部位に連結することであった。生成するプ
ラスミドpRF69(図34) は cat遺伝子を ribオペロンと同
じ方向で含有していた。天然または野生型 rib P₁ プロ
モーターおよび rib P₂ のあとの SPO1-15プロモーター
を有する完全なオペロンを含有するプラスミドを作製す
るためには、 pRF64の6.３kb EcoRI-BamHIフラグメン
ト、pRF36 の2.75kb EcoRI-ClaI フラグメント、および
pRF63 の470bp ClaI-BamHIフラグメントを連結したE.コ
リ DH5α細胞中に形質転換した。Ap^r コロニーの約50％
が黄色であり、このことはリボフラビン産生を示してい
る。ミニ調製物ＤＮＡを黄色コロニーから調製するとpR
F68が所望の構造を有していた (図34) 。先に論議した
ように cat遺伝子をpRF68 のXbaI部位で加えてpRF71
(図34) を生成させた。このプラスミドは cat遺伝子をr
ib オペロンと同じ方向で含有していた。

【０１１４】本発明で有用なプラスミドを作製するもう
一つの例として、存在するＤＮＡ配列を予め除去するこ
となくリボフラビンオペロン内に１個またはそれ以上の
プロモーターを導入できる例を以下に示す。例として、
rib P₁ と推定 rho−非依存性転写終止部位の間に位置
する30bp非必須領域内に挿入された SPO1-15プロモータ
ー１コピー、 SPO1-15プロモーターのありうる転写妨害
を阻止するための不活性化された rib P₁ プロモータ
ー、活性な rib P₂ プロモーター、 rib生合成酵素をコ
ードする５個の構造遺伝子、およびリボフラビンオペロ
ンの末端から下流にある、約1.５kb側面ＤＮＡヌクレオ
チド配列、を含有する原型を改良したオペロンをpRF78
(図32) 中に構築した。

【０１１５】図32について言及すると、 ribオペロンの
プロモーター領域および側面の領域を含有するフラグメ
ントである、pRF2の1.7kb NcoI-PstI フラグメントをは
じめにE.コリバクテリオファージベクターM13(United S
tates Biochemical Catalog,60-61, 1987; New England
Biolabs, Massachusetts, USAから入手しうる) の誘導
体であるmp19中にサブクローンした。組換えファージの
一つであるM1.7を回収してプロモーター領域を標準的Ｄ
ＮＡ配列分析にかけると、 rib P₁ プロモーターの−10
領域にそのプロモーターを不活性化する可能性のある自
然発生的突然変異であるTAからCTへの変化が見出され
た。１本鎖ＤＮＡを調製して、 rib P₁ から上流にある
ＤＮＡと相同の付加的な配列により側面を挟まれた制限
酵素部位の組み合せ-EcoRI-SmaI-BamHI-を含有する合成
的に生成させた55bpＤＮＡオリゴマー (図35) にアニー
リングさせた。標準的な特定部位の突然変異誘発 (ＳＤ
Ｍ)プロトコールを用いて２本鎖ＤＮＡ分子を合成し
た。これらＤＮＡ分子をE.コリ宿主TG-1 (Amersham Cor
p.,Illinois, USA) 中にトランスフェクションにより導
入して組換えファージプラークを生成させた。標準的な
ＤＮＡ配列分析により測定すると１つの組換えファージ
が所望の改変されたＤＮＡ配列を含有することが判明し
た。

【０１１６】次にこの改変された ribプロモーター領域
を、 rib P₁ 領域および周囲配列から750bp 離れた一対
の特有のNsiI制限酵素部位を用いてオペロンのrib 構造
遺伝子中に再結合させた。ファージ組換え体の２本鎖Ｄ
ＮＡ分子を調製し、NsiIで消化し、 750bpフラグメント
を単離し、そしてこのフラグメントを pRF39△R1 (野生
型 ribオペロンを含有するpRF39 から導かれたプラスミ
ド、図30) の脱りん酸化8.7kb NsiIフラグメントに連結
した。この連結されたＤＮＡ分子を形質転換によりE.コ
リDH５α細胞に導入し、アンピシリン耐性を選択して所
望の組換えプラスミドpRF75 を含有するAp^r コロニーを
回収した。次にpRF75 をEcoRI とBamHI 酵素の組み合せ
を用いて消化し、切断ＤＮＡを精製400bp EcoRI-BamHI
SPO1-15 含有制限フラグメントに連結し、そして連結さ
れたＤＮＡをE.コリ DH5α細胞に形質転換により導入
し、アンピシリン耐性を選択することにより SPO1-15プ
ロモーターを rib P₁ の上流に挿入した。１つのAp^rコ
ロニーが所望の SPO1-15改変 ribオペロンを含有する組
換えプラスミドpRF77を含有することが判明した。次に
1.6kb XbaI制限フラグメント上のクロラムフェニコール
耐性遺伝子 catを特有のXbaI部位でpRF77 中に導入して
プラスミドpRF78(図32) を生成させた。

【０１１７】この原型オペロンをさらに前記したように
改変して活性 rib P₁ プロモーター、および／または r
ibコード領域ORF3およびORF4の間のシストロン間領域内
でrib P₂ から下流に導入されたSPO1-15 プロモーター
の第２のコピーを含有させた。例えば、野生型 rib P₁
プロモーターを含有する組換えファージを用いて前記と
同じ操作により、活性 rib P₁ プロモーターを有するpR
F78(図32) 中に改変ribオペロンの誘導体を含有するプ
ラスミドpRF88 を作製した。他の実施例においては、プ
ラスミドpRF78 およびpRF88 両者のＤＮＡの2.０kb Bgl
IIフラグメントをとり出してpRF66 の2.4kb BglII フラ
グメントに挿入してそれぞれプラスミドpRF81 およびpR
F89(図32) を生成させることにより、存在する改変 rib
オペロン含有プラスミドpRF78 およびpRF88 中に rib P
₂ の下流に位置するSPO1-15 プロモーターの第２のコピ
ーを挿入した。

【０１１８】Ade±RB50菌株の作製 発酵培地に添加すべき成分ができるだけ少ない細菌菌株
を用いるのが重要である。かかる菌株はリボフラビンを
生成させるための発酵がより安価である。この目的に、
改変された ribオペロンを増幅したものを含有するアデ
ニン復帰細胞を作製した。これら復帰細胞はpur-60の真
の復帰細胞ではなくむしろアデニン要求を抑制する他の
部位での突然変異を含有するものである可能性がある。
以下に論議するようにこれらは非復帰株より約25％多い
リボフラビンを産生する。かかる作製物の例を以下に記
載する。プラスミドpRF8、 pRF40、 pRF50、 pRF69、 p
RF71、 pRF78、 pRF81、pRF88および pRF89をそれぞれR
B50 (ａ ROF^r 調節解除されたB.サブチリス株中に形質
転換してクロラムフェニコール耐性 (Cm^r ) について選
択した。各菌株について耐性コロニーを選択した。細菌
を10μg/mlアデノシン含有RMM1ブロス中で増殖させそし
て培養物の試料を最少寒天プレートにまくことにより各
菌株の Ade⁺ 復帰細胞を単離した。各 Ade⁺ 菌株から１
コロニーずつ選択し、そして最高60μg/mlまでの漸増量
のクロラムフェニコールの存在下に増殖しうるコロニー
を選択することによりベクターＤＮＡを増幅させた。

【０１１９】第２部位組み込み 前記したとおり、B.サブチリス染色体中に作製された r
ibオペロンを増幅させることは高力価リボフラビンを得
るのに重要である。染色体内の ribオペロンのＤＮＡコ
ピー数がリボフラビン産生を限定しないように保証する
ことも重要である。 ribオペロンをさらに増幅させるに
は、 ribオペロンのコピーをB.サブチリス染色体中の１
個所をこえる部位に組み込み増幅させることにより達成
でき、リボフラビン収率をさらに増大させることができ
る。以下に第２の部位の組み込みを如何にして行うか例
示する。前記したベクターすべては ribオペロン部位で
の組み込みに cat遺伝子を利用している。 rib遺伝子を
第２の部位に挿入するには、その第２の部位で用いるた
めの異なる抗生物質耐性遺伝子を有することが好まし
い。例えば、B.サブチリスからのテトラサイクリン耐性
(tet) を用いることができ(PerkinsおよびYoungman, J.
Bacteriol., 155:607-615, 1983)、かかる tet遺伝子は
当業者にはよく知られており、かかる人物は容易に入手
しうる。このような構築物の一つ、例えばpRF78(図32)
は改変された ribオペロンバージョンを含有しており、
このプラスミドをXbaIで切断して tet遺伝子を含有する
2.4 XbaIフラグメントに連結できる。生成するプラスミ
ドはXbaI部位に tet遺伝子を含有しており、pRF85 と呼
ばれる。

【０１２０】全 ribオペロンが欠失しかつ第２の部位に
tet遺伝子が組み込まれている菌株はその部位での pRF
85の組み込みを行うのに必要である。かかる部位の一つ
は重要でない非必須細胞外プロテアーゼバチロペプチダ
ーゼＦをコードする bpr遺伝子である。 bpr遺伝子を含
有するE.コリプラスミドpKT2, (Sloma等、J.Bacterio
l.,172:1470-1477, 1990) をEcoRV で消化した。このEc
oRV 部位は bprのコード領域中にある。次にＤＮＡをブ
ラント末端化した tet遺伝子含有2.４kb EcoRIフラグメ
ントに連結した。生成するプラスミド(bprのEcoRV 部位
にtet 遺伝子を含有) をpKT2-tetと呼ぶ。このＤＮＡを
EcoRIを用いて直線状となし、次にリボフラビン合成に
関して調節解除された菌株であるRB52中に形質転換し
た。 trt^R コロニーが生成し、かかるコロニーの一つを
RB54と呼ぶ。 bprで組み込まれた tet遺伝子はpRF85 の
組み込みに関し相同配列として作用しよう。

【０１２１】pRF85のクローン化されたリボフラビンオ
ペロンをテトラサイクリン耐性遺伝子を含有する第２の
染色体部位で確実に挿入させるには、 pRF85に含有され
るものと等しい本来のリボフラビンオペロンならびに側
面ＤＮＡを含有する領域をインビトロ法によりRB54の染
色体から欠失させた。要約すれば、これはNcoIとXbaI制
限部位間のクローン化リボフラビンオペロンおよび側面
領域が除去され、代りにB.サブチリス中で発現されるク
ロラムフェニコール耐性遺伝子 catで置換されたE.コリ
組換えプラスミドをはじめに生成させることからなる。
次にこのプラスミドを用いて、直線化したプラスミド分
子でRB54を形質転換しクロラムフェニコール耐性 (C
m^r ) 細菌を選択することにより染色体リボフラビンオ
ペロンを欠失させた。野生型 rib遺伝子を cat遺伝子を
含有する欠失コピーで置き換える組換え事象 (マーカー
置換) によりCm^r 細菌が生成する。

【０１２２】詳細には、プラスミドpRF34(実施例６参
照) を用いて、インビトロ生成されたリボフラビンオペ
ロン欠失を有するE.コリプラスミドを生成させた。この
プラスミドは、リボフラビンオペロンが両側を２個の特
有のXbaI部位 (一方の部位は欠失された0.８kb NcoI フ
ラグメントの次の ribオペロンの5'末端の上流に位置し
そして第２の部位はそのオペロンの末端から約1.６kb下
流に位置する) により挟まれておりそして cat遺伝子が
この領域の外側に挿入されている pRF２から誘導され
る。pRF34 をXbaIで消化しそして切断ＤＮＡ分子を希Ｄ
ＮＡ濃度の下に連結することにより、リボフラビンオペ
ロンを含有する7.２kb領域が除去されそして実質的に c
at遺伝子により置換されている組換えプラスミドpRF82
が回収された。プラスミドpRF82 を制限酵素消化により
直線状となしそして切断ＤＮＡを用い、ＤＮＡ形質転
換、Cm^r 細菌の選択によりマーカー置換させて pRF54の
染色体リボフラビンオペロンを除去した。Cm^r コロニー
をリボフラビン栄養要求性に関して選択しそして Rib^-
Cm^r コロニーの一つRB55を回収してさらに調査した。

【０１２３】プラスミドpRF85を菌株RB55中に形質転換
してRib⁺ に関して選択した。Rib⁺形質転換体の一つを
選択してRB58と称した。この菌株はプラスミドおよび染
色体中の tet^r 遺伝子間の相同組換えにより bprで組み
込まれた ribオペロンを有する。RB58からの染色体ＤＮ
Ａを調製し、これを用いてRB50::［pRF69 ］を形質転換
し、 tet^r に関して選択することができる。そこでこれ
ら耐性コロニーは ribオペロンの部位および bprで組み
込まれた改変された ribオペロンを有していよう。 rib
で組み込まれた ribオペロンは前記したように漸増量の
クロラムフェニコールの存在下で増殖するコロニーを選
択することにより増幅されようし、またribオペロンの
第２のコピーは漸増量のテトラサイクリン上で増殖する
コロニーを選択することにより増幅されよう。

【０１２４】実施例９ 発酵によるリボフラビンの生産 リボフラビン過剰生産性菌株の評価は炭素供給限定され
たバッチ発酵によりChemap 14Ｌ容器中で実施し、リボ
フラビン含量をHPLCにより測定した。リボフラビン合成
に関する遺伝子によりコードされる酵素が律速性である
ので、増幅された rib遺伝子は発酵器中にでなく接種用
の種に60μg/mlのクロラムフェニコールを含有されるこ
とにより高いコピー数に保持された。B.サブチリスRB5
0::［pRF69 ］の培養物を60μg/mlのクロラムフェニコ
ール(CAM) を含有するトリプトース血液寒天ベース (Tr
yptose Blood Agar Base (TBAB Difco))中で増殖させ
た。コロニーは60μg/mlの CAMを含有するリボフラビン
最少培地 (RMM:グルタミン酸ナトリウム2.0g/l、カザミ
ノ酸(Difco) 0.2g/l、酵母エキス(Difco) 0.2g/l, KH₂P
O₄ 6.0g/l, K₂HPO₄ 14.0g/l, (NH₄)₂ SO₄ 2.0 g/l, ク
エン酸ナトリウム1.0g/l, MgSO₄・7H₂O 0.2g/l, アデノ
シン 0.05g/l, グルコース15.0g/l 含有、pH 7.0) 25ml
を含有する 300mlバッフルフラスコに移した。接種され
たフラスコを250rpmおよび37℃で振盪することによりイ
ンキュベートした。８時間後、滅菌グリセリンを最終濃
度15％となるまで加えそして１mlずつ−80℃で貯蔵し
た。

【０１２５】発酵を開始させるためにはRB50::［pRF6
9］の凍結バイアルを37℃で解凍しそして60μg/mlの CA
Mを有するRMM 25mlを含有する 300mlバッフルフラスコ
に移して250rpmおよび37℃で振盪した。８時間後、増殖
中の培養物６mlを用いて２Ｌトランスファーフラスコ中
の発酵培地（下記表VII 参照)300mlを接種した。このフ
ラスコは15％グルコースおよび30％マルトースの混合物
90mlを添加した発酵培地 300mlを含有した。クロラムフ
ェニコールを最終濃度60μg/mlとなるまで加えた。２直
径軌道を有する振盪器上37℃で200rpmで12時間インキュ
ベーションしたのち、かかるフラスコの内容物を14Ｌ発
酵容器中の発酵培地７Ｌに移した。発酵期間中はブロス
をpHおよび溶解酸素 (DO₂ ) につき連続的に監視した。
排ガスを四極 (quadrapole) マススペクトル測定により
連続的に分析して二酸化炭素の発生 (CER)および酸素の
とり込み速度を記録した。

【０１２６】幾通りかの発酵を比較すると制御系の再現
性が示される。当初の炭水化物は増殖４時間後にRB50::
［pRF8］₆₀を含有する発酵物から消費されつくしてpH上
昇および CER低下を来した。この時点で、炭水化物の供
給を開始しそしてDO₂ が６時間で限界となるまで対数増
殖が再開された。炭水化物の供給速度をコンピューター
制御して残る発酵期間全体を通してDO₂ を10〜20％飽和
に維持した。発酵器中の過剰の炭水化物は酸素涸枯およ
びリボフラビン産生低下を招来する。酸素トランスファ
ーの限定により対数増殖の持続時間、最終的な細胞密度
およびリボフラビン生成速度が決定される。酸素トラン
スファー速度を高めるためには、Chemap発酵器をヘッド
圧0.６気圧で1000rpm で操作した。培地炭水化物供給物
に酵母エキスを補添すると補添なしの培地に比較してリ
ボフラビン産生が高まった（図29、白角：RBF-14、表VI
I)。しかしながらその価格が高いので、より安価な無機
成分で置きかえることにより酵母エキスの量を系統的に
減少させた。pH制御における水酸化ナトリウムに代えて
水酸化アンモニウムを用いると供給物中の酵母エキスを
減少でき、細胞マスおよびリボフラビン力価の両方が増
大した（図29、黒角、RBF-22、表VII)。発酵時間も低下
した。さらに、他の発酵においては酵母エキスを供給物
から完全に排除してアンモニウム塩と燐酸塩の組み合せ
物により置き代えるとさらにリボフラビン生成が高まり
かつ工程時間が短縮された（図29、白丸、RBF-23、表VI
I)。

【０１２７】もとのRB50::［pRF8］₆₀はそのpur-60突然
変異ゆえにアデニン要求性である。リボフラビン前駆体
IMP(図２）を生成する経路に関与する早期の生合成酵素
の阻害を最小限に抑えるために、その菌株が要求するア
デノシンの最低量を測定する実験を行うと、RB50::［pR
F8］₆₀（および一般に、それらの染色体内に増幅された
rib オペロンを有するRB50株）はそのアデノシン要求が
不安定であることが判明し、そして原栄養性復帰細胞(A
de⁺ ) がかなり高頻度で生成された。振盪フラスコで
は、 Ade⁺ 復帰細胞は少くともRB50::［pRF8］₆₀親と同
じ程度に増殖しそしてリボフラビンを生成すると思われ
る。発酵器中で評価すると、復帰細胞RB50::［pRF8］₆₀
(Ade⁺ ) は培地処方にアデノシンを必要としなかった。
より重要なことは、この復帰細胞はその親株より速かに
増殖して25％多いリボフラビンをより短い時間で生成し
た。 5.4g/l リボフラビン力価が49時間で生成された
（図29、黒丸：RBF-29: 表VII)。その上、付加的な発酵
においてはHy Soy Tが当初充填物または培地から除去さ
れてコーンスティープリカーで置き代えると、48時間内
のリボフラビン生成がさらに6.3g/lまで増大した（RBF-
42、表VII)。

【０１２８】これらの発酵条件においては、遺伝子操作
により作製されたリボフラビンオペロンＤＮＡを含有す
る細菌菌株を用いることにより、さらにそれ以上のリボ
フラビン産生の有意な増大が例証された。6.5kb EcoRI-
XbaI制限フラグメント上の野生型リボフラビンオペロン
を含有する菌株RB50::［pRF40 ］₆₀(Ade⁺ ) は48時間で
7.4g/l のリボフラビンを生成した。さらに、 rib P₁
プロモーターおよび調節領域が構造性の SPO1-15プロモ
ーターで置き換えられている転写的に改変されたrib オ
ペロンを含有する菌株RB50::［pRF50 ］₆₀(Ade⁺ ) は48
時間で9.０g/lのリボフラビンを生成した。これらの結
果は調節領域の除去によるかおよび／またはより強力で
構造性の外因性プロモーターの導入によってリボフラビ
ンオペロンを改変させるとリボフラビン力価が高められ
ることを示している。

【０１２９】

【表７】

【０１３０】種々の発酵におけるリボフラビン産生の力
学をLuedeking-Piret モデルを用いて分析した。すべて
の場合に、特異的な生産性は指数増殖期の終りから発酵
の終りまで低下した。また、リボフラビン生産は用いら
れた発酵条件下で増殖と関連していることは明白であっ
た。リボフラビンの収率は発酵成分および条件を変化さ
せることにより増大させうることを見出した。リボフラ
ビンの収率は表VIIIに示される発酵成分および条件を用
いることにより前記した条件に比較して増大させること
ができる。

【０１３１】

【表８】表 VIII当初バッチ (g/l) 酵母エキス 20 グルコース 25 KH₂PO₄ 7.5 MgCl₂・H₂O 1.5 CaCl₂・2H₂O 1.0 MnSO₄ 0.05 FeCl₃・6H₂O 0.025 Mazu DF37C 2.5 コーン浸出液 10 グルタミン酸ナトリウム 5供給培地（全使用量３Ｌ） グルコース 583.3 クエン酸ナトリウム 6.67 KH₂PO₄ 15 コハク酸 1.67 MgSO₄・7H₂O 1.67

【０１３２】要約すれば、かかる発酵の一つにおいては
出発物質はバッチ培地6.65Ｌおよび細菌 (RB50::［pRF5
0 ］₆₀Ade⁺ ) 接種物0.35Ｌである。酸素レベルはChema
pポーラログラフィー溶解酸素電極を用いて監視する。
溶解酸素レベルは供給培地をコンピューター調節により
添加して15％±５％に維持する。添加された全供給量は
48〜56時間で約3.０Ｌである。発酵pHは6.５±0.１ (1N
H₂SO₄ およびNH₃ ガス使用) に維持され、発酵器圧力
は0.６バールに、そして空気流は毎分10.5Ｌに維持され
る。これらの条件下においてRB50::［pRF50 ］₆₀(Ade
⁺ )株は48時間で11.0g/l のリボフラビンを生成し、こ
のことは先の発酵条件に比較して約20％の生産改善を示
す。終りに、１個は rib P₁ および調節配列に置き代る
もの、そして第２のものはORF3およびORF4の間に挿入さ
れたものである２個のSPOI-15 プロモーターを含有す
る。転写的に改変された リボフラビンオペロンを含有
する細菌菌株RB50::［pRF69 ］₆₀(Ade⁺ )を用いるとさ
らにリボフラビン生産が増大することが示された。この
菌株は48時間で13.0〜14.0g/l そして56時間で15g/l の
リボフラビンを生成し、このことは２個の強力な外国性
プロモーターを用いるリボフラビンオペロンの転写増大
によりリボフラビン生産レベルが高まることを示してい
る。

【０１３３】微生物の寄託 プラスミドpRF69 はブタペスト条約に基づき、1990年６
月６日付でアメリカンタイプ カルチャー コレクショ
ンに寄託された受託番号ATCC 68338を交付された。プラ
スミドpRF50 を含むE.coli株 DH5はブタペスト条約に基
づき、1990年５月30日付でアメリカン タイプ カルチ
ャー コレクションに寄託され受託番号ATCC 68332が交
付された。プラスミドpRF78 を含むE.coli株 DH5アルフ
ァーはAmerican Type CultureCollection（アメリカン
タイプ カルチャー コレクション）にブタペスト条
約に基づき1990年５月30日付で寄託された受託番号ATCC
68333を交付された。又、B.サブチリス株RB58も同様に
アメリカン タイプ カルチャー コレクションにブタ
ペスト条約に基づき1990年５月30日付で寄託され受託番
号ATCC 55053を交付された。B.サブチリス株RB50は1989
年５月23日に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に
関するプタペスト条約の下に The Agricultural Resear
ch Culture Collection(NRRL), Peoria, Illinois に19
89年５月23日に寄託され受託番号B18502を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】リボフラビン生合成経路を示す図である。

【図２】プリン生合成経路を示す図である。

【図３】バチルス・サブチリス ribオペロンの5'末端の
ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図であ
る。

【図４】図３に続くバチルス・サブチリス ribオペロン
のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図で
ある。

【図５】図４に続くバチルス・サブチリス ribオペロン
のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図で
ある。

【図６】図５に続くバチルス・サブチリス ribオペロン
のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図で
ある。

【図７】図６に続くバチルス・サブチリス ribオペロン
のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図で
ある。

【図８】図７に続くバチルス・サブチリス ribオペロン
のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図で
ある。

【図９】図８に続くバチルス・サブチリス ribオペロン
のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図で
ある。

【図１０】図９に続くバチルス・サブチリス ribオペロ
ンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図
である。

【図１１】図１０に続くバチルス・サブチリス ribオペ
ロンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図１２】図１１に続くバチルス・サブチリス ribオペ
ロンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図１３】図１２に続くバチルス・サブチリス ribオペ
ロンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図１４】図１３に続くバチルス・サブチリス ribオペ
ロンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図１５】図１４に続くバチルス・サブチリス ribオペ
ロンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図１６】図１５に続くバチルス・サブチリス ribオペ
ロンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図１７】図１６に続くバチルス・サブチリス ribオペ
ロンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図１８】図１７に続くバチルス・サブチリス ribオペ
ロンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図１９】図１８に続くバチルス・サブチリス ribオペ
ロンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図２０】図１９に続くバチルス・サブチリス ribオペ
ロンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図２１】図２０に続くバチルス・サブチリス ribオペ
ロンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す
図である。

【図２２】rib遺伝子クラスターの構造を示す模式図で
ある。

【図２３】バチルス・サブチリスRB50の菌株由来を示す
図である。

【図２４】ribオペロン含有組換えプラスミドpRF1、pRF
2、pRF3、pRF6およびpRF7の作製を示す模式図である。

【図２５】バチルス・サブチリスRB53::［pRF8］₉₀の菌
株由来を示す図である。

【図２６】挿入および欠失を用いたリボフラビン生合成
に必須な領域を含むＤＮＡフラグメントの同定を示す図
である。

【図２７】rho−非依存性転写終止部位のヘアピンルー
プ構造を示す図である。

【図２８】S-30インビトロ共役転写／翻訳反応に用いら
れる様々なプラスミド誘導体の構造を示す図である。

【図２９】リボフラビン生産曲線の比較を示す図であ
る。

【図３０】pRF40 の作製を示す模式図である。

【図３１】pRF50 の作製を示す模式図である。

【図３２】種々のベクターの構造を示す模式図である。

【図３３】種々のベクターの構造を示す模式図である。

【図３４】種々のベクターの構造を示す模式図である。

【図３５】プラスミド作製に使用される55-mer体を示す
図である。

【図３６】ベクター作製に用いられる様々のオリゴヌク
レオチドを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 スロマ アラン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02172， ウォータータウン，ジェームス ストリート 20

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １以上のリボフラビン生合成タンパク質
   をコードし、かつ遺伝性であって細菌による発現が可能
   な核酸配列の少なくとも１コピーを、組換え細菌による
   リボフラビン生合成がこの核酸配列を有しない細菌に比
   較して増加するような様式で染色体内の１以上の部位に
   外因的に導入されて含有する組換え細菌。