JPH1068657A - レーザ走査型顕微鏡及び測光装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】入射光量に応じた電気信号を出力する回路の感
度、増幅率、オフセット量などの測定パラメータを設定
すること無く、好適なコントラストと広いダイナミック
レンジの画像が得られるレーザ走査型顕微鏡を提供する
こと。 【解決手段】試料９からの信号光を電気信号に変換する
光電変換手段２０と、前記光電変換手段２０の信号光に
対する感度又は電気信号に対する増幅率を設定する感度
調整手段２３と、前記光電変換手段２０の出力信号が予
め設定された基準値に近付くように前記感度調整手段２
３を制御する感度制御手段２２とを備え、光電変換手段
２０に設定された感度又は増幅率を前記濃淡情報に相当
する測定値に変換して使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、点光源であるレー
ザビームで試料を２次元走査して得られた濃淡情報から
試料画像を形成するレーザ走査型顕微鏡及びレーザ走査
型顕微鏡の光電変換部に使用できる測光装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】レーザ走査型顕微鏡は、点光源であるレ
ーザビームを対物レンズを介して試料のＸ軸及びＹ軸方
向に走査しながら照射し、試料からの透過光、反射光又
は蛍光を再び対物レンズ、光学系を介して検出器で検出
して二次元像の濃淡情報を得るようにしたものである。
この濃度情報の２次元分布をＸ−Ｙ走査位置に対応させ
てＣＲＴディスプレイ等の表示装置に輝点の分布として
表示することで画像化する。検出光学系の試料と共役な
位置に照明光または被測定光の回折限界以下の径を持つ
絞りを設けることにより、焦点の合っている面の情報の
みを検出する共焦点光学系を備えた共焦点レーザ走査型
顕微鏡もレーザ走査型顕微鏡に含まれる。レーザ走査型
顕微鏡の検出系は典型的には次のように構成されてい
る。すなわち、試料からの透過光、反射光及び又は蛍光
を電気信号に光電変換する検出器に、フォトダイオード
や光電子増倍管等を用いて適当な感度を当該検出器に設
定する。検出器から光量の強弱に応じて出力される出力
電圧（電流）信号を増幅回路に導いて増幅する。

【０００３】増幅回路の出力信号には、背景光や電気的
なオフセットなどの像の位置によらず常に一定の値とな
るオフセット成分と、試料の分布に応じて変化する信号
成分とが含まれる。このうち、像の位置によらず一定の
値となる信号成分は測定のダイナミックレンジを狭める
要因になるため、オフセット減算回路により取り除いて
いる。そして、試料の分布に応じて変化する信号成分を
取り出した電圧信号をＡ／Ｄ変換回路でデジタルデータ
に変換し、メモリに保存する。

【０００４】このようにして得られたデータは、画像の
濃淡が検出器からの出力信号の強弱すなわち検出された
光の強度を表し、その２次元分布が各点での光の強度を
表している。

【０００５】このようなレーザ走査型顕微鏡において、
好適なコントラストの画像を得るためには、検出器の感
度、増幅回路の増幅率、オフセット減算回路のオフセッ
ト量などの測定パラメータを適宜調整する必要がある。
この調整が適当でない場合、例えばオフセット量の設定
が不十分な場合はオフセット成分がＡ／Ｄ変換回路のダ
イナミックレンジの大半を占めてしまったり、逆に信号
成分までを減算してしまうといった不具合を生じる。

【０００６】また、光電変換器の感度又は増幅回路の増
幅率を過大に設定すると、信号がＡ／Ｄ変換回路のダイ
ナミックレンジを越えて飽和し、逆に過小に設定すると
の振幅が不十分で測定対象が像として観察できない等の
不具合を生じる。

【０００７】従来のレーザ走査型顕微鏡では、得られた
画像を目視しながら各測定パラメータの設定を順次調整
していく方法がとられていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、すべて
のパラメータを調整するのは多大な時間と、ある程度の
熟練を要する。例えば、試料からの蛍光を測定するよう
な場合には、測定パラメータの調整に時間が掛かってい
ると蛍光色素の褪色を招くなど測定対象にダメージを与
えたり、測定のスループットを低下させるなどの問題が
ある。

【０００９】なお、特開平5-336405号公報などにおい
て、各パラメータの設定を自動的に最適化する手法が提
案されている。しかしながら、同公開公報記載によれ
ば、適当な光電変換器の感度、増幅器の増幅率、オフセ
ット減算回路のオフセッ卜量であらかじめ測定対象とな
る試料を測定し、そのデータから最適なパラメータを算
出する手法を採っているため、ある程度の時間の短縮と
調整のばらつきは減少するものの、実際の測定までには
ある程度時間がかかり、試料に不要なダメージを与える
などの問題が依然として残されている。

【００１０】また、特願平6-303506号には、測定パラメ
ータをサンプリングクロックに同期して、つまり画像の
画素毎にダイナミックに変化させて、コントラスト強
調、補正などの効果を得られるようにした方法が提案さ
れている。しかしながら、この方法においても、各パラ
メータの値や適応位置等はあらかじめ設定しておく必要
があり、その設定値は一旦画像を測定しなければ最適値
を与えることができなかった。

【００１１】本発明は、以上のような実情に鑑みてなさ
れたもので、測定画像の画質に影響を及ぼす各種測定パ
ラメータの設定を行うことなく、好適なコントラスト
で、かつ広いダイナミックレンジの画像が得られるレー
ザ走査型顕微鏡及び測光装置を提供することを目的とす
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するために以下のような手段を講じた。

【００１３】本発明のレーザ走査型顕微鏡は、試料から
の信号光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記光
電変換手段の信号光に対する感度又は電気信号に対する
増幅率を設定する感度調整手段と、前記光電変換手段の
出力信号が予め設定された基準値に近付くように前記感
度調整手段を制御する感度制御手段とを備え、前記光電
変換手段に設定された感度又は増幅率を前記濃淡情報に
相当する測定値に変換して使用する。

【００１４】本発明によれば、光電変換手段の出力信号
が予め設定された基準値に近付くように前記感度調整手
段を制御することにより、信号光の光強度が高ければ光
電変換手段の感度又は増幅率が低くなるように制御さ
れ、信号光の光強度が小さければ感度又は増幅率が高く
なるように制御される。

【００１５】このように、光電変換手段の感度又は増幅
率が信号光の光強度に対応した情報を持つので、光電変
換手段に設定された感度又は増幅率を濃淡情報に相当す
る測定値として使用することにより、感度、増幅率、オ
フセット量などの測定パラメータを設定すること無く、
好適なコントラストと広いダイナミックレンジの画像が
得られることになる。

【００１６】本発明のレーザ走査型顕微鏡は、前記光電
変換手段からの出力信号と、前記光電変換手段の出力信
号を基準値に近付けるように制御したときの感度又は増
幅率とから、前記濃淡情報に相当する測定値を求める。

【００１７】本発明によれば、応答速度の速い出力信号
と、この出力信号を測定した際の感度又は増幅率とから
光量を算出することで、高速な被測定光の変動にも追従
できる測定を実現することができる。

【００１８】本発明の測光装置は、入射光を電気信号に
変換する光電変換手段と、前記光電変換手段の入射光に
対する感度又は電気信号に対する増幅率を設定する感度
調整手段と、前記光電変換手段の出力信号が予め設定さ
れた基準値に近付くように前記感度調整手段を制御する
感度制御手段と、前記光電変換手段の感度又は増幅率を
入射光強度の測定値に変換する演算手段とを具備する。

【００１９】本発明によれば、入射光が光電変換手段に
より電気信号に変換され、その出力が感度制御手段によ
りあらかじめ設定された基準値と比較され、その結果に
より光電変換手段の感度を動的に調整する。

【００２０】従って、光電変換手段は、入射光の光量に
対して常に適当な感度又は増幅率を与えられることにな
る。さらに前記感度制御手段の出力を測定値とすること
で光電変換手段からの出力に含まれるオフセット成分の
影響を排除し、かつ広いダイナミックレンジの測定を実
現することができる。

【００２１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。 （第１の実施の形態）図１は第１の実施の形態に係る共
焦点レーザ走査型顕微鏡の測光装置の構成図である。こ
の測光装置を図２に示す共焦点レーザ走査型顕微鏡に適
用した実施の形態について説明する。まず、共焦点レー
ザ走査型顕微鏡の構成から説明する。この共焦点レーザ
走査型顕微鏡は、レーザ発振器１を射出した照明光を、
ビームエキスパンダ２およびビームスプリッタ又はダイ
クロイックミラーなどの光路分割素子３で偏向してガル
バノメータスキャナなどを用いたＸ及びＹ方向スキャナ
４，５に入射し、Ｘ及びＹ方向スキャナ４，５で２次元
走査するように偏向する。Ｙ方向スキャナ５を射出した
照明光は、瞳投影レンズ６、結像レンズ７を介して対物
レンズ８に入射し、試料９を２次元走査する。

【００２２】試料９からの透過光はコレクタレンズ１
０、リレーレンズ１１を介して透過光検出用の測光回路
１２にて検出される。また、試料９からの反射光及び又
は蛍光は照明光と同じ光路をたどって光路分割素子３に
到達し、該光路分割素子３および共焦点光学系１４を透
過して測光回路１７，１８へ導かれる。

【００２３】次に、測光回路１２，１７，１８の構成に
ついて説明する。なお、３つの測光回路１２，１７，１
８は基本的に同じ構成を有しているので、以降の説明で
は特に区別しないものとする。

【００２４】この測光回路は、光電変換素子２０の出力
を増幅回路２１を通してフィードバック回路２２に入力
し、フィードバック回路２２で光電変換出力がリファレ
ンス信号３０と一致するように制御した感度設定信号を
生成して高圧電源２３に与える。高圧電源２３が感度設
定信号に応じて光電変換素子２０に印加する感度設定電
圧を分圧回路１９を介して取り出してＡ／Ｄ変換回路２
５でデジタル信号に変換する。このＡ／Ｄ変換回路２５
から出力されるデジタル信号値を測定値としてメモリ回
路２６に保存する。リファレンス信号３０は制御用ＣＰ
Ｕ２７からＤ／Ａ変換器２８へ入力したデジタル信号を
アナログ信号に変換することによって生成される。Ａ／
Ｄ変換回路２５でのサンプリングはサンプリングクロッ
ク回路２９から与えられるサンプリングクロックに同期
して行われ、メモリ回路２６から測定値を読み出して表
示手段３０に表示する。なお、光電変換素子２０は一般
的によく使用される光電子増倍管を使用している。光電
子増倍管は印加電圧によって感度を調節することができ
る。

【００２５】この測定回路では、試料９からの被測定光
は光電変換素子２０に入射し、その光量と光電変換素子
２０に設定されている感度に応じた電気信号に変換され
増幅回路２１へ出力される。増幅回路２１で増幅された
信号は、フィードバック回路２２に導かれリファレンス
信号３０と比較される。その結果が、感度設定用の高電
圧電源２３にフィードバックされる。すなわち、増幅回
路２１からの出力信号が常にＤ／Ａ変換回路２８からの
リファレンス信号３０と同等になるよう制御される。

【００２６】例えば、増幅回路２１の出力信号レベルが
リファレンス信号レベルより低い場合は、フィードバッ
ク回路２２は高電圧電源２３に対して現在より高い感度
に設定するような電圧設定信号を出力する。逆に、増幅
回路２１の出力信号レベルがリファレンス信号レベルよ
り高い場合は、フィードバック回路２２は高電圧電源２
３に対して感度を下げるような電圧設定信号を送出す
る。

【００２７】ここで、フィードバック制御の内容は、比
例、微分、積分などの制御を光電変換素子２０から高電
圧電源２３までの系の特性を考慮して選択する必要があ
る。リファレンス信号３０は、制御用ＣＰＵ２７がＤ／
Ａ変換回路２８に与えるデジタル値で決まることはすで
に説明した通りであるが、そのデジタル値は光電変換素
子２０の入力光量に対して出力電流が直線的に得られる
領域であることが望ましい。

【００２８】光電変換素子２０に光電子増倍管を用いた
本例では、光電子増倍管の入力光量に対する出力電流の
特性は図３に示すようになる。同図に示す区間（ａ）が
入力光量に対して出力電流が直線的に得られる領域であ
る。

【００２９】光電子増倍管の場合、高電圧電源２３の電
圧（光電子増倍管への印加電圧）に対して、図４に示す
ように電流増倍率（感度と同義）が変化するが、高電圧
の上昇に伴って入射光量がゼロの状態での出力である暗
電流が上昇するという特性を持っている。図３において
（ｂ）の区間がこの暗電流が発生する部分に当たる。従
って、リファレンス値を決定するに当たっては、高電圧
電源２３の上限での暗電流を考慮しなければならない。
決定した出力電流により得られる増幅回路２１の出力電
圧を求めることで理想的なリファレンス値を定めること
ができる。

【００３０】このようにして設定された高電圧電源２３
の出力電圧を分圧回路２４を介してＡ／Ｄ変換回路２５
によりサンプリングクロック回路２９により発生される
クロックに同期してサンプリングし、ディジタルデータ
に変換し、メモリ回路２６に保存する。サンプリングク
ロックの速度は、前記フィードバック系の応答速度、ｘ
方向スキャナ４の速度、要求される画像の解像（画素
数）などを考慮して決定する。

【００３１】このようにしてメモリ回路２６に保存され
たデータは各画素に対応した光電変換素子２０の感度デ
ータに相当する。すなわち、試料９の明るい部分では光
電変換素子２０の感度は低く、逆に暗い部分では感度が
高いといったデータが保存されている。

【００３２】メモリ回路２６に保存されたデータをその
まま濃淡情報として表示手段３０に表示すると、試料９
の明るい部位では表示輝度が低く、試料９の暗い部位は
表示輝度が高くなるので、実際の試料９のネガ画像のよ
うになってしまう。

【００３３】そこで、メモリ回路２６に保存された光電
子増倍管２０の感度に相当するデータから、入力された
光量に相当するデータに変換する処理を行う必要があ
る。光電変換素子２０として光電子増倍管を用いたとす
ると、各画素での感度Ｇ(x,y)は、メモリ回路２６に保
存されたデータ（高電圧電源の値）をＶ(x,y) 、光電子
増倍管の構造による係数をα、ａを定数として一般に次
式で表すことができる。 Ｇ(x,y)=ａ・Ｖ(x,y) ^α …式（１） また、与えられたリファレンス信号３０をＩref とすれ
ば、各画素における相対光量Ｉ(x,y) は、ｂを定数とし
て，以下の式から求めることができる。

【００３４】 Ｉ(x,y)=Iref/ Ｇ(x,y) =b・Iref/ Ｖ(x,y) ^α …式（２） 使用しているＣＰＵの性能によっては、このような演算
処理を制御用ＣＰＵ２７に行わせることが可能である。
ただし、単位時間当たりの処理データ量が多い場合、又
は高速な処理速度が要求される場合などは、図１のなか
に破線で示すデータ処理回路３１を別途設けることにな
る。又は、上記演算処理をメモリ回路２６に保存する前
に行うように構成する。

【００３５】このような実施の形態によれば、光電変換
素子２０の出力電流がリファレンス値と一致するように
光電変換素子２０の感度をフィードバック制御し、その
感度データをメモリ回路２６に保存して光量情報として
取得するようにしたので、これまでのレーザ走査型顕微
鏡で必要とされてきた測定パラメータの設定を必要とせ
ず、広いダイナミックレンジ、具体的には光電変換素子
の感度調整範囲を最大限使用した測定を実現することが
できる。

【００３６】（第２の実施の形態）次に、第２の実施の
形態に係る測光装置について説明する。

【００３７】図５は第２の実施の形態に係る測光装置の
回路構成図である。図５において第１の実施の形態と同
等の機能については同一番号を付している。

【００３８】第１の実施形態で述べたように、システム
の測定速度を決定するサンプリングクロックの速度は、
光電変換素子２０、増幅回路２１、フィードバック回路
２２、高電圧電源２３を含むフィードバックループの応
答速度に左右される。一般的に、光電変換素子２０を構
成する光電子増倍管、増幅回路２１、フィードバック回
路２２などの応答速度はマイクロ秒単位であるのに対し
て、高電圧電源２３の応答速度はミリ秒単位になってし
まう。

【００３９】そこで、本実施形態では光電子像倍管２０
の感度を決定する高電圧電源の出力電圧値および測光値
の両方を採用する構成としている。

【００４０】第１の実施形態で述べたように、リファレ
ンス値前後において光電変換素子２０からの出力信号は
入力光量に対して直線的に変化する。従って、任意の点
での増幅回路２１からの出力をＳ(x,y) 、そのときの光
電子増倍管の感度（高電圧電源２３の出力電圧値）をＶ
(x,y) 、光電子増倍管の構造による係数をαとすれば、
任意の点における相対光量Ｉ(x,y) は式(3) より求める
ことができる。

【００４１】 Ｉ(x,y)=Ｓ(x,y)/Ｖ(x,y) ^α …式（３） このように、応答速度の速い増幅回路２１からの測光デ
ータと、このデータを測定した際の光電子増倍管２０の
感度データとから光量を算出することで、高速な被測定
光の変動にも追従できる測定を実現することができる。
式（３）の演算はデータ処理回路３３において実行し、
ここでの演算により取得された測定値はメモリ回路２６
に保存する。

【００４２】このような実施の形態よれば、測定パラメ
ータの設定を必要とせず、広いダイナミックレンジで測
定ができ、かつ高速な測定を同時に実現することができ
る。以上の２つの実施の形態の中では、光電変換素子２
０として光電子増倍管を用いているが、アバランシェダ
イオードなど素子自体の感度を可変できる光電変換素子
であればそのまま置き換えて実施することが可能であ
る。さらに、フォトダイオードやフォトトランジスタな
ど素子自体の感度を可変できない素子であっても、増幅
回路２１の増幅率を可変とすることで同様の効果を得る
ことができる。またフィードバック回路２２は各Ａ／Ｄ
変換回路の後方に配置し、ディジタルフィードバック制
御を行う構成としても同様の効果が得られることはいう
までもない。

【００４３】以上、本発明について実施の形態に基づい
て説明してきたが、以下の発明が含まれる。

【００４４】（１） レーザビームで試料を２次元走査
して得られた濃淡情報から試料画像を形成するレーザ走
査型顕微鏡において、試料からの信号光を電気信号に変
換する光電変換手段と、前記光電変換手段の信号光に対
する感度又は電気信号に対する増幅率を設定する感度調
整手段と、前記光電変換手段の出力信号が予め設定され
た基準値に近付くように前記感度調整手段を制御する感
度制御手段とを備え、前記感度制御手段により前記光電
変換手段の出力信号を一定に保つよう制御したときの前
記感度制御手段の出力を測定値とすることを特徴とする
レーザ走査型顕微鏡。

【００４５】（２） レーザビームで試料を２次元走査
して得られた濃淡情報から試料画像を形成するレーザ走
査型顕微鏡において、試料からの信号光を電気信号に変
換する光電変換手段と、前記光電変換手段の信号光に対
する感度又は電気信号に対する増幅率を設定する感度調
整手段と、前記光電変換手段の出力信号が予め設定され
た基準値に近付くように前記感度調整手段を制御する感
度制御手段と、前記光電変換手段への入力光量に対して
出力電流が直線的に得られる領域に対応した基準値を前
記感度制御手段に対して指示する手段とを具備したこと
を特徴とするレーザ走査型顕微鏡。

【００４６】（３） 上記（１）又は（２）のレーザ走
査型顕微鏡において、光電変換手段は、試料からの信号
光が入射する光電子増倍管と、この光電子増倍管の出力
信号を増幅する増幅回路とを有して構成され、感度調整
手段は、外部から制御可能な高電圧を前記光電子増倍管
に印加する高電圧電源から構成され、感度制御手段は、
前記増幅回路からの出力信号と光電子増倍管の所定の感
度に対応した基準値とを比較して、その偏差に応じた電
圧設定値を前記高電圧電源へ出力するフィードバック回
路を含んで構成されたことを特徴とするレーザ走査型顕
微鏡。

【００４７】（４） 上記（１）又は（２）のレーザ走
査型顕微鏡において、光電変換手段は、試料からの信号
光が入射する光電子増倍管と、この光電子増倍管の出力
信号を増幅する増幅回路とを有して構成され、感度調整
手段は、前記増幅回路に増幅率を決める信号を供給する
電圧印加回路を含んで構成され、感度制御手段は、前記
増幅回路からの出力信号と増幅回路の所定の増幅率に対
応した基準値とを比較して、その偏差に応じた電圧設定
値を前記増幅回路へ出力するフィードバック回路を含ん
で構成されたことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。

【００４８】（５） 上記（３）のレーザ走査型顕微鏡
において、前記高電圧電源の出力電圧を検出する電圧検
出回路と、この電圧検出回路で検出された電圧値をＡ／
Ｄ変換するＡ／Ｄ変換回路と、このＡ／Ｄ変換回路から
出力される電圧データを保存するメモリ回路と、このメ
モリ回路に保存された電圧データを相対光量の測定値に
変換する処理手段と、この処理手段で変換された測定値
を可視化表示する表示手段とを具備する。

【００４９】（６） 上記（３）のレーザ走査型顕微鏡
において、前記高電圧電源の出力電圧を検出する電圧検
出回路と、この電圧検出回路で検出された電圧値をＡ／
Ｄ変換するＡ／Ｄ変換回路と、このＡ／Ｄ変換回路から
出力される電圧データを相対光量の測定値に変換するデ
ータ処理回路と、このデータ処理回路の出力を保存する
メモリ回路と、このメモリ回路のデータを読み出して可
視化表示する表示手段とを具備する。

【００５０】

【発明の効果】以上詳記したように本発明によれば、入
射光量に応じた電気信号を出力する回路の感度、増幅
率、オフセット量などの測定パラメータを設定すること
無く、好適なコントラストと広いダイナミックレンジの
画像が得られるレーザ走査型顕微鏡を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１の実施の形態に係る共焦点レーザ走査型顕
微鏡の測光回路の構成図である。

【図２】第１の実施の形態に係る共焦点レーザ走査型顕
微鏡の全体図である。

【図３】光電子増倍管の入射光量に対する出力電流特性
を示す図である。

【図４】光電子増倍管の印加電圧に対する感度特性及び
暗電流出力特性を示す図である。

【図５】第２の実施の形態に係る測光回路の構成図であ
る。

【符号の説明】

１…レーザ発振器 ２…ビームエキスパンダ ３…光路分割素子 ４，５…スキャナ ８…対物レンズ ９…試料 １２，１７，１８…測光回路 ２０…光電変換素子 ２１…増幅回路 ２２…フィードバック回路 ２３…高電圧電源 ２４…分圧回路 ２５…Ａ／Ｄ変換回路 ２６…メモリ回路

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レーザビームで試料を２次元走査して得
   られた濃淡情報から試料画像を形成するレーザ走査型顕
   微鏡において、 試料からの信号光を電気信号に変換する光電変換手段
   と、前記光電変換手段の信号光に対する感度又は電気信
   号に対する増幅率を設定する感度調整手段と、前記光電
   変換手段の出力信号が予め設定された基準値に近付くよ
   うに前記感度調整手段を制御する感度制御手段とを備
   え、 前記光電変換手段に設定された感度又は増幅率を前記濃
   淡情報に相当する測定値に変換して使用することを特徴
   とするレーザ走査型顕微鏡。
2. 【請求項２】 請求項１記載のレーザ走査型顕微鏡にお
   いて、 前記光電変換手段からの出力信号と、前記光電変換手段
   の出力信号を基準値に近付けるように制御したときの感
   度又は増幅率とから、前記濃淡情報に相当する測定値を
   求めることを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
3. 【請求項３】 入射光を電気信号に変換して当該電気信
   号に基づいて入射光強度の測定値を取得する測光装置に
   おいて、 入射光を電気信号に変換する光電変換手段と、前記光電
   変換手段の入射光に対する感度又は電気信号に対する増
   幅率を設定する感度調整手段と、前記光電変換手段の出
   力信号が予め設定された基準値に近付くように前記感度
   調整手段を制御する感度制御手段と、前記光電変換手段
   の感度又は増幅率を入射光強度の測定値に変換する演算
   手段とを具備したことを特徴とする測光装置。