JPH1072345A

JPH1072345A - ９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルを含有する白血病治療剤

Info

Publication number: JPH1072345A
Application number: JP17340897A
Authority: JP
Inventors: Makoto Makishima; 誠槇島; Yasuhiro Kanetani; 泰宏金谷; Yoshio Honma; 良夫本間; Kohei Inomata; 浩平猪股; Takao Kishie; 孝男岸江
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 1998-03-17

Abstract

(57)【要約】【課題】副作用が少なく、低用量で有効な白血病治療
剤を提供することを目的とする。【解決手段】９−シス−レチノイン酸−α−トコフェ
ロール−エステルを有効成分とするかまたはこの化合物
と１α,２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃もしくは９−シ
ス−レチノイン酸とを有効成分とする白血病治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、９−シス−レチノ
イン酸−α−トコフェロールエステルを有効成分とする
白血病治療剤に関する。また本発明は、この化合物と１
α,２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（以下、「ＶＤ₃」
という)、またはこの化合物と９−シス−レチノイン酸
（以下、「９−シス−ＲＡ」という）を有効成分とする
白血病治療剤にも関する。

【０００２】

【従来の技術】わが国において、各種疾患の中で癌が死
因の第１位となっており、これに対する新規な治療方法
を早急に確立することが求められている。特に、血液の
癌である白血病に対しては、白血病細胞増殖抑制作用お
よび細胞分化誘導作用を有する薬剤を用い、その治療が
試みられてきた。白血病細胞を、成熟した白血球に類似
した細胞に分化誘導することにより、白血病細胞は増殖
が抑制され、白血病細胞としての特性を喪失することが
知られている。

【０００３】天然型レチノイドの活性体であるオールト
ランス−レチノイン酸（以下、「ＡＴＲＡ」という）は
ＰＭＬ／ＲＡＲα遺伝子転移を伴う急性前骨髄球性白血
病患者の９０％以上を完全に寛解させると報告されてい
る（New Eng．J．Med. 329：177, 1993）。

【０００４】近年になり、ＡＴＲＡの受容体としてレチ
ノイン酸受容体（以下、「ＲＡＲ」という）が発見され
(Nature, 330巻, 444, 1987年および Nature, 330巻,
624,1987年)、ＡＴＲＡはこのＲＡＲを介して種々の転
写調節を行っていると考えられている。しかし、ＡＴＲ
Ａを用いた治療では再発を起こすケースが多く、ＡＴＲ
Ａ治療後に再発した場合における、このＡＴＲＡによる
再寛解率は３６％に低下する。さらに、ＡＴＲＡは副作
用が大きく、高用量で投与すると皮膚、中枢神経系、肝
臓などに多くの障害を引き起こす。さらに、妊婦に投与
する場合は催奇形性の恐れもある。したがってこの高用
量投与による障害の克服が患者にとって課題となること
もありうる。さらには、ＡＴＲＡを継続して投与する
と、多くの組織で細胞内ＡＴＲＡ−結合蛋白（ＣＲＡＢ
Ｐ）のような結合蛋白が誘導され、その結果、ＡＴＲＡ
の血清中の濃度が減少して、白血病治療の目的の達成に
そぐわない結果が起こり得ることも知られている（Bloo
d, 82巻, 1949，1993年参照)。

【０００５】最近になり、新たなレチノイド受容体であ
る、レチノイドＸ受容体（以下、「ＲＸＲ」という）が
発見され、そのリガンドはＡＴＲＡの９位幾何異性体で
ある、９−シス−ＲＡであることが明らかにされた（Ce
ll, 68巻, 397, 1992年)。９−シス−ＲＡは、ＲＸＲの
みならず、ＲＡＲに対しても強いリガンドになることが
知られており、骨髄性白血病細胞であるＨＬ−６０細胞
における分化誘導作用を有している（医学のあゆみ, 17
5巻, 925, 1995年, Blood, 81巻, 1009, 1993年）。し
かし、９−シス−ＲＡは化学的に不安定で、容易にＡＴ
ＲＡに異性化することが知られており、そのためにＡＴ
ＲＡ同様の副作用が予想されるところであり、９−シス
−ＲＡの投与量をできるだけ少なくすることが望まれて
いる。

【０００６】一方、ＶＤ₃は骨代謝改善剤として知られ
ているが、ＡＴＲＡと同様に分化誘導作用を有し、結腸
癌、乳癌および白血病由来の細胞株の分化を誘導し（En
docrine Rev. 13, 765, 1992年参照）、制癌剤としての
使用も期待されている。しかしながら、ＶＤ₃は低投与
量においてのみ使用可能で、例えば、その血清中の濃度
が１０^-9Ｍを越えると高カルシウム血症等の副作用を生
じるため、このような血清中の高いＶＤ₃濃度を招来す
る投与量での臨床上の使用は制限されている（Cancer T
reat Rep.,69，1399，1985年参照）。

【０００７】ＡＴＲＡとＶＤ₃の組合せの技術として、
特開平７−２６７４号公報の従来技術の欄に、両者の併
用はＨＬ−６０白血病細胞の成育阻害および分化誘導に
対し相加的な効果しか生じない旨の記載があり、同公報
に記載の発明は相乗的な効果を得るために、ＡＴＲＡお
よびＶＤ₃アナローグを含有する白血病治療剤を開示し
ている。しかし、この発明は、白血病細胞の５０％以上
の生育阻害率を達成するためのＶＤ₃アナローグの血清
中濃度は１０^-8Ｍ以上であることが同公報の表１の記載
から明らかで、このような高濃度でのＶＤ₃アナローグ
の使用は、前記した重篤な高カルシウム血症等の副作用
が予想される所である。

【０００８】９−シス−ＲＡとトコフェロール誘導体の
エステル化物が皮膚潰瘍治療剤、消化管潰瘍治療剤およ
び抗腫瘍剤として有用であることは、本出願人の出願に
係る特開平４−２４４０７６号公報に開示されている。
しかしながらこのエステル化合物が白血病治療剤として
有用であることは記載されていない。

【０００９】かかる状況から、より副作用が少なく、か
つ有効な新たな白血病治療剤の開発が望まれていた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、生体
に対してより副作用が少なく、白血病治療の上で有効な
薬剤が求められているが、現在までに充分に有効な薬剤
は見いだされていない。かかる状況のもとで、既知の白
血病治療剤と比べてより安全かつ有効な治療効果を有す
る白血病治療剤が求められるところである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究の結果、９−シス−ＲＡのα
−トコフェロールエステルである９−シス−レチノイン
酸−α−トコフェロールエステルが、白血病細胞を分化
誘導する性質を有し、さらに９−シス−レチノイン酸−
α−トコフェロールエステルをＶＤ₃または９−シス−
ＲＡと共に用いる場合には、ＶＤ₃または９−シス−Ｒ
Ａの副作用が現れない低用量で白血病の治療に有効であ
ることを見出して本発明を完成させたのである。

【００１２】すなわち、本発明は、下記式(Ｉ)

【化２】で示される９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロー
ルエステルを有効成分として含有する白血病治療剤に関
する。

【００１３】また本発明は、上記式(Ｉ)で示される９−
シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルとＶ
Ｄ₃を有効成分として含有する白血病治療剤に関する。
さらに本発明は、上記式(Ｉ)で示される９−シス−レチ
ノイン酸−α−トコフェロールエステルと９−シス−Ｒ
Ａを有効成分として含有する白血病治療剤にも関する。

【００１４】本発明の９−シス−レチノイン酸−α−ト
コフェロールエステルは、全トランス型α−トコフェロ
ールビタミンＡ酸エステルの光異性化により得られるこ
とが特公昭６０−５６１５６号に記載されている。工業
的には９−シス−ＲＡとα−トコフェロールをエステル
化することにより製造することができる。９−シス−Ｒ
Ａとα−トコフェロールのエステル化の方法は、例えば
既知のエステル化形成方法（本出願人の出願にかかる特
開平５−２０２０２０号参照）に記載されている方法に
よることができる。

【００１５】本明細書におけるα−トコフェロールに
は、ｄｌ−α−トコフェロール、ｄ−α−トコフェロー
ルおよびｌ−α−トコフェロールが含まれ、式(Ｉ)には
９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
の可能な光学異性体、ラセミ体混合物が包含される。

【００１６】本発明における、式(Ｉ)で表される、９−
シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルの可
能な光学活性体は、例えば光学活性な出発物質を用いる
キラル合成により製造することができる。

【００１７】９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロ
ールエステルはそれ自体白血病細胞の増殖を抑制し、白
血病細胞の分化を誘導する作用を有する。さらに、９−
シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルにＶ
Ｄ₃または９−シス−ＲＡを併用することにより相乗的
な効果を発揮し、ＶＤ₃または９−シス−ＲＡの投与量
を軽減することができ、これによりＶＤ₃または９−シ
ス−ＲＡ固有の副作用の発現を抑制することが出来る。
本発明の白血病治療剤の治療対象の白血病とは、血液学
的腫瘍である白血病、特に急性前骨髄球性白血病および
リンパ腫である。

【００１８】白血病治療効果が十分発揮されるための成
人（体重６０kgとして）の血清中の９−シス−レチノイ
ン酸−α−トコフェロールエステルの濃度は、１×１０
^-9Ｍ〜５×１０^-5Ｍである。この血清中の濃度を満足す
るための成人１日あたりの具体的な投与量は、９−シス
−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルとして好
ましくは１０mg〜１２００mg、より好ましくは６０mg〜
６００mgである。

【００１９】本発明の９−シス−レチノイン酸−α−ト
コフェロールエステルおよびＶＤ₃を有効成分とする白
血病治療剤は、９−シス−レチノイン酸−α−トコフェ
ロールエステルとＶＤ₃の併用による相乗的な効果が十
分に発揮され、しかもＶＤ₃の副作用が生じない低用
量、すなわち、患者の血清中の濃度が１０^-9Ｍの濃度以
下の用量で投与されることが必要である。この相乗的な
効果が十分発揮されるための成人（体重６０ｋｇとし
て）の血清中の９−シス−レチノイン酸−α−トコフェ
ロールエステルの濃度は、１×１０^-9Ｍ〜５×１０^-5Ｍ
である。この両者の血清中の濃度を満足するための成人
１日あたりの具体的な投与量は、９−シス−レチノイン
酸−α−トコフェロールエステルとして好ましくは１０
mg〜１２００mg、より好ましくは６０mg〜６００mgであ
り、ＶＤ₃として好ましくは０.００５μｇ〜５μｇ、よ
り好ましくは０.０１μg〜０.５０μgであり、この２者
が同時に投与されることが必要である。

【００２０】本発明の９−シス−レチノイン酸−α−ト
コフェロールエステルおよび９−シス−ＲＡを有効成分
とする白血病治療剤は、９−シス−レチノイン酸−α−
トコフェロールエステルと９−シス−ＲＡの併用による
相乗的な効果が十分に発揮され、しかも９−シス−ＲＡ
の副作用が生じない低用量、すなわち、患者の血清中の
濃度が１０^-7Ｍの濃度以下の用量で投与されることが必
要である。この相乗的な効果が十分発揮されるための成
人（体重６０kgとして）の血清中の９−シス−レチノイ
ン酸−α−トコフェロールエステルの濃度は、１×１０
^-9Ｍ〜５×１０ ^-5Ｍである。この両者の血清中の濃度を
満足するための成人１日あたりの具体的な投与量は、９
−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルと
して好ましくは１０mg〜１２００mg、より好ましくは６
０mg〜６００mgであり、９−シス−ＲＡとして好ましく
は１.０mg〜８０mg、より好ましくは５.０mg〜２０mgで
あり、この２者が同時に投与されることが必要である。

【００２１】本発明の白血病治療剤の投与方法として
は、例えば、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内
投与、直腸内投与などが挙げられるが、静脈内投与およ
び経口投与が好ましい。

【００２２】本発明の白血病治療剤は、任意慣用の製剤
方法を用いて調製することができる。経口投与剤として
は、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、硬カプセル剤、軟
カプセル剤、経口用液体製剤などである。非経口投与用
の剤型としては注射剤、坐剤などが挙げられる。

【００２３】これらの製剤の調製にあたっては製剤化の
ための慣用の添加剤、例えば賦形剤、安定剤、防腐剤、
溶解剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味剤、着色剤、香
味剤、酸化防止剤などを添加して通常の方法で製造する
ことができる。これらの添加剤としては、例えばデンプ
ン、白糖、果糖、乳糖、ブドウ糖、マンニトール、ソル
ビトール、沈降性炭酸カルシウム、結晶セルロース、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストリン、ゼラチン、
アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース等が挙げられる。

【００２４】本発明の白血病治療剤を液剤、注射剤とし
て用いるときは活性成分を慣用の希釈剤中に溶解または
懸濁して用いることができる。希釈剤としては、生理食
塩水、リンゲル液、ブドウ糖水溶液、アルコール類、脂
肪酸エステル類、グリコール類、グリセリン、脂肪酸グ
リセリド、動植物由来の油脂、パラフィン類などが含ま
れる。注射剤は、必要によりｐＨ調製剤、緩衝剤、安定
化剤、保存剤、可溶化剤などを添加し常法により調製さ
れる。

【００２５】以下、実施例により本発明を具体的に説明
する。なお、本発明はこれらの実施例により限定される
ものではない。

【００２６】

【実施例】以下の製造例、実施例で用いた薬剤、試薬等
は以下の方法により入手した。ジメチルスルホキシド
（以下、「ＤＭＳＯ」という）およびＶＤ₃は和光純薬
工業社製のものを用いた。ＡＴＲＡはシグマ社製、９−
シス−ＲＡは Biomol Research Laboratories社製また
はＢＡＳＦ社製（日清バーディシェより入手）のものを
用いた。ニトロブルーテトラゾリウム（以下、「ＮＢ
Ｔ」という）、ホルボール−１２−ミリステート１３−
アセテート（以下「ＴＰＡ」という）はシグマ社製のも
のを用いた。

【００２７】（製造例）９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル９−シス−ＲＡ５０mg（0.1664mmol）のジイソプロピル
エーテル（５ml）溶液にトリフルオロ酢酸無水物２６μ
l（0.1831mmol）を加え室温下１５分間撹拌後、ついで
ｄｌ−α−トコフェロール７９mg（0.1831mmol）のジイ
ソプロピルエーテル（５ml）溶液を滴下し、室温下１時
間撹拌した。反応液に２８％（w／v）アンモニア水（１
０ml）を加え、ジイソプロピルエーテル（２０ml×３）
で抽出した。合わせた有機層を水、飽和食塩水にて順次
洗浄し、ジイソプロピルエーテル層を無水硫酸ナトリウ
ムにて乾燥後、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲ
ルクロマトグラフィーにて精製を行い、２％（v／v）ジ
イソプロピルエーテル含有ヘキサンの流分から黄色油状
の標記化合物３６mg（３０％）を得た。¹ H NMR (CDCl₃, 400MHz) d 0.82-0.90 (m, 12H), 1.00-
2.20 (m, 29H), 1.05(s, 3H), 1.55 (s, 6H), 1.66 (s,
3H), 1.98 (s, 3H), 2.03 (s, 6H), 2.09 (s, 3H), 2.
40 (s, 3H), 2.59 (t, J=6.8Hz, 2H), 6.08 (s, 1H),
6.09 (d, J=10.7Hz, 1H), 6.29 (d, J=13.2Hz, 1H), 6.
33 (d, J=14.2Hz, 1H), 6.67 (d, J=15.6Hz, 1H), 7.15
(dd, J=11.7Hz, 15.0Hz, 1H)．

【００２８】（培養細胞および培養条件）以下に示す測
定および実施例等で用いる培養細胞として、ヒト骨髄単
球性白血病の培養細胞であるＮＢ４細胞（Blood, 77巻,
1080, 1991年, H. Phillip Koeffler教授（Cedars-Sin
ai Medical Center／UCLA Schoolo of Medicine, Los A
ngels, USA)より入手した）を、５％のＣＯ₂を含む湿っ
た空気中、３７℃で、１０％のウシ胎児血清（以下、
「ＦＢＳ］という）および８０μg／mlのゲンタマイシ
ンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco BRL社製）
中で、懸濁し培養したものを用いた。

【００２９】（培養細胞の増殖および分化の測定）培養
プレート中に、９−シス−レチノイン酸−α−トコフェ
ロールエステル単独またはこれとＶＤ₃、ＡＴＲＡまた
は９−シス−ＲＡとを組合せて添加し、上記と同様の条
件で上記の培養細胞の培養を行った。培養細胞の数はコ
ールター・エレクトロニクス社（Coulter Electronics
社；英国）製コールターカウンターＺＭ型で計測した。
骨髄単球性白血病の培養細胞の分化誘導の指標として、
ＮＢＴ還元活性値を以下の方法に従い測定した。１) ＮＢＴ試液の調製：１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１
６４０培地１００mlに、ＮＢＴ１００mgをＤＭＳＯ１
mlに溶解したものを加え、さらに１００μg／mlに調製
したＴＰＡのＤＭＳＯ溶液１００μlを加え、よく撹拌
し、ＮＢＴ試液とした。２) 培養細胞を１０mlの試験管に入れ培養細胞の数を計
測し、その後遠心分離して上清を廃棄したものに、上記
ＮＢＴ試液を１mlずつ添加する。その後、３７℃で３０
分間振とうし、５Ｎ塩酸を０.３ml添加し反応を終了さ
せた後、室温で１〜２時間放置する。室温で放置した前
記培養細胞液を遠心分離し上清を除いたのち、０.７ml
のＤＭＳＯを添加し、分光吸光度計(日立製作所社製Ｕ
−2000）にて、５６０nmにおける吸光度を測定し、培養
細胞１０⁷個あたりの吸光度に換算し、これをＮＢＴ還
元活性値とした。ＮＢＴ還元活性値が高くなるというこ
とは、白血病細胞の分化誘導が促進されることを意味す
る。

【００３０】〔実施例１〕ＮＢ４細胞の分化誘導に対する９−シス−レチノイン酸
−α−トコフェロールエステルとＶＤ₃の併用作用培養細胞としてＮＢ４（２×10⁵細胞／ml）を用い、こ
れにＶＤ₃をその濃度が３×１０^-9Ｍ、３×１０^-8Ｍ、
３×１０^-7Ｍになるようにそれぞれ添加し、さらに９−
シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルを３
×１０^-6Ｍの濃度になるようにそれぞれ添加して４日間
培養し、細胞の分化誘導に対する併用効果を検討した。
比較のため９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロ
ールエステルが無添加のものおよび９−シス−レチノイ
ン酸−α−トコフェロールエステルの代わりにトレチノ
イントコフェリル３×１０^-6Ｍを添加したものを同様に
培養した。細胞の分化誘導に対する効果はＮＢＴ還元活
性値を測定することにより検討した。結果を図１に示
す。

【００３１】この図１において、横軸はＶＤ₃の濃度、
縦軸は培養細胞１０⁷個あたりの吸光度（ＮＢＴ還元活
性値）を表す。また（−●−）はＶＤ₃単独使用の場合
のＶＤ₃の濃度とＮＢＴ還元活性値との関係を示し、
（−■−）は９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロ
ールエステル（３×10^-6Ｍ）とＶＤ₃との併用の場合の
ＶＤ₃の濃度とＮＢＴ還元活性値との関係を示し、そし
て（−▲−）はトレチノイントコフェリル（３×10
^-6Ｍ）とＶＤ₃との併用の場合のＶＤ₃の濃度とＮＢＴ還
元活性値との関係を示す。

【００３２】図１の結果から、ＶＤ₃を単独で使用した
場合、３.０×１０^-6Ｍまでの濃度範囲においてＮＢＴ
の還元能は上昇しなかった。一方、トレチノイントコフ
ェリル３×１０^-6Ｍを併用した場合、トレチノイントコ
フェリルは、ＶＤ₃によるＮＢＴ還元能を増強したが、
その増強能はＶＤ₃ ３×１０^-9Ｍにおいて約３倍程度で
あった。これに対して９−シス−レチノイン酸−α−ト
コフェロールエステル３×１０^-6Ｍを併用した場合に
は、この９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロール
エステルはＶＤ₃によるＮＢＴ還元能を増強し、その増
強能はＶＤ₃ ３×１０^-9Ｍにおいて約７.５倍に上昇し
た。このことから、９−シス−レチノイン酸−α−トコ
フェロールエステルはＶＤ₃によるＮＢ４細胞の分化を
飛躍的に増強し、その増強作用はトレチノイントコフェ
リルに比して強いことは明らかである。

【００３３】〔実施例２〕ＮＢ４細胞増殖抑制に対する９−シス−レチノイン酸−
α−トコフェロールエステルと９−シス−ＲＡの併用効
果培養細胞としてＮＢ４（５×10⁵細胞／ml）を用い、こ
れに９−シス−ＲＡ（３×10^-9Ｍ）を添加し、さらに９
−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルを
３×１０^-6Ｍになるように添加して４日間培養し、細胞
の増殖に対する抑制効果を検討した。比較のため９−シ
ス−ＲＡおよび９−シス−レチノイン酸−α−トコフェ
ロールエステルが共に無添加のもの（Control)、９−シ
ス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルが無添
加のもの、および９−シス−レチノイン酸−α−トコフ
ェロールエステルの代わりにトレチノイントコフェリル
が３×１０^-6Ｍになるように添加したものを用いて同様
に培養した。４日後に細胞数をカウントし、Controlに
おける細胞数を１００としたときの、相対百分率を求め
た。結果を図２に示す。

【００３４】図２中、横軸のNoneは９−シス−ＲＡ非投
与群、９ＣＲＡは９−シス−ＲＡ投与群を表す。各カラ
ムは、左側から順に、Control（全て非投与）、トレチ
ノイントコフェリル（３×10^-6Ｍ）の単独投与、９−シ
ス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル（３×
10^-6Ｍ）の単独投与、９−シス−ＲＡ（３×10^-9Ｍ）の
単独投与、９−シス−ＲＡ（３×10^-9Ｍ）とトレチノイ
ントコフェリル（３×10^-6Ｍ）との併用投与、９−シス
−ＲＡ（３×10^-9Ｍ）と９−シス−レチノイン酸−α−
トコフェロールエステル（３×10^-6Ｍ）との併用投与の
各群を表す。

【００３５】図２の結果から、９−シス−ＲＡ（３×10
^-9Ｍ）単独ではＮＢ４細胞の増殖を抑制しなかった。一
方、トレチノイントコフェリル（３×10^-6Ｍ）は、９−
シス−ＲＡ（３×10^-9Ｍ）を併用した場合に、ＮＢ４細
胞の増殖を抑制したが、その抑制率（Controlに対する
生存細胞数の相対百分率）は約８６％であった。これに
対して、９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロール
エステル（３×10^-6Ｍ）を併用した場合に、ＮＢ４細胞
の増殖を抑制し、その抑制率は約７２％であり、飛躍的
にＮＢ４細胞の増殖を抑制した。このことより、９−シ
ス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルと９−
シス−ＲＡとの併用は、ＮＢ４細胞の増殖を効果的に抑
制することは明らかであり、その増殖抑制効果はトレチ
ノイントコフェリルに比して強いことは明らかである。

【００３６】〔実施例３〕ＮＢ４細胞の分化誘導に対する９−シス−レチノイン酸
−α−トコフェロールエステルと９−シス−ＲＡの併用
効果培養細胞としてＮＢ４（５×10⁵細胞／ml）を用い、こ
れに９−シス−ＲＡ（３×10^-9Ｍ）を添加し、さらに９
−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
（３×10^-6Ｍ）を添加して４日間培養した。細胞をリン
酸緩衝液で洗浄し、マウスモノクローナル抗体ＣＤ１１
ｂ（ニチレイより入手）〔ＩＦＡ緩衝液（10mMヘペス、
pH7.4、150mM NaCl、４％FBS、0.1％ナトリウムアジ
ド）で希釈〕と４℃で１時間反応させた。細胞を、ＩＦ
Ａ緩衝液で２回洗浄後、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗マウス抗
体（ＩＦＡ緩衝液で希釈）と４℃で１時間反応させた。
細胞を、ＩＦＡ緩衝液で２回洗浄し、蛍光陽性細胞を、
フローサイトメトリー（EpicsXL, Coulter社製）で解析
した。比較のため、９−シス−ＲＡおよび９−シス−レ
チノイン酸−α−トコフェロールエステルを無添加のも
の、９−シス−ＲＡ（３×10^-9Ｍ）のみを添加したも
の、９−シス−ＲＡ（３×10^-8Ｍ）のみを添加したも
の、９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエス
テルの代わりにトレチノイントコフェリル（３×10
^-6Ｍ）を添加したものを同様に培養し、抗体との反応を
行った。ＣＤ１１ｂの分化マーカーの発現は、細胞の顆
粒球系への分化を示すものである。結果を図３に示す。

【００３７】図３中、Noneは非投与群、９ＣＲＡは９−
シス−ＲＡ投与群を表す。９ＣＲＡ＋ＴＴは９−シス−
ＲＡ（３×10^-9Ｍ）とトレチノイントコフェリル（３×
10^-6Ｍ）併用投与、９ＣＲＡ＋９ＣＴＴは９−シス−Ｒ
Ａ（３×10^-9Ｍ）と９−シス−レチノイン酸−α−トコ
フェロールエステル（３×10^-6Ｍ）との併用投与の各群
を表す。

【００３８】図３から明らかなように、９−シス−ＲＡ
（３×10^-9Ｍ）単独の場合に比べ、トレチノイントコフ
ェリル（３×10^-6Ｍ）を添加した場合にはより分化を誘
導するが、９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロー
ルエステル（３×１０^-6Ｍ）を添加した場合には、トレ
チノイントコフェリル（３×10^-6Ｍ）を添加した場合よ
りも飛躍的に分化を誘導し、その分化誘導能は、９−シ
ス−ＲＡ（３×10^-8Ｍ）のみを添加した場合と同等であ
った。このことは、９−シス−ＲＡと９−シス−レチノ
イン酸−α−トコフェロールエステルとの組み合わせに
より、９−シス−ＲＡの使用量を１／１０にしても同等
の効果が得られることを明らかにするものである。

【００３９】〔実施例４〕９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
単独投与およびＶＤ₃との併用投与におけるＮＢ４細胞
増殖抑制効果培養細胞としてＮＢ４（５×10⁵細胞／ml）を用い、こ
れに９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエス
テル（1.5×10^-5Ｍ）を添加して４日間培養した。比較
のため、無添加のもの、９−シス−レチノイン酸−α−
トコフェロールエステルの代わりにトレチノイントコフ
ェリル（1.5×10^-5Ｍ）を添加したもので同様に培養し
た。また、ＶＤ₃との併用効果をみるために、９−シス
−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル（1.5×1
0^-5Ｍ）とＶＤ₃（３×10^-9Ｍ）とを添加したもの、比較
のためトレチノイントコフェリル（1.5×10^-5Ｍ）とＶ
Ｄ₃（３×10^-9Ｍ）とを添加したものを培養した。結果
を図４に示す。

【００４０】図４中、横軸のNoneは９−シス−レチノイ
ン酸−α−トコフェロールエステル（1.5×10^-5Ｍ）ま
たはトレチノイントコフェリル（1.5×10^-5Ｍ）非投与
群、９ＣＴＴは９−シス−レチノイン酸−α−トコフェ
ロールエステル（1.5×10^-5Ｍ）投与群を表す。ＴＴは
トレチノイントコフェリル（1.5×10^-5Ｍ）投与群を表
す。各カラムは、左側から順に、Control（全て非投
与）、ＶＤ₃（３×10^-9Ｍ）単独投与、９−シス−レチ
ノイン酸−α−トコフェロールエステル（1.5×10
^-5Ｍ）単独投与、ＶＤ₃（３×10^-9Ｍ）と９−シス−レ
チノイン酸−α−トコフェロールエステル（1.5×10^-5
Ｍ）との併用投与、トレチノイントコフェリル（1.5×1
0^-5Ｍ）の単独投与、ＶＤ₃（３×10^-9Ｍ）とトレチノイ
ントコフェリル（1.5×10^-5Ｍ）との併用投与の各群を
表す。

【００４１】この図４から９−シス−レチノイン酸−α
−トコフェロールエステル（1.5×10^-5Ｍ）は、単独で
もＮＢ４細胞の増殖を強く抑制し、この効果はトレチノ
イントコフェリル（1.5×10^-5Ｍ）を単独で用いた場合
よりも強かった。さらに、９−シス−レチノイン酸−α
−トコフェロールエステル（1.5×10^-5Ｍ）は、ＶＤ₃の
増殖抑制効果を飛躍的に増強し、その増殖抑制効果は、
トレチノイントコフェリル（1.5×10^-5Ｍ）とＶＤ₃（３
×10^-9Ｍ）とを併用した場合よりも効果的であった。

【００４２】〔実施例５〕９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
の分化誘導作用培養細胞としてＮＢ４（５×10⁵細胞／ml）を用い、９
−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
（1.5×10^-5Ｍ）を添加して４日間培養し、細胞の分化
誘導に対する効果を検討した。比較のため９−シス−レ
チノイン酸−α−トコフェロールエステル無添加のもの
および９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエ
ステルの代わりにトレチノイントコフェリル（1.5×10
^-5Ｍ）を添加したものを用いて同様に培養した。また、
ＶＤ₃との併用効果をみるために、９−シス−レチノイ
ン酸−α−トコフェロールエステル（1.5×10^-5Ｍ）と
ＶＤ₃（３×10^-9Ｍ）とを添加したもの、比較のため９
−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルの
代わりにトレチノイントコフェリル（1.5×10^-5Ｍ）と
ＶＤ₃（３×10^-9Ｍ）とを添加したものを培養した。細
胞の分化誘導に対する効果はＮＢＴ還元活性値を測定す
ることにより検討した。結果を図５に示す。

【００４３】この図５において、縦軸は培養細胞１０⁷
個あたりの吸光度（ＮＢＴ還元活性値）を表す。また、
横軸のNoneは９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロ
ールエステル(1.5×10^-5Ｍ）またはトレチノイントコフ
ェリル（1.5×10^-5Ｍ）非投与群、９ＣＴＴは９−シス
−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル(1.5×10
^-5Ｍ）投与群を表す。ＴＴはトレチノイントコフェリル
（1.5×10^-5Ｍ）投与群を表す。各カラムは、左側から
順に、Control（全て非投与）、ＶＤ₃（３×10 ^-9Ｍ）の
単独投与、９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロー
ルエステル（1.5×10^-5Ｍ）の単独投与、ＶＤ₃（３×10
^-9Ｍ）と９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロール
エステル（1.5×10^-5Ｍ）との併用投与、トレチノイン
トコフェリル（1.5×10^-5Ｍ）の単独投与、ＶＤ₃（３×
10^-9Ｍ）とトレチノイントコフェリル（1.5×10^-5Ｍ）
との併用投与の各群を表す。

【００４４】図５の結果から、９−シス−レチノイン酸
−α−トコフェロールエステル（1.5×10^-5Ｍ）は、単
独でもＮＢＴ還元能を飛躍的に上昇させた。この効果は
トレチノイントコフェリル（1.5×10^-5Ｍ）単独で用い
た場合よりも強かった。さらに、９−シス−レチノイン
酸−α−トコフェロールエステル（1.5×10^-5Ｍ）は、
ＶＤ₃の増殖抑制効果を飛躍的に増強し、その増殖抑制
効果は、トレチノイントコフェリル（1.5×10^-5Ｍ）と
ＶＤ₃（３×10^-9Ｍ）を併用した場合よりも効果的であ
った。このことから、９−シス−レチノイン酸−α−ト
コフェロールエステルは、ＮＢ４細胞の分化を強く誘導
し、かつＶＤ₃によるＮＢ４細胞の分化を増強すること
が明らかとなった。

【００４５】〔製剤例〕製剤例１（経口投与用軟カプセル剤）９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
５０ｇをヤシ油１３０ｇを混合し、均一な溶液とする。
別にゼラチン９３ｇ、グリセリン１９ｇ、Ｄ−ソルビト
ール（７０w／v％）１０ｇ、パラオキシ安息香酸エチル
０.４ｇ、パラオキシ安息香酸プロピル０.２ｇ及び酸化
チタン０.４ｇの組成物からなるゼラチン溶液を作りこ
れをカプセル皮膜剤として手動式平板打抜法により９−
シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル１８
０mgを含有するソフトカプセルを製造した。

【００４６】製剤例２（注射液）９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
５ｇ、ダイズ油適量およびベンジルアルコール１ｇを混
合し、さらにダイズ油を使用して全量１００ccとする。
本溶液を無菌操作によりアンプルに２cc分注し、溶閉す
る。

【００４７】製剤例３（経口投与用軟カプセル剤）９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
５０ｇおよびＶＤ₃５μgをヤシ油１３０ｇを混合し、均
一な溶液とする。別にゼラチン９３ｇ、グリセリン１９
ｇ、Ｄ−ソルビトール（７０w／v％）１０ｇ、パラオキ
シ安息香酸エチル０.４ｇ、パラオキシ安息香酸プロピ
ル０.２ｇ及び酸化チタン０.４ｇの組成物からなるゼラ
チン溶液を作りこれをカプセル皮膜剤として手動式平板
打抜法により９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロ
ールエステル１８０mgおよびＶＤ₃ ０.０１８μgを含有
するソフトカプセルを製造した。

【００４８】製剤例４（注射液）９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
５ｇ、ＶＤ₃ ０.５μgダイズ油適量およびベンジルアル
コール１ｇを混合し、さらにダイズ油を使用して全量１
００ccとする。本溶液を無菌操作によりアンプルに２cc
分注し、溶閉する。

【００４９】製剤例５（経口投与用軟カプセル剤）９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
５０ｇおよび９−シス−ＲＡ２．８ｇをヤシ油１３０ｇ
を混合し、均一な溶液とする。別にゼラチン９３ｇ、グ
リセリン１９ｇ、Ｄ−ソルビトール（７０w／v％）１０
ｇ、パラオキシ安息香酸エチル０.４ｇ、パラオキシ安
息香酸プロピル０.２ｇ及び酸化チタン０.４ｇの組成物
からなるゼラチン溶液を作りこれをカプセル皮膜剤とし
て手動式平板打抜法により９−シス−レチノイン酸−α
−トコフェロールエステル１８０mgおよび９−シス−Ｒ
Ａ１０mgを含有するソフトカプセルを製造した。

【００５０】製剤例６（注射液）９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
５ｇ、９−シス−ＲＡ２８０mg、ダイズ油適量およびベ
ンジルアルコール１ｇを混合し、さらにダイズ油を使用
して全量１００ccとする。本溶液を無菌操作によりアン
プルに２cc分注し、溶閉する。

【００５１】

【発明の効果】本発明の９−シス−レチノイン酸−α−
トコフェロールエステルを有効成分とする白血病治療
剤、９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエス
テルおよびＶＤ₃を有効成分とする白血病治療剤、９−
シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステルおよ
び９−シス−ＲＡを有効成分とする白血病治療剤は、極
めて効果的に白血病細胞の増殖を阻害し且つそれら細胞
の分化誘導を飛躍的に促進する。また、ＶＤ₃の血清中
濃度が１０^-9Ｍ以下の副作用のない安全な濃度でも白血
病の治療に有効である。さらに、９−シス−ＲＡの使用
量をその副作用が発現しない量まで減らすことができ治
療上極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＢ４細胞に対して、ＶＤ₃を単独で使用した
場合（−●−）、９−シス−レチノイン酸−α−トコフ
ェロールエステルとＶＤ₃とを併用した場合（−■
−）、およびトレチノイントコフェリルとＶＤ₃とを併
用した場合（−▲−）のＶＤ₃の濃度とＮＢＴ還元活性
値との関係を示す。

【図２】ＮＢ４細胞に対して、９−シス−ＲＡ（３×10
^-9Ｍ）、９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロール
エステル（３×10^-6Ｍ）、トレチノイントコフェリル
（３×１０^-6Ｍ）をそれぞれ単独で使用した場合、９−
シス−ＲＡ（３×10^-9Ｍ）と９−シス−レチノイン酸−
α−トコフェロールエステル（３×10^-6Ｍ）またはトレ
チノイントコフェリル（３×10^-6Ｍ）を併用した場合の
増殖抑制効果を増殖率(％)で表す。

【図３】ＮＢ４細胞に対して、９−シス−ＲＡ単独（３
×10^-9Ｍまたは３×10^-8Ｍ）で使用した場合、９−シス
−ＲＡ（３×10^-9Ｍ）と９−シス−レチノイン酸−α−
トコフェロールエステル（３×10^-6Ｍ）またはトレチノ
イントコフェリル（３×１０^-6Ｍ）を併用した場合の分
化マーカー（ＣＤ11ｂ）の蛍光強度と細胞数の関係を表
す。

【図４】ＮＢ４細胞に対して、ＶＤ₃（３×10^-9Ｍ）、
９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
（1.5×10^-5Ｍ）、トレチノイントコフェリル（1.5×10
^-5Ｍ）をそれぞれ単独で使用した場合、ＶＤ₃（３×10
^-9Ｍ）と９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロール
エステル（1.5×10^-5Ｍ）またはトレチノイントコフェ
リル（1.5×10^-5Ｍ）を併用した場合の増殖抑制効果を
増殖率(％)で表す。

【図５】ＮＢ４細胞に対して、ＶＤ₃（３×10^-9Ｍ）、
９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロールエステル
（1.5×10^-5Ｍ）、トレチノイントコフェリル（1.5×10
^-5Ｍ）をそれぞれ単独で使用した場合、ＶＤ₃（３×10
^-9Ｍ）と９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロール
エステル（1.5×10^-5Ｍ）またはトレチノイントコフェ
リル（1.5×10^-5Ｍ）を併用した場合のＮＢＴ還元活性
値を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ａ６１Ｋ 31/355 31:59） (Ａ６１Ｋ 31/355 31:20） (72)発明者猪股浩平埼玉県入間郡大井町鶴ヶ岡５丁目３番１号日清製粉株式会社創薬研究所内 (72)発明者岸江孝男埼玉県入間郡大井町鶴ヶ岡５丁目３番１号日清製粉株式会社創薬研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式(Ｉ) 【化１】で示される９−シス−レチノイン酸−α−トコフェロー
ルエステルを有効成分として含有する白血病治療剤。
【請求項２】請求項１記載の化合物および１α,２５
−ジヒドロキシビタミンＤ₃を有効成分とする白血病治
療剤。
【請求項３】請求項１記載の化合物および９−シス−
レチノイン酸を有効成分とする白血病治療剤。
【請求項４】成人１日あたりの投与量が請求項１記載
の化合物１０mg〜１２００mgおよび１α,２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ₃ ０.００５μg〜５μgである請求項
２記載の白血病治療剤。
【請求項５】成人１日あたりの投与量が請求項１記載
の化合物１０mg〜１２００mgおよび９−シス−レチノイ
ン酸１.０mg〜８０mgである請求項３記載の白血病治療
剤。
【請求項６】白血病が急性前骨髄球性白血病である請
求項１〜請求項３のいずれかに記載の白血病治療剤。