JPH1077298A - 馬インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決課題】 馬の関節性リウマチなどの炎症性疾患を
治療するため副作用のない治療薬を提供する。 【解決手段】 下記に示すアミノ酸配列を有し、馬イン
ターロイキン−１の作用を阻害する馬インターロイキン
−１レセプターアンタゴニストを有効成分とする馬の炎
症治療薬。 MEIRRRSVRHLISLLLFLFYSETACHPLGKRPCKMQAFRIWDVNQKTFYM
RNNQLVAGYLQESNTKLQEKIDVVPIEPDALFLGLHGRKLCLACVKSGDE
IRFQLEAVNITDLSKNKEENKRFTFIRSNSGPTTSFESAACPGWFLCTAQ
EADRPVSLTNKPKESFMVTKFYLQEDQ*

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は馬インターロイキン
−１レセプターアンタゴニスト及びそれをコードする遺
伝子に関する。さらに詳細には、馬における炎症性サイ
トカインの一つとして重要な役割を持つ馬インターロイ
キン−１の作用を阻害する物質として有用な馬インター
ロイキン−１レセプターアンタゴニスト、その製造法、
及びその使用に関するものである。

【０００２】

【発明の背景と従来の技術】インターロイキン−１（以
下、ＩＬ−１と略す）は、単球・マクロファージを中心
とした種々の細胞から生産され、生体が受ける障害に対
して急性期の反応を引き起こす多彩な作用を持ったサイ
トカインである。その多彩な生物学的作用から種々の疾
患あるいは病態の形成に直接また間接的に関わっている
ことが近年知られるようになってきた。特にＩＬ−１は
種々の炎症において、その慢性化とその結果としての組
織破壊に関して中心的な役割を果たしており、ＩＬ−１
の作用を抑制することが疾患あるいは病態の治療に役立
つという観点から、その抑制物質、すなわちＩＬ−１阻
害剤が注目されている。

【０００３】その中でも生体内に存在する生理的物質と
してのＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（以下、ＩＬ
−１ｒａと略記する）が注目されている。ヒトＩＬ−１
ｒａは、ＩＬ−１阻害物質としてすでに１９８０年代に
単球性白血病の患者や発熱患者の尿中に存在することが
知られていた。１９９０年、ヒトＩＬ−１ｒａはＨａｎ
ｎｕｍら、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらによってヒト単球培養
細胞上清中より精製・同定されるにいたった(Hannum et
al., Nature, 343, p336-340; Eisenberg etal., Nat
ure, 343, p341-346; Carter et al., Nature, 344, p
633-638) 。ヒトＩＬ−１ｒａは分子量約１７ｋＤａの
分泌タンパク質で、１５２個のアミノ酸から構成されて
いる。そのアミノ酸配列はヒトＩＬ−１αと１９％、Ｉ
Ｌ−１βと２６％の相同性を有する(Carter et al., Na
ture, 344, p633-638; Eisenberg et al., Nature, 34
3, p341-346)。

【０００４】ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１レセプターにおい
てＩＬ−１と拮抗し、ＩＬ−１とほぼ等しい結合定数を
持って結合するが、ＩＬ−１活性は示さない。したがっ
て、ＩＬ−１ｒａが存在するとＩＬ−１はレセプターに
結合できないため、ＩＬ−１の作用が阻害されることに
なる。

【０００５】実際にこれまでにヒトの疾患・病態におい
てＩＬ−１とＩＬ−１ｒａのバランスの崩れた状態と考
えられる病態、例えば慢性関節リウマチ、敗血性ショッ
ク、急性骨髄性白血病、炎症性腸疾患などで組換えＩＬ
−１ｒａ投与による病態の改善が数多く報告されている
（田中, 塩澤. 医学のあゆみ, 174, p1218-1222)。

【０００６】これらの報告の中で注目すべきことはその
多くで投与量の多少に関わらず重篤な副作用がなく、ま
た、それに対する抗体産生が見られなかったという事実
である。これはＩＬ−１ｒａが元来生体内に存在する生
理活性物質であることに由来するものと考えられ、治療
薬として有用な点である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】馬は産業動物としても
飼育されているが、一方、競走馬として重要視されてい
る。したがって、競走馬が、たとえば関節性リウマチな
どの重篤な炎症性疾患に陥いると競走馬としての生命を
奪われ、たとえ軽微な炎症であっても競馬に影響するた
め、炎症を治療するため副作用のない治療薬が必要とな
る。したがって、安全で強力な効果を持つＩＬ−１ｒａ
が注目される。

【０００８】しかしながら、馬ＩＬ−１ｒａは馬を飼育
して、もしくは馬由来の培養細胞を用いて大量に生産す
る技術は確率されておらず、また精製する試みさえされ
ていない。したがって、患馬に治療剤として使用するの
に必要な十分量を入手することは困難である。また、ヒ
トなど他の種のＩＬ−１ｒａを流用することも考えられ
るが、投与の際にそれらに対して免疫反応を惹起し、ま
た、抗体を誘導する危険性があり、さらに、馬における
効果は低いと予想される。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点に鑑み、馬ＩＬ−１ｒａを安価に供給すべく馬ＩＬ
−１ｒａをコードする遺伝子をクローニングし、さらに
該遺伝子を有する発現ベクターを作製し、本発明の完成
にいたった。

【００１０】すなわち、本発明は、馬ＩＬ−１の作用を
阻害し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する馬ＩＬ
−１ｒａを提供するものである。

【００１１】前記のアミノ酸は、馬インターロイキン−
１の作用を阻害するものであればその配列の一部が欠失
もしくは置換、あるいは１〜複数個のアミノ酸の付加、
さらにはこれらの操作の組み合わせによって作成された
アミノ酸配列を有するものであってもよく、これらは遺
伝子組換え技術によって造成された組換えＩＬ−１ｒａ
遺伝子を用いて得ることができる。

【００１２】本発明の上記のアミノ酸配列を有する馬Ｉ
Ｌ−１ｒａの生物活性を有するタンパク質は、配列番号
１の塩基配列を持つ遺伝子断片、あるいは馬ＩＬ−１ｒ
ａをコードするゲノム遺伝子から転写・翻訳されたもの
である必要はかならずしもなく、例えば、化学合成法等
により生産されるものであっても良い。また、配列番号
１の塩基配列も、化学合成法、ＤＮＡ複製法、逆転写
法、転写法などいずれの方法によって得たものであって
も良い。

【００１３】本発明はさらに当該遺伝子を用いての遺伝
子組換え技術による馬ＩＬ−１ｒａの製造方法を提供す
る。

【００１４】馬ＩＬ−１ｒａ生産細胞は次のようにして
作出することができる。

【００１５】宿主細胞が真核細胞の場合は、例えば、配
列番号１に示すアミノ酸配列を有する馬ＩＬ−１ｒａ遺
伝子断片を有するＤＮＡ断片をウイルス等のプロモータ
と結合させ、真核細胞を形質転換させて馬ＩＬ−１ｒａ
生産細胞を作出することができる。また、バキュロウイ
ルス等の組換えウイルスベクターを用いた場合は、たと
えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Smith et al., Mol. Cell.
Biol., 3, p2156-2165 ）に基づいて、組換えウイルス
ベクターを作出することができる。すなわち、馬ＩＬ−
１ｒａタンパク質をコードするＤＮＡ断片をバキュロウ
イルスの多核体プロモータと連結し、そのトランスファ
ーベクターをバキュロウイルスＤＮＡとともに昆虫細胞
に導入し、得られた組換えバキュロウイルスの内、馬Ｉ
Ｌ−１ｒａの活性を生産する組換えウイルスクローンを
選択し、その組換えクローンを昆虫細胞もしくは昆虫に
感染させ、馬ＩＬ−１ｒａタンパク質を生産することが
できる。

【００１６】また、宿主細胞が原核細胞である場合は、
例えば発現ベクターに馬ＩＬ−１ｒａタンパク質をコー
ドするＤＮＡ断片を連結し、真核細胞を形質転換させて
馬ＩＬ−１ｒａ生産細胞を作出することができる。

【００１７】これらの遺伝子組換え操作は、既知の手法
に従って行えば良く、特に限定されない。遺伝子操作技
術・細胞工学技術によって、たとえばシグナル配列の付
加や改良、宿主−ベクター系の好適選択、遺伝子の発現
制御部位の改良等により発現効率の調節などを図ること
ができる。また、宿主の選択により糖鎖が結合されたも
のとして得ても良い。

【００１８】本発明はまた、上記形質転換された細胞を
培養し、生産される馬ＩＬ−１ｒａタンパク質を分離回
収することによって該タンパク質を製造する方法を提供
することを特徴とする。培養細胞からの上記タンパク質
の分離は通常の方法を用いることができるが、アフィニ
ティカラムクロマトグラフィーによる方法、特には特異
抗体を結合させた担体を用いる方法が好ましく用いられ
る。

【００１９】本発明によれば、形質転換させた細胞等を
用いて馬ＩＬ−１ｒａタンパク質を大量に生産すること
ができ、馬の炎症治療薬として用いることができる。

【００２０】なお、以上の操作は、サムブロックら（Sa
mbrook et al, 1989, Molecular cloning: a laborator
y manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor, New Yor
k: Cold Spring Harbor Press ）等の既知の遺伝子操作
技術・細胞工学技術にしたがって行うことができる。

【００２１】本発明はさらに、本馬ＩＬ−１ｒａを有効
成分として含有する医薬組成物を提供することを特徴と
する。この医薬組成物は炎症治療薬として好ましくは用
いられる。また、本馬ＩＬ−１ｒａを用いれば、公知の
手法により特異抗体を得ることもできる。本特異抗体は
馬ＩＬ−１ｒａを測定する手法に特に有効で、それによ
り、馬の炎症性疾患に関する情報を提供することができ
る。

【００２２】

【発明の実施の形態】配列番号１のアミノ酸配列を有す
る馬ＩＬ−１ｒａの生物活性を有するタンパク質は以下
のようにして同定することができる。

【００２３】すなわち、馬の末梢単核球をＬＰＳ（リポ
ポリサッカライド）で刺激し、それらの細胞ＲＮＡを抽
出する。そのＲＮＡに対してｃＤＮＡを作製し、ヒト・
マウスですでに報告されている遺伝子配列を元に作製し
た合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ
チェーン リアクション）法により目的とする遺伝子
領域を増幅した。これを市販のベクターに組み込んで塩
基配列を決定し、ヒト・マウス・ウサギのＩＬ−１ｒａ
遺伝子と相同性のあるクローンを選択し、さらに、タン
パク質をコードする全塩基配列を決定するために、上記
ｃＤＮＡを組み込んだｃＤＮＡライブラリーを作成し、
ＰＣＲクローニングしたＤＮＡ断片をプローブとしてス
クリーニングしｃＤＮＡクローンを得る。さらに、ＰＣ
Ｒ法により、残りのｃＤＮＡ断片をクローニングし、以
上のクローニングされたｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定
する。それらを組み合わせることにより、ｃＤＮＡの全
体の塩基配列を明らかにする。さらに、クローン化され
たｃＤＮＡのタンパク質をコードする遺伝子断片を融合
タンパク質として大腸菌で発現させ、生物活性を確認す
ればよい。

【００２４】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。

【００２５】（１）ｃＤＮＡの合成 ＩＬ−１ｒａはヒトでは主としてリポポリサッカライド
（以下、ＬＰＳと略記する）の刺激により単球、マクロ
ファージで生産されることが報告されている（Andersso
n et al., Eur. J. Immunol., 22, p2617-2623）。した
がって、馬ＩＬ−１ｒａのｃＤＮＡを作製するために、
正常な馬から血液を採取し、単球を含む末梢血単核球
（以下、ＰＢＭＣと略記する）を分離・精製した。

【００２６】すなわち、血液をリン酸緩衝生理食塩水
（以下、ＰＢＳと略記する）で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−
Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ^TM、Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社製）に重層した後、１７５０ｒｐｍ ｘ４０
ｍｉｎで遠心し、血漿とＦｉｃｏｌｌとの界面に存在す
るＰＢＭＣを回収した。

【００２７】回収したＰＢＭＣを１０％ ＦＣＳ、５０
μｇ／ｍｌ ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０
（日水製薬株式会社製）に細胞濃度 １×１０⁵ ／ｍｌ
になるように浮遊させ、５μｇ／ｍｌ ＬＰＳを加
え、２４時間、３７℃、５％ ＣＯ₂ 下で培養した。細
胞を遠心で集め、直ちにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社から
販売されているＦａｓｔ ＴＲＡＣＫ^TM ｍＲＮＡ Ｉ
ｓｏｌａｔｉｏｎキットに添付されているＬｙｓｉｓバ
ッファで細胞を溶解した。次に、本キットに添付されて
いるプロトコールにしたがってｍＲＮＡを分離し、エタ
ノール沈殿状態とした。

【００２８】次に、得られたｍＲＮＡを滅菌蒸留水に溶
解し、そのうちの１μｇを鋳型とし、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ 社より販売されているｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓキットを用いて、添付のプロトコール通りに反応を行
い、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡは１００μｌの滅菌
蒸留水に溶解した。

【００２９】（２） ＰＣＲによる増幅 （２−１） ３Ｓ５Ｒフラグメントの増幅 ヒトおよびマウスのＩＬ−１ｒａ遺伝子の間でよく保存
されている領域の塩基配列をもとに、下記の塩基配列を
有するＤＮＡプライマー、３Ｓおよび５Ｒを合成した。

【００３０】 ３Ｓ： 5'-TGCAAGCCTTCAGAATCTGGGA-3' ５Ｒ： 5'-ATCGCTGTGCAGAGGAACCA-3' なお、これらのプライマーはヒトＩＬ−１ｒａ遺伝子の
塩基配列に次のように対応する。すなわち、３Ｓは１０
４番目から１２５番目の塩基配列に、５Ｒは４２９番目
から４４９番目の塩基配列に対応する。

【００３１】前記「（１）」で合成したｃＤＮＡのうち
１μｌ、３Ｓプライマー（０．４μＭ）、５Ｒプライマ
ー（０．４μＭ）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１．
５Ｕ）を用いて、市販のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｇ
ｅｎｅ Ａｍｐキットにて全量１００μｌで、９４℃
１分、５５℃ １分、７２℃ １分からなる行程を１サ
イクルとして３０サイクルからなるＰＣＲを行った。Ｐ
ＣＲの産物を３％アガロースゲルで電気泳動を行い、臭
化エチジウムにて染色後、紫外線照射下で約３００ｂｐ
のバンドを切り出し、Ｔａｋａｒａ ｓｕｐｒｅｃ−０
１カラムにて添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを回収
した。

【００３２】（２−２） ＰＣＲ産物のクローニング 前記「（２−１）」で得られたＰＣＲ産物を、ＴＡ−ｃ
ｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて
ＰＣＲＩＩプラスミドベクターへ組み込んだ後、大腸菌
ＩＮＶαＦ’株（ＯｎｅＳｈｏｔキット，Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ社製）へ遺伝子導入し、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリン、３６μｇ／ｍｌの５−ブロム−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドおよび４０μｇ
／ｍｌのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（以
下、ＩＰＴＧと略する）を含んだ２×ＹＴ培地で作成し
たアガープレートで選択した。３７℃で一晩培養し、現
れてきたコロニーのうち白いものをランダムに選択し、
引き続き、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ２ｍ
ｌの２×ＹＴ培地で一晩培養した。遠心により大腸菌を
集菌した後、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸
（以下、ＥＤＴＡと略記する）、５％トリトンＸ−１０
０を含むバッファに大腸菌を浮遊させ、２５０μｇのリ
ゾチームを加えて大腸菌の細胞壁を破壊した。大腸菌の
浮遊液を１００℃の温浴で４０秒間熱することで溶菌
し、１２０００ｇで１０分間遠心し、ペレットを除い
た。上清に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
２）と等量のイソプロパノールを加え、核酸を沈殿と
し、１２０００ｇで５分間遠心して沈殿を回収した。沈
殿を７０％エタノールで洗浄し乾燥させた後、２０μｇ
／ｍｌのＲＮａｓｅを含むＴＥバッファ（１０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し
た。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、
アガロースゲルで電気泳動することにより、ｃＤＮＡが
組み込まれているプラスミドＤＮＡを持つ大腸菌クロー
ンを選択した。

【００３３】（２−３） 塩基配列の決定 ｃＤＮＡが組み込まれていたクローンを２×ＹＴ培地で
５０ｍｌ培養し、プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ Ｐ
ｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉキット（Ｂｉｏ１０１、Ｉｎ
ｃ．社製）にて添付のプロトコール通り操作し、抽出・
精製した。組み込まれたｃＤＮＡの塩基配列をＡｕｔｏ
Ｒｅａｄ Ｓｅａｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製）を用い、キットに含まれるプライマー
を利用して添付のプロトコールに従って決定した。

【００３４】（３）ｃＤＮＡライブラリーの作製および
スクリーニング ｃＤＮＡライブラリーはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＬａ
ｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ Ｖｅｃｔｏｒキットを用い、
添付のプロトコール通り行った。

【００３５】すなわち、前記「（１）」で得られたｃＤ
ＮＡにキットに添付されているＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリ
ンカーを結合し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したλＺＡ
Ｐ−ＩＩベクターと混合し、ライゲーションを行い、ｃ
ＤＮＡをベクターに組み込んだ。さらに、Ｇｉｇａｐａ
ｃｋ Ｐｌｕｓ キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）
を用いて添付のプロトコールに従いパッケージングを行
い、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。前記「（２−
２）」で得られた馬ＩＬ−１ｒａ ｃＤＮＡ断片を³²Ｐ
で標識したものをプローブとして用い、プラークハイブ
リダイゼーション法によりこのｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングした。

【００３６】すなわち、ファージプラークを転写したフ
ィルターを作成し、そのフィルターを１００ｍＭ／ｍｌ
鮭精子ＤＮＡ、標識プローブを含むハイブリダイゼーシ
ョン溶液（５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、５％アイ
リッシュクリーム、４×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．
１８Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１Ｍ リン酸ナトリウ
ム，１ｍＭ ＥＤＴＡ））で３７℃で１８時間保温し
た。フィルターを０．１％ＳＤＳを含む４ｘＳＳＣ（１
ｘＳＳＣは０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム）で、１時間ずつ３回洗浄した。
フィルターをＸ線フィルムと重ね、−７０℃でオートラ
ジオグラフィーを行った。

【００３７】陽性クローンを３回同様の方法でプラック
クローニングし、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ Ｖｅｃ
ｔｏｒキットのプロトコール通り、Ｒ４０８ヘルパーフ
ァージを用いてインサートを持ったプラスミドクローン
を取り出した。本プラスミドクローンはｐＥｒａ２と命
名した。

【００３８】ｐＥｒａ２のｃＤＮＡインサートの塩基配
列を前記「（２−３）」に示した方法で決定した。

【００３９】（４） ５’領域のクローニング 前記「（３）」で作成したＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリンカ
ーを結合したｃＤＮＡを、ｐＵＣ１１８プラスミドベク
ターのＥｃｏＲＩ部位に組み込み、それを鋳型として、
ｐＵＣ１１８特異的プライマーＯＵＴおよび馬ＩＬ−１
ｒａ特異的プライマーｒａ４Ｒを用いて前記「（２−
２）」と同様にＰＣＲを行い、クローニングした。ＯＵ
Ｔ、ｒａ４Ｒプライマーの塩基配列は以下の通りであ
る。

【００４０】 ＯＵＴ； 5'-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3' ｒａ４Ｒ； 5'-GCTCAGGTCAGTGATGTTAAC-3' 以上のｃＤＮＡの塩基配列は前記「（２−３）」に示し
た方法で決定した。

【００４１】（５）塩基配列の比較 以上の方法で決定されたｃＤＮＡ断片の塩基配列を結合
し、馬ＩＬ−１ｒａｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。
塩基配列と予想されるアミノ酸配列を配列番号１に示
す。予想されるアミノ酸配列をヒト、マウス、ウサギの
ＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列と比較し、それらを並記し
た図を図２に示す。また、計算される相互の相同性を表
１に示す。馬ＩＬ−１ｒａはヒト、マウス、ウサギのＩ
Ｌ−１ｒａとそれぞれ、７５．７％、７５．３％、およ
び７６．３％の相同性を示した。また、ヒト、マウス、
ウサギのＩＬ−１ｒａで保存されているＮ型糖鎖の部
位、５つのシステイン残基の部位も保存されていた。

【００４２】（６）馬ＩＬ−１ｒａの生物活性 （６−１） グルタチオン−Ｓ−転移酵素（以下、ＧＳ
Ｔと略す）−馬ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質の生産 馬ＩＬ−１ｒａ ｃＤＮＡのアミノ酸コード領域から、
予想されるシグナルペプチドをコードする領域を除いた
領域、すなわちＯＲＦの塩基配列７０番目から５３４番
目に相当するＤＮＡ断片をＰＣＲ法で調製した。下記の
プライマーＥＥｒａＳ、ＥＥｒａＲを合成した。

【００４３】 ＥＥｒａＳ； 5'-CGGAATTCGCCTGCCACCCTTTGGGGAA-3' ＥＥｒａＲ； 5'-CGCTCGAGCTACTGGTCCTCCTGGAGGT-3' ベクターと結合するため、プライマーＥＥｒａＳおよび
ＥＥｒａＲはそれぞれ、５’端にＥｃｏＲＩもしくはＸ
ｈｏＩの制限酵素部位を付加してあり、その塩基配列を
下線で示した。さらに、プライマーＥＥｒａＳは、Ｅｃ
ｏＲＩ部位で結合したとき、ＧＳＴタンパク質と馬ＩＬ
−１ｒａとがフレームがあうよう設計されている。

【００４４】ＰＣＲはｐＥｒａ２を鋳型として前記
「（２−１）」と同様に行った。ＰＣＲ産物のＤＮＡ断
片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、前記「（２
−１）」と同様にアガロースゲルを用いて精製した。発
現ベクターはｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）を利用し、同社のＢｕｌｋ ａｎｄ ＲｅｄｉＰａ
ｃｋ ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌ
ｅｓキットを用いて添付のプロトコールに従い、発現・
精製した。

【００４５】すなわち、ｐＧＥＸ発現ベクターをＥｃｏ
ＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、上記精製ＰＣＲ断片を組
み込んだ。大腸菌ＤＨ５α株（ＢＲＬ社製）へ遺伝子導
入し、前記「（２−２）」と同様の方法でｃＤＮＡの組
み込まれているクローンを選択した。ｃＤＮＡの組み込
まれているクローンを２ｍｌの２ｘＹＴ培地で一晩培養
し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、２時間発現誘導し
た。大腸菌を遠心して集め、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０を加えたＰＢＳに懸濁し、超音波処理で溶菌した後、
キットに添付されているグルタチオンセファロース４Ｂ
ＲｅｄｉＰａｃｋカラムを用いてプロトコールに従っ
て精製し、馬ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質サンプルとし
た。またコントロールとして、インサートの入っていな
いクローンより同様の方法でＧＳＴタンパク質サンプル
を得た。

【００４６】（６−２） バイオアッセイ ＩＬ−１ｒａの生物活性は、、ヒトＩＬ−１により増殖
が抑制されるヒトメラノーマ由来Ａ３７５−Ｓ２細胞を
用いたバイオアッセイにより検討した。

【００４７】なお、この定量系は馬細胞を用いた系では
ないが、対象とするサイトカイン・リンフォカイン等が
種特異性が低い場合に異種で用いられているアッセイ系
を利用し生物活性を測定する方法は、例えばインターロ
イキン４(Howard et al.,J.Exp.Med.,155,914,(1982)
)、インターロイキン７(Conlon et al.,Blood,74,136
8,(1989))など、多数のサイトカイン・リンフォカイン
等の活性測定で採用されている一般的な方法である。

【００４８】すなわち、１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ培養液に１×１０⁵ ／ｍ
ｌの濃度になるようにＡ３７５−Ｓ２細胞を浮遊させ、
０．８Ｕ／ｍｌヒト組換えＩＬ−１βを加えた上で、そ
れぞれ蛋白質濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌに調製したの
ち、３倍段階希釈したＧＳＴタンパク質サンプルあるい
は馬ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質サンプルを添加した。
アッセイは一希釈につきトリプリケイトで行った。

【００４９】以上のように調整した培養液でＡ３７５−
Ｓ２細胞を３７℃、５％ＣＯ₂ 下で７２時間培養した。
細胞の増殖は次のように判定した。

【００５０】すなわち、培養後、培養上清を除き、細胞
シートをＰＢＳで洗浄後、２０％エタノール水溶液に溶
解した０．０５％クリスタルバイオレット溶液にて１０
分間染色した。余分なクリスタルバイオレットを水洗に
より除いた後、１００％メタノールを細胞に添加するこ
とで細胞に結合したクリスタルバイオレットを溶出し、
ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いてクリスタルバイオ
レットの吸収波長である５４０ｎｍの吸光度を測定した
（図３）。

【００５１】ＧＳＴタンパク質添加では５４０ｎｍの吸
光度は低く、すなわち、細胞増殖が抑制されていた。こ
の抑制は培養液中に加えたヒト組換えＩＬ−１βの作用
によるが、その抑制効果はＧＳＴタンパク質添加では解
除されなかったことを示す。一方、ＩＬ−１ｒａ融合タ
ンパク質サンプルを加えた場合、濃度依存的にヒト組換
えＩＬ−１βの増殖抑制作用は阻害され、すなわち、細
胞が増殖して高い吸光度を示した。以上のことから本遺
伝子がＩＬ−１の作用を抑制する活性、すなわち、ＩＬ
−１ｒａ活性を有すると判断された。

【００５２】

【表１】

【００５３】

【発明の効果】本発明によれば、馬ＩＬ−１ｒａ遺伝子
を遺伝子工学的手法により発現させ、馬ＩＬ−１ｒａタ
ンパク質を大量に製造することができ、馬の炎症治療薬
として用いることができる。

【００５４】

【配列番号１】 (-13)GCGGCCGCACAGG ATGGAAATCCGCAGGCGTTCTGTCAGACACCTAATCTCTCTCCTCCTTTTCTTGTTCTAC 60 M E I R R R S V R H L I S L L L F L F Y 20 TCAGAGACAGCCTGCCACCCTTTGGGGAAGAGACCCTGCAAGATGCAAGCCTTCAGAATC 120 S E T A C H P L G K R P C K M Q A F R I 40 TGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTACATGAGGAATAACCAACTAGTTGCTGGATACTTG 180 W D V N Q K T F Y M R N N Q L V A G Y L 60 CAAGAATCAAATACTAAATTACAAGAGAAGATAGATGTGGTGCCCATTGAGCCTGATGCT 240 Q E S N T K L Q E K I D V V P I E P D A 80 CTATTCCTGGGACTCCATGGGAGGAAGCTGTGCCTGGCCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAG 300 L F L G L H G R K L C L A C V K S G D E 100 ATTAGGTTCCAATTGGAGGCAGTTAACATCACTGACCTGAGCAAGAACAAGGAGGAGAAC 360 I R F Q L E A V N I T D L S K N K E E N 120 AAGCGCTTCACCTTCATCCGCTCAAACAGTGGCCCCACCACCAGCTTCGAGTCTGCCGCC 420 K R F T F I R S N S G P T T S F E S A A 140 TGCCCTGGCTGGTTCCTCTGCACGGCGCAGGAGGCAGACCGGCCCGTCAGCCTCACCAAC 480 C P G W F L C T A Q E A D R P V S L T N 160 AAGCCCAAAGAGTCCTTCATGGTCACCAAGTTCTACCTCCAGGAGGACCAGTAGAACTGC 540 K P K E S F M V T K F Y L Q E D Q * 177 CCGTAGCTCCGCTTCCCCTATTCCCAGCACGTCGATGACTCCAGAGACTGCCTCTCCACC 600 CCAGGGTCTCCTGGGGCTCTGAGGAGCAGCCTTGGCAGGGTGGGCCCTCAGAAGGAGGTA 660 CACGAGCCCTCGTAACAGGACTCTGTCTCCAGCCTCCTCAGCTATCCCACCCTCCATGCT 720 GCTTCCACCATGGTCTTTCTAAAGTGCAGCTCAAACCACGGCCCTACTTAAAGCCCTTCA 780 GTGTCGTCTGTACCTTCAGGATAAAATCCGGGCCACCTGGCCAGCCTGGATGCCCTCTGC 840 TCTCCTCTCTCAAGTCTTCCTTCTCCCTCACCCCACTGTCCCTGCCCGAGATCCCTCAGG 900 CCACTCACTGGCCCCCCACCAATGGCTCTCATACCTTGTTTTGGAATCTGATGCTGTTCT 960 GTAGGGAAGACTTTTAGAGTCTGTGGCAAAATGGAAAATAAGAATTTCATGAAACTTTCT 1020 AAAGCCAGCTTTATCCAATTTGAAGGAGAGTCCTTTATTTGGAGATTATTTCCTTTTTGC 1080 AAAGGGGTGGGGATCAAAATATTCCTGTGTTTGTGAAGTGATAGTGAAGGGAGGTTCCCT 1140 TGTTAGTGTCCATTCTTGTTTTTGTAATACCCTAACCGGTAAAAATGAACAGTTAGTGTA 1200 CTATGTTTGTCCCTTATTCTTTCTTTCTGAAACGTTCCTGTAAGTCTGGACCCACTGCCC 1260 GGGCCTGAGCACCACCTCCATTGCAGACCTTTCACAGCTGCCCACAGTGCTTTCCCCTCC 1320 CATCAAAGGTTCCCCTGCTCCCACGGCACAGCACAAATGTGGCTCCTCCAAGGCCTTTCC 1380 TGATCTCCCGGGAGGAATGAATCGCTCCTTGACCATTTTAGCACTTCTGACGCTCTGAAA 1440 CTTGTTTGAAAGGTGGTTATGCCTCTGTCTGTCTCCTGCCCCAAACTGTGAGCTCCTGGA 1500 AGCAGGGAACATGACTGGCATGTGTCTCAGCTTCCCCCAGGGCCAAGCACATGGCCTGTT 1560 TTACAATAAAACCTTGA 1577

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はｃＤＮＡの全長の塩基配列を決定した方
法を模式的に示す。

【図２】図２はヒト、マウス、のＩＬ−１ｒａ遺伝子と
馬ＩＬ−１ｒａ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ
酸配列を相同部分が最大となるように並記した結果を示
した。

【図３】図３は大腸菌で発現させた馬ＩＬ−１ｒａの生
物活性を測定した結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＥＲ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ０７Ｋ 14/545 ＺＮＡ 9282−4Ｂ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 高木 茂美 神奈川県町田市成瀬5092−３ エステ・ス クエア成瀬壱番館601号 (72)発明者 亘 敏広 神奈川県秦野市南が丘２−２−２−304 (72)発明者 辻本 元 東京都杉並区成田東５−４−24 (72)発明者 長谷川 篤彦 東京都武蔵野市吉祥寺北町４ー７ー16

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有
   し、馬インターロイキン−１の作用を阻害する馬インタ
   ーロイキン−１レセプターアンタゴニスト
2. 【請求項２】 配列番号１記載の馬インターロイキン
   −１レセプターアンタゴニストと同一のアミノ酸配列、
   またはその一部が欠失もしくは置換、あるいは付加、さ
   らにはこれらの操作の組み合わせによって作成されたア
   ミノ酸配列を有し、馬インターロイキン−１の作用を阻
   害する、遺伝子組換え技術によって発現された組換えイ
   ンターロイキン−１レセプターアンタゴニスト。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の馬インターロ
   イキン−１レセプターアンタゴニストのアミノ酸配列を
   コードする遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の遺伝子を含む発現ベ
   クター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の発現ベクターにより
   形質転換された宿主。
6. 【請求項６】 請求項１又は２に記載の馬インターロ
   イキン−１レセプターアンタゴニストを有効成分として
   含有する医薬組成物。
7. 【請求項７】 馬の消炎症薬である請求項７に記載の
   医薬組成物。
8. 【請求項８】 請求項１又は２に記載の馬インターロ
   イキン−１レセプターアンタゴニストを抗原とする抗
   体。
9. 【請求項９】 請求項５に記載の宿主を培養または飼
   育し、産生された馬インターロイキン−１レセプターア
   ンタゴニストを採取することを特徴とする馬インターロ
   イキン−１レセプターアンタゴニストの製造方法。