JPH06506195A - サイトカイン誘導タンパク質、ｔｓｇ−１４、そのためのｄｎａコード化およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サイトカイン誘導タンパク質、ＴＳＧ−１４、そのためのＤＮＡコード化および その使用 光匪■宵景 発朋塑韮涛−分厨 本発明は腫瘍壊死因子によって結合＆ＩｌＶ＆細胞中に誘導できるタンパク質、 ＴＳＧ−１４、またはＴＳＧ−１４タンパク質を符号化するインターロイギン− １、ＤＮＡおよびｍＲＮ八、タンパク質の機能誘導体、タンパク質に特異的な抗 体、タンパク質およびＤＮＡを製造する方法、およびタンパク質、ＤＮＡ、ｍＲ Ｎ＾、ペプチドおよび抗体の使用に関するものである。

■−伎避＝Ｑ糺述 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は腫瘍および感染性の作用因に対する宿主防御において 重要な強力な多面発現性サイトカインである。

ＴＮＦはまた幾つかの悪性の疾患、感染および自己免疫障害の病理学に影響を与 えてきた。ＴＮＦの大抵の生物学上の作用は標的細胞中の複雑な遺伝プログラム の誘発にあるとすることができる。

ＴＮＦによって活性化する幾つかの遺伝子が同定されたがさらに多くの特性を与 えることが必要である。

−工ｊｑ、−Ｆ−（７）−二般約方−性雀ＴＮＦ　（またＴＮＦ−αおよびカケ クチンと呼ばれる）は細菌性ワクナン（カルメノト−ゲラン菌、ＢＣＧ）および エンドトキソン逐次注射した動物の血清内に元来検出された活性化単核白血球／ マクロファージによって生成されるタンパク質である（力Ｊレウェル・イー・エ イら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ倶よ」り坦づり工Ｊ鉢　互：　３６６６（１９７５）） 　、　ＴＮ　Ｆは元来リンホトキシン（ＬＴ）と呼ばれる活性化Ｔリンパ球によ って生成されるサイトカインに構造的機能的に関係しており、またＴＮＦ−βと して知られている（アノガーワル・ビー・ビーら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、２６０：２３３４　（１９８５））；　ウイリアスム・ティ・ダブリュら、Ｎ ａｔｕｒｅ　２１９：１０７６　（１９６８）；ルノドルーｘヌ・エイチら、Ｊ 、Ｅ×０Ｍｅｄ８月！８：１２６７　（１９６８）；スピース・ティら、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＤＮＡ　８３：８６９９　（１９８６ ）；　グレイ・ビー・ダブリュら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア２１　（１９８４ ）；ペンニカ・ディ・ダブリュら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア２４　（１９８４ ））　、　Ｔ　Ｎ　ＦおよびＬＴを符号化する遺伝子は結合し、ヒト染色体６の 短いアーム上のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子座付近にある（スピース・ティら、上記）。

ＴＮＦおよびＬＴは共通の細胞表面受容体に結合する（アソガーワル・ビー・ビ ーら、Ｎａｔｕｒｅ　３１Ｂ：６６５　（１９８５））。

°自然のヒ）ＴＮＦは１５７個のアミノ酸であり、変性条件下に約１７ｋＤａの 分子量をもつ非グリコジル化タンパク質である。成熟分子は７６の追加のアミノ 酸をＮ−末端で含む前駆体（ｐｒｅ−Ｔ　Ｎ　Ｆ　）から誘導される（ペンニカ ・ディ・ダブリュら、上記）。遺伝子符号化ＴＮＦの発現は単球／マクロファー ジ科の細胞に限られない。複数のヒ）・の非単球腫瘍細胞系はＴＮＦを生成する ことが示された（ルピン・ビー・ロイら、Ｊ、　Ｅｘ且工１リユ　坦：１３５０ 　（１９８６）；スプリノグズ・ディら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、ＤＮＡ　８４：６５６３（１９８７）　）。ＴＮＦはまたＣＤ４’お よびＣＤ８”末梢血液Ｔリンパ球によって、および種々の培養したＴおよびＢ細 胞系によって生成される（クラリ・エム・シーら、よし一旦５し一町ｌユ　■臣 ：１５８１（＋９８７）　；スンプ・ニス、−ニス・グレイら、Ｌ−ｂ上ユ１１ ユ　層数１５３９　（１９８８）　）。

蓄積する証拠ではＴＮＦが多面発現性の生物学上の活性をもつ調節サイトカイン であることを示している。これらの活性は次のものを含む：リボタンパク質リパ ーゼ合成の阻害じカケクチン”活性）（ビニ−トラ−・ビーら、μ遅且匹　冴： ５５２　（１９８５））　、多９８７）、細胞生長の阻害または細胞生長の刺激 （ヴイルセク・グレイら、Ｊ、　Ｅかニブ旦、Ｊ−卵：６３２　（１９８Ｇ）； 　スガーマン・ビー・ジエイラ、鉢セ匪聾−３３０：９４３（１９８５）　；ラ ッチマン・エル・ビーら、ム１＋ｕｗｕｎｏ１．　↓３８：　２９１３　（１９ ８７））　、一定の形質転換細胞タイプの細胞障害作用（ラッチマン・エル・ビ ーら、上記；ダルチンキーウ刺激とプロスタグランジンＥ２生成（デイヤー・グ レイ・エムら、ム」狂ユ勿先　１−リ：２１６３　（１９８５）　、その他の使 用。ＴＮＦの概観にツイテは、参照へウトラー・ビーら、Ｎａｔｕｒｅ　３２０ ：５８４　（１９８６）；またＴＮＦは免疫Ｉ整作用を有し、Ｔｌ１ｌ胞の活性 化（ヨコタ・ニスら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４０：５３１　（１９８Ｂ） ）　、Ｂ細胞（ケールル・グレイ・エイチら、ム」１匹」睡（月；６：７８６　 （１９８７））　、単球（フィリップ　アールら、Ｎａｔｕｒｅ　３２３：８６ 　（１９８６））、胸腺細胞（レンジズ・ジー・イーら、Ｌ」狸、九（即：１４ １２　（１９８Ｂ））、および腫瘍組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩお よびクラス■分子の細胞表面発現の刺激（コリンス・ティら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：４４６　（１９８６）；プジョル・ボレル・アールら 、騒旦匹蔓虹３０４　（１９８７））を含む。

またＴＮＦはＭ織損傷に帰する種々の前炎症性作用ををし、例えば血管内皮細胞 での凝血促進剤の誘発（ホバー・グレイ・ニスら、Ｊ、　Ｉｍ＋＊ｕｎｏ１．　 匡１６８０　（１９８６））、好中球とリンパ球の増大した接着（ホバー・グレ イ・ニスら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３８：３３１９　（１９８７））、お よびマクロファージ、好中球および血管内皮細胞からの血小板活性化因子（Ｐ　 Ａ　Ｆ）の放出の刺激（カムノシ・ジーら、ム」狂。

Ｍｅｄ、、　１６ｆｃ１３９０　（１９８７））、最近の証拠は多くの感染の病 原においテ（セラミ・エイら、とＵ匹ＬＪ列ｎ　β：２Ｂ　（１９８８）　、免 疫不全症（ビグニレビー・エフら、Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、１６６：１２８０ 　（１９８７））、および若干の悪性度を伴う悪液質において（オリフラ・ニー ら、釦旦　５０：５５５　（１９８７））においてＴＮＦに関係している。ミシ ェ・エイチ・アールら、Ｂｒ、　Ｊ、　Ｓｕｒ　、７６：６７０−６７１　（１ ９８９）　ハ、ＴＮＦはひどいセプシスの病変に関連した主要な媒介物である証 拠を概説した。

またＴＮＦは増血前駆細胞の生長と分化に関連した活性をもつ（ムルフィ・エム ら、Ｌ」狂、勘ム　１６４：２６３　（１９８６）　；ブロソクスマイヤー・エ イチ・イーら、Ｊ、　Ｉｎ＋…ｕｎｏ１．虚：４４８７　（１９８６））；これ らの作用の若干は間接的であり、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ −Ｃ３Ｆ）（ムンヵー・アールら、Ｎａｔｕｒｅ３２３ニア９　（１９８６）） および他の造血生長因子（ヅヵリ・グレイ・アールら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 　１＋卸：８４６　（１９８８））の生成の刺激によって仲介されると考えられ ている。

ＴＮＦによる゛　云　の１ 従って、ＴＮＦは極めて“用途の広い”臨床的に重要なサイトカインであること は明らかである。その作用の大部分は作用する際に細胞内の特定の遺伝子の活性 化または不活性化によって仲介されるようだ、この作用方法のひとつの例外は一 定の標的細胞上のＴＮＦの迅速な細胞毒性効果である；この効果はＲＮＡまたは タンパク質合成のインヒビターによって増大し、遺伝子発現の調節に依存するよ うには思われない（マッシュウズ・エヌ、Ｂｒ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　４８：４０５　（１９８３））、多くの特異的遺伝子生成物はＴ ＮＦ処理細胞内にアップに調節されているように示されたが、その幾つかを以下 に記述する。

ＴＮＦ！ｌｉｔ節遺伝子の発現の第１の例の中ｆ、ＴＮＦ処理がＭＨＣクラスＩ 　＋ｌＲＮ＾水準においてそしてヒト血管内皮細胞（ＨＵ　Ｖ　ＥＣ）および正 常及繊維芽細胞においてＭＨＣクラス■糖タンパク質の表面発現において増加を 誘発することが示された（コリンス・ティら、上記）。ＴＮＦによって誘発され る他の分子（また遺伝子）の一部のリストを以下の表１に示しである。外因的に 添加されたＴＮＦは単球および単球細胞系におけるＴＮＦ合成を増加するので、 ＴＮＦが自己調節サイトカインであることは特に興味あることである（フィリッ プ・アールら、Ｎａｔｕｒｅ　３２３：８６　（１９８６）；シュミド・ジエイ ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３９：２５０　（１９８７））。

表± によ　て悸　された゛　−と　ンパク ンパク　または′−１２ＪＬ 白血球接着９７ハク’ｉＨ４／１８　ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃ（１）血小板由来増殖因 子　ＨＵＶＥＣおよび　（２）（ＰＤＧＦ）　若干の腫瘍細胞系 ＩＬ−６（ＩＦＮ−β２またはＢＳＰ−２）　ヒト皮膚繊維芽細胞　（３）ＨＬ Ａ−ＤＲヒト腫瘍細胞系　（４） コラ−ゲナーゼ　滑液細胞と皮膚繊維芽細胞（５）２′　−５°オリゴアデニル 酸　腫瘍細胞系　（６）シンテターゼ Ｃ−ｕＬＬおよびｃ−ｆｏｓがん遺伝子　ヒト皮膚繊維芽細胞　（７）上皮増殖 因子受容体　ヒト皮膚繊維芽細胞　（８）ｍｍ因子ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃ（９） Ｉ　ＣＡＭ−１とＥＬＡＭ−Ｉ　ＨＵＶＥＣ（１０）プラスミノーゲン活性化因 子　ＨＴ１０８０　細胞系　（１１）インヒビター１および２ （ＦＡＩ−１およびＦＡＩ−２） ３６ｋＤａと４２ｋＤａ（＝ＦＡＩ−２）　ヒト皮膚繊維芽細胞　（１２）タン パク質の合成 スーパーオキシドジスムターゼ　ヒト腫瘍細胞系　（１３）（ＭｎＳＯＤ）遺伝 子 ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β遺伝子　ヒト皮膚繊維芽細胞　（１４）参考文献： １．ポハー・ジエイ・ニスら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６．１６８０゜１９ ８６゜２．バジャー・ケイ・エイら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６６、２３ ５，１９８７゜３．コハセ・エムら、独　リ：６５９　（１９８６）。４．フィ ゼンマイヤー・ケイら、Ｊ、　ｌ＋＊ｍｕｎｏ１．１３８．９７５．１９８？。

５、ダイヤ−・ノエイ・エムら、Ｌ」狂ユ傾Ｌ　郵２：２１６３　（１９８５） 。６．ウォング・シイ・エイチ・ダブリュら、Ｎａｔｕｒｅ　３２３：８１９　 （１９８６）。

７、す７−ジエイ・エックスら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６２．１１ ９０８．１９８７．８．パロンヘラ・ケイ・ジエイら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　２６２＋１９５０ｐ　＋９８７゜９．ニシントン・ティ・ニスら、Ａｂ ｓ、　２ｎｄ　ＩｎＬｅｒｎａｔ、　Ｃｏｎ１　ＴＮＦ、４頁、１９８９゜１０ ．　ヘビラッカ・エム・ピーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　１１Ｓ＾８４．９２３８．　＋９８７　、１１．メドヵルフエ・アル・エル ら、ム」■ユ肛ｄ、　１６８．７５１．１９８Ｂ。１２．キルスティン・エムら 、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋＋、　２６１．９５６５．１９８６゜１３．ウ ォング・シイ・エイチら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２．９４１．１９８８゜１４． リー・ジエイら、Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、５６：２３４　（１９８７）。

遺伝子発現上のＴＮＦの抑制作用はあまり良く特徴付けられない、ＴＮＦは細胞 中でその生長を抑制したｇ発現を抑制することを示された（クロンケ・エムら、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８４：４６９　（１９８７））。コラーゲン合成はヒト繊維芽細胞中で 抑制されたくソリスーヘルゾら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２６３：５８４ １　（１９８８））、およびＨＵＶＥＣ中のトロンボモデュリン（コンウェイ・ イー・エムら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、旦：５５８Ｂ　（１９８ ８））。これらすべての抑制作用は転写のレベルで発現されたが、正確な機構は まだ不明である。

ＴＮＦによる信号形質導入と遺伝子活性化の機構は大きな関心事である。多くの 細胞型において、ＴＮＦはホスホリパーゼ（大抵はＰＬＡ２らしい）を活性化し て、細胞プールからアラキドン酸をａ離することになり（スソフィス・ピーら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈＬｈ−初五一匹μＶユ　…ニア３５　（１９８７ ））　、そしてエイコサノイド合成を増加する（ダイア・ノエイ・エムら、上記 ）。ヒト繊維芽細胞では、ＴＮＦ刺激ＧＰＴアーゼ活性は（イマムラ・ケイら、 Ｌ」１ｏ１．Ｃ熊Ｌ２６３：１０２４　（１９８９））　ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ水準を 上昇し、ｃＡＭＰ−依存タンパク質キナーゼ活性を高め、そしてタンパク質キナ ーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化した（ツハング・ワイら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

活性化でき、これはＴＮＦがＩＬ−２受容体α鎖を誘導する機構であるようだ（ ロウエンドハル・ジエイ・ダプリュら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、υ５４　８６：２２３１　（１９８９））　、または潜伏ヒト免疫不全 ウィルスＨＩＶ−１の活性化の原因となる（グリッツイン・ジＴＮＦ−α、ＴＮ Ｆ−β、［Ｌ−１α、［Ｌ−１β、ｌ　ＦＮ−α、ＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−ガ ンマの各作用を種々の実験系で比較するとき、た（さんの明らかに余分なものお よびあいまいさが注目される。まず、同じ受容体（例えば、ＴＮＦ　−ｅｘとＴ ＮＦ−β；ＩＬ−１αとＩＬ−１β、ＩＦＮ−αとＩＦＮ−β）を用いる構造的 に関連したサイトカインは同しように働く。さらに驚くべきことに、異なる受容 体に結合する構造的に関連しないサイトカインもまたＲｆｌ！の生理学的効果を もつ。例えば、１し−１とＴＮＦは類似の遺伝子活性化活性度をもつ類似の生物 学の効果とＪ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、１５９：８２Ｂ　（１９８４））　、例え ば、ＩＦＮｓとＴＮＦはＭＨＣクラスｌとクラス■遺伝子、２’　−５’　オリ ゴ−アデニン酸シンセターゼ、ＩＬ−６、転写因子ｌＲ１１、およびＴＮＦ遺伝 子それ自身を含めて、同し遺伝子の幾つかを活性化する（ブイルセク°シエイ・ ハ到動α」±上便弘臆弘封しハエエ４」」ムク５／■巻、３頁、スプリンガー・ ヘルラーク・ヘルリン（１９９０））。

自然の条件下に細胞は、めったにないが、あるとすれば、単一サイトカインにさ らされる。むしろ生体内のサイトカインの作用は、生長因子に対して仮定される ような”前後関係”である（スポーツ−エム・ビーら、Ｎａｔｕｒｅ　３３２： ２１７　（１９８８））　、自然の条件下にサイトカインによって生した生物学 の効果は従って所定の微環境に同時にあるすべてのサイトカインの相互依存的で 拮抗する相互作用の合計を示す。さらに、サイトカインは“ネットワーク”と“ カスケード”に配列されるらしく、ひとつのサイトカインの合成はもうひとつに よって正または負に調節することができる。

これらの理由のため、個々に同様に組合せて作用するサイトカインの作用の分子 機構を理解することは重要である。

上記と対照的に、ＴＮＦとＩＦＮｓの作用が同類または相互依存的であるよりは むしろ拮抗する場合がある。例えば、ＴＮＦはヒト二倍体繊維芽細胞に対して細 胞分裂促進性であるが、ＩＦＮ３はこれらの細胞の生長を抑制するくブイルセク ・ジエイら、ムＬＪ、　Ｍｅｄ、圓：６３２　（１９８６））。ＴＮＦとＩＦＮ の組合せへの細胞応答はどちらか一方単独の応答と質的に量的に異なることがで きる（リーウエンヘルグ・ジェイ・エフ・エムら、Ｊ、ＥｘｏＭｅｄ。

担：１１８０　（１９８７）ニレイス・エル・エフ・エルら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃ上程：１６３５１　（１９８９）；　フエイマン・アールら、ムユ憇凱虹、 唐：２４４１　（１９８６）：　）リンチ・シイら、Ａｂｓｔｒ、１吋、Ｉｎｔ ’　ｌ　Ｃｏｎｆ、　Ｔ肚、７頁（１９８９））　、一層込み入った問題にする ため、若干の細胞中にＴＮＦはＩＦＮ−β合成を誘導することができる（レイス ら、上記）：ｉ−Ｎ　Ｆによる若干の遺伝子の活性化く例えばＨｌ−ＡクラスＩ ）は＋ＦＮ−βの存在を必要とする（リーウエンヘルグら、上記）。

ＩＦＮｓおよびＴＮＦ−αおよびＴ　Ｎ　Ｆ−βは、同類の組の刺激作用に応答 して同し微環境で生成されることが多いので（ムルフィ・エムら、上記；ストン ーウオルフら、上記；ビリアラ・エイ、ＩＭＭＵＮＯＩ７．　Ｔｏｄａｙ　９： ３７　（１９８８））　、ＴＮ　ＦとＩＦＮｓの相互作用が“正常゛または病理 形態学状態のいずれかでインケイヴオの結果に大いに関連していることは明らか である。

サイトカイン、特にＴＮＦと癌および感染性病気との結合はしばしば宿主の異化 状態に関係した多くの形態をとる。癌患者に見られる主要な最も特徴のある問題 のひとつは、通常は食欲不振と関連した体重減少である。結果として生ずる大き な消耗は“カヘキシー”として知られている（参照、復習のために、ケルン・ケ イ・エイら、Ｊ、　Ｐａｒｅｎｔ、　Ｅｎｔｅｒ、　Ｎｕｔｒ、　１２：２８６ −２９８（１９８８）。カへキシ−は連続的な体重の減少、食欲不振、および悪 性腫瘍の成長に応じて身体の持続的侵食を含む。基本的な生理学的混乱はエネル ギー消費に比例して食物の摂取量が下がることに関係しているのかもしれない。

この一般に認められてしばしば寿命を短くする障害の原因は、多くの寄与する因 子が関係しているとしても、結局限定される（ブラウンヮルド・イーら（＆ｉ） 　、ハリソンのプリンシプルズ・オン・インターナル・メディシン、第１１版、 マグロウ・ヒル・ブック社、ニューヨーク、１９８７．７８章、４２１−４３１ 頁）。カヘキシー状態は重要な病的状態と関連しており癌死亡率の大部分の原因 である。ＴＮＦは癌、感染性病気、および他の異化状態において力ヘキシーの重 要な媒介者であることは多（の研究が示唆してきた。

細菌性感染、敗血症および危険な病気、細菌性のリポ多糖（ＬＰＳ）またはエン ドトキシンは、発熱、不定愁訴、食欲不振、およびカヘキシーを含めて、多くの 病態生理学の証明に対して信鯨できることがしばらくの間知られていた。さらに 最近はＴＮＦ、およびマクロファージ／単球科の細胞から誘導された関連するサ イトカイン、特にＩＬ−１は病気のｆｉｎ床上の明示に責任がある中心の媒体物 であるという示唆に導かれる多くのエンドトキシン効果にＴＮＦがよく似ること ができることが観察された。エントドキノンはＴＮＦ　（コルンプルス・ニス・ ケイら、Ｊ、　Ｉｎ＋＋＊ｕｎｏ１．１３″Ｌ：２５８５−２５９１　（１９８ ６））および他のＩＬ−１を含むサイトカイン（ディナレｏ−シイ・エイ、Ｒｅ ｖ、　Ｉｎｆｅｃ、　Ｄｉｓ、、６：５ｌ−９４（１９８４））、インターロイ キン−６（ＩＬ６）、およびコロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）　（アプテ・アール・ エフら、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈ５ｉｏ１．　８９：３１３（＋９７６））の生 産と分泌を刺激する有力な単球・マクロファージ活性化物質である。さらにこれ らサイトカインのあるものはＴリンパ球を刺激して例えばインターフェロキン− ２（ＩＬ−２）（ロブ・エール・ジエイ、Ｊ、Ｉｎ＋ａ＋ｕｎｏ１．　Ｔｏｄａ 　５　：２０３　：２０９　（１９８４））のような追加のサイトカインを生成 する。

蛤球−＝ｉサイトカインはエントドキノン（ミチェ・エイチ・アールら、ＬハＩ ユム」何、鏝、８：１４８１−１４８６　（１９８８））　、および癌および他 の異化状態（ツートン・ジェイ　エイら、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ−１・＋３１−１ ３５　（１９８９））への代謝と神経ホルモンの応答の重要な媒介物であると考 えられている。おもしろいことには、投与量の少ないＴＮＦによって誘導される 若干の変化は投与量の多いＩＬ−２によって引き起こされる変化に良く似ている （レミソク・ディ・シイら、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、５６：５８３−５９０　（ ９１８７））。

ヒトの志願者に対してエンドトキシンを投与すると、発熱、頻脈、代謝速度の増 加およびストレスホルモンの放出を含むインフルエンザ様の症状をもつ急性の病 気を生じたくレブハウグ・エイら、戊びゆユ険ｒ１．　＋２３：［６２−１７０ （１９８８））。癌患者（正常な腎臓と肝臓機能をもつ）にＴＮＦを漸増投与し て治療すると（４−６３６μｇ／蒙２／２４時間’）　、５４５μｇ／＋ａｚ／ ２４時間以上の投与量では健康なヒトにエンドトキシンを注射して（４μｇ／ｋ ｇ）誘発されるものに似た変化を引き起こしくミノエ・エイチ・アールら、鉢」 肛Ｌ　則４：２８０−２８６　（１９８８））　、著者らはＴＮＦは敗血症のエ ンドトキシン応答の主要な宿主調停者であるという結論を導いた。さらに最近は 、ヒトまたはラットに５日間の長期にわたる静脈注射のＴＮＦ注入を行うと、食 欲不振、液体遣残、急性相応答、お゛よび陰性窒素バランスと関連することが示 され（すなわち、古典的異化作用）、ＴＮＦは危険病気の間に注目される多くの 変化の原因であるという結論に導かれる（ミチエ・エイチ・アールら、Ａｎｎ、 　Ｓｕｒ　、２０９：１９−２４　（１９８９））　、癌患者にｒＴＮＦを投与 するとＣ−反応タンパクｆ（ＣＲＰ）が上昇し、血糖亜鉛が減少し、全アミノ酸 の前腕流出が大きく増加し、他の組織によるアミノ酸摂取に導かれ（ワレン・ア ール・ニスら、紅堕ユａ」、遣：１３９６−１４００　（１９８７））、さらに 癌カヘキシーにおけるＴＮＦの役割の証拠と考えられた。

光里皇塁！ ＴＮＦおよびＩＬ−１のようなサイトカインは炎症性反応の仲介ならびに感染症 および癌に対する宿主反応において主要な役割を演しる。これらのサイトカイン の作用の形式はようやく分がり始めたばかりである。本発明者らはこのようなサ イトカインによる結合ＩＪＩｍ細胞に誘導される一連のタンパク質と糟タンパク 質を発見し研究してきた。これら研究の結果として、本発明者らはこのようなＴ ＳＧタンパク質と呼ばれるサイトカイン誘導タンパク質または塘タンパク質、ま たはそこから誘導されるペプチドのような機能誘導体およびこれらＴＳＧタンパ ク質／ｌＪ！タンパク譬に特異的な抗体の使用を、多くの診断上および治療上の 方法のために、思いついた。これらのタンパク質、そのためのＤＮＡコード化、 およびその機能誘導体は、慢性の炎症性状態、特にリウマチ様関節炎を含めて、 上記タイプのサイトカインの作用と結合した多くの病気において、感染および敗 血病において、および癌において有用である。

特に、本発明はＴＳＧ−１４と呼ばれるサイトカイン誘導タンパク質または糖タ ンパク質分子、またはその機能誘導体を提供し、タンパク質分子が自然に発生す るものである場合は、自然に結合した他のタンパク質または糖タンパク質を実質 的に含まない。全長のタンパク質分子は、有望な信号配列を含めて、約１９．５ ｋＤａの見かけの分子量を有し；成熟タンパク質の分子量は約１７．５ｋＤａで ある。

ＴＳＧ−１４タンパク質はアミノ酸配列ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２を有する。

さらに本発明はＴＳＧ−１４を符号化するＤＮＡ分子またはその機能誘導体に関 し、ＤＮＡ分子が自然に生じる場合は、それが自然に結合する他のヌクレオチド 配列を実質的に含まない。好適例では、ＤＮＡ分子はヌクレオチド配列ＳＥＱ　 １０　ＮＯ：１を有する。本発明のＤＮＡ分子はゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡで あることができ、−末鎖または二本鎖であることができる。

本発明はプラスミドのような発現ビヒクルとしてＤＮＡ分子を提供し、そしてＤ ＮＡ分子を用いて形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を提供する 。宿主は、酵母および哺乳類細胞を含めて、バクテリアまたは真核生物細胞であ ることができる。

また、本発明には自然に結合する他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に 含まないＴＳＧ−１４タンパク質または糖タンパク質分子、またはその機能誘導 体を調製するための方法が含まれ、この方法は次の工程から成る＝　（ａ）培養 条件下にタンパク質を発現できる宿主細胞を培養し、（ｂ）タンパク質または機 能誘導体を発現し；そして（Ｃ）タンパク質または機能誘導体を培養物から回収 する。

また本発明はＴＳＧ−１４タンパク質に特異的な抗体またはそのエピトープに向 けられている。好ましい抗体はモノクロナール抗体である。

また生物学上の試料中に存在するＴＳＧ−１４タンパク質を検出するための方法 を提供するものであり、次の工程がら成る：（ａ）ＴＳＧ−１４タンパク質を含 むのではないがと思われる生物学的試料をタンパク質に結合できる分子と接触さ せ；そして（ｂ）このタンパク質に結合した分子のいずれかを検出する。この方 法に対して、好ましい分子は抗体または抗体フラグメントであり、最も好ましく はモノクロナール抗体であり、好ましい検出方法はイムノアッセイである。

さらに本発明は次の工程から成る対象において正常または突然変異のＴＳＧ−１ ４タンパク質を符号化する核酸の存在を検出するための方法を含む：　（ａ）対 象から得られた細胞、その抽出物、またはその培養上澄液を、ハイブリッド形成 条件下に正常または突然変異のＴＳＧ−１４の少なくとも一部を符号化するオリ ゴヌクレオチドプローブと接触させ；そして（ｂ）細胞の核酸に対してこのプロ ーブのハイブリッド形成を測定し、これによって核酸の存在を検出する。この方 法はさらに、工程（ａ）の前に、ＴＳＧ−１４タンパク質を符号化する細胞のＤ ＮＡの分子量を選択的に増幅する。

なおまた本発明は細胞中のＴＳＧ−１４の発現の誘導を測定するための方法に向 けられており、次の工程から成る；　（ａ）細胞をＴＳＧ−１４の発現を誘導で きる物質と接触させ；　（ｂ）細胞中のｍＲＮＡ符号化ＴＳＧ−１４の分量を少 なくとも一部のＴＳＧ−１４を符号化するオリゴヌクレオチドプローブとハイブ リッド形成させて測定し；そして（ｃ）細胞中のＴＳＧ−１４ｄＮＡの分量と誘 導物質と接触しない細胞中のＴＳＧ−１４＋ｍＲＮＡの分量とを比較し、ここで ＴＳＧ−１４ｍＲＮＡの分量の増加は誘導が発生したことを示す。

本発明によるＴＳＧ−１４の発現の誘導を測定するための代替の方法は次の工程 から成る：　（ａ）細胞をＴＳＧ−１４の発現を誘導できる物質と接触させ、（ ｂ）　ＴＳＧ−１４タンパク質を測定するための上記方法、好ましくはイムノア ッセイを用いる細胞の抽出物または上澄液中のＴＳＧ−１４タンパク質の分量を 測定し；そして（Ｃ）細胞の抽出物または上澄液中のＴＳＧ−１４タンパク譬の 分量を誘導物質と接触しない細胞の抽出物または上澄液中のＴＳＧ−１４タンパ ク質の分量と比較する、ここでＴＳＧ−１４タンパク質の分量の増加は誘導が発 生したことを示す。

本発明はまた細胞中のＴＳＧ−１４の発現を誘導できる化合物を同定するための 方法にも用いられ、次の工程から成る：　（ａ）細胞を試験される化合物と接触 させ；そして（ｂ）上記２つの方法の一つによるＴＳＧ−１４ｍＲＮＡの誘導を 測定し、これによって化合物を同定する。

本発明はまたＴＮＦまたはＩＬ−１に反応する細胞の能力を測定するための方法 を提供し、次の工程から成る：　（ａ）細胞をＦＳ−４細胞中のＴＳＧ−１４遺 伝子発現を誘導できるＴＮＦの分量と接触させ；そして（ｂ）上記方法のいずれ がを用いるＴＳＧ−１４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の誘導を測定し、これ によってＴＮＦに反応する細胞の能力を測定する。

図面の簡単な説明 図１はＴＮＦで処理したＦＳ−４細胞中の８個のＴＳＧ　ｃＤＮＡｓに相当する ｍＲＮＡ５の誘導を示すノーザンブロソトを描写している。

成長停止ＦＳ−４細胞はＴ　Ｎ　Ｆ　（２０ｎｇ／ｍｌ）に０時間さらした。そ の後に異なる間隔で、全細胞ＲＮＡを単離し、ホルムアルデヒド−アガロースゲ ル上に分画し、ゼータ−プローブブロッキング膜に移し、そして３ｔＰ−標識Ｔ ＳＧ　ｃＤＮＡｓ挿入物の各々に別々にハイブリッド形成させた。各レーンに等 しい分量のＲＮＡを装填したがどうかと確かめるため、最も多くのプロットを約 １．０ｋｂの不変５ＲＮＡ種に特異的な３２ｐ−標識ｐＨｅ７内部参照ｃＤＮＡ 挿入物でプローブした。

図２はＴＮＦによって８個のＴＳＧ　ｍＲＮＡ５を誘導する速度論を示す一連の グラフである。図１に示したノーザンブロノトの放射能写真をレーザー濃度計に よって走査した。各個の＋＊ＲＮＡに対して、最高密度のバンドを１００％の誘 導を示すように標準化した。

図３はＴＮＦによるＴＳＧ−１４麟ＲＮＡの誘導を示すノーザンプロットとグラ フ（図１と２の適当な部分からとった）である。静止したＦＳ−４細胞を０時間 で２０ｎｇ／＠ｌのＴＮＦにさらした。全細胞ｍＲＮ＾は種々の時間ポイントで 取出し、ホルムアルデヒド／アガロースゲル上で分画し、ゼータ−プローブブロ ッティング膜に移し、ｆｆ！ｐ−標ｍＴｓＧ−１４ｃＤＮＡプローブでハイブリ ッド形成させた。次に放射能写真をレーザー濃度計によって走査し、最高密度の ハンドを１００％の誘導として標準化した。

図４はＴＳＧ−１４のｃＤＮＡとアミノ酸配列を示す。疎水性の信号配列とポリ アデニル化信号を下線で示した。

図５はＴＳＧ−１４タンパク質の疎水性プロ、トである。疎水性は、カイトおよ びドーリトル（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、耳ｉ７：１０５　（１９８２））の アルゴリズムを用いるマノキントシュＳＥコンピューターのＤＮＡストライダー プログラムを用いてプロ、トした。

図６はＴＳＧ−１４タンパク質の酸／塩基プロットである。ＴＳＧ−１４かう成 るアミノ酸残基の等電点はマ、キントソシュＳＥコンピューターのＤＮＡストラ イダープログラムを用いて計算しプロットした。

図７はｐＡＴＨ２−ＴＳＧ−１４発現ヘクターを描写した。ＴＳＧ−１４挿入物 はその５゛末端で…３八へ位を含む。挿入物の３′末端での…３Ａ部位はＴＳＧ −１４の…Ｒ１フラグメントがｐＴＺ１９ヘクター系に挿入されるときに発生し 、続いて５ａｕ３Ａ酵素で判断した。この挿入物を次にｐＡＴＨ２ベクターのｔ ｒｐＥタンパク質のコード領域内の唯一の随旧部位に連結した。

図８はＴｒｐＥ／ＴＳＧ−１４融合タンパク質の発現を示すゲルパターンである 。大腸菌ＪＭＩＯＩ細胞はＰＡＴＨ２−ＴＳＧ−１４発現ヘクターを用いて形質 転換されインドールアクリル酸を用いてＳＲ導された。全細胞溶解物は２％ＳＤ Ｓとβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液中で沸騰させて変性させた。変性し た試料はＳＤＳを含む１０％アクリルアミドゲルで電気溶出した。次にクーマシ ーブルーで染色した。レーンＩ：ＭＷマーカー；レーン２：コントロール（Ｔｒ ｐＥのみ）；レーン３およびレーン４；切頭のＴｒｐＥ−ＴＳＧ−１４融合タン パク１−ＰＡＴＨ２−ＴＳＧ−１４ヘクターはＰｓｔｌで切断してより小さい発 現タンパク質（ＭＷ＝４４　ｋＤａ＞を生成した；レーン５および６；　Ｔｒｐ Ｅ／ＴＳＧ−１４融合タンパク質（ＭＷは約６０　ｋＤａである）。

月１澄五ｌス裁珊。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）によりヒ１−ＦＳ−４繊維芽細胞中で活性化される遺伝 子の多くは本発明者によって“ＴＮＦ−刺激遺伝子”　（ＴＳＧと吋ふ）と名付 けられた。このような遺伝子、およびそれらが符号化するタンパク質および糖タ ンパク質は、ＴＮＦおよびＩ　Ｌ　−，１を含めて、さらに一般的なサイトカイ ンによって誘導される。タンパク質、機能誘導体、例えばペプチドフラグメント 、およびタンパク質に対する抗体は病気の診断と治癒およびこのようなサイトカ インの活性または不活性が特定の病気と結合する条件に重要な多くの方法におい て有用である。このような病気は慢性の炎症、例えばリウマチ様関節炎、癌、お よび特にグラム陰性バクテリアに伴う感染症を含む。

本発明はこれらの遺伝子および両方ともＴＳＧ−１４と呼ばれているそのタンパ ク譬生成物のひとつに向けられる。本発明は、実質的に純粋な形でのＴＳＧ−１ ４ＤＮＡ、　＊ＲＮ＾およびタンパク質、ペプチドフラグメントのようなタンパ ク質の機能誘導体、タンパク質に特異的な抗体、ＤＮＡ、ｄＮＡおよびタンパク 質を製造する方法、これら分子を使用する方法を提供する。

“実質的に純粋な”の語は本発明の任意のタンパク質またはペプチド、または任 意のこのようなタンパク質またはペプチドを符号化する任意のＤＮＡまたはｍＲ ＮＡ配列を意味し、それぞれ他のタンパク質、ＤＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列を 含まず、あるいは自然に普通に見られ、それ自体、自然に見られない形で存在す る他の汚染物を含まない。

“他のタンパク質を実質的に含まない”の語は、タンパク質が少なくとも９０パ ーセント（重量基準で）、そして好ましくは少なくとも９９パーセントの天然に 結合した他のタンパク質および糖タンパク質から精製され、従って実質的にそれ らを含まないことを示す。これはＴＳＧ−１４タンパク質を発現または含んでい る細胞、組織または液体を、抗体、例えばタンパク質に対して反応するモノクロ ーナル抗体（ｍＡｂ）に耐える免疫咬着剤カラムのようなタンパク譬精製技術に 委ねて行われる。あるいは、精製は硫酸アンモニウム沈澱、分子ふるいクロマト グラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーのような標準方法を組み合わ せて行われる。

本発明の方法は正常または突然変異のＴＳＧ−１４遺伝子を同定し、または細胞 または組織と結合し、または細胞によって分泌されたＴＳＧ−１４タンパク質の 存在または分量を測定するために用いられる；このような方法は炎症性の状態お よびグラム陰性バクテリア感染に続く敗血症への感受性を同定するための方法と して役立つことができる。

ひとつの例では、本発明は自然に結合するヒト由来の不純物を実質的に含まない 自然発生のＴＳＧ−１４タンパク質または糖タンパク質に向けられる。他の例で は、本発明は組み換えＴＳＧ−１４符号化タンパク質または塘タンパク譬に向け られる。

本発明のＴＳＧ−１４タンパク質は種々の細胞またばＭｉ織源がら生化学的にま たは物理化学的に精製することができる。自然に発生するＴＳＧ−１４タンパク 質を精製するため、ヒト繊維芽細胞のような結合組繊細胞が好ましい。あるいは 、固相支持体上の望ましい配列のポリペプチドの合成および続いて支持体からこ れらを分離するための方法が良く知られている。

ＴＳＧ−１４遺伝子は単離または合成できるので、ＴＳＧ−１４ポリペプチド、 またはその機能誘導体は、望ましい場合には、原核生物有機体または非哺乳動物 の真核生物有機体における哺乳動物起源の他のタンパク質または塘タンパク質を 実質的に含まないで合成することができる。本発明によって意図されるように、 トランスフエフシコンしたＧＭ６３７細胞のような哺乳動物細胞における組み換 え手段によって生成したＴＳＧ−１４タンパク質または糖タンパク質分子は天然 に発生ずるタンパク譬配列またはその機能誘導体のいずれかである。天然に発生 するタンパク質または塘タンパク質が組み換え手段によって生成される場合、自 然のままに結合する他のタンパク質および糖タンパク質を実質的に含まないで提 供される。

この発明の好ましい用途は、例えば抗体等に結合して生物化成をまだ保持してい るＴＳＧ−１４分子のフラグメントの化学的合成または組み換えＤＮＡ技術によ る製造である。本発明の方法の若干について一層短いペプチドの利点の中で、（ １）大きい安定性および拡散性、および（２）小さい免疫原性がある。ここで議 論したように本発明のＴＳＧ−１４タンパク質またはペプチドはさらに薬物設計 のために変更することができ、例えば免疫原性を減らし、溶解性を促進または導 出を促進し、またはクリアランスまたは劣化を妨げる。

また、本発明の範囲内に含まれるものは、ＴＳＧ−１４タンパク質の可溶性形態 、およびここに記載した用途のすべてに同様の対生物活性をもつＴＳＧ−１４タ ンパク質の機能誘導体である。また、ＴＳＧ−１４転写から誘導されたＴＳＧ− １４のすべての活性形態、およびＴＳＧ−１４活性をもつすべての突然変異体で ある。

“機能誘導体”の語はＴＳＧ−１４タンパク質の“フラグメント”、′変異体” 、“同族体”、または“化学的誘導体”を意味する。

機能誘導体は本発明に従ってその有用性を可能にするＴＳＧ−１４タンパク質の 機能の少なくとも一部を保持する。

ＴＳＧ−１４タンパク質の“フラグメント”は分子の任意のサブセットであり、 即ち、一層短いペプチドである。

ＴＳＧ−１４の６変異体”は全体のペプチドまたはそのフラグメントのいずれか に実質的に似ている分子である。変異ペプチドは、この分野で良く知られた方法 を用いる、変異ペプチドの直接の化学合成によって都合よく調製することができ る。

あるいは、ペプチドのアミノ酸配列変異体は合成したペプチドを符号化するＤＮ Ａにおいて突然変異によって調製することができる。このような変異体は、例え ば、アミノ酸配列内の残基がらの削除、挿入または置換を含む。削除、挿入、お よび置換の任意の組合せはまた、最終の構成が所望の活性をもっているとするな らば、最終の構成に達するようにすることもできる。明らかに、変異体ペプチド を符号化するＤＮＡにおいて作られるであろう突然変異体は読み取り枠を変えて はならず、好ましくは二次ｌｌｌＲＮＡ構造を生成できる相補的領域を作らない であろう（ヨーロッパ特許公報第ＥＰ７５．４４４号）。

遺伝子レベルでは、これらの変異体は通常ペプチド分子を符号化するＤＮＡにお いて、ヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発（アデルマンら、Ｄ　Ｎ　Ａ　２ 　：１８３（１９８３）によって例示される）によって調製され、これによって 変異体を符号化するＤＮＡを生成し、その後にＤＮＡを組み換え細胞培養基に発 現させる。変異体は代表的には非変異ペプチドと同し定性生物活性を示す。

一般的に、ここに従う部位特異的突然変異誘発は最初、その配列内に適切なペプ チドを符号化するＤＮＡ配列を含む一末鎖ベクターを得ることによって行われる 。望ましい突然変異した配列をもつオリゴヌクレオチドプライマーは、一般に合 成により、例えばフレアらの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　（ＵＳＡ）　７５：５７６５　（１９７８）　）によって調製される。こ のプライマーを次に一末鎖タンパク質配列含有ヘクターを用いてアニール化し、 そして大腸菌ポリメラーゼ１クレノウフラグメントのようなりＮＡ重合酵素に委 ね、突然変異に耐える鎖の合成を完了する。このように、第二鎖において突然変 異した配列は望ましい突然変異に耐える。このヘテロ二本鎖ベクターは次に適当 な細胞を形質転換するために使用され、突然変異した配列の配置に耐える組み換 えベクターを含むクローンが選ばれる。突然変異したタンパク質領域は取出し、 タンパク質生成のための適当なベクター、一般には適当な宿主の形質転換のため に用いることができるタイプの発現ベクターに置く。

あるいは、正常または変異したＴＳＧ−１４タンパク質を符号化するＤＮＡを相 同的組み換えによって変えることができ、過去数年間に転写活性遺伝子において 突然変異体を誘導または収集する遺伝子をターゲットにするための技術が開発さ れた（クチェルラバチ、Ｐｒｏ　、　ｉｎ　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　 ａｎｄ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　３６：３０１　（１９８９）Ｌ相同的組み換え の技術は哺乳類ゲノムの特殊領域に特殊突然変異体を導入するための方法として （トーマスら、堕旦、　４４：４１９−４２８゜１９８６；　）−マスおよびカ ベフチ、釦旦、　５１！５０３−５１２．１９８７）；プツチマンら、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：８５８３−８５８７（ １９８８））または欠陥遺伝子内の特殊の突然変異体を収集するために開発され た（プツチマンら、Ｎａｔｕｒｅ　嘉：５７６−５７８　（１９８７））−相同 的組み換えに対する上記参考文献をここに参照のために加える。

末端挿入の例には、組み換え宿主からの成熟ペプチド分子の分泌を容易にするた めペプチド分子のＮ末端に対して、宿主細胞に異種または同種の単一配列の融合 を含む。

変異体の別のグループはペプチド分子内の少なくとも一個のアミノ酸残基、およ び好ましくは一個のみが、除去され、異なる残基がその場所に挿入されたもので ある。このような置換は好ましくは、ペプチド分子の特性を精細に調節すること が望ましい場合に次のリストに従って行われる。

云■歿基　■元負１を１蒸　云Ωｌ盈　■丞悠１１１１．撓蓋Ａｌａ　ｇｌｙＨ ｓｅｒ　Ｌｅｕ　１ｌｅＨｖａｔ＾ｒｇ　Ｉｙｓ　Ｌｙｓ　ａｒｇ；　ｇｉｎ； 　ｇｌｕ八ｓへ　ｇｌｎ；　ｈｉｓ　Ｍｅｔ　１ｅｕＨｔｙｒ；　ｉｌｅ＾ｓｐ 　ｇｌｕ　Ｐｈｅ　ｍｅｔ；　Ｉｅｕ；　ｔｙｒＣｙｓ　ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ｔｈ ｒ Ｇｉｎ　ａｓｎ　Ｔｈｒ　５ｅｒ Ｇｌｕ　ａｓｐ　Ｔｒｐ　ｔｙｒ Ｇｌｙ　ａｌａ；　ｐｒｏ　Ｔｙｒ　ｔｒｐＨｐｈｅＨ４ｓ　ａｓｒＢ　ｇｌｎ 　Ｖａｌ　ｉｌｅ；　１ｒｕｌｉｅ　Ｉｅｕ；　ｖａ１ 機能的または免疫的性質における実質的変化は上記リストにおける置換基よりも さらに控え目な置換基を選択することによって、すなわち、（ａ）例えば、シー トまたはらせん構造として、置換基の領域におけるペプチド中軸の構造、（ｂ） 標的部位での分子のチャージまたは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持す る際のそれらの効果において一層著しく異なる残基を選択することによって行わ れる。一般にかなりの変化を生じるように期待される置換は（ａ）グリシンおよ び／またはプロリンが他のアミノ酸によって置換されたまたは削除または挿入さ れ；　（ｂ）親水性残基、例えばセリルまたはトレオニルを疎水性残基、例えば ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニン、バリル、またはアラニＪしの代わ りに（またはによって）置換し；　（Ｃ）システィン残基を任意の他の残基の代 わりに（またはによって）置換し；　（ｄ）電気陽性の側鎖を有する残基、例え ばリシル、アルギニル、またはヒスチジルを電気陰性のチャージを有する残基、 例えばグルタミンまたはアスパルチルの代わりに（またはによって）置換し；ま たは（ｅ）かさばった側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンを側鎖を有 しない残基、例えばグリシンの代わりに（またはによって）置換するものが挙げ られる。

大抵の削除と挿入、および特に置換は、ペプチド分子の特性においてラジカル変 化を生しることは期待されていない。しかし、そうする前に置換、削除、または 挿入の厳密な効果を予測することが困難なとき、当業者はその効果は通常のスク リーニングアッセイによって評価されるだろう０例えば、代表的に７５Ｇ−１４ 変異体はＴＳＧ−１４符号化核酸の部位特異的突然変異誘発または相同的組み換 えによって、組み換え細胞培養における変異核酸の発現によって、および任意に 、細胞培養物から、例えば抗体含有カラムに免疫アフィニティ吸着させて精製に よって行われる。

ＴＳＧ−１４タンパク質の“類似体”は全体の分子またはそのフラグメントのい ずれかに実質的に似た非天然分子を意味する。

ＴＳＧ−１４タンパク質の“化学的誘導体”は通常はタンパク質の一部ではない 追加の化学的部分を含む。ペプチドの共有結合の変異は本発明の範囲内に含まれ る。このような変更ではペプチドの標的アミノ酸残基を選択された側鎖または末 端残基と反応できる有機誘導剤と反応させて分子に誘導することができる。

システイニル残基は最も普通にアルファーハロアセテート（および対応するアミ ン）、例えば２−クロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させ、カルボキシ メチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。またシステイニル残基は プロモトリフルオロアセトン、アルファーブロモ−ベーター（５−イミドジイル ）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３− ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−ク ロロメルクリヘンゾエート、２−クロロノルクリ−４−ニトロフェノール、また はクロロ−７−ニドロベンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させて誘 導される。

ヒスチジル残基は、ジエチルプロカルボネートとｐＨ５，５〜７．０で反応させ て誘導されるが、この薬剤は比較的ヒスチジル側鎖に対して特異的である。パラ −ブロモフェナシルブロマイドもまた有用である；反応は好ましくはｐＨ６，０ で０．ＩＭＯカコジル酸ナトリウム中で行われる。

リシニルおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応さ せる。これらの薬剤を用いる誘導はリシニル残基のチャージを逆転する効果があ る。アルファーアミノ−含有残基を誘導するための他の適当な薬剤にはメチルビ コリンイミディトのようなイミドエステル；ピリドキサルホスフェート；ピリド キサル；クロロボロハイドライド；トリニトロヘンゼンスルホン酸；０−メチル イソウレア；２．４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスア ミナーゼ触媒化反応を含む。

アルギニル残基は１または複数の伝統的な試薬、それらのうちフェニルグリオキ サル、２．３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒド リンと反応させて改変される。

アルギニン残基の誘導はグアニジン官能基のρＫａが高いためアルカリ条件下に 行われる反応を必要とする。さらに、これらの試薬はりシンの基とアルギニンイ プシロン−アミノ基を反応することができる。

チロシル残基の特定の改変はそれ自体広く研究されて、芳香族ジアゾニウム化合 物またはテトラニトロメタンと反応させてチロシル残基にスペクトルラヘルを導 入する際に特別の関心がもたれた。最も普通には、Ｎ−アセチルイミダゾールと テトラニトロメタンを使用して０−アセチルチロシル種および３−二トロ誘導体 をそれぞれ生成する。

カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）を１−シクロへキシル− ３−（２−モルホリニル＝　（４−エチル）カルボジイミドまたはｌ−エチル− ３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンデル）カルボジイミドのようなカル ボジイミド（Ｒ“−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’　）と反応させて選択的に改変する。さら に、アスパルチルおよびグルタミル残基をアンモニウムイオンを反応させてアス パラギニルおよびグルタミル残基に転換する。

グルタミニルおよびアスパラギニル残基は対応するグルタミルおよびアスパルチ ル残基に脱アミド化される場合が多い。あるいは、これらの残基は穏和な酸性条 件下に脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態は本発明の範囲内にあ る。三官能分子の薬剤を用いる誘導化は水不溶性支持体母材またはだの高分子キ ャリアにペプチドを架橋結合するために有用である。普通に用いられる架橋結合 剤は、例えば、１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタ ルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサ リチル酸をもつエステル、３，３°−ジチオビス（スクシン−イミジルプロピオ ネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモニ官能イミドエステル 、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能マレイドを含 む、メチル−３−（（Ｐ−アジドフェニル）ジチオ〕プロピオイミデートのよう な誘導化剤は光の存在で架橋を形成できる光活性化中間体を生成する。また、シ アノーゲンブロマイド活性化カルボハイドレートのような反応性の水溶性母材お よび米国特許第３，９６９．２８７；　３６９１，０１６．４，１９５，１２８ ；４．２４７，６４２；　４，２２９，５３７；および４，３３０，４４０に記 載された反応性物質をタンパク質固定化に用いられる。

他の変更はプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残 基の水酸基のホスホリル化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアル ファーアミノ基のメチル化（ティ６イー°クレイトン、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｎ　Ｐｒ肝ｙ旦閃、ダブリュ・エ イチ・フリーマン・アンド・カンパニイ、サンフランシスコ、７９−８６頁（１ ９８３））　、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および、ある場合には、Ｃ−末端 カルボキシル基のアミド化を含む。

このような誘導化部分は溶解性、吸着性、生物学上の半減期等を改善することが できる。この部分はまたタンパク質等の望ましくない多少の副作用を除きあるい は減することができる。このような効果を媒介することができる部分は、例えば 、Ｒｅｍ１ｎ　ｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、第 １６版、マソク・パブリッシング・カンバニイ、イーストン、ＰＡ　（１９８０ ）に開示されている。

組み換えＤＮＡ技術の一般的な原理を示す標準の参照著作はワトソン・シエイ・ デイラの　ｂセ狙坦ｌ二Ｕ」旦Ｕゴ用」初」１鱈よＩおよび■巻、発行者、ザ・ ベンジャミン／クミンゲス・パブリッシング・カンパニイ・インコーポレイテッ ド、メン口・パーク、ＣＡ（１９８７）　；ダーネル・ジエイ・イーら、ム江匹 ハＬ並旦」豆圏■、発行者、サイエンティフィック・アメリカン・ブソクス社、 ニューヨーク、Ｎ、Ｙ、　（１９８６）　；　レウイン・ビー・エム、ジーン■ 、発行者、ジョン・ウイリイ・アンド・ソング、ニューヨーク、Ｎ、Ｙ。

（１９８５）　；オールド・アール・ダブリュら、紅罰旦蛙竺」Ｌ釦匹＄ｔｉｏ ｎ：　Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅ ｅｒｉｎ　、、第２版、発行者、ユニバーシティ・オン・カリホルニア・プレス ・パークレイＣ＾（１９８１）　；およびサムブルーフ・ジエイら、Ｍｏ１ｅｃ ｕ１ａｒＣ１０ｎ１ｎ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプ リング−バーバー・ラボラトリイ、コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ（１ ９８９）を含む。これらの参考文献はここに参照のために加える。

“クローン化“の語は特定の遺伝子または他のＤＮＡ配列をベクター分子に挿入 するためのインケイトロ組み換え技術の使用を意味する。望ましい遺伝子をうま くクローン化するために、ＤＮＡフラグメントを発生するため、フラグメントを ベクター分子に結合するため、複ＤＮＡ分子を復製できる宿主細胞に導入するた め、そして受け入れる宿主細胞の間から標的遺伝子をもつクローンを選択するた めの方法を用いることが必要である。

”　ｃＤＮＡ”の語はＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によ ってＲＮＡ鋳型から生成した相補的またはコピーＤＮＡを意味する。従って、“ ｃＤＮ＾ＤＮＡン”の語はクローン化ベクターに運ばれる問題のＲＮＡ分子に相 補的な二重ＤＮＡ配列を意味する。

“ｃＤＮＡライブリー”の語は、生物の全体の発現できるゲノムを共に含むｃＤ Ｎ＾ＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ分子の収集物を意味する。このようなｃＤＮ＾ ＤＮＡリーは当業者に知られている方法によって調製することができ、例えば、 サムブルーフら、上記に記載されている。一般にＲＮＡはまず生体の細胞から単 離するがゲノムから特定の遺伝子をクローン化することが望ましい。本発明の目 的のために好ましいものは哺乳動物、最も好ましくはヒトの細胞ラインである。

ＴＳＧ−１４配列の一部を示すオリゴヌクレオチドは相同遺伝子の存在のための スクリーニングおよびそのような遺伝子のクローン化のために有用である。この ようなオリゴヌクレオチドを合成するための技術は例えば、つ・アールら、均透 １２−１且Ｌ−担１止、且明工Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、２１：１０１−１４１ 　（１９７Ｂ）によって開示されている。

遺伝暗号は縮重するので、１個以上のコドンを使用して特定のアミノ酸を符号化 する（ワトソン・ジエイ・ディ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　Ｇｅｎｅ　、第４版、ベンジャミン／クミンラス・パブリッシング社、メン 口・パーク、ＣＡ　（１９８７））、遺伝子コードを用いると、１個以上の異な るオリゴヌクレオチドを同定することができ、それらの各々はアミノ酸を符号化 することができるだろう。

実際に、特定のオリゴヌクレオチドが実際のＸｘＸ−符号化配列を構成するであ ろう可能性は異常な塩基対の関係および特定のコドンが実際に真核細胞中に（特 定のアミノ酸を符号化するため）使用される頻度を考慮して評価することができ る。このような“コドン使用規則”はレイズ・アールら、Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　 Ｒｉｏｔ、　１８３：１−１２　（１９８５）によって開示される。レイズの“ コドン使用規則”を用いると、ＴＳＧ−１４配列を符号化できる理論的な“最も 可能性のある”ヌクレオチド配列を含む単一のオリゴヌクレオチド、または−組 のオリゴヌクレオチドが同定される。

アミノ酸配列は時には１個のみのオリゴヌクレオチドによって符号化できるが、 しばしばアミノ酸配列を１組の同様のオリゴヌクレオチドのいずれかによって符 号化することができる。重要なことは、この組を構成するもの全部がＴＳＧ−１ ４ペプチドフラグメントを符号化できるオリゴヌクレオチドを含み、従って、ペ プチドフラグメントを符号化する遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を潜在的 に含むのに対して、その組の１個だけが遺伝子のヌクレオチド配列に等しいヌク レオチド配列を含むことである。この構成員がその組に存在し、その組の他の構 成員が存在してもＤＮＡにハイブリッド形成することができるので、タンパク質 を符号化する遺伝子をクローン化するために単一のオリゴヌクレオチドを用いる 同し方法で分画していない組のオリゴヌクレオチドを用いることができる。

オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組は、ＴＳＧ−１４フラグメン トを符号化できる理論的に“最も可能性のある′配列を含み、“最も可能性のあ る”配列または配列の組にハイブリッド形成できる相補オリゴヌクレオチドまた はオリゴヌクレオチドの組の配列を同定するために使用される。このような相補 配列を含むオリゴヌクレオチドはＴＳＧ−１４遺伝子を同定し単離するためのプ ローブとして用いることができる（サムブルーフら、上記）。

ＴＳＧ−１４遺伝子のフラグメントを符号化できる（またはこのようなオリゴヌ クレオチド、またはオリゴヌクレオチドの組に相補的である）適当なオリゴヌク レオチド、またはオリゴヌクレオチドの組は、（上記方法を用いて）同定され、 合成され、そして、この技術分野で良く知られている方法によって、ＤＮＡまた は、さらに好ましくは、ＴＮＦ−処理ＦＳ−４細胞のようなＴＳＧ−１４遺伝子 を発現できる細物から誘導されたｃＤＮＡｊＰｉ製に対してハイブリッド形成さ れる。

“最も可能性のある”ＴＳＧ−１４タンパク質コ一ド化配列に相補的な一末鎖オ リゴヌクレオチド分子は当業者に良く知られている方法を用いて合成することが できる（ベラガジェ・アールら、屋すフチ・ディ・ビイら、アカデミツクブレス 編、ＮＹ、（１９７６）　；つ・アールら、紅ルＪ叫山］亘り桓Ｌ）山系ノ■１ ．　２１：１０１−１４１（１９７８）　；コラナ・アール・ジ４．５ｃｉｅｎ ｃｅ　２０３：６１４−６２５　（１９７９）。

さらにＤＮＡ合成は自動化合成器によって行うことができる。核酸ハイブリッド 形成形成の技術はサムプルツクら（上記）によって、そしてハイメス・ビイ・デ ィら、（Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｂｒｉｄｉｚａ旦ヨエエヱ阻は回復」明 ｍ姐値、ＴＲＳプレス、ワシントン、ＤＣ（１９８５））によって開示これてお り、これらの参考文献をここに参照として組み入れる。例えば、または上記の技 術に類似した技術はヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（フス・エル・シーら、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳ＾８２：３７７１−３７ ７５　（１９８５））　、フィブロネクチン（スズキ・ニスら、ｈム」囮工１坤 ユ町ｌｌ−扛４：２５１９−２５２４　（１９８５））、ヒトエストロゲンリセ プター遺伝子（ワルター・ピーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　８２ニア８８９−７８９３　（１９８５））　、＆Ｉｉ織タイブ プラスミノゲンアクチベーター（ペンニカ・ディら、Ｎａｔｕｒｅ　３０１：２ １４−２２１　（１９８３）　）およびヒト満期胎盤アルカリ性ホスファターゼ 相補的ＤＮＡ　（カム・ダブリュら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ。

ＵＳＡ　８２：８７１５−８７１９　（１９８５））に対して遺伝子のクローン 化をうまく可能にした。

ＴＳＧ−１４遺伝子をクローン化する代わりの方法では、発現ベクターのライブ ラリーをＤＮＡまたは、さらに好ましくは（ＴＮＰ−処理ＦＳ−４細胞のような ＴＳＧ−１４を発現できる細胞からの）　ｃＤＮＡを発現ベクターにクローン化 して調製される。次に抗−ＴＳＧ−１４抗体に結合し、ＴＳＧ−１４タンパク質 またはペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのフラグメ ントを符号化できるヌクレオチド配列をもつタンパク質を発現できる構成員に対 してライブラリーを予備選択する。この例では、ＤＮＡ、またはさらに好ましく はｃＤＮＡはＴＳＧ−１４タンパク質を発現できる細胞から抽出し精製される。

精製したｃＤＮＡは（剪断、エンドヌクレアーゼ消化等によって）フラグメント にしてＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントのプールを生成する。このプールから のＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを次に、各構成員が単一のクローン化ＤＮ ＡまたはｃＤＮＡフラグメントを含む発現ベクターのゲノムライブラリーを生成 するために発現ベクターにクローン化する。

“ベクター”の語は、プラスミドまたはバクテリオファージから誘導され、ＤＮ Ａのフラグメントを挿入またはクローン化することができるＤＮＡ分子を意味す る。ベクターは１個またはそれ以上の単一制限部位を含み、クローン化配列を再 生できるような一定の宿主またはビヒクル有機体中に自主栄養複製を行うことが できる。

“発現ベクター”の語はく適当な転写および／または翻訳コントロール配列の存 在によって）ベクターにクローン化されたＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）分子を発現 でき、これによって、ポリペプチドまたはタンパク質を生成できるベクターを意 味する。クローン化配列の発現は発現ベクターが適当な宿主細胞に導入されると きに生ずる。原核発現ベクターを用いるならば、そのときは適当な宿主細胞はク ローン化配列を発現できる任意の原核細胞であろう。

同様に、真核発現ベクターを用いるならば、そのときは、適当な宿主細胞はクロ ーン化配列を発現できる任意の真核細胞であろう。

重要なことは真核ＤＮＡは介在配列を含むことができるので、そしてこのような 配列が原核細胞中に正しく処理されることができないので、原核ゲノム発現ベク ターライブラリーを生成するためにＴＳＧ−１４を発現できる細胞からのｃＤＮ Ａを用いることが好ましい。

ｃＤＮＡを調製するための方法とゲノムライブラリーを生成するための方法はサ ムブルーフら（上記）によって開示されている。

ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子の“機能誘導体“の語はＴＳＧ− １４タンパク質の“フラグメント“または１変異体”を符号化するポリヌクレオ チド分子を意味する。相補的ポリヌクレオチド分子とハイブリッド形成する能力 のようなその機能を保持する化学誘導体であることができる。このようなポリヌ クレオチド、またはオリゴヌクレオチド、化学誘導体は核酸ハイブリッド形成ア ッセイによってＴＳＧ−１４配列を検出するための分子プローブとして有用であ る。

本発明のＴＳＧ−１４タンパク質を符号化するＤＮＡ配列、またはその機能誘導 体は、従来の技術によりベクターＤＮＡと組み換えることができ、これらの技術 には連結反応のための平滑末端または付着末端の終結、適当な終結を与えるため の制限酵素消化、望ましくない結合を避けるための適当なアルカリ性ホスファタ ーゼ処理として凝集性末端における充填、および適当なりガーゼを用いる連結反 応が含まれる。このような操作のための技術はサムブルーフ・ジエイら、上記、 によって開示されており、当該分野で良く知られている。

ＤＮＡのような核酸分子は転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含 むならばポリペプチドを“発現できる”と言われ、このような配列はポリペプチ ドを符号化するヌクレオチド配列に”実施可能に結合”する。実施可能な結合は 調節ＤＮＡ配列および発現されようとしているＤＮＡ配列を遺伝子発現を可能に するような方法で連結する結合である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性 質は生物体から生物体に変化できるが、一般に、原核生物において、プロモータ ー（これはＲＮＡ転写の開始に案内する）ならびに、ＲＮＡに転写するとき、タ ンパク質合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含むプロモーター領 域を含む。このような領域は通常はＴＡＴ＾ボックス、キャッピング配列、ＣＡ ＡＴ配列等の転写および翻訳の開始を伴う５゛−非コード化配列を含む。

望ましい場合は、タンパク質にコード化する遺伝子配列に対して非コード化領域 ３゛は上記方法によって得ることができる。この領域は、末端およびポリアデニ ル化のようなその転写終結調節配列のために保持することができる。従って、タ ンパク質にコード化するＤＮＡ配列に自然に相接する３゛領域を保持することに よって、転写終結信号を与えることができる。転写終結信号が発現宿主細胞にお いて満足に機能しない場合には、次に宿主細胞において機能する３゛領域を置換 することができる。

核酸分子の２つの配列は同しＲＮＡの写しに両方の配列を転写できるか、または １つの配列において開始されるＲＮＡの写しを第２の配列に広げることができる がいずれかの方法で互いに連結するとき“実施可能”に連結されると言われる。

従って、プロモーター配列と任意の他の“第２の”ＤＮＡまたはＲＮＡの配列の ような２つの配列は、プロモーター配列において始まる転写が実施可能に連結さ れた第２の配列のＲＮＡ転写を生じるであろう場合に、実施可能に連結される。

“実施可能に連結される”ためには、２つの配列が直接互いに近接していること は必要ない。

プロモーターはＲＮＡポリメラーゼを結合し′実施可能に連結された”核酸配列 の転写を促進することができる二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。ここで用 いられるように、“プロモーター配列”はＲＮＡポリメラーゼによって転写され るＤＮＡまたはＲＮＡの鎖に見出されるプロモーターの配列である。“プロモー ター配列補体”は配列が“プロモーター配列”の補体である核酸分子である。従 って、−末鎖の′プロモーター配列補体”に近接するプライマーＤＮＡまたはＲ ＮＡ、または“プロモーター配列”を伸長する際に、伸長が′プロモーター配列 ”または“プロモーター配列補体”に対して進行するならば、機能的プロモータ ーを含むであろう二本鎖分子を生成する。この機能的プロモーターは、“プロモ ーター配列”を含む二本鎖分子の鎖（そして“プロモーター配列補体”を含む分 子の鎖ではない）に実施可能に連結する核酸分子を転写するようにするだろう。

一定のＲＮＡポリメラーゼはこのようなプロモーターに対して高い特異性を示す 。バクテリオファージＴ７、Ｔ３、および５Ｐ−６のＲＮＡポリメラーゼは特に 良く特徴づけられ、プロモーターの特異性が高い。これらのＲＮＡポリメラーゼ の各々に特異的であるプロモーター配列はまた二本鎖ＤＮＡ鋳型の二本鎖のうち 一本鎖のみを用いる（すなわち転写する）ようにポリメラーゼに指示する。

鎖を転写する選択はプロモーター配列の配向によって決定される。

この選択はＲＮＡがヌクレオチド５°ホスフエートを３°ヒドロキシル末端に添 加することによって酵素で重合されるだけであるので転写の方向を決定する。本 発明のプロモーター配列は原核、真核またはウィルス性であってもよい。適当な プロモーターは抑制でき、またはさらに好ましくは、構造性である。強いプロモ ーターが好ましい。

本発明は真核発現が好ましいが、原核または真核細胞のいずれかにおいてＴＳＧ −１４タンパク質（またはその機能誘導体）の発現を含む。

好ましい原核宿主は大腸菌、バチルス、ストレプトミセス、シュードモナス、サ ルモネラ、セラチア等のような細菌を含む。最も好ましい原核宿主は大腸菌であ る。サルモネラ・チフイムリウムまたはセラチア・マルセノセンスのような他の 腸内細菌、および種々のシュードモナス種もまた利用できる。このような条件下 で、タンパク質をグリコジル化することはできない。原核宿主は発現プラスミド においてレプリコンおよびコントロール配列と一致しなければならない。

ＴＳＧ−１４タンパク質は原核細胞（例えば大腸菌、バチルス・サブチリス、シ ュードモナス、ストレプトミセス等）において、それ自体、または融合タンパク 質の一部として発現することができる。

融合タンパク質として発現するために、原核タンパク質と適当な読み取り枠に連 結されなければならない。好ましい融合タンパク質“パートナ−”は大腸菌の」 Ｅタンパク質またはバタテリオファージタンパク質、例えばＭＳ２ファージのそ れである（以下の実施例参照）。原核宿主においてＴＳＧ−１４タンパク質（ま たはその機能誘導体）を発現するため、ＴＳＧ−１４符号化配列を機能原核プロ モーターに実施可能に結合することが必要である。構成プロモーターの例にはバ クテリオファージラムダの」旦プロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ 遺伝子の」圏プロモーター、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチ ル転位酵素遺伝子等を含む。誘発性原核プロモーターの例はハタテリオファ−シ ラムダの主要な右および左プロモーター（ＰＬおよびＰ□）、大腸菌の」■、匹 並、１ａｃＺ、皿、およびｇａｌ　プロモーター、α−アミラーゼ（ウルマネン ・アイら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１６２：１７６−１８２　（１９８５） ）およびバチルス・サブチリスの５−２８−特異的プロモーター（ギルマン・エ ム・ゼットら、Ｇｅｎｅ　３２：１１−２０　（１９８４））、バチルスのバク テリオファージのプロモーター（グリッツアン・ティ・ジェイ、Ｔｈｅ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、アカデミツク・プ レス社、ＮＹ　（１９８２）　、およびストレプトミセスプロモーター（ワード ・ジヱイ・エムら、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、２０３：４６Ｂ−４７８ （１９８６））を含む。原核プロモーターはグリラグ・ビー・アールら、（Ｊ、 　Ｉｎｄ。

明について、最も好ましいプロモーターはラムダのＰＬプロモーターであり、あ るいは、タンパク質はラムダＰしプロモーターの温度感受性リプレッサーのコン トロール下に発現できる。

原核細胞における適当な発現はまた遺伝子符号化配列の上流でリポソーム結合部 位の存在を必要とする。このようなリポソーム結合部位は、例えば、ゴールド・ エルらによって開示されている（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　 ３５：３６５−４０４　（１９８１））。

好ましい宿主は酵母、昆虫、菌類、および生体内または＆ｌｌ織培養基内の哺乳 動物細胞を含む。哺乳動物細胞は、補正折りたたみまたは補正部位でのグリコジ ル化を含むタンパク質分子への翻訳後変更を与える。宿主として使用できる哺乳 動物細胞はＶＥＲＯまたはＣＨＯのような繊維芽細胞由来の細胞、またはリンパ 球由来の細胞、例えばハイフリドーマ５Ｐ２１０−八ｇ１４またはマウス骨髄１ １Ｐ３−Ｘ６３＾ｇ８　、およびそれらの誘導体を含む、最も好ましい宿主はＴ ＮＦを用いて処理する際にＴＳＧ−１４遺伝子を発現しないもの、例えばＧＭ− ６３７，５Ｖ４０−形質転換ヒト繊維芽細胞系である。

哺乳動物細胞宿主に対して、多くの可能なベクター系がＴＳＧ−１４の発現のた めに入手することができる。広範囲の転写および翻訳調節配列を宿主の性質によ って用いることができる。転写および翻訳調節信号はウィルス源、例えばアデノ ウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サルウルス等から誘導することができ、調節信 号は高しヘルの発現を有する特定の遺伝子と結合している。また、アクチン、コ ラーゲン、ミオシン等の哺乳動物の発現生成物からのプロモーターを用いること ができる。抑制または活性化のために与える転写開始ｔｌｉ１ｗ信号は、遺伝子 の発現を調節できるように選択することができる。感温性である調節信号は、温 度を変えることによって発現を抑制または開始することができ、または化学的調 節、例えば代謝産物に委ねられることは興味深い。

酵母細胞宿主はグリコジル化を含む財訳後ペプチド変更を行うこともできる本質 的な利点を与える。多くの組み換えＤＮＡ戦略は強いプロモーター配列と、酵母 中の望ましいタンパク質の生産のために利用できる高いコピー数のプラスミドを 用いることにある。酵母はクローン化した哺乳動物の遺伝子生成物上にリーダー 配列を認識し、リーダー配列を運ぶペプチド（即ち、プレペプチド）を分泌する 。

酵母がグルコース中に豊富な媒体中で生長するとき大量に生成される糖分解酵素 に対しコード化する活性的に発現した遺伝子からプロモーターおよび終結要素を 組み込む一連の酵母遺伝子発現系のいずれかを用いることができる。既知の糖分 解遺伝子はまた極めて有効な転写コントロール信号を与えることができる。例え ば、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターおよび終結信号を用いる ことができる。

昆虫におけるＴＳＧ−１４またはその機能誘導体の生産を、例えば、昆虫宿主に 当業者に知られている方法によってＴＳＧ−１４を発現するように工作されたバ キュロウィルスを感染させて行うことができる。従って、１例では、ＴＳＧ−１ ４を符号化する配列はウィルスポリヘトリンタンパク質の副部領域に実施可能に 連結することができる（ジャスエイ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：１６５３　（１ ９８７））　、組み換えバキュロウィルスを感染させて、培養した昆虫細胞、ま たは生きている昆虫自体は全タンパク質生産の２０ないし５０％の大きさの量で ＴＳＧ−１４タンパク質を生産することができる。生きている昆虫を使用する場 合、本発明による大規模なＴＳＧ−１４生産のために毛虫が現在好ましい宿主で ある。

上記のように、真核宿主におけるＴＳＧ−１４タンパク質の発現は真核調節領域 の使用を必要とする。このような領域は、一般に、ＲＮＡ合成の開始を指示する ために充分なプロモーター領域を含む。

好ましい真核プロモーターはＳＶ４０初期プロモーター（ベノイスト・シーら、 Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２９０祁０４−３１０　（１９８１）；　Ｍ ＭＴνしＴＲｆｔ１域と結合したＲ５Ｖプロモーター；マウスメタロチオネイン ｌ遺伝子のプロモーター（ハマー・ディら；Ｌ−ひＬ−知見し」旦ｎ、　１：２ ７３−２８８　（１９８２））；ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター（マクナ イト・ニス、Ｃｅ１ｌ　３１：３５５−３６５　（１９８２））；酵母且旦遺伝 子プロモーター７９：６９７１−６９７５　（１９８２）；シルバー・ビー・エ イら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、ＡＣ広く知られているように、真核ｍＲＮＡの翻 訳は最初のメチオニンを符号化するコドンで開始される。この理由のため、真核 プロモーターと、ＴＳＧ−１４タンパク質（またはその機能誘導体）を符号化す るＤＮＡ配列との間の結合がメチオニンを符号化できる介在コドン（すなわちＡ ＵＧ）を何も含まないことを確実にすることが好ましい。このようなコドンの存 在は融合タンパク質の生成（ＡＵＣコドンがＴＳＧ−１４符号化ＤＮＡ配列と同 し読み取り伜にある場合）またはフレームシフト変異（ＡＵＧコドンがそのＴＳ Ｇ−１４符号化配列と同し読み取り枠にない場合）となる。

ＴＳＧ−１４符号化配列および実施可能に結合したプロモーターを受入原核また は真核細胞に、線形分子であるか、または一層好ましくは閉鎖した共有結合環状 分子のいずれかである非複製ＤＮＡ　（またはＲＮＡ）分子として導入すること ができる。このような分子は自主栄養複製をすることができないので、ＴＳＧ− １４タンパク質の発現は導入配列の過度的な発現によって起ることができる。代 わりに、永久発現は宿主染色体に導入した配列の組込みによって起ることができ る。

１例において、望ましい遺伝子配列を宿主細胞染色体に組み込めるベクターを用 いる。安定にそれらの染色体に導入したＤＮＡを組み込んだ細胞はさらに発現ベ クターを含む宿主細胞の選択のために与える１個またはそれ以上のマーカーを導 入することによって選択することができる。マーカーは原栄養体のために栄養要 求宿主に、姓名破壊阻止剤、例えば抗生物質または重金属、例えば銅等を与える ことができる。選択できるマーカー遺伝子は発現すべきＤＮＡ遺伝子配列に直接 結合できるか、またはコトランスフエクションによって同じ細胞に導入すること ができる。追加の要素はまたタンパク質ｍＲＮＡを結合する一本鎖の最適の合成 にも必要である。これらの要素はスプライス信号ならびに転写プロモーター、エ ンハンサ−１および終止信号を含むことができる。このような要素を組み込むｃ ＤＮＡ発現ヘクターはオカヤマ・エイチ、勲１、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、３　 ：２Ｂ　（１９８３）によって記載されているものを含む。

好適例では、導入配列は受入宿主中の自主栄養複製の可能なプラスミドまたはウ ィルスベクターに組み込まれるだろう。任意の広範囲のベクターをこの目的のた めに用いることができる。特定のプラスミドまたはウィルスベクターを選択する 際に重要な因子は次のものである：ベクターを含む受入細胞をｖ２熾しベクター を含まない受入細胞をそれらから選択する容易さ；特定の宿主に望まれるベクタ ーのコピー数寥および異なる種の宿主細胞間にベクターを“往復”できることが 望ましいかどうかである。好ましい原核ベクターには大腸菌中で複製できるよう なプラスミドを含む（例えばｐＢＲ３２２、Ｃｏ１Ｅ１　、　ｐｓｃｌｏｌＳｐ ＡｃＹｃ１８４、ｙ＋ＶＸ等。コノようなプラスミドは、例えばサムブルーフら （上記）によって開示されている。バチルスプラスミドはｐｃ１９４　、ｐｃ２ ２１　、　ｐＴ１２７等を含む。このようなプラスミドはグリコアン・ティ　（ Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ旦坦」ｌユＬ刊見ｌ曵則旦、アカデミツク・プレス ・ＮＹ　（１９８２）　３０７−３２９頁）を含む。適当なストレプトミセスプ ラスミドはｐｌＪｌｏｌ（ケンダル・ケイ・ジエイら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌ　１６氾４１７７−４１８３　（１９８７）、およびφＣ３１のようなストレ プトミセスバクテリオファージ（チャタ−・ケイ・エフら、５ｉｘｔｈ　Ｉｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ　ｍ　ｏｓｉｕ＋ｗど」ｋ月ユ硯ｙ及堕旦ｌ」乃土腫 Ｕユアカデミアイ・カイト・ブタペスト・ハンガリイ（１９８６）、４５−５４ 頁）を含む。シュードモナスプラスミドはジョン・ジエイ・エフら（Ｒｅｖ、　 Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、８　：６９３−７０４　（＋９８６）　、およびイザ キ・ケイ　（Ｊ　ｎ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　３３ニア２９−７４２（１９８ ７））を含む。

好ましい真核プラスミドはＢＰＶ、ワタシニア、ＳＶ４０．２−ミクロンサーク ル等、またはそれらの誘導体を含む。このようなプラスミドは当分野において良 く知られている（ホトスティン・ディら、門ｉａｍｉ　Ｗｎｔｒ、　Ｓ　＋１　 、１９、：　２６５−２７４　（１９８２）；　フ゛ローチ・ジェイ゛アール、 Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　５ａｃ ｃｈａｒｏ＋ｍ匹競二月Ｊ東ちａＬｕｄ　Ｉｎｈｅｒｉ田ユ岨、コールド・スプ リング・ハーバ−・ラボラトリイ、コールド・スプリング・ハーバ−・ＮＹ、　 ４４５−４７０真（１９８１）；ブローチ・ジェイ・アール、釦旦　訃：２０３ −２０４（１９８２）　；ポロン・ディ・ビイら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｈｅｍａ ｔｏｌ、　０ｎｃｏ＋、　１０：３９−４８　（１９８０）；マニアチス・ティ 、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ幻■：　Ａ　Ｃｏ＋＊　ｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｔｒｅａｔ ｉｓｅ、３巻、Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ、アカデミツク・プレス、ＮＹ 、５６３−６０８頁（１９８０））。

一旦構成体を含むベクターまたはＤＮＡ配列を発現のために調製すると、ベクタ ーまたはＤＮＡ構成体を適当な宿主細胞に、形質転換、トランスフエフシラン、 接合、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈澱、およびジエチルアミノエチ ル（ＤＥＡＥ）デキストランのようなポリカチオンの応用のような生化学的手段 、および電気穿孔法、直接マイクロインジェクシッン、およびマイクロ発射衝撃 （ジョンストンら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４叶１５３８　（１９８８））等の機械 的手段を含む広範囲の適当な手段のいずれかによって導入することができる。

ベクターを導入した後、受入細胞は、ベクター含有細胞の生長に対して選択する 選択的媒体内で生長する。クローン化遺伝子配列の発現はＴＳＧ−１４タンパク 質の生産、またはこのタンパク質のフラグメントの生産となる。これはそれ自体 形質転換細胞に起るか、またはこれらの細胞の分化誘導に導く。

発現タンパク質または融合タンパク質を従来の条件で、例えば抽出、沈澱、クロ マトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動等によって単離し 精製することができる９例えば、細胞を遠心分離によって、または適当な緩衝液 を用いて収集し、溶離し、タンパク質を例えばＤＥＡＥセルロース、ホスホセル ロース、ポリリボシチジル酸−アガロース、ヒドロキシアパタイトでのクロマト グラフィーまたは電気泳動または免疫沈降によって単離することができる。ある いは、ＴＳＧ−１４またはその機能誘導体を抗ＴＳＧ−１４抗体を使用して単離 することができる。このような抗体は既知の方法によって得ることができ、その 中の若干を以下に述べる。

上記のようなＴＳＧ−１４機能誘導体を符号化する遺伝子構成体は遺伝子療法に 用いることができる。病気に対する感染性を高めることになる異常なＴＳＧ−１ ４分子を、融合細胞が優先的に内因性細胞個体群にとって代わる条件下に、正常 または改質のＴＳＧ−１４タンパク質を符号化するＤＮＡを用いてトランスフェ クトした望ましいリネノジの細胞（例えば繊維芽細胞）の融合によって置き換え ることができる。

本発明はまたトランスジェニック非ヒト真核動物（好ましくは薩歯動物、例えば マウス）に向けられ、その性細胞および体細胞はＴＳＧ−１４タンパク質または その機能誘導体を符号化する本発明によるゲノムＤＮＡを含む。ＴＳＧ−１４Ｄ 　Ｎ　Ａはトランスジェニックされるべき動物、または動物の原種に、胎児段階 、好ましくは１個の細胞、または受胎卵母細胞段階、そして一般に約８個の細胞 の段階より遅くない時期に導入される。ここで用いられる“トランスジーン”の 語は、トランスジェニック動物においてタンパク質が存在することになる動物の ゲノムに組み込まれる動物内で発現される遺伝子を意味する。

このような遺伝子を染色体によって組み込み発現するように動物胎児のゲノムに 導入できる幾つかの方法がある。一つの方法は自然に発生するとき遺伝子と胎児 をトランスフェクトし、発現することになる遺伝子座で遺伝子が染色体を組み込 んだトランスジェニック動物を選択する。発現を確保するための他の方法は胎児 に導入する前に遺伝子またはそのコントロール配列を改変する方法を含む。この ような方法の一つは胎児をすでに改質した遺伝子を含むベクター（上記参照）と トランスフェクトする方法である。

他の方法はその転写が合成または真核またはウィルス由来であるかいずれにせよ 、誘導できるかまたは構造的に作用するプロモーターのコントロール下にある遺 伝子を使用するか、または１個またはそれ以上の塩基対の置換、欠失、または付 加（上記参照）によって活性化された遺伝子を使用する方法である。

受精した卵母細胞段階での望ましい遺伝子配列の導入はトランスジェニック動物 の生殖細胞と体細胞のすべてにトランスジーンを存在させて、このような細胞の すべてに発現されるポテンシャルをもつことになる。トランスジーン、り“創始 者”動物の卵母細胞中のトランスジーンの存在は順にその子孫のすべてが彼等の 卵母細胞と体細胞のすべてにトランスジーンを有することを意味する。創始者動 物の後の胎児段階でのトランスジーンの導入は創始者の若干の体細胞線列におい てトランスジーンの存在が制限されることになる；しかしながら、創始者の卵母 細胞から常法によりトランスジーンを遺伝するこの創始者動物の子孫のすべては 、彼等の卵母細胞と体細胞のすべてにトランスジーンを所有するである。

卵母細胞と体細胞の全部よりは少ない数のものが本発明のＴＳＧ−１４ＤＮＡを 含むキメラ非ヒト哺乳動物は、本発明の範囲内に入り、このような動物はモルラ の全細胞よりは少ない数のものがトランスジェニック咄乳動物を生産する工程で トランスフェクトされる。

レダーの米国特許４，７３６，８６６号（ここに参照文献として組み込まれる） に記載されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生産するための技術は、本発 明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の生産のために使用することができる。

ここにその全体の内容が参照文献として組み込まれるバルミター・アールらのＡ ｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｇｅｎｅｔ、２０：４６５−９９　（１９８６）に記載された種々の技術もまた 使用することができる。

ＴＳＧ−１４遺伝子を所有する動物は、結合＆ＩＩ繊細胞にＴＮＦ作用によって 仲介される慢性の炎症状態を防ぎ、抑制し、または直すことができる化合物また は他の治療様相を試験するために使用することができる。これらの試験は本発明 のトランスジェニック動物に与えられる試験下に薬剤投与量の調節能力のために 極めて感度を良くすることができる。このような病気には、慢性関節リウマチ、 肉芽ｌ病等を含むがこれらに限られない。本発明によるトランスジェニック動物 はまた細胞培養のための細胞源として使用することもできる。

本発明はまたＴＳＧ−１４タンパク質のエピトープに特異的な抗体に関する。追 加の例では、本発明の抗体を細胞中、または細胞または＆！１織の抽出物中のＴ ＳＧ−１４タンパク質、または生体液の存在を検出し、または分量と濃度を測定 するための方法に用いられる。抗体はまた細胞中のＴＳＧ−１４の発現の誘導を 測定するための方法、または細胞中のＴＳＧ−１４の発現を誘導できる化合物を 同定するための方法に使用することができる。抗体はまたＴＳＧ−１４の作用を 中断させるために使用することができ、これによってＴＳＧ−１４の過剰生産、 または不適当な生産または作用と関係した病気、例えば慢性関節リウマチ、感染 症およびセブシスを含む炎症性の疾患、ならびにＴＮＰ−刺激白血球癒着と関連 した状態を防ぎまたは治療する。

“抗体”の語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡＢｓ）　、キメ ラ抗体、および抗イデイオタイプ抗体（抗−［ｄ）を含むことを意味する。

抗体は分子と特異的に反応し、これによって分子を抗体に結合できる場合に分子 を“結合できる”と言われる。“エピトープ”の語は抗体によって認識でき、そ の抗体によって結合できる任意の分子の部分を表す。エピトープまたは“抗原決 定基゛は通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基から 成り、特定の三次元構造の特性と特定のチャージ特性をもつ。

“抗原”は、抗原のエピトープに結合できる抗体を生成するように動物をさらに 誘発できる抗体によって結合できる分子またはその一部である。抗原は１個また はそれ以上のエピトープを持つことができる。上に示した特定の反応の意味は抗 原が、選択性の高い方法で、その対応する抗体と反応し、他の抗原によって引き 起こされる他の抗体の多数と反応しないことを表している。

タンパク質中に存在する抗原エピトープを予言するために、アミノ酸配列は視覚 的に調べるかまたはコンピューターによって、例えばＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＩＩ ＣＴＵＲＥ　（ジャメソンら、ＣＡＢＩＯ５↓：１８１−１８６（１９８８）） のプログラムを用いて分析される。このプログラムはヒドロパソンティ値を決定 することができ、この値は次に全体のタンパク質配列中のどのペプチド配列がそ れらのポテンシャル二次構造に基づき最も免疫原性であるらしいかを決定するた めに用いられる。このようなペプチドは化学的に合成され、または代わりに、そ して好ましくは、組み換えＤＮＡ方法によって合成することができる。

合成ペプチドに対して発生する抗体の落とし穴のひとつはこのように提出された 抗体が天然タンパク質と反応し損なう可能性があることである。このために代わ りの方法を用いることができる。

ＴＳＧ−１４タンパク質はバクテリアにより発現した融合タンパク質として発現 プラスミド、例えば図７と以下の実施例Ｖ１１に記載されたｐＡＴ）１２−ＴＳ Ｇ−１４発現ベクターを用いて調製できる。あるいは、ＴＳＧ−１４は例えばｐ ＤＢ１６９　（リム・ディら、上記）のような発現プラスミドを用いる融合タン パク質として発現できる。ＡｒｇＲリプレッサータンパク質はベクターの強い」 赳プロモーターのコントロール下に大腸菌株ＪＭＩＯＩ内に高く発現される。Ａ ｒｇＲコード化領域のＣ−末端部分は、正しい読み取り枠内でＮ−末端欠失ＴＳ Ｇ−１４コード化配列によって置換できる。この構成を次に、例えば、ＪＭＩＯ Ｉ細胞にトランスフェクトして、融合タンパク質の発現ヲ５Ｏ３−ＰＡＧＥによ ってモニターする。融合タンパク質の発現は」匹プロモーターに特異的なＩＰＴ Ｃを用いて、大きい培養システムで誘導され、ｍリプレッサーに特異的な抗体を 用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。

精製した融合タンパク質は兎の免疫感作に用いられる。代わりに、このような融 合タンパク、または合成ペプチドのようなタンパク譬の機能誘導体を使用してモ ノクローナル抗体の世代用舊歯動物を免疫感作するために用いることができる。

ポリクローナル抗体は抗原で免疫感作した動物の血清から誘導した抗体分子の外 来個体群である。

モノクローナル抗体は特定の抗原に対する実質的に相同の個体群の抗体である。

ＭＡｂｓは当業者に知られている方法で得られる。

例えばコーラ−およびミルスティンのＮａｔｕｒｅ　２５６：　４９５−４９７ 　（１９７５）および米国特許第４，３７６．１１０号参照。このような抗体は ＩｇＧ、ＩｇＭ−１ｇＥ、ＩｇＡを含むいずれかのイムノグロブリン・クラスお よびそのいずれかのサブクラスであることができる。本発明の−ｂｓを生産する ハイプリドーマはイン・ケイトロまたはイン・ケイヴオで培養することができる 。ｍＡｂｓのイン・ケイヴオ生産の高力価の生産はこれを現在好ましい生産方法 とする。簡単には、各ハイプリドーマからの細胞はプリスタン感作Ｂａ１ｂ／ｃ マウスに腹膜内に注射して高濃度の望ましいｍＡｂｓを含む腹水液を生成する。

イソタイプのＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡｂｓは、このような腹水液から、または 培養上澄液から、当業者に良（知られたカラムクロマトグラフィ一方法を用いて 精製することができる。

キメラ抗体は異なる動物種から誘導される異なる部分の分子であり、例えばネズ ミｍＡｂから誘導される可変領域およびヒトイムノグロブリンの一定領域を有す るものである。キメラ抗体およびその製造方法は当該技術分野で知られている（ カビリイら、紅匹。

８−２７０　（１９８５）；　タニグチら、ヨーロッパ特許用ＩＪ１１７１４９ ６　（１９８５年２月１９日発行）：クトーら、ヨーロッパ特許用＠１８４１８ ７　（１９８６年６月１１日発行）；ロビンソンら、国際特許公報＃ＰＣＴ／Ｕ Ｓ８６１０２２６９　（１９これらの参考文献はここに参照として組み込まれる 。

抗イデイオタイプ（抗−１ｄ）抗体は抗体の抗原結合部位と一般に関係する独特 の決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体はｍＡｂの源と同じ種および遺伝子型 （例えばマウス菌株）の動物を、抗−Ｉｄが調製される一＾ｂを用いて免疫感作 して調製することができる。

免疫感作した動物はイディオタイプ決定基（抗−［ｄ抗体）に対し抗体を生産す ることによって、免疫感作する抗体のこれらイディオタイプ決定基を認識して応 答する。

抗−１ｄ抗体はまた“免疫源”として使用することもでき、いわゆる抗−抗−１ ｔ！抗体を生成する他の動物にも免疫応答を誘導する。

抗−抗−１６は抗−目を誘導した元のＩＩＡｂに対して構造の類似性をもつ。従 って、清＾ｂのイディオタイプ決定基に対して抗体を用いることにより、同一の 特異性の抗体を発現する他のクローンを同定できる。

従って、本発明のＴＳＧ−１４タンパク質に対して発生したｍＡｂｓを使用して 適当な動物、例えばＢａ１ｂ／ｃマウスに抗−１ｄ抗体を誘導することができる 。このような免疫感作マウスからの肺臓細胞を使用して抗−１ｄ　ｍＡｂｓを分 泌する抗−１６ハイブリドーマを生成する。

さらに、抗−Ｉｄ　ＩＩＡｂｓをキイホール・リンペット（カサガイの一種）の ヘモソアニン（ｌｎＨ）のようなキャリアにカップルさせて、追加のＢａ１ｂ／ ｃマウスを免疫感作するために用いる。これらのマウスからの血清はＴＳＧ−１ ４タンパク質エピトープに特異的な元のｓＡｂの結合性を有する抗−抗−１ｄ抗 体を含むだろう。

“抗体”の語はまた完全な分子とそのフラグメントの両方を含み、例えばＦａｂ およびＰ（ａｂ’）ｚは抗原を結合できる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｚフラグ メントは完全な抗体のＦｃフラグメントを欠いており、これはその循環から一層 早く明らかであり、完全な抗体よりも非特異的組織の結合が小さい（ワールら、 Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、　２４：３１６−３２５　（１９８３））　。

ＦａｂとＦ（ａｂ’）ｚおよび本発明の有用な抗体の他のフラグメントを、完全 な抗体分子のためにここに開示した方法によってＴＳＧ−１４タンパク質の検出 と定量に使用できる。このようなフラグメントは代表的には、パパイン（Ｆａｂ フラグメントを生成するため）またはペプシン（Ｐ（ａｂ’）ｚフラグメントを 生成するため）のような酵素を使用して、タンパク質分解開裂によって生成され る。

本発明の抗体、または抗体のフラグメントを使用して表面または細胞内にＴＳＧ −１４タンパク質を発現する細胞の存在を定置的または定性的に検出できる。こ れは光学１９を微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量法による検出を用 いてカップルした蛍光標識抗体（下記参照）を用いる免疫蛍光法によって行われ る。

本発明の抗体は、免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法のように、ＴＳＧ−１４タ ンパク質をインシトウ検出するため、組織学により用いることができる。インシ トウ検出は物体から組織（細胞または組織）標本を取り出して、このような標本 に本発明の標識抗体を与えて行うことができる。抗体（またはフラグメント）は 好ましくは生物試料に付着または重ねて行うことが好ましい。このような方法を 使用して、ＴＳＧ−１４タンパク質を存在だけでなく試験組織上の分布も決定で きる。本発明を用いると、任意の広範囲のｍｍ学方法（例えば染色方法）をこの ようなインソトウ検出を行うために改変できることは、当業者は容易に気付くで ある。

さらに本発明の抗体を使用して生物試料中の可溶性ＴＳＧ−１４Ｓチー１在を検 出できる。この方法を使用すると、抗体は、ＴＳＧ−１４のＴＮＦ誘導と関連し た状態、例えば炎症状態、感染症またはセプシス等をもつ患者のＴＳＧ−１４タ ンパク質の存在と定量をモニターする手段として用いることができる。

このようなＴＳＧ−１４タンパク質のためのイムノアッセイは代表的には生物試 料、例えば生物流体、組織抽出物、リンパ球または白血球のような新しく採取し た細胞、または組織培養基で培養した細胞を、ＴＳＧ−１４タンパク質を同定で きる検出可能に標識した抗体の存在でインキュベートし、この抗体を当該分野で 良く知られた多くの方法のいずれかによって検出することからなる。

生物試料は、ニトロセルロースのような固相支持体またはキャリヤ（ここではこ れらの語を互換して使用する）、または細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質 を固定化できる他の固体支持体を用いて処理できる０次に支持体を適当な緩衝液 で洗浄し、次に検出可能なｔｌｍＴｓＧ−１４特異的抗体を用いて処理できる。

次に固相支持体をさらに緩衝液で洗浄し結合していない抗体を除去する。

前記固体支持体上に結合した標識の量を次に通常の手段で検出することができる 。

“固相支持体またはキャリヤ゛は抗原または抗体を結合できる任意の支持体を表 す。良く知られた支持体、またはキャリヤは、ガラス、ポリスチレン、ポリプロ ピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改質 セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩、および磁鉄鉱を含む。キャリヤの 性質は本発明の目的のためにある程度まで溶解できるがまたは不溶性である。支 持体材料はカップルした分子が抗体または抗体に結合できる限り、実質的に任意 の可能な構造形態をもっことができる。従って、支持体の形態はビーズのように 球状であるかまたは試験管の内面または棒の外面のように円筒形であってもよい 。

あるいは表面はシート、試験片等のように平坦であってもよい。

当業者は抗体または抗原を結合するための多くの他の適当なキャリヤを知ってい るだろう、あるいは日常の実験を使用して同様に確かめることができるだろう。

抗−ＴＳＧ−１４抗体の所定のロットの結合活性は既知の方法によって決定でき る。当業者は日常の実験を使用してそれぞれを決定するための操作上の最適アッ セイ条件を決定できるだろう。

特定の状況に応じて慣習的または必要であるときには、洗浄、撹拌、振盪、濾過 等の他の工程をアッセイに追加できる。

ＴＳＧ−１４特異的抗体を検出可能に標識できる方法のひとつは、これを酵素に 結合して、酵素イムノアッセイ　（ＥＩＡ）を用いて標識できる。この酵素は、 順に、後に適当な基質に反応させるとき、例えば分光光度針、蛍光測定または視 覚による方法によって検出できる化学的部分を生成するような方法で基質と反応 させるだろう。

抗体を検出可能に標識するために使用できる酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ 、スタフィロコッカスのヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、 酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファーグリセロホスホフェートデヒドロ ゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビパーオキシダーゼ、 アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘー ターガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼー、カタラーゼ、グルコ ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエ ステラーゼを含むが、これらに制限されるものではない。この検出は酵素に対し て発色体基質を用いる比色定量方法によって行うことができる。また検出は同様 に調製された標準物と比較して基質の酵素反応の程度を視覚により比較して行う こともできる。

検出は種々のイムノアッセイのいずれかを用いて行うことができる。例えば、抗 体または抗体フラグメントを放射性標識することによって、ＴＳＧ−１４タンパ ク質をラジオイムノア、セイ　（ＲＩＡ）を使用して検出できる（チャード・テ ィ、°ラジオイムノアッセイおよび関係する技法の紹介”、（ワーク・ティ・ニ スら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ ｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ノース・オランダ・ パブリッシング・カンパエイ、ニューヨーク（１９７８）、ここに参照文献とし て組み込む）。

放射性同位体はガンマカウンターまたは液体シンチレーシコンカウンターを使用 する方法によっであるいはオートラジオグラフィーによって検出できる。また抗 体に蛍光化合物の標識を付けることもできる。蛍光によって標識を付けた抗体を 適当な波長の光にさらして、次にその存在を蛍光によって検出できる。最も一般 に用いられる蛍光標識化合物はフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン 、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、０−フタルアルデ ヒドおよびフルオレサミンである。

また抗体はＩｓ！Ｅｕのような蛍光発光金属、またはランタン系列の他の金属を 用いて検出できるように標識を付けることもできる。

これらの金属はジエチレントリアミン四酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミ ン四酢酸（ＥＤＴ＾）のような金属キレート基を用いて抗体に結合できる。

また抗体は化学発光化合物にカップリングさせて検出できるように標識を付ける ことができ、化学ルミネセンス標識抗体の存在を次に、化学反応の過程に生じる ルミネセンスの存在を検出して決定する。特に有用な化学発光！！識化合物の例 にはルミノール、イソルミノール、熱性アクリジニウムエステル、イミダゾール 、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルがある。

同様に生物発光化合物を使用して本発明の抗体に１１６を付けることができる。

生物発光は触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める生物系に見出された化 学発光のタイプである。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出して決定 される。標識を付けるための重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフエラ −ゼおよびエクオリンである。

本発明の抗体分子はまた“二側”または“サンドウィッチ”アッセイとして知ら れている免疫計量アッセイに利用するために適応させることができる。代表的な 免疫計量アッセイでは、一定量の標識を付けていない抗体くまたは抗体のフラグ メント）を固体支持体に結合し、一定量の検出できる標識を付けた可溶性抗体を 添加して、固相抗体、抗原、および標識抗体間に形成された三重複合体の検出お よび／または定置を行う。

代表的な、そして好ましい免疫計量アッセイは“前進”アッセイを含み、固相に 結合した抗体は先ず試験される試料と接触し、二成分固相抗体−抗原複合体を生 成して試料から抗原を“抽出”する、適当なインキュベーション期間後に、固体 支持体を洗浄して、もしあるならば未反応抗原を含む液体試料の残渣を除き、次 に未知の分量の標識抗体（“レポーター分子”として働く）を含む溶液と接触さ せる。未標識の抗体によって固体支持体に結合した抗原と［ｋ抗体を複合体化合 物にする第二のインキュベーション期間の後に、固体支持体を第二の時間洗浄し て未反応の標識抗体を除去する。

“サンドウィッチ”アッセイの別のタイプでは、これもまた本発明の抗原を用い ることができ、いわゆる“同時”および“リバース”アッセイを用いる。同時ア ッセイは、固体支持体に結合した抗体および標識抗体を共に同時に試験される試 料に添加するので単一のインキュヘーンヨン段階を含む。インキュベーションを 完了した後、固体支持体を洗浄して、液体試料の残渣と複合体を作っていない標 識抗体を除去する。固体支持体と会合する標識抗体の存在は次に従来の“前進” サンドウィッチアッセイのように決定される。

“リバース“アッセイでは、先ずＩＩｉ！Ｉｌ抗体の溶液を液体試料に順次添加 して次に適当なインキュベーション期間後に固体支持体に結合した未標識抗体を 添加する。第二のインキュベーションの後に固相を従来の方法で洗浄し、試験さ れる試料の残渣と未反応標識抗体の溶液を取り除く。固体支持体と会合する標識 抗体の決定は、次に“同時゛および“前進”アッセイのように行われる。

本発明によれば、ＴＳＧ−１４タンパク質に特異的な対象物の循環抗体を診断す ることができる。これは上述のように、本発明のタンパク質またはその機能誘導 体を用いるイムノアッセイによって行われる。

癌患者では、循環エンドトキシンのレベルが高く　（ハリス・アール・アイら、 Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈ、３７：４６７−４７０　（１９８４））、特に悪 液質の影響が大きく関連することが知られている腫瘍タイプの患者において高い （バンパーストーン・ディ・エイら、Ｃａｎｃｅｒ　６２：１６１９−１６２４ 　（１９８８））。高レベルのエンドトキシンの存在は多分腫瘍自体の直接の結 果ではなく、むしろ患者の一般的な衰弱を示しているのだろう。重い病気で内在 バクテリアとエンドトキシンの腸管からの転移の増加は栄養不良によるものであ り、細胞性免疫を損なったものは一層悪化させる因子となる（ウィルモア・ディ ・ダブリュら、Ｓｕｒ　ｅｒ　１０紅９１７−９２３　（１９８Ｂ））。悪液質 癌患者は栄養不良であり、細胞性免疫の抑制を示す場合が多いので、内在微生物 の転移は高レベルのエンドトキシンの原因であってもよい。

癌患者の末梢血液単核細胞はしばしばインケイトロで“自然の”ＴＮＦ放出を高 める（アデルカ・ディら、Ｌａｎｃｅｔ　ｉ：　１１９０４１９２　（１９８５ ））　、マクロファージ活性化剤に応答するＴＮＦ生産は病気の転移が進んでい る患者では減少するが、局部的な癌患者では減少しない。これらの観察は腫瘍細 胞による単核細胞／マクロファージの刺激または腫瘍細胞による直接のＴＮＦ生 産により、ＴＮＦ生産が癌患者では進行するという考えを支持した。ＴＮＦは健 康な血清の３％および活動していない癌患者からの血清の１８％と比較して、活 動している病気をもつ２２６人の癌患者の５０％の血清に検出された（バルクウ ィル・エフら、Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ：１２２９−１２３２　（１９８７））。

ＴＮＦ　レベルはまたＡＩＤＳ　（ラーデケイルタ・ジエイら、Ａｍｅｒ、　Ｊ 。

勿ａ、８５：　２８９−２９１　（１９８Ｂ））および髄膜炎菌髄膜炎および敗 血症（ワーブエイら、１．ａｎｃｅｔ　±：３５５−３５７　（１９８７））） を含む種々の細菌性およびウィルス性病気において高くなる。ラットの火傷／感 染症モデルでは、肝臓ＴＮＦ　＋ｍＲＮＡのレベルは、火傷したが感染症のない コントロールのラットと比較して、火傷＋感染症のう・ノドでハ１００％１加し た（マラノ・エム・アールら、Ａｒｃｈ工錘■、　皿１３８３−１３８８　（１ ９８８））。火傷と感染症の動物はまた代謝応答が大きかった（悪液質）。ミチ エ・エイチ・アールら、Ｂｒ、Ｊ、Ｓｕｒ。

邦：６７０−６７１　（１９８９）は、ＴＮＦが重い敗血症の変化と関連した重 要な媒介者であるという証拠を概説した。

従って、ＴＮＦまたはＩＬ−１のようなサイトカイン、または細菌性エンドトキ シンに対する対象物の応答を測定できる本発明の方法は癌または感染症の病気の 衰弱させる効果への個々の感受性を予言する際に有用である。同様に、本発明の 組成物は、ＴＮＰの作用によって連動能力に示される事象を中断させる能力によ って、このような病気の予防と治療に有用である。

ここに用いられるように、炎症性の反応のような病気の°予防”の語は、患者に ＴＳＧ−１４ペプチド誘導体、または病気の臨床開始前の抗体（上記参照）の投 与を含む。“治療”は病気のＨｎ床開始後の予防構成物の投与を含む。例えば、 炎症性の病気、悪性腫瘍または感染ｑの発生後に本発明によるＴＳＧ−１４ペプ チド誘導体または抗−ＴＳＧ−１４抗体をうまく投与することは、病気の“治療 ”となる。

本発明のＴＳＧ−１４タンパク質、ペプチドまたは抗体は例えばりウマ千様関節 炎または他の炎症性状態、悪性腫瘍、感染症等を治療するために意図された目的 を達成する任意の方法によって投与することができる。

例えば、皮下、静脈、皮肉、筋肉内、腹膜内、鼻腔内、経皮のような種々の腸管 外経路または口内経路によって投与することができる。あるいは、または同時に 、局所経路または口腔経路によって投与することができる。腸管外投与は巨丸注 大または時間をかけた徐々の潅流によって行われる。

慢性炎症（リウマチ様関節炎のような）または悪性腫瘍のような病気を防ぎ、抑 制し、または治療するだめの代表的な摂生は有効量のＴＳＧ−１４機能誘導体、 またはそれに対する抗体を投与することであり、１日または数日間、１週間から 約６ケ月間まで投与される。投与量は受容者の年令、性別、健康状態、および体 重、同時治療の種類、あるならば、治療の回数および望ましい効果の性質に依存 する。以下に記載する有効投与量の範囲は、これに制限するものではなく、好ま しい投与量の範囲を示すものである。しかし、当業者によって理解され決定でき るので、最も好ましい投与量は各患者に合わせられるだろう。

各治療に必要な全投与量は複数回または１回の投与量によって投与することがで きる。タンパク質、その機能誘導体または抗体は単独または、ウィルス感染症ま たは他のウィルス病の症状に合わせて他の治療と組み合わせて投与することがで きる。

ＴＳＧ−１４タンパク譬、その機能誘導体、またはそれに対する抗体の有効量は 体重につき約０．０１μｇないし約１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは体重に つき約ｌＯμｇないし約５０ｍｇ／ｋｇである。

腸管外投与のための製剤は無菌水または非水溶液、懸濁液、および乳濁液を含み 、当該分野で知られている補助剤または賦形剤を含むことができる０錠剤および カプセルのような製薬組成物もまた慣例の方法によって調製することもできる。

本発明のタンパク質、ペプチドまたは抗体から成る製薬組成物は、タンパク質、 ペプチドまたは抗体がその意図する目的を達成するために有効な量で含まれるす べての組成物を含む。さらに、この製薬組成物は製薬学的に使用できる製剤に活 性化合物を処理することが容易な賦形剤および補助剤からなる適当な製薬学的に 受け入れられるキャリヤを含む。

製薬組成物は注射または経口によって投与するための適当な溶液を含み、約０． ０１ないし９９パーセント、好ましくは約２０ないし７５パーセントの活性成分 （すなわち、ＴＳＧ−１４タンパク質または抗体）を賦形剤と共に含む。経口投 与のための製薬組成物は錠剤およびカプセルを含む。直腸経由で投与する組成物 は座剤を含む。

本発明の好ましい動物の対象は哺乳動物である。“哺乳動物”の語は哺乳類に属 する個体を意味する。なお獣医用にも向けられるが、本発明は特にヒトの患者の 治療に有用である。

本発明は患者の正常または変異体のＴＳＧ−１４タンパク質またはｍＲＮ＾の存 在とレベルを評価するための方法を提供する。例えばＴＮＦ、　ＩＬ−１または 細菌感染症のような外因性刺激物を用いて刺激に反応するＴＳＧ〜１４の過剰発 現は炎症性または腐敗性反応の重要な予言者として役立つことができる。ハイブ リッド形成アッセイまたはＴＳＧ−１４タンパク質におけるＴＳＧ−１４ｍＲＮ ＾の定量のための方法を提供することによって、イムノアッセイにおけるように 、本発明はりウマチ様関節炎のような炎症性病気の発現、感染症および腐敗性の 病気等の患者における感受性を検出するための方法を提供する。

ＴＳＧ−１４ＤＮＡ配列の種々の部分を符号化するオリゴヌクレオチドプローブ を使用して存在するＴＳＧ−１４ＤＮ　Ａまたはｓ＋ＲＮＡに対して患者からの 細胞を試験する。好ましいプローブはＴＳＧ−１４配列の少なくとも１２個およ び好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドを符号化する核酸配列に向けられ たものであろう。

定性または定量アッセイは、このようなプローブを用いて行うことができる。例 えばノーザン分析（下記の実施例参照）を用いて細胞または組織標本中のＴＳＧ −１４ｓ＋ＲＮＡの発現を測定する。

このような方法は個体から得られたＤＮＡを極めて少量用いることができ、続い て選択的増幅技術を使用する。精製した核酸フラグメントを増幅できる組み換え ＤＮＡの方法論は長い間認められてきた。代表的には、このような方法論は核酸 フラグメントのＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの導入、ベクターのクローン化増 幅、および増幅された核酸フラグメントの回収を含む。このような方法論の例は コーヘンら（米国特許４，２３７，２２４）、サムブルーフら（上記）等によっ て与えられる。

最近、インケイトロ酵素方法がこのような望ましい核酸分子のｔｌｍを増加でき ることが記載されている。この方法は“ポリメラーゼ鎖反応”または“ＰＣＲ” と呼ばれる（ムリス・ケイら、並Ｉｄ　Ｓ　ｒｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓ　ｍ　、 Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、５１：２６３−２７３　（１９８６）；エルリッチ・エ イチら、Ｅ　Ｐ２Ｏ，４２４；　Ｅ　Ｐ８４．７９６；　Ｅ　Ｐ２５Ｂ、０１７ ；　Ｅ　Ｐ２３７．３６２：ムリス・ケイ、Ｅ　Ｐ２Ｏ１，１８４；ムリス・ケ イら、ＵＳ４．６８３．２０２；エルリッチ・エイチ、Ｕ　Ｓ　４，５８２．７ ８８；およびサイキ・アールら、Ｕ　Ｓ　４．６８３．１９４）。

このポリメラーゼ鎖反応は、配列が予め精製されておらず特定試料中に単一コピ ーでのみ存在するときにも特定の核酸配列濃度を選択的に増加するための方法を 提供する。この方法を使用して一本鎖または二本鎖ＤＮＡを増幅することができ る。本発明の核心は望ましい核酸分子の鋳型依存ポタメラーゼ介在複製のための プライマーとして役立つように２個のオリゴヌクレオチドプローブを使用するこ とを含む。

ＰＣＲ方法の２個のオリゴヌクレオチドプローブのまさにその性質は本方法の成 功に重要である。良く知られているように、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子は分子の ホスフェート基の５°−３゛結合によって与えられる指向性をもつ。ＤＮＡまた はＲＮＡのの配列は共に１の配列の末端５゛ホスフエート基と第２の配列の末端 ３゛水酸基との間にホスホジエステル結合を生成して結合する。核酸分子のポリ メラーゼ依存性増幅は５゛ヌクレオチドホスフエートを核酸分子の３゛水酸基末 端に付加して行う。従って、ポリメラーゼの作用は核酸分子の３゛末端に及ぶ。

これら固有の性質はＰＣＲのオリゴヌクレオチドプローブを選択して活用される 。ＰＣＲ方法のプローブのオリゴヌクレオチド配列は、それらが増幅が望ましい 特定の核酸配列の側面を守る配列に等しいか、または相補的である配列を含む。

さらに特に“第１の′プローブのオリゴヌクレオチド配列は望ましい配列に対し て３゛に位置したオリゴヌクレオチド配列にハイブリッド形成できるように選択 し、一方“第２の”プローブのオリゴヌクレオチド配列は望ましい領域に対し１ 個の現存の５゛に同しオリゴヌクレオチド配列を含むように選択する。両者のプ ローブは３゛水酸基を有し、従って核酸合成のためのプライマーとして役立つ。

ＰＣＲでは反応条件はハイブリッド形成と核酸重合に対して伝導性のものと、二 本鎖分子の変性で生しるものとの間で循環する。

反応の第１段階では、試料の核酸は存在できるいずれかの二本鎖分子の変性のた めに、−次的に加熱され、次に冷却される。次に“第１の”および“第２の”プ ローブを望ましい核酸分子の濃度よりも大きい濃度で試料に添加する。試料をハ イブリッド形成と重合に対して伝導性の条件下にインキュベーションするとき、 “第１の”プローブは増幅される配列に対して位置３°で試料の核酸分子にハイ ブリッド形成するだろう。試料の核酸分子が最初に二本鎖であったならば、“第 ２の”プローブは増幅が望ましい配列の補体である配列に対し位置３°で核酸分 子の相補的鎖にハイブリッド形成するだろう。ポリメラーゼを添加する際に、“ 第１の”および（核酸分子が二本鎖であったならば）“第２の”プローブの３” 末端に伸長するだろう。“第１の”プローブの伸長は望ましい核酸の正確な配列 をもつオリゴヌクレオチドを合成するだろう。“第２の”プローブの伸長は望ま しい核酸の補体の正確な配列をもつオリゴヌクレオチドを合成するだろう。

ＰＣＲ反応は、“第１の”プローブの伸長生成物が、必然的に、“第２の”プロ ーブの配列に相補的である配列を含み、従って、“第２の”プローブの伸長生成 物の生成のために鋳型として働くことができるので、特定の核酸配列の指数関数 的増幅が可能である。同様に、“第２の”プローブの伸長生成物が、必然的に、 “第１の”プローブの配列に相補的である配列を含み、従って、“第１の”プロ ーブの伸長生成物の生成のために鋳型として働くことができる。このようにして 、重合、および変性の循環を可能にすることによって、望ましい核酸分子の濃度 の幾何学的な増加を達成することができる。ＰＣＲはムリス・ケイ・ビー（Ｃｏ ｌｄ　５ｒｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓ　ｍ　、　Ｑｕａｎｔ　Ｂｉｏｌ、５１：２ ６３−２７３　（１９８６））；サイキ・アール・ケイら（肛Ｍハ堕二ハ■↓： １００Ｂ−１０１２（１９８５））：およびムリス・ケイ・ビーら（Ｍｅｔｈ、 　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、１５釘３３５−３５０　（１９８７））によって概説されて いる。

今まで本発明を一般的に記載してきたが同様に以下に実施例を参照して実例とし て記載するが、本発明を特に制限するものではない。

大筒■± ＴＮＦ−九　ＦＳ−４からのｃＤＮ＾ライフ゛ラリ−のｉ　′と刊３貼が（社） １除 林料 大腸菌誘導組み換えヒト↑ＮＦ（比活性、３　Ｘ　１０’Ｕ／ｍｇ）は日本国大 阪市サントリー・インスチチュート・フォア・バイオメディカル・リサーチのエ ム・ツジモトによって提供された。大腸菌誘導組み換えヒトＩＬ−１α（比活性 、ｌ　Ｘ　１０’Ｕ／＋ｍｇ）　４；［ｆ国ＮＪ（Ｄ　ヌト’Ｊ　４　（７）ア ルビン・スターン・アンド・ピータ−・ロメディコ・ホフマン・ラロシュ社から 入手した。大腸菌誘導ヒトガンマインターフェロン（ＩＮＦ−ガンマ）（比活性 ２．１　ｘ　１０’Ｕ／町）は米国ＭＡのケンブリッジのビオケンによって提供 された。大腸菌誘導ヒトＩＩＩＦ−β（へ−ターセロン、比活性、２　Ｘ　１０ ”Ｕ／ｍｇ）は米国Ｃ＾のアラメダのトリトン・バイオサイエンシーズから入手 した。上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびトラン スフォーミング生長因子−β（ＴＧＦ−β）は米国一＾のベトフォードのコラポ ラティプ・リサーチから購入した。ポリ　（ｒ）−ポリ　（Ｃ）は米国−Ｉのミ ルウォーキーのビー・エル・バイオケミカルスがら入手した。Ｎ　’−２“−〇 −ジブチルアデノシン環状３’、５’−モノホスフェート、シクロヘキシイミド 、フォルスコリン、１２−ｏ−テトラデカノイルポルポル１３−アセテート（Ｔ Ｐ＾）、カルシウムイオノフオアＡ２３１８７、およびイソブチルメチルキサン チンは米国間のセントルイスのシグマケミカル社から購入した＊　ｐＨｅ７プラ スミドは、内部参照ｃＤＮＡ源として使用しくカッマレク・エルら、Ｊ、　Ｃｅ １１．　Ｂｉｏｌ、　１０４：１８３−１８７　（１９８７）　、米国ＮＹのニ ューヨークのロックフェラー大学のビー・ビー・セーガルによって供給された。

薇１１１益 ヒト二倍体ＦＳ−４包皮繊維芽細胞系（ケイルセク・ジェイら、ｈｏｃ、　Ｎａ １１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７０：３９０９−３９１３　（１９７３ ）は全実験において継代レベル１５で使用した。ＦＳ−４細胞は６ＩＩＩＭのＨ ＥＰＥＳ、　３　ｄのトリシン、５０μｇ／ｙａ　ｌのゲンタミシン、および５ ％の熱不活性（５６℃、３０分）ウシ胎児血清（ＦＭＳ　、Ｇ　ＪＢＣＯラボラ トリイズ、グランドアイランド、ＮＹ）を補充したイーグルの最小必須培地（Ｅ −ＭＵＭ）で生長させた。実験のために、４Ｘ１０’個の細胞を１７５ｃｍ”の メチルコンフラスコに接種し、３７℃でインキュベートして、６日以上集合体に 生長させた。集密的細胞単層を１回リン酸塩緩衝溶液で洗浄し、０．２５％のＦ ＢＳを含むＥ−ＭＥＮを補充した。培養基をこの媒体中でさらに７２時間３７℃ でインキュベートして細胞を静止させて、次にここで特定化したような適当な薬 剤で処理した。

ｃＤＮＡの量　りとｃＤＮＡライブラリーの全部の細胞質ＲＮＡを先に述べたよ うにＴＮＦ　（Ｌｏｎｇ／ｎ＋１）を用いて３時間処理した静止ＦＳ−４細胞か ら単離した（リン・ジェイ・エックスら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２６２ ：１１９０８−１１９１１　（１９８７）。ポリ　（Ａ）”　ＩＩＮ＾をオリゴ （ｄＴ）−セルロース（タイプ７：ビー・エル・バイオケミカルス）に結合する １サイクルによって選択した。二本鎖ｃＤＮＡを米国ＭＯのガイサースバーグの ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズのｃＤＮＡ合成装置を用いて１０μｇのポ リ　（Ａ）９から作成した。

二本鎖のｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチラーゼでメチル化し、Ｔ４ＤＮ＾ポリメラー ゼで平滑末端を作成した。ＥｃｏＲＩリンカ−をｃＤＮＡに連結し、次に旦ｃｏ ＲＩで制限した。得られた大きさが６００塩基対よりも大きいｃＤＮＡを分別し 、セファロースＣＬＡＢカラムクロマトグラフィーによってリンカ−フラグメン トから′分離しラムダｇｔｌｏのＥｃｏＲＩｔａｌ１位ニ連結した。ライブラリ ーをインケイトロでギガバックパッケージ抽出物（ストラタジーン）で充填した 。

ｃＤＮＡ−イプーリーの　１スクリ一ニングラムダｇｔｌｏ　ｃＤＮＡ　ラ（ブ ーｙ　’）−を１００ＯＰＦＵ／ｄ　ｉｓｈ　（１５０ｖｗ直径）の密度で大腸 菌ＬＥ３９２に培養した。ニトロセルロースフィルターを使用した各プレートの 重複プラークリフトを調製した。３！ｐ＝標識一本積ｃＤＮＡプローブを用いて フィルターにプレハイブリッド形成およびハイブリッド形成を記載されたように 行った（レオナード・ディ・ジー・ビーら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、　１：　３１５６−３１６７　（１９８７））。プローブは１０８ｇのポリ 　（Ａ）“ＲＮ＾を用いてベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズｃＤＮ＾合成装 置で合成した。第一の鎖合成反応は各／１．５ｍＭ　ｃｒ）ｄＡＴＰ、　ｄＧＴ Ｐ、　オヨヒｄＴＴＰ、　０．１ｍＭ　（７）ｄＣＴＰ、　１００　ＩＪｇ／ｍ ｌのダクチノマイシン、および２００．ｕｃｉ（７）　（ｃｒ−”Ｐ）　ｄＣＴ Ｐ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；　ＩＣＮ７　ｙ　−７ス−チヵ／Ｌ／ス社、ア ービン、ＣＡ）を含むように調整した＃　ＣＤＮＡの合成後、ＲＮＡを２０分間 ７０’Ｃで０．２ＭのＮａＯＨでインキュベートして除去した０反応はＨＣＩで 中和し、ｃＤＮＡを０６２Ｍの酢酸アンモニウムの存在でエタノール沈澱させた 。ペレットを２００＃　Ｉ　（７）ＴＥ　（１０＋＋Ｍ（７）　）　’Ｊ　ス） ＩｃＩ　、　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁し、ハイブリッド形成溶液 およびフィルターに添加した。

２個のプローブのうち１個を使用して２個のレプリカフィルターの各々にハイブ リッド形成し；−個は未処理ＦＳ−４細胞がら作成し、他の１個は３時間ＴＮＦ （Ｌｏｎｇ／ｍｌ）　Ｔ：処理したＦＳ−４細胞がら作成した。ハイブリッド形 成後、フィルターを２　Ｘ５ＳＣ（ＩＸＳＳＣは０．１５ｈのＮａＣｌプラス　 ０．Ｏ１５？’ｌのクエン酸ナトリウム）−０，１％のドデシル硫酸ナトリウム （５０５）で６５℃にて１時間１回または２回の変化で洗浄した。フィルターを コダソクスＸＡＲ−５フィルムに１〜２時間増圧スクリーンで一７０℃にて現像 させた。２個のプローブを用いて異なる強度のハイプリ、ド形成信号を示したプ ラークを選択した。これらのクローンをさらに１回鑑別スクリーニングにがけ、 プラークを精製した。

並ハのサブクローニング、、および六　ハイブリッドノ　の旦究 ソフト０．７ｚアガロース中の大腸菌ＬＥ３９２細胞を１５０ｍｍのプレートに 注入した。次いでラムダクローンをグリッドアレイ内のプレートにスポットした 。４個のニトロセルロースフィルターを各プレートから上げて、処理し、使用す るまで保管した。プラーク精製組み換えクローンからｃＤＮ＾挿入物を調製する ため、１０ｍ１の液体熔解物から不純物を除き、１＋ｗｌにつき２μｇのＤＮａ ｓｅ　Ｉで消化して汚染した染色体ＤＮＡを除去した。次に２１の２．５χ５Ｄ Ｓ−０，５Ｍのトリス）ＩｃＩ（ｐ）１９．５）−０，２５ＭのＥＤＴＡを添加 し、プレートを６５℃で１５分間インキュベートしてファージを溶解した。次に 溶液を室温に冷却して、２．０ｍｌの１０Ｍ酢酸アンモニウムを添加した。試料 を氷上で２０分間冷却し４℃で１０分間１５．０００ｘｇで遠心分離してＤＮＡ ベレットを得た。ペレットを１ｍｌにつき２１！１ｇのＲＮａｓｅ＾（ヘーリン ガー）を含む１００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁し、制限酵素旦ｃｏＲＩで切断した 。

ｃＤＮＡ挿入物を単離し、Ｍ１３ｍｐ１９ヘクターのＥｃｏＲ１部位にサブクロ ーン化した。交差ハイブリッド形成とノーリン（ＲＮＡ）プロット実験にプロー ブとして使用すべきｃ（ＩＮＡ挿入物はハックグラウンドを最小にするようにＥ ｃｏＲＩで制限することによって組み換えＭ１３クローンから調製した。プロー ブは早くから調製した。ハイブリッド形成の条件は基本的には鑑別スクリーニン グ実験について上に述べたものと同じである。

ノーザンブロノトノ 細胞質ＲＮＡをホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルに分別し、ゼーター プローブフロソテイング膜（ビオ−ラド・ラボラドリース、リノチモンド、ＣＡ ）にプロットした。細胞質ＲＮ＾を１０Ｍｇ／レーンにて装填した。ノーリンプ ロットのプレハイブリッド形成とハイブリッド形成を記載されたように行った（ リン・ジエイ・エックスら、上記）。フィルターを組み換えＭ１３クローンから の３ｔｐ　＠識ｃＤＮ＾挿入物を用いておよび／またはｆｆｇｐ−標識内部参照 ｐＨｅ７挿入物を用いてプローブした。ノーリンプロットはレーザーデンシトメ ーターを用いて定量した。

■力透析 組み換えＭ１３クローンからの一本鎖ＤＮＡ鋳型を調製し、ｃＤＮＡの各端部か らの数百個のヌクレオチドはジデオキシヌクレオチド鎖終結法によって決定した （サンガー・エフら、Ｐａｒｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、υＳＡ　７４：５４６３−５４６８　（１９７７））。部分的ヌクレオ チド配列をシーンバンクに入った配列（リリース６０．０）と比較した。

■ ＦＳ−４細胞を集密に生長させ、次に０．２５％のウシ胎児血清（ＰＢＳ）を用 いた媒体に切り替えて７２時間３７℃でインキュベートした。次に細胞を組み換 えヒトＴＮＦ　（１０Ｍｇ／ｍｌ）にさらした。細胞質ＲＮＡは３時間ＴＮＦで インキュベートした後に単離した（リン・ジェイ・エックスら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｓｓ、２６２：１１９０８　（１９Ｂ？））　、　ＴＮＦを用いる３ 時間のインキュベーシヨンは次の理由で選ばれた。ＴＮＦは静止ＦＳ−４細胞中 で２０〜３０分以内に若干のｍＲＮｓＡｓのレベルに増加を促すが、これらの“ 早期反応”＋１ＲＮＡｓの若干は単に３０〜１２０分で一過性で増加するに過ぎ ないことは知られている（例えば、ｃ−ｆｏｓとｃ−ｙｍｙｃ　＋１ＩＲＮＡ　 ｉ参照リン・ジエイ・エックスら、上記）、このような即時の早期反応遺伝子生 成物は他の遺伝子に向きを変えるために重要であるが、それらが過度的にのみ誘 導されるという事実はＴＮＦによって誘導された表現型の変化に応答できる実際 のエフェクター分子ではないことを示唆した。従って、ＴＮＦ処理後にさらに安 定に高められたメツセージに応答するｃＤＮＡに対して研究が開始された。

ポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを細胞質ＲＮ＾から単離して二本鎖ｃＤＮＡを合成した 。得られたＴＮＰ処理ＦＳ−４細胞からのｃＤＮ＾ライブラリーは、２×１０＆ 組み換えクローンから成り、コントロールとＴＮＦ処理ＦＳ−４細胞からのポリ 　（Ａ）”ＲＮＡから調製された（”　Ｐ　）　ｃＤＮＡプローブを用いて示差 ハイブリッド形成によってＴＮＦ誘導遺伝子配列に対してスクリーンにかけた。

ＴＮＦ処理細胞からのｃＤＮＡを用いて調べたときに強い信号を与えたが、コン トロール細胞ｃＤＮ＾を用いて調べたときには与えなかったプラークを、推定Ｔ ＮＦ誘導可能遺伝子として採集した。

約３ＸＬＯ’個のプラークをスクリーンにかけて、４７個は２ラウンドのスクリ ーニング後に明らかに誘導可能として数えた。それらをＴＳＧ　ｌ−４７と命名 した（ＴＳＧ−“ＴＮＦ−刺激遺伝子配列”）。示差スクリーニングによって選 択されたＴＳＧクローンの間に示された異なるーＲＮＡ５Ｏ数を決定するため、 挿入物を交差ハイブリッド形成によって配列相同性に対して試験した。全体の４ ４個のクローン化ｃＤＮＡを相互に交差ハイブリッド形成によって試験した。こ れらの実験は８個の明確な非交差反応のｃＤＮＡを表した。以下の表２にまとめ て示すように、ｃＤＮＡの若干は高顧度（ＴＳＧ−８とＴＳＧ−１４）をもつ４ ４個のクローンの中に示されているが、他のものは非常に少ない発生量である（ ＴＳＧ−２１，ＴＳＧ−２７とＴＳＧ−３７）。対応するｍＲＮ＾Ｓの大きさは ０．８から４．５ｋｂの範囲である。

犬」− ４４個のＴＮＦ−特異的ｃＤＮへクローン中の各ＴＳＧ　ｃＤＮＡｓの発生量Ｔ ＳＧ−３７２０，８ ８４４個のｃＤＮＡ挿入物の各々はＩｇｔｌＱヘクターから単離しＭ１３＋ｗｐ １９ヘクターにサブクローン化した。？＋１３ヘクターからの挿入物は二ノクト ランスレーシヲンによって（”　Ｐ　）標識を付け、４４個のラムダｃＤＮＡク ローンでハイブリッド形成した。交差ハイブリッド形成はｃＤＮＡｓが同じ＋＊ ＲＮＡ種から誘導された証拠として行われた。

人血医旦 ＴＮＦ　”　ｍＲＮＡ５　の量禾　の東　量４ＴＮＦ　処理によってＦＳ−４細 胞にレベルがアップレギュレートされているｍＲＮＡ５によく対応して８個の別 々のＴＳＧ　ｃＤＮＡｓが単離されたことを確かめるために、静止ＦＳ−４培養 体をＴＮＦ　（２０Ｍｇ／＋＊ｌ）を用いて０．５から１６時間の範囲の異なる 間隔で処理し、細胞質ＲＮＡを単離しくリン・ジエイ・エックスら、上記）８個 のｃＤＮＡの各々に対応する１ＩＲＮ＾レヘルをノーザンブロソト分析およびオ ートジオグラムのデンントメーター走査によって定量した（図１と２）。ｍＲＮ Ａレベルの増加は約３倍（ＴＳＧ−２１）から１００倍（ＴＳＧ−５とＴＳＧ− ８）の範囲であった。

ｍＲＮＡ刺激の３つの異なるパターンに注目した。第一のパターンは２〜４時間 でピークレベルまで増加し、次にｍＲＮＡレベルに徐々に減少した（ＴＳＧ−１ とＴＳＧ−６）。第二のパターンは１．５〜４時間で最大までｍＲＮＡレベルが 急速に増加し、次に少なくとも１６時間まで平坦になった（ＴＳＧ−８、ＴＳＧ −１２、ＴＳＧ−１６とＴＳＧ−３７）。第三のパターンは最初かなり減少し、 次に１６時間の観察時間を通じてｍＲＮＡレベルが徐々に増加した（ＴＳＧ−２ １とＴＳＧ−２７）。

大流■ユ旦 Ｕ１並用と箆蓬分立 単離したＣ・ＯＮ八が先に同定した遺伝子に相同であるかどうかを決定するため 、全部で８個のｃＤＮＡを部分的に配列しく３００〜４００ｂｐ）決定される配 列をシーンバンクで入手できる配列に対してチェックした。４個のＣＤＮＡ３の 配列（ＴＳＧ−１、ＴＳＧ−８、・ＴＳＧ〜２１とＴＳＧ−２７）は初期に同定 した遺伝子と同一であることが判った。これらのうち、ＴＳＧ−１はβ−トロボ グロブリン様タンパク質３−１０Ｇに対する遺伝子に相当しくシュミド・ジェイ ら、Ｊ、　Ｉｎｕ＋＋ｕｎｏ１．１３氾２５０（１９８７））、またＩＬ−８と しても知られている。ＴＳＧ−８は°単球走化性および活性化因子”（ＭＣＡＦ ）に対して最近クローン化した遺伝子と同一であった（マツシマ・ケイら、訂旦 秤胆　土：２　（１９８９））。

ＴＳＧ−２１とＴＳＧ−２７はそれぞれ、コラゲナーゼとストロメリシン遺伝子 と同一であることがわかった。そしてＴＳＧ−３７はメタロチオネイン１１を符 号化することがわかった。他の３個の部分的ｃＤＮＡ配列は既知の遺伝子と有意 な相同性は示さず、今までに同定されていない遺伝子配列であることを示した。

ＴＮＦおよびＩＬ−１によるＩＬ−８（＝ＴＳＧ−１）の誘導は最近他の者らに よって観察されたくマツシマ・ケイら、１９８９、上記；ム」狂ユＭｅｄ。

皿１８８３　（１９８８））。ＩＬ−８、好中球走化性因子は構造的に、血小板 因子−４（ＰＦ−４）、ＩＦＮ−ガンマ−誘導性タンパク’ＪｔｌＰ−１０、Ｐ ＤＧＦ−誘導性遺伝子ＪＥ、　ＭＩＰ−１とＭＩＰ−２と呼ばれるタンパク質、 およびＧＲＯを含む炎症性サイトカインの族の複数に関係する（マツシマ・ケイ ら、上記；ラーモア・シイ・シイら、５ｃｉｅｎｃｅ　直１４６４（１９８９） ）。これらのタンパク質の大部分は走化性である。

ＴＮＦとＩＬ−１によるヒト繊維芽細胞のＭＣＡＦ　（−ＴＳＧ−８）誘導は最 近記載されている（マツシマ・ケイら、上記）、おもしろいことには、ＭＣＡＦ はＩＬ−８とかなり似たアミノ酸配列を示しく２１％）、両者とも同じ位置に４ 個のシスティンを有する。

コラゲナーゼ（ＴＳＧ−２１）　もまた滑液細胞と繊維芽細胞にＴＮＰ誘導でき ることが早期に報告された（ディヤーら、上記）。コラゲナーゼを誘導するＴＮ Ｆの能力は炎症中に再成形される組織においてＴＮＦの役割に関連しているらし い、　ＴＮＦによるストロメリシンの誘導は報告されていないが、ストロメリシ ンｍＲＮＡは最近ＩＬ−１によって誘導できることが示された（キノンス・ニス ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６虹８３３９　（１９８９））。コラゲナーゼのように、ストロ メリシンはコラーゲン分解メタロプロティナーゼであり、そして両者共にフィブ ロネクチン、ラミニンおよび軟骨プロテオグリカンを分解できる。コラゲナーゼ とストロメリシンの両者は共にリウマチ様関節炎に生しる細胞外マトリックス分 解を増加するために重要であることが教示されている。

最後にメタロチオネインＩＩ　（ＭＴ−ＩＩ）は、種々のストレス、重金属攻Ｖ 、リポ多１１ｍの注射ならびにインターフェロンとルー１を含むサイトカインに よって誘導できることが示された（カリン・エム、販旦　４１：９−１０　（１ ９８５））　、重金属イオンを結合するその能力に加えて、ＭＴｉｌ　はまた炎 症反応中に活性化されたマクロファージと好中球によって放出された遊＃基のス カベンジャーとして働くことができる。　ＭＴ−１１誘導は従って組ｖ６損傷の 防止において防護の役割をする（ソーナリイ・ビイ・ジェイ、…匹７■。

旦１）録７：３６−４４　（１９）。

配列によって同定された全部で５個のＴＳＧ　ｃＤＮＡｓが炎症反応に重要なタ ンパク質に対して遺伝子コード化に対応することは意義あることである。これら の結果は免疫反応と炎症の重要な作用を用いて新規の遺伝子を同定する際にヒト 繊維芽細胞からのＴＮＦ−誘導ｃ［１ＮＡｓをクローン化する本発明のアプロー チの有用性を支持する。

スｍα なるサイトカインと　の′　によるＴＳＧ４４ｍＲＮＡ峰　のパターン 表３はノーザンブロソト分析を用いる種々の薬剤に反応させたＰＳ−４細胞中の ＴＳＧ−１４ｍＲＮＡのレベルを測定した実験のデータをまとめて示している。

ＴＳＧ−１４は他のＴＮＦ誘導ｍＲＮＡ５　、　ＴＳＧ−８およびＴＳＧ−１２ のためのケースと同様に、タンパク質合成阻害剤、シクロヘキシミドによって誘 導される。シクロへキシミドの添加はＴＮＦによるＴＳＧ−１４ｍＲＮＡ誘導可 能性はなく　、ｍＲＮＡレベルの増加はＴＮＦの直接の作用の結果であり、タン パク質中間体を必要としないことを示している。ＴＳＧ４４　ｍＲＮＡはＩＦＮ −ガンマのＩＦＮ−βによって誘導できない。ＴＳＧ−１４ｍＲＮＡは、ＩＬ− １によって、二本鎖ＲＮＡポリ（１）：ポリ（Ｃ）によって、そしてホルボール エステル１２−０−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）に よって誘導できた。

紅 ＴＳＧ−１４ｍＲＮＡの悸 ｆｉｊｔ　’ＡＪＬ　ＴＳＧ−１４”ＲＮＡノ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）　２０　 ｎｇ／ｍｌ　＋　＋　＋シクロへキシミド　１０μｇ／ｌ＋ ＴＮＦ　＋シクロへキシミド　＋＋＋ インターロイキンー１　１μｇ／＋＊ｌ　＋＋＋インターフェロンーノー　５０ ０　Ｕ／ｍｌ　Ｏインターフェロン−１１００［＋／ｍｌ　０ＴＮＦ　＋ＩＦＮ −β　＋＋＋ ＴＮＦ　−ＮＦＮ−ｒ　＋　＋　＋ 上皮増殖因子　２５　ｎｇ／ｍｌ　＋ 血小板由来増殖因子　５　ｎｇ／１ｌｌｌ　＋トランスフォーミング生長因子　 ２　ｎｇ／ｍｌ　Ｏポリ（Ｉン：ポリ（Ｃ）　５０　ｕ　ｇ／幇１　＋＋ホルボ ールエステ／Ｌ／（ＴＰＡ）　１００　ｎｇ／ｍｌ　＋Ａ２３１８７　１μＭＯ ホルスコリン　１０μＭＯ ジブチリル環状ＡＭＰ　１００μＭＯ イソブチルメチルキサンチン　１００μＭＯこの結果はノーザンプロソト実験を まとめて示しており、全細胞質ＲＮＡ５は指示した濃度の薬剤を用いて２時間処 理したＦＳ−４から抽出した。結果はＴＳＧ−１４ｍＲＮＡ　レベルがコントロ ールよりも相対的に増加していることを示す。

上皮増殖因子（ＥＧＦ）と血小板由来増殖因子（ＰＤＦＧ）は各々ＴＳＧ−１４ 　ｍＲＮＡの中位の誘導を刺激した。トランスフォーミング生長因子−β（ＴＧ Ｆ−β）、カルシウムイオノホア、＾２３１８７、ジブチリル環状ＡＭＰおよび ホスホジェステラーゼ阻害剤、イソブチルメチルキサンチンはＴＳＧ−１４ｍＲ ＮＡを誘導する際に効果がない。

人崖斑ｙ ＴＳＧ−１４の６　なりＮＡ配装 ＴＳＧ−１４をＭ１３＋＋＋ｐ１８　ニクｏ　−ン化して配列を分析した。ＴＳ Ｇ−１４のｃＤＮ＾配列は１８３７塩基対から成ることを見出した（ＳＥＱ　Ｉ ｎ　ＮＯ：ｌ：参照図４）。ｃＤＮＡの完全な配列は幾つかの短い重なっている フラグメントを配列して誘導した。配列の分析は３個の読み取り枠を示したが、 これらの１個だけは色々考慮すると正確な読み取り枠であることが明らかである 。まず、このＯＲＰは短い５’　７３−ｂｐ非翻訳領域を含み、大部分のｍＲＮ Ａ５の特徴と一致している。第二に、このＯＲＦのための開始コドンは共通出発 領域の関係にある。最後に、５゛コード化領域は、切断できる信号ペプチド配列 の特徴をもち、１７アミノ酸の長さの高疎水性領域（図３と４）を符号化する。

ＴＳＧ−１４のＯＲＦはタンパク質１７Ｂアミノ酸の長さを符号化する５３４個 のヌクレオチドから成る（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２；参照図４）。転写は非常に 長い３゛の非翻訳領域を含み、特徴はサイトカインの中では異常ではない。さら に、２ポリアデニル化部位は配列の末端３゛に存在する。最もおもしろいことに は、ＴＳＧ−１４の３゛符号化領域は、ジーンバンクデーターヘースから誘導し た情報により、他のサイトカイン、即ちＩＬ−１βの３゛領域と７０％以上相同 の領域を含む。合わせると、これらの特徴はＴＳＧ−１４が新規であり、生物学 的に活性なサイトカインであることを示している。

爽施■■ ＴＳＧ−１４アミノ　配置とタンパク　′告ＴＳＧ−１４タンパク質の予言され た配列はいくつかの顕著な特徴をもつ。潜在的なＮ−グリコジル化部位は存在し ない。おもしろいことには、成熟タンパク質のただ一個のりシン残基が全体のタ ンパク質に見出される。５個のシスティン残基が成熟タンパク質の中に存在し、 分子内または分子間ジスルフィドブリッジを示す。

カイトとドオリトル（上記）のアルゴリズムを用いる疎水性プロットは、Ｎ−末 端で高い疎水性の配列の存在を示す（図５）。

実際に最初の１７個のアミノ酸は性質が全く疎水性であり、この領域が切断でき る信号配列または膜アンカーを示すことを示唆している。

各アミノ酸（図６）残基の導電点の機能としてプロッ゛卜するＴＳＧ−１４はタ ンパク質のＮ−末端の半分が強い酸性であることを示した。実際に、５０−アミ ノ酸領域内には１５個のアミノ酸があるが、４個だけの塩基残基が同じ領域に見 出される。タンパク質の残りは酸性のアミノ酸よりも僅かに塩基性である。この タンパク質の正味のチャージは酸性であり（計算値ｐｉ・４．５１）　；タンパ ク質は従って溶解性が大きい。

ＴＳＧ−１４タンパク質二次構造の分析は、幾っがの領域が（隣接残基の状況に おいて各アミノ酸の相対的抗原性に基づき）抗原性が高いことが期待される。こ の性質はＴＳＧ−１４に対して抗体を調製する際に利点がある（以下参照）。予 言されたアミノ酸配列に基づいた相同の調査はＮＢＲＦタンパク質データデ−タ ーベースの配列に対して行われる（レリース１８．０）。任意の他のタンパク質 を用いると優位な相同は見られず、ＴＳＧ−１４が全く新規なタンパク質である ことを示している。

裏施■直 融ムタンパク　のｉ　′とタンパク　のＴＳＧ−１４の細菌性融合タンパク質を 発現するため、Σ肥３＾部位をその５゛末端に含むＴＳＧ−１４挿入体を使用し た。挿入体の３゛末端でのΣａｕ３Ａ部位はＴＳＧ−１４のＥｃｏＲＴフラグメ ントをｐＴＺ１９ベクター系に挿入し、続いてΣａｕ３Ａ酵素で切断したとき発 生した。この挿入体を次にｐＡＴＨ２ベクターのｔｒｐＥタンパク質のコード化 領域内の単一のＢａａ旧部位に連結し、ｐＡＴ）１２−ＴＳＧ−１４発現ベクタ ーを発生させた。

（ベクターの描写のための図７参照。）融合タンパク質はＴｒｐプロモーターの コントロール下に発現させた。

発現プラスミドｐＡＴ）１２−ＴＳＧ−１４はコンピテント大腸菌ＪＭＩＯＩ細 胞に転位させた。２％のカサミノ酸、２０μｇ／ｍｌのＬ−トリプトファン、お よび１５０　ＩＩ　ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む間媒体中の形質転換細胞をＡ 　６００　＝０．５　（６００ｒ＋ｎ＋での吸収度）の濃度まで成長させた。

融合タンパク質の合成を促すため、細胞をベレットにして予熱したＬ　−）リプ トファンを含まない媒体に再懸濁させた。さらに１時間インキ、１ベートした後 、２０μｇ／ｎ＋１の３−β−インドールアクリル酸を添加し、さらに２４時間 インキュヘーションを続けた。図８は期待された大きさのタンパク質（約６０ｋ Ｄａ）が実際に３−β−インドールアクリル酸を添加した後に誘導されたことを 示す。ｐＡＴＨ２−ＴＳＧ−１４ヘクターをＰｓｔＴを用いて切断して生じた先 端を切ったｔｒｐＥ−ＴＳＧ−１４融合タンパク質を示し、分子量約４４ｋＤａ を有する。

ｎ氾 旦旺■監金１ｙパＵ勿１１ 上記の融合タンパク質の精製は基本的にストレベルら（Ｊ、　Ｖｉｒ旦、　５７ ：９８３−９９１　（１９８５））によって記載されたように行った。ＩＬ培養 基からの細胞をベレットにしてＴ　Ｅ　Ｎ　（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　ｐ ）Ｉ８．０　、ＩＢＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣ１）で洗浄し、リゾチーム （５ｗｇ／ｍｌ）で溶解し最後に超音波で破壊した。不溶性の物質は遠心分離（ ３０分、２０．０００　Ｘ　ｇ）　ニヨッテ回収し、続いて２ｏ１の３Ｍ尿素（ ！：５１１１１（７）７Ｍ尿素で各々３０分間３０℃で抽出した。融合タンパク 質を含む７Ｍ尿素抽出物をさらに予備５Ｏ３−ＰＡＧＥによって精製する。融合 タンパク質を電気泳動にかけた後、ゲルがら摘出し、電気溶出し必要な濃度に濃 縮した。電気溶出した融合タンパク質を分析用ゲルでチェックした。第二回の電 気溶出の後、大腸菌タンパク質のバンドを５ＤＳ−ＰＡＧＥに検出できない高精 製の融合タンパク質が得られる。

裏施五域 々の細　のＴＳＧ−１４の ＴＳＧ−１４の生物学的機能をＴＳＧ−１４ｍＲＮＡの誘導によってＴＮＦに反 応しない細胞系中のＴＳＧ−１４の発現により研究することができる。

ＴＮＦによるＴＳＧ−１４ｍＲＮＡの誘導性は従ってノーザンプロット分析によ る種々の細胞系で調べた。この研究には、多くの５Ｖ４０−形質転換細胞系と腫 瘍細胞系を含む。その結果を表４に示す。

ｌ↓ ＴＮＦによるＴＳＧ−１４ｍＲＮＡの悸Ｕ糸　コントロール　ＴＮＦ（２０ｎｇ ／＋ｗｌ、４時間）正塞稚膳 ＧＭ６３７　＋ ｌＵ！ ＳＫ−Ｍｅｌ−１９−− このデーターは正常、５Ｖ−４０−形質転換、および腫瘍細胞系におけるＴＳＧ −１４ＮＲＮＡのノーザンブロノトをまとめて示す。ＨＵＶＥＣ：ヒト抗静脈内 皮細胞：　ＳＶ２．　ＳＶ３およびＳν４：　ＳＶ４０大Ｔ抗原で形質転換した ＦＳ−４細胞、　Ｍｌ−３８：　５Ｖ４０−形質転換皮膚繊維芽細胞；　Ｇｌ＋ ６３７：５Ｖ４Ｑ−形質転換皮膚繊維芽細胞；＾５４９：肺嚢癌系；　Ａ６３７ ：横絞筋肉腫系；　Ｃｏ１ｏ２０５：結腸腺癌系、　ＨＴ２９：結腸腺癌系：Ｓ に−Ｍｅｌ−１９：黒色腫系；　［９３７：前単球白血球系。

従って、丁５Ｇ４４　ｍＲＮＡは若干の細胞のみにＴＮＦに応答して発現される 。分析した６個のＩ！瘍系には、ＴＮＦが存在しても発現は認られなかった。お もしろいことには、ＴＳＧ−１４ｍＲＮＡのレベルは正常の、非形質転換対照物 に比べて、これらの細胞を形質転換するＳＶ４０の犬Ｔ−抗原で形質転換したＦ Ｓ−４細胞では大きかった。これはＴＳＧ−１６ｍｌ？〜へのＴＮＦＭＲがＳＶ ４０大Ｔ抗原で形質転換したＦＳ−４細胞では有意に減少する他のＴＮＦ−誘導 タンパク質、ＴＳＧ−６と対照的である。従って、“癌”形質転換の程度はＴＳ Ｇ−１４ウィルスＴＳＧ−６ｍＲＮＡの誘導性に特異な効果をもたらす。

犬施ｆｌ 、のＴＳＧ−１４ｃＤＮＡの）　ｚ；ｃ！：ｌ啜ＴＳＧ−１４の哺乳動物発現ヘ クターを、構成発現体としてｐＳＶ２を（ムリガン・アール・シイら、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２０９：１４２３　（１９８０））、デキサメタシン発現体としてｐＭ 八へｎｅｏ　（サルプツト・シイら、Ｃｅ１１５６：２７１　（１９８９））を 、それぞれ用いて構築する。これらの構築体を使用して、ＴＳＧ−１４がＴＮＦ によって誘導されない細胞、即ち、Ａ３４９細胞膜系をＣａＰＯ，沈澱を用いて トランスフェクトする。ｐＳＶ２−ＴＳＧ−１４ベクターで安定なトランスフェ クトする場合は、抗生物質の６１４８に耐性を与えるｐＲ３Ｖｎｅｏ　（ゴーマ ン・シイら、５ｃｉｅｎｃｅ　皿５５１　（１９８３））を共にトランスフェク トする。

安定なトランスフェクト体は媒体を含むＧ１４８で選択され、ノーザンブロノト 分析によってＴＳＧ−１４ｃＤＮＡの発現に対して試験される。トランスフェク ト体はＴＮＦの不在でＴＳＧ−１４ｍＲＮＡを発現する。

ノーザンブロソトの主バンドはＦＳ−４細胞中のＴＮＦによって誘導されたＴＳ Ｇ−１４ＭＲＮ八に相当するバンドと同じ大きさである。

実隻炭Ｕ ポリクローナル−血゛°のＵとイムノアフィニティクロη上グーフィーによる一 −ＴＳＧ−６−の 兎をフロイント完全アジュバントに懸濁した丁ｒｐＥ／ＴＳＧ−１４融合タンパ ク質約２００μｇを用いて免疫化し、フロイント不完全アジュバント中の同量の タンパク質を用いて２〜３週間の間隔で追加免疫化した。最後の追加免疫には静 脈注射をした以外は、全部皮下注射で行った。兎は免疫して約６日後に出血した 。血清をストレベルらに従ってイムノプロットにより分析した（Ｊ、　Ｖｉｒｏ ｌ、　５７：９８３−９９１　（１９８５））。

融合タンパク質のＴＳＧ−１４６１域に特異的な抗体を得るため、抗血清を、第 二のＴＳＧ−１４融合タンパク質、例えばＭＳ２／ＴＳＧ４４融合タンパク質を 結合するイムノアフィニティ母材で精製する。このような融合タンパク質はプラ スミドｐＥＸ３４Ａ、　ＭＳ２ポリメラーゼのＮ−末端部分に融合した外来タン パク質を製造し温度誘導ラムダＰＬプロモーターによってコントロールされるｐ ＥＸ２９の誘導体（クリンカート・エムら、Ｉｎｆｅｃ、　Ｉｍｍｕｎ、　４９ ：３２９−３３５’　（１９８５）を用いて生成される。

イムノアフィニティクロマトグラフィー母材は次のようにして調製される。５ｍ ｇの精製ＭＳ２／ＴＳＧ−１４融合タンパク質を０．５ＭのＮａＣｌで大量に透 析する。３ｎ＋ｌのＥＡＨ−セファローズ４Ｂ　（ファーマシア）を０．５Ｈの ＮａＣｌで大量に洗浄し、精製したＭＳ２／ＴＳＧ−６融合タンパク質を添加す る。ｐＨを４．５に調整し、４０ｍｇの１−（３−ジメチルアミノプロピル）− ３−エチルカルボジイミド塩酸塩（アルドリッチ・ケミカル社）を１ｍｌの蒸留 水に溶解してコンスタントに攪拌しながら滴加する。その後に、ｐＨを４．５に 調整しカップリング反応で終夜コンスタントに攪拌する。酢酸（２００μｌ）を さらに４時間添加して残りのアミノ基を母材にブロックする。最後に、母材物質 を数回交替に、０．１門のアセテート緩衝液、ｐｎ　４．０．０．５ｉのＮａＣ １、そして０．１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，３，０，５ＭのＮａＣ １で洗浄し、貯蔵するためにトリス−緩衝塩水に懸濁する。

イムノアフィニティクロマトグラフィーのために、０．５１のＭ３２７丁５Ｇ− １４セフアローズを０．０５％のトウイーン−２０（ＴＴＢＳ）を含むトリス− 緩衝塩水（２０ＩＩＭのトリス、０，５ＭのＮａＣ１，ＰＨ７，５）で平衡にす る。ＴｒｐＥ／ＴＳＧ−１４融合タンパク質に対して生した１ｓ＋１の抗血清を ０．５１のＭＳ２／ＴＳＧ−１４セフアローズと０．５ｍｌ　のＴＴＢＳと混合 し、混合物は４℃でコンスタントに回転させて終夜クライオチューブでインキヱ ヘートする。懸濁した固相母材物質を遠心分離管に移し、１０１１１のＴＴＢＳ で洗浄する。その後に、沈降物をエノペンドルフチューブに移し、遠心分離（１ ４，ＯＯＯｒｐｍ、　２分間）し、上澄みを注意深く除く。１ｍｌノｏ、ＩＭグ リシ７−ＨＣＩＩＩ衝液、ｐＨ２，５、を添加し、ゲルを２分間振盪する。さら に遠心分離した後、上澄みを直接固体トリスで中和する。この結果、ＴＳＧ−１ ４に特異的な抗血清を製造する。

叉ｍ旦 ＴＮＦ−几　ＦＳ−４およびＴＳＧ−１４ベク　−でトランスフェクト　れた　 がらの−然 および　み　えＴＳＧ−１４ンバク　プロチェス些檎■（ａ）９時間ＴＮＦで処 理したＦＳ−４細胞、または（ｂ）ＴＳＧ−１４ｃＤＮＡでトランスフェクトし た細胞のいずれがの上澄みまたは抽出物中のＴＳＧ−１４タンパク質を配置する 実験を行った。

細胞（ＰＳ−４又はＴＳＧ−１４）ランスフエクト細胞のいずれが）を集合する まで生長させた後、媒体を除去し、血清を含まない媒体を補充する。ＦＳ−４細 胞を２０ｎｇ／ｍｌ　ＴＮＦで刺激するがまたは未処理で置く。フないし２４時 間後、媒体を収集し、アミコン装置に１００倍まで濃縮する。細胞ペレットを集 めてＳ［１Ｓ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に溶解する。試料をＴＳＧ−１４タンパク質 に対する免疫精製抗血清の補助でウェスタンプロット分析にかける。

免疫精製抗血清によって特異的に認識された主ハンドをＴＮＦ−処理ＦＳ−４細 胞およびＴＳＧ−１４）ランスフェクト細胞の両方の培養上澄み液では検出する がコントロール細胞では検出しない。このタンパク質は５Ｏ５−ＰＡＧＥの１６ −１９ｋＤａのみがけの分子量で移動する。分泌ＴＳＧ−１４タンパク質の概算 分子量は、第一の配列に基づき、約１７．５ｋＤａである。

本発明を完全に記載したが、広範囲の同等のパラメーター、濃度、および条件内 で本発明の精神と範囲から離れることなく過度の実験をすることなく同様に実施 すことができることは当業者には正しく認識されるだろう。

本発明は特定の実施例に関して記載したが、さらに変更することができることは 理解されるだろう、この応用は任意の変量、用途、または一般に、本発明の原理 に従い、本発明が属する分野内で既知または慣習的の実施を行うようにそして特 許請求の範囲に従って上記した基本的な特徴を応用できるように、本発明の開示 からのこのような離脱を含め、本発明の適合をカバーすることを意味する。

配列リスト （１）一般情報 （ｉ）出願人：リー、タエ　ホ （ｉｔ）発明の名称；サイトカイン誘導タンパク質、ＴＳＧ−１４、そのための ＤＮＡコード化およびその使用（目ｉ）配列の数：２ （ｉｖ）相当する住所： （Ａ）住所ニブロウディ　アンド　ニーマーク（Ｂ）街路：４１９セプンス　ス トリート、　Ｎ１１（Ｃ）市：ワシントン （Ｄ）州：ＤＣ （Ｆ）郵便番号：　２０００４ （Ｖ）コンピューター読み取り型 （Ａ）媒体タイプ：フロッピィディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ　ＰＣコ ンパチブル（Ｃ）操作’ｉス＋Ｌ　：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＣ３（Ｄ）ソフ トウェア：　ＰａＬｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　１１１．２４（ｖｉ）現在の 出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人情報： （Ａ）名前：リブナト、ジェムエル （Ｂ）登録番号：　３３．９４９ （Ｃ）参照／ドケノト番号：　ＶＩＬＣＥＫ＝２（ｉｘ）　を話伝達情＠Ｉ： （Ａ）電話：　（２０２）　６２８−５１９７（Ｂ）ファクシミリ：　（２１２ ）７３７−３５２８（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１のための情報：（ｉ）配列 の特徴； （Ａ）長さ７１８３６　塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：　ｃＤＮ＾ （ｖｉ）起ｆｉ： （Ｇ）細胞の種類：繊維芽細胞 （Ｈ）セルライン：　ＦＳ−４ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キイ：ＣｒＪＳ （Ｂ）位置：　７３．．６０６ （Ｄ）他の情報： （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：１　：ｕ、ｍ　ＣＡＡＣｆロＧゴＣ ＡＣｒＧＡＧに；ＴＣＫＰ工ｆｆ１３ＡＧＡＡｅ　６０σｘ↑コツフＧＣＡＪｌ ＄ＣＡｆｆＣｍ：ＣＩＴ讃ＡＴＴＣｒＧＴＴＴＴＧｒＧＣＴＣＴｃＴＧＧ　１０ ｓＭｅｔ　１（ｉｓ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｊｌｄａ　Ｉｌｅ　Ｌａｕ　Ｆｈｅ　Ｃ ｙｓ　Ａｌａ　Ｌａｕ　ＴｒｐＴ’Ｔ　ＧＣＡ　ＧｒＧ　ＴＴＧ　ＧＣＣＧＡＧ 　ＭＣＴＩ！、　（、ＡＴ　（、ＡＴ　ＴＡＴ　（、ＡＴ　ｆｉ　ＡＴＧ　ＴＡ Ｔ　ＧＩ’f　１５６ Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　 Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｖａ１ＡＡ、Ｔ　？ｒＧＧ ＡＣＭＣＧＡＡ　ＡＴＡ　ＧＡＣＭＴα譜０℃ＣＡＴα：’ＣＡＣＴ　ＧＡＧ　 ＧＡＣＣＣＣ２０４Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　にｌｕ工１ｅ　Ａｓｐ　 Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　）ｕｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　’Ｐｒ。

ＡＡｃＡｆｆｉＡｍ　ｍ　ＣＴＡＣＴＧＴＡＭτ〜ＩＪＩＱＴＡＴＴＴ　ＴＡＴ 〜す込Ｃ丁ＡへＡαχ；ＡＡ７ＴＣ１ａ〕６（２）　５Ｅｆｌｌ　１０　ＮＯ： ２のための情ＩＩＩ。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７８アミノ酸 ＣＢ）型；アミノ酸 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （ｉｉ）分子の［類：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋２　：Ａｒｇ　Ｌａｕ ＴＩＭＥ（ｈｒ） ＴＩＭＥ（ｈｒ） （％）笛■　（別ＩＢ＝ （％）ｔ！Ｊ　（％）釘■ （％）ｔ２Ｘ　（％）鮒■ ａ−ｐ−＋　＆、ｌ　Ｎ　Ｍ　＋　４ｐＨｅ７ＦＩＧ、８ ＭＷ　Ｃ２Ｂ　４　５ ＦＩＧ、３ｂ 時間（ｈｌ ＦＩＧ、７ 平成５年７月１４日

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．分子が天然に現存し、該分子が実質的に天然に結合している他のタンパク質 または糖タンパク質を含まない、腫瘍壊死因子−誘導タンパク貿分子ＴＳＧ−１ ４、またはその機能誘導体。
2. ２．変性条件下に約１６ないし約１９ｋＤａの見かけの分子量を有する請求項１ 記載の分子。
3. ３．アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、またはその機能誘導体を有する請求 項１記載の分子。
4. ４．ＤＮＡ分子が天然に存在するとき、天然に結合している隣接したヌクレオチ ド配列を実質的に含まない、ＴＳＧ−１４を符号化するＤＮＡ分子またはその機 能誘導体。
5. ５．実質的に他のヒトヌクレオチド配列を含まない、請求項４記載のヒトＴＳＧ −１４タンパク質を符号化するＤＮＡ分子。
6. ６．ｃＤＮＡである請求項４記載のＤＮＡ分子。
7. ７．ゲノムＤＮＡである請求項４記載のＤＮＡ分子。
8. ８．ヌクレオチド配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１を有する請求項４記載のＤＮＡ分 子。
9. ９．発現ビヒクルである請求項４記載のＤＮＡ分子。
10. １０．前記ビヒクルがプラスミドである請求項９記載のＤＮＡ分子。
11. １１．請求項９記載の分子で形質転換した原核宿主。
12. １２．細菌である請求項１０記載の宿主。
13. １３．請求項９記載の分子でトランスフェクトした真核宿主。
14. １４．酵母細胞または哺乳類細胞である請求項１３記載の宿主。
15. １５．（ａ）培養条件下にタンパク質を発現できる宿主細胞を培養し、 （ｂ）前記タンパク質または機能誘導体を発現し；そして（ｃ）前記培養物から 前記タンパク質または機能誘導体を回収する 各工程から成るヒトＴＳＧ−１４タンパク質分子、またはその機能誘導体を調製 する方法。
16. １６．前記宿主が原核生物である請求項１５記載の方法。
17. １７．前記宿主が真核生物である請求項１５記載の方法。
18. １８．請求項１記載のタンパク質に特異的な抗体。
19. １９．モノクローナルである請求項１８記載の抗体。
20. ２０．（ａ）ＴＳＧ−１４タンパク質を含むのではないかと思われる生物学的試 料を前記タンパク質に結合できる分子と接触させ；そして（ｂ）前記タンパク質 に結合した前記分子のいずれかを検出する各工程から成る、生物学的試料中のＴ ＳＧ−１４タンパク質の存在を検出するための方法。
21. ２１．前記分子が抗体またはそのフラグメントである請求項２０記載の方法。
22. ２２．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２１記載の方法。
23. ２３．（ａ）対象物から得られた細胞、その抽出物、またはその培養上澄液を、 ハイブリッド形成条件下に正常または突然変異のＴＳＧ−１４の少なくとも一部 を符号化するオリゴヌクレオチドプローブと接触させ；そして （ｂ）前記細胞の核酸に対して前記プローブのハイブリッド形成を測定し、これ によって前記核酸の存在を検出する各工程から成る対象物中の正常または突然変 異のＴＳＧ−１４タンパク質を符号化する核酸の存在を検出する方法。
24. ２４．（ａ）の工程の前に、 （ｃ）前記ＴＳＧ−１４タンパク質を符号化する前記細胞のＤＮＡの量を選択的 に増幅する工程を追加して含む請求項２３記載の方法。
25. ２５．（ａ）細胞をＴＳＧ−１４の発現を誘導できる物質と接触させ；（ｂ）前 記細胞中のＴＳＧ−１４を符号化するｍＲＮＡの量を、ハイブリッド形成の条件 下に、少なくとも一部のＴＳＧ−１４を符号化するオリゴヌクレオチドプローブ とハイブリッド形成によって測定し；そして （ｃ）前記細胞中のＴＳＧ−１４−符号化ｍＲＮＡの量と前記物質と接触しない 前記細胞中のＴＳＧ−１４−符号化ｍＲＮＡの分量とを比較する（ここで前記ｍ ＲＮＡの量の増加は前記誘導が発生したことを示す） 各工程から成る、細胞中のＴＳＧ−１４の発現の誘導を測定するための方法。
26. ２６．（ａ）細胞をＴＳＧ−１４の発現を誘導できる物質と接触させ；（ｂ）請 求項２０記載の方法を用いて前記細胞の抽出物または上澄液中のＴＳＧ−１４の 量を測定し、 （ｃ）前記細胞抽出物または上澄液中のＴＳＧ−１４の量を、前記物質と接触し なかった前記細胞の抽出物または上澄液中のＴＳＧ−タンパク質の量と比較する （ここで前記ＴＳＧ−１４タンパク質の量の増加は前記誘導が発生したことを示 す） 各工程から成る、細胞中のＴＳＧ−１４の発現の誘導を測定する方法。
27. ２７．（ａ）細胞を化合物と接触させ；（ｂ）請求項２４記載の方法を用いてＴ ＳＧ−１４ｍＲＮＡの誘導を測定し（ここで前記誘導物質が前記化合物である） 、これによって前記化合物を同定する、細胞中のＴＳＧ−１４の発現を誘導でき る化合物を同定する方法。
28. ２８．（ａ）細胞を化合物と接触させ；（ｂ）請求項２０記載の方法を用いて前 記細胞の上澄液中のＴＳＧ−１４タンパク質の存在を測定し、 これによって前記化合物を同定する、細胞からのＴＳＧ−１４タンパク質の分泌 を誘導できる化合物を同定する方法。