JPH1082784A - 血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体の測定法および測定キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検体中血清由来ヒアルロナン結合タンパク質
−ヒアルロン酸結合体（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）濃度を
簡易に測定する方法およびその方法に使用する測定キッ
トの提供。 【解決手段】 検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を抗イン
ター−α−トリプシンインヒビター（抗ＩＴＩ）抗体を
使用して抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）の複
合体を形成し、その含量を測定することによって定量す
る方法。抗ＩＴＩ抗体を含む測定キット。固相体に固着
されたヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質に、Ｓ
ＨＡＰ−ＨＡ結合体を結合させ、そこに抗ＩＴＩ抗体を
反応させて、抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）
−（ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質）−固相
体の複合体を形成し、その含量を測定することによって
ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を定量する方法及び測定キット。
検体として血液、血清または血漿を用いることによりＳ
ＨＡＰ−ＨＡ結合体濃度を測定し、リウマチ性関節炎、
肝疾患等の診断に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、検体中の血清由来
ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体
を、抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体（抗
ＩＴＩ抗体）を用いて測定する方法、この方法を行うた
めの測定キット、この方法を用いて関節炎または肝疾患
を診断する方法およびこの診断に使用するための診断用
キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロン酸（ＨＡ；hyaluronic acid)
は軟骨、関節腔の滑液、臍帯、血清、尿、眼の硝子体等
の全身組織に広く分布し、組織構築の安定化や関節の円
滑な運動性の維持に寄与している。健常人の関節液中の
ヒアルロン酸はほぼ単独で存在しているが、変形性関節
炎やリウマチ性関節炎などの炎症性疾患患部の関節液中
にはある種のタンパク質と結合した形態で存在してい
る。また、ウシ血清から従来知られているものとは異な
る性質を示すヒアルロン酸結合性タンパク質が単離さ
れ、このタンパク質は血清由来ヒアルロナン結合性タン
パク質（SHAP; Serum-derived hyaluronan associated
protein)と命名された(J.Biol.Chem., 265, 5247-5257
(1990)) 。また、ヒト血清由来ヒアルロナン結合性タン
パク質−ヒアルロン酸（ＳＨＡＰ−ＨＡ； Serum-deriv
ed hyaluronan associated protein−hyaluronic acid)
結合体は関節炎患者の関節液より分離精製され、非還元
条件下のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により分子量約 85kDaと約 83kDaの２本
の主バンドを示し、各バンドのプロテアーゼＶ８処理に
よって得られるペプチドフラグメントの一次構造が明ら
かにされた（特開平7-157500号公報）。

【０００３】その後、アミノ酸配列の分析結果からヒト
ＳＨＡＰがヒトインター−α−トリプシンインヒビター
（ＩＴＩ：Inter-α-Trypsin Inhibitor）の長鎖 HC1と
HC2に相当することが明らかとなった（J.Biol.Chem.,
268, 26725-26730 (1993))。さらに、ＳＨＡＰ−ＨＡ結
合体をプロテアーゼとコンドロイチナーゼＡＣIIで分解
して得られた結合部分のマススペクトリー解析により、
Ｃ末端アスパラギン酸残基のαカルボキシル基にヒアル
ロン酸のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基が
エステル結合していることが明らかにされた（J.Biol.C
hem., 270, 26657-26663 (1995))。また、ヒト関節液由
来のＳＨＡＰに対する抗体を作成し、この抗ＳＨＡＰ抗
体とプロテオグリカン由来のヒアルロン酸結合性タンパ
ク質とを用いたＥＬＩＳＡ系による測定法で関節液中の
ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を定量することにより関節炎の診
断ができることが報告されている（特開平7ー157500号公
報) 。しかし、従来の測定法では抗ＳＨＡＰ抗体の作成
のために抗原であるＳＨＡＰのヒト関節液からの分離精
製が必要であり、原料としてヒト関節液の確保が容易で
ない点、また、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定の対象が関節
液であり、関節液の採取の際に患者に苦痛を与えること
等多くの欠点があった。

【０００４】さらにまた、肝疾患の患者の血液中におい
てヒアルロン酸量が増加することが知られており（Laur
ent AE, Loof L, Nyberg A, et al,Hepatology, 5, 638
-642,1985）、血中ヒアルロン酸量を固相に結合させた
ヒアルロン酸結合タンパク質（ＨＡＢＰ）に結合させた
後、更に標識したＨＡＢＰを加えてヒアルロン酸に結合
した標識ＨＡＢＰ量からヒアルロン酸量を測定すること
により肝疾患を診断する方法が知られているが、ヒアル
ロン酸が低分子化され、ＨＡＢＰとの結合部位を複数カ
所有さない場合には、検体中のヒアルロン酸量を検出す
ることができず、正確な診断は不可能であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、血中にＩＴ
Ｉが豊富に存在する（健常人で約0.4mg/ml) ことから抗
原確保が容易であること、およびＩＴＩとＳＨＡＰとに
共通構造が存在することから抗ＩＴＩ抗体がＳＨＡＰと
反応することに着目してなされたものである。すなわ
ち、本発明の目的は、患者からの試料採取が容易な血液
を測定対象として、この試料中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体
を、抗ＩＴＩ抗体を用いてより正確に測定する方法を提
供するものである。また、本発明の他の目的は、この測
定系を利用して関節炎または肝疾患を診断する方法およ
び診断用キットを提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＡとの
結合体として存在するＳＨＡＰが抗ＩＴＩ抗体と反応す
ること、および上記結合体中のＨＡがヒアルロン酸と結
合能を有するタンパク質、特にＣＤ４４等のヒアルロン
酸受容体あるいはヒアルロン酸結合性タンパク質と反応
することを利用して、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定する
ことができること、および血液中にＳＨＡＰとＨＡとの
結合体が存在することを見出した。また、変形性膝関節
炎とリウマチ性膝関節炎とを鑑別する方法として関節液
中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定する方法が報告（特開
平7-157500号公報）されているが、本発明者らは血液中
の該結合体を測定することにより簡便にこれら関節炎を
識別できることを明らかにした。また、肝疾患患者にお
いても血液中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体量が大きく増加す
ることを見出し、上記リウマチ性膝関節症の他に肝疾患
の診断を行うことが可能であることを明らかにした。

【０００７】すなわち、本発明は、検体中のＳＨＡＰ−
ＨＡ結合体を、抗ＩＴＩ抗体と反応させて抗ＩＴＩ抗体
−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）の複合体を形成させること
によって検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定する方
法、この測定方法を用いて関節炎または肝疾患を診断す
る方法およびこれらの診断に使用する診断用キットに関
する。本発明の測定方法は、好ましくは、ＳＨＡＰ−Ｈ
Ａ結合体を含む検体を、固相体に固着されたヒアルロン
酸と結合能を有するタンパク質、好ましくはＣＤ４４あ
るいはヒアルロン酸結合性タンパク質と接触させ、つい
で標識物質で標識されたまたは標識され得る抗ＩＴＩ抗
体とを接触させることにより、標識された抗ＩＴＩ抗体
−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−（ヒアルロン酸と結合能
を有するタンパク質）−固相体からなる複合体を形成さ
せ、該複合体を複合体を形成しなかった未反応の抗ＩＴ
Ｉ抗体から分離し、該複合体中の標識物質または未反応
の標識物質を検出することにより検体中のＳＨＡＰ−Ｈ
Ａ結合体を測定することを特徴とする。

【０００８】また、本発明は、抗ＩＴＩ抗体とＳＨＡＰ
−ＨＡ結合体との複合体を形成させることによりＳＨＡ
Ｐ−ＨＡ結合体を測定する方法に使用するキットであっ
て、構成成分として抗ＩＴＩ抗体を含むことを特徴とす
るＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定用キットに関する。好まし
くは、本発明のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定用キットは、
抗ＩＴＩ抗体とヒアルロン酸と結合能を有するタンパク
質、好ましくはＣＤ４４あるいはヒアルロン酸結合性タ
ンパク質とから構成され、かつ抗ＩＴＩ抗体、ヒアルロ
ン酸と結合能を有するタンパク質のいずれかが、標識物
質で標識されたもしくは標識され得るものであり、さら
に好ましくは、主としてヒアルロン酸と結合能を有する
タンパク質が固着された固相体と抗ＩＴＩ抗体と標識物
質で標識された抗イムノグロブリン抗体から構成される
ものである。

【０００９】さらに本発明は、前記測定方法を用いて、
関節炎、肝疾患等を診断する方法に関する。

【００１０】本発明でいう抗ＩＴＩ抗体はＩＴＩの長鎖
HC1およびHC2 の一方もしくは両方と反応するポリクロ
ーナル抗体またはモノクローナル抗体等である。また、
本発明でいうヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質
とはヒアルロン酸結合性タンパク質およびヒアルロン酸
受容体から選択される少なくとも１種のタンパク質であ
る。ヒアルロン酸結合タンパク質とは、後述するよう
に、ヒアルロン酸結合性プロテオグリカン、ヒアルロン
酸結合性プロテオグリカンのコアタンパク質、リンクプ
ロテイン、ヒアルロネクチン、それらのヒアルロン酸結
合領域を含む部分タンパク質等である。一方、ヒアルロ
ン酸受容体とは、ＣＤ４４、ＣＤ４４のヒアルロン酸結
合領域を含む部分タンパク質またはそれらの融合タンパ
ク質も含まれる。また、Turleyらが報告しているＲＨＡ
ＭＭ（Receptor for hyaluronan-mediated motility)、
ＲＨＡＭＭのヒアルロン酸結合領域を含む部分タンパク
質またはそれらの融合タンパク質もヒアルロン酸受容体
に含まれる。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の測定方法 本発明の測定方法は、少なくとも抗ＩＴＩ抗体と検体中
のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体との複合体を形成させる工程を
含むことを特徴とする。ＩＴＩは寒天ゲル電気泳動にお
いて、α１とα２グロブリン領域の中間に泳動され、ト
リプシン阻害活性を有することで定義されている。ヒト
ＩＴＩは正常血清中に約0.4mg/mlの濃度で存在し、分子
量23万の複合体で、３種類の異なるペプチド鎖、 HC1、
HC2およびＨＩ−30からなる。HC1 とHC2 とはそれぞれ
80kDa と85kDa の分子量を持ち、分子量の大きさから長
鎖と呼ばれる。一方、45〜55kDaの分子量を示すＨＩ−3
0は短鎖と呼ばれ、２個の Kunitz 型トリプシンインヒ
ビタードメインからなり、プロテアーゼ阻害活性能はこ
れに起因する。この２個のKunitz型ドメインよりＨＩ−
30をビクニン（bikunin)とも呼ぶ。ビクニンのＮ末端か
ら10番目のセリン残基にはコンドロイチン−４−硫酸が
結合し、このペプチド鎖はプロテオグリカンでもある。
また、米田らはウシ胎児血清中にヒアルロン酸と強く結
合する 85kDaおよび83kDa のペプチド鎖から成るタンパ
ク質を発見し、これをＳＨＡＰ(Serum Derived Hyaluro
nan Associated Protein) と命名した（J.Biol.Chem.,
265, 5247-5257 (1990))。その後の研究によりＳＨＡＰ
のペプチド鎖はＩＴＩの長鎖と同一で（J.Biol.Chem.,
268, 26725-26730 (1993))、ヒアルロン酸と共有結合し
ていることが明らかにされた（J.Biol.Chem., 270, 266
57-26663 (1995))。

【００１２】本発明で使用される抗ＩＴＩ抗体は、測定
すべきＳＨＡＰ−ＨＡ結合体がヒト由来のものであると
きは、ヒトＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を構成するＳＨＡＰ、
すなわちヒトＩＴＩの長鎖であるHC1 およびHC2 の一方
または両方と反応するものであればよく、市販の抗ヒト
ＩＴＩ抗体（バイオピュア社、ダコ社、バインディング
サイト社等）、市販のヒトＩＴＩ（バイオピュア社）を
ウサギ等に免疫して得られるポリクローナル抗体あるい
はマウス、ラット、ハムスター等に免役して得られるモ
ノクローナル抗体でもよい。また、ＨＡとの結合体とし
て得られたＳＨＡＰを免疫して得られるポリクローナル
抗体あるいはモノクローナル抗体でもよい。また、ヒト
以外の動物由来ＩＴＩあるいはＳＨＡＰを抗原として
も、得られた抗体がヒトＩＴＩの長鎖を認識する抗体で
あれば本発明の抗ＩＴＩ抗体として使用できる。前述の
市販の抗ヒトＩＴＩ抗体は入手が容易であるので好まし
い。

【００１３】本発明で使用されるヒアルロン酸受容体と
しては、ＣＤ４４、ＣＤ４４のヒアルロン酸結合領域を
含む部分タンパク質あるいはそれらの融合タンパク質が
挙げられる。また、ＲＨＡＭＭ（Receptor for hyaluro
nan-mediated motility)と呼ばれる膜タンパク質(Bioch
em. Biophys. Res. Commun. 108, 1016-1024 (1982))お
よびＲＨＡＭＭのヒアルロン酸結合領域を含む部分タン
パク質あるいはそれらの融合タンパク質もヒアルロン酸
受容体として例示できる。

【００１４】ＣＤ４４は白血球抗原の１種であり、ヒア
ルロン酸をリガンドとする接着分子であること、抗ＣＤ
４４抗体との反応性等により定義されている。ＣＤ４４
は細胞膜貫通型のタンパク質であり、多数の異性体（ア
イソフォーム）が存在することが知られている。例え
ば、ヒトの標準型のＣＤ４４（ＣＤ４４Ｈ）は、248 ア
ミノ酸残基からなる細胞外領域、21アミノ酸残基からな
る膜貫通領域および７２アミノ酸残基からなる細胞質内
領域からなり、分子量は85〜90kDa であることが知られ
ている。ＣＤ４４の細胞外領域は、アミノ末端側に軟骨
プロテオグリカンコアタンパク質とリンクプロテインに
相同性（例えば、ＣＤ４４Ｈの場合、約30％の相同性）
のあるヒアルロン酸結合領域（例えばＣＤ４４Ｈの場
合、アミノ末端から12〜101 番目のアミノ酸残基からな
る領域等）（以下、「ＣＤ４４のヒアルロン酸結合領
域」という。）が存在し、さらにカルボキシル末端側の
膜近位領域にコンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸等のグ
リコサミノグリカンあるいはそのオリゴ糖が結合したも
のも知られている。ＣＤ４４は、細胞と細胞、細胞と細
胞間基質（ヒアルロン酸、コラーゲンＩ型、コラーゲン
IV型、フィブロネクチン）等の接着を司る分子であり、
白血球全般、繊維芽細胞、上皮細胞等の細胞膜上に発現
していることが知られている。ＣＤ４４は、フィブロネ
クチン、コラーゲンＩ型およびコラーゲンIV型のレセプ
ター機能、癌転移への関与等多様の機能を有し、その一
つとしてヒアルロン酸のレセプターとしての機能を有す
る。

【００１５】なお、ＣＤ４４は、Pgp-1 、ECMRIII 、He
rmes抗原、gp90HERMES、Ｈ−ＣＡＭ、ln(Lu)-related a
ntigen、 Hutch-1、ln(Lu)-related p80、p80A3D8 およ
びp85等とも呼ばれている（Cell,61,1303-1313 (199
0)、J. Exp. Med., 172, 69-75(1990)、細胞工学別冊・
ハンドブックシリーズ「接着分子ハンドブック」、第29
8-3076頁、1994年発行）。

【００１６】一方、ヒト、ヒヒ、マウス、ラット等のＣ
Ｄ４４をコードするｃＤＮＡが知られており、遺伝子工
学的手法によって得られたＣＤ４４の細胞外領域のアミ
ノ末端とヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメント（すなわちヒ
ンジ部、不変部のCH2 部分およびCH3 部分）のカルボキ
シル末端とが結合した融合タンパク質が知られている
（Cell,61,1303-1313(1990))。

【００１７】本発明で使用されるＣＤ４４はヒアルロン
酸との結合能を有し、ＣＤ４４のヒアルロン酸結合領域
を有するものであれば特に限定されないが、例えば標準
型ＣＤ４４（ＣＤ４４Ｈ）、ＣＤ４４変異分子（ＣＤ４
４Ｖ）、ＣＤ４４Ｅ、可溶性ＣＤ４４等が挙げられる。
また、ＣＤ４４のヒアルロン酸結合領域を含むＣＤ４４
の部分タンパク質（例えば、ＣＤ４４の細胞外領域全体
もしくはその一部分等）、またはＣＤ４４、ＣＤ４４の
部分タンパク質もしくはＣＤ４４のヒアルロン酸結合領
域のアミノ酸配列を有するタンパク質と免疫グロブリ
ン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ等のタンパク
質を結合させた融合タンパク質等が挙げられる。好まし
い融合タンパク質としては、例えば、ＣＤ４４の細胞外
領域のカルボキシル末端と免疫グロブリンのアミノ末端
とが結合したものが挙げられ、さらに好ましくは、ＣＤ
４４の細胞外領域のカルボキシル末端とＩｇＧのＦｃフ
ラグメントのアミノ末端とが結合した融合タンパク質等
が挙げられる。

【００１８】融合タンパク質は、ヒアルロン酸との結合
能を有していれば多量体（例えば２量体等）を形成して
いてもよい。例えばＩｇＧまたはそのＦｃフラグメント
を含む上記融合タンパク質であれば、通常、非還元条件
下でジスルフィド結合によってＩｇＧ様の２量体を形成
することができる。

【００１９】ＣＤ４４のヒアルロン酸結合領域を含む部
分タンパク質または融合タンパク質の製造方法として
は、以下に示す1)〜3)の方法を例示することができる。 1) ＣＤ４４を、タンパク分解酵素（例えばトリプシ
ン、キモトリプシン、ペプシン等）で消化する等の公知
の手段で分解後、ヒアルロン酸を結合した担体等を用い
てヒアルロン酸との結合能を有する部分タンパク質を分
離精製する方法。 2) 上記1)の操作において、さらに糖分解酵素（例えば
コンドロイチナーゼＡＢＣ、ヘパリチナーゼ、Ｎ−グリ
コシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ等）を作用させる等の
方法で部分的にあるいは完全に糖鎖が除かれた部分タン
パク質を得る方法。 3) 公知の融合方法（例えば、遺伝子工学的方法やハイ
ブリッドタンパクを得る方法等）を用いて融合タンパク
質を得る方法。

【００２０】本発明で使用されるヒアルロン酸結合性タ
ンパク質としては、ヒアルロン酸結合性プロテオグリカ
ン（例えば、軟骨プロテオグリカン（アグリカン）、バ
ーシカン、ニューロカン等）、ヒアルロン酸結合性プロ
テオグリカンのコアタンパク質（例えば、軟骨プロテオ
グリカンのコアタンパク質等）、これらの部分タンパク
質、リンクプロテイン、ヒアルロネクチン等が挙げられ
る。

【００２１】ヒアルロン酸結合性タンパク質の製造法と
しては、公知の方法（Leurent et al, Anal.Biochem.,
109, 386-394(1980)、特開平 4-26279号公報、Anal.Bio
chem., 149, 555-565 (1985)等）を用いればよい。例え
ば軟骨プロテオグリカンの部分タンパク質は、上記 Leu
rentらの方法、特開平 4-26279号公報に記載の方法等に
したがって調製することができる。即ち、例えば軟骨か
ら塩酸グアニジン等を用いてプロテオグリカンを可溶化
して抽出し、透析したものにタンパク分解酵素（トリプ
シン等）を作用させてコアタンパク質を分解し、ヒアル
ロン酸結合担体（例えば、ヒアルロン酸を結合させた球
状セルロース等）等を用いるアフィニティークロマトグ
ラフィーにより前記部分タンパク質を得る方法等が挙げ
られる。

【００２２】本発明において検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結
合体を抗ＩＴＩ抗体を用いて測定するには、通常いわゆ
るサンドイッチ法（特公平6-41952 等参照）が用いられ
る。すなわち、結合体中のＳＨＡＰと抗ＩＴＩ抗体との
免疫学的親和性とＨＡのヒアルロン酸と結合能を有する
タンパク質に対する親和性を利用し、三者のサンドイッ
チ状複合体を形成させて複合体を測定する方法であり、
通常、ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質または
抗ＩＴＩ抗体の一方を固相体に固着させ、該サンドイッ
チ状複合体を分離して測定する方法である。例えば、Ｓ
ＨＡＰ−ＨＡ結合体を含む検体を、固相体に固着された
ＣＤ４４と接触させ、次いで標識物質で標識された抗Ｉ
ＴＩ抗体と接触させることによって、検体中のＳＨＡＰ
−ＨＡ結合体と該ＣＤ４４と該標識物質で標識された抗
ＩＴＩ抗体とを反応させて、抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ
−ＨＡ結合体）−ＣＤ４４−固相体からなる複合体を形
成させ、前記複合体と遊離の該標識された抗ＩＴＩ抗体
とを分離し、前記複合体中の標識物質を検出することに
より検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定する方法が挙
げられる。

【００２３】また、形成させた抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡ
Ｐ−ＨＡ結合体）−ＣＤ４４−固相体の前記複合体に、
抗ＩＴＩ抗体に特異的に結合する標識された抗イムノグ
ロブリン抗体を接触させることによって、前記複合体と
該標識抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させ、そ
の標識物質を検出することにより、検体中のＳＨＡＰ−
ＨＡ結合体を測定することもできる。前記の抗ＩＴＩ抗
体を直接標識する方法に比べ、入手の容易な標識された
抗イムノグロブリン抗体を使用する方法の方が簡便であ
り、好ましい。なお、この方法で使用する抗イムノグロ
ブリン抗体は、抗ＩＴＩ抗体を製造するためにＩＴＩを
免疫した動物と同種の動物のイムノグロブリンを認識す
る抗体である。

【００２４】上記サンドイッチ法による測定方法におい
ては、固相体に固着する物質としてＣＤ４４の代わりに
ヒアルロン酸結合性タンパク質を使用することもでき
る。さらに、ＣＤ４４、ヒアルロン酸結合性タンパク質
以外のヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質を用い
ることもできる。前記サンドイッチ法において、抗ＩＴ
Ｉ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−（ヒアルロン酸と
結合能を有するタンパク質）の複合体形成順序は、いわ
ゆるフォワード、リバース、同時のいずれも可能である
（「蛋白核酸酵素」別冊 No.31、酵素免疫測定法、共立
出版（株）発行、1987年、ｐ13-26 参照）。

【００２５】これらのサンドイッチ法による本発明の測
定方法において、ＣＤ４４等のヒアルロン酸受容体また
はヒアルロン酸結合性タンパク質等のヒアルロン酸と結
合能を有するタンパク質を固着させる固相体としては、
プレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等が挙
げられる。材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレ
ン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が好ましい。これ
らの固相体にＣＤ４４またはヒアルロン酸結合性タンパ
ク質等のヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質を固
着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包
括法等固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化
酵素、1975年、講談社発行、第９〜75頁参照）を応用す
ることができる。特に物理的吸着が、操作が簡便な点で
好ましい。

【００２６】また、ヒアルロン酸と結合能を有するタン
パク質を固着させた固相体の表面には、これらが固着し
ていない表面部分が残存している場合があり、そこへ検
体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体や他の分子種が固着する
と、正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よ
って、検体を固相体と接触させる前にブロッキング物質
を添加してヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質が
固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。こ
のようなブロッキング物質としては、ウシ等から採取で
きる血清アルブミン、カゼイン、ミルク蛋白等が挙げら
れ、また、ブロッキング物質として市販されているもの
を使用することもできる。

【００２７】また、固相体に固着させたヒアルロン酸と
結合能を有するタンパク質に検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結
合体を結合させた後に、固相体の表面を洗浄液で洗浄し
て非特異吸着物を除去することが好ましい。洗浄液とし
ては、例えば、トゥイーン(Tween) 系界面活性剤等の界
面活性剤を添加した緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、リ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液）等
が挙げられる。

【００２８】抗ＩＴＩ抗体または該抗体に免疫学的親和
性を有する抗イムノグロブリン抗体の標識に使用される
標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、アイソトープ
(125 Ｉ、131 I 、3 Ｈ等) 、蛍光色素（ルミノール、
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、化
学発光物質、ハプテン、ビオチン、アビジン（例えば、
ストレプトアビジン等）が挙げられるが、通常タンパク
質の標識に可能なものであれば、特に限定されない。な
お、ここで標識物質とは、ビオチンのようにそれ自体を
直接検出せず、その物質と特異的結合能を有する物質
（例えばアビジン）に検出可能な標識を結合したものを
組み合わせて用いる方法に使用する物質も包含する。

【００２９】前記の抗体の標識方法は、標識物質に適し
た公知の方法、例えば、酵素を標識する際にはグルタル
アルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、
カルボジイミド法、活性化エステル法等、放射性同位元
素で標識する際にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシ
ダーゼ法等（続生化学実験講座２「タンパク質の化学
（下）」、東京化学同人、1987年発行参照）から適宜選
択することができる。

【００３０】標識物質の検出法としては、用いる標識物
質により異なるが、例えば、標識物質にビオチンを使用
する場合には、ストレプトアビジン等を結合させた酵素
を添加して、このストレプトアビジン等を介してペルオ
キシダーゼ等の酵素を標識物質としてビオチンを含む複
合体へ結合させ、該酵素の基質としてテトラメチルベン
ジジン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反
応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定す
る方法等を挙げることができる。また、例えば、標識物
質として蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、
反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられ
る。

【００３１】本発明の測定方法においては、検体中のＳ
ＨＡＰ−ＨＡ結合体の濃度は、予め既知濃度のＳＨＡＰ
−ＨＡ結合体標準液を用いてＳＨＡＰ−ＨＡ結合体濃度
と標識物質の検出結果との関係について検量線を作成
し、未知濃度の検体についての検出結果と前記検量線と
を用いる方法によって、定量することができる。

【００３２】本発明の測定方法によれば、関節液、血
液、血清、血漿、尿等の体液、細胞もしくは微生物の培
養液等の液状試料中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を定量する
ことができる。特に、後述の関節炎または肝疾患の診断
に本測定法を用いる場合、血液、血清、血漿等を検体と
することができ、患者の負担を軽減することができる。
なお、本発明の測定方法に用いるＳＨＡＰ−ＨＡ結合体
を含む検体は、予め精製されている必要はない。すなわ
ち、検体中にヒアルロン酸以外のグリコサミノグリカ
ン、ＩＴＩおよびその他の各種タンパク質が含まれてい
ても、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を選択的に測定することが
できるため、それらによって測定結果が影響されること
はない。

【００３３】（２）ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定用キット 本発明のサンドイッチ法によるＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測
定用キットは、少なくとも抗ＩＴＩ抗体をキットの構成
成分として含むものである。しかし、一般的には、標識
物質で標識されたまたは標識されうる抗ＩＴＩ抗体とヒ
アルロン酸と結合能を有するタンパク質（例えばＣＤ４
４等のヒアルロン酸受容体もしくはヒアルロン酸結合性
タンパク質）とから構成されるものである。このような
キットにおいて、ヒアルロン酸と結合能を有するタンパ
ク質を予め固相体に固着されたものを使用すれば、上述
した測定方法において、固相体に固着する操作を省くこ
とができる。

【００３４】すなわち、例えば本発明のＳＨＡＰ−ＨＡ
結合体測定キットを用いて、固相体に固着させたＣＤ４
４にＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を含む検体を接触させ、次い
で抗ＩＴＩ抗体と接触させることによって、抗ＩＴＩ抗
体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）−ＣＤ４４−固相体から
なる複合体を形成させ、さらにペルオキシダーゼ標識抗
イムノグロブリン抗体を接触させることによって、前記
複合体と該標識抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成
させ、その複合体に含まれる標識物質（ペルオキシダー
ゼ）を検出することにより、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結
合体濃度を測定することができる。

【００３５】前記キットには、さらに検量線作成のため
の標準となる既知濃度のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体標準品、
標識物質の検出試薬、抗ＩＴＩ抗体を標識する試薬、抗
ＩＴＩ抗体を検出する試薬（標識された抗イムノグロブ
リン抗体等）等を加えることができる。また、これらの
成分の他に、前記ブロッキング物質、前記洗浄液、検体
希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。ま
た、これらの成分は、それぞれ別体の容器に収容してお
き、使用時に上記処方に従って使えるキットとして保存
しておくことができる。

【００３６】本発明のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定用キッ
トを用いて関節液、血液、血清、血漿、尿、骨髄液等の
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を特異的に測定すること
ができ、測定範囲も広く、かつ高感度である。

【００３７】本発明のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体測定用キッ
トを用いてヒトの血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定
した場合、健常人は低値であり、変形性膝関節炎患者で
はやや高く、リウマチ性関節炎患者では著しく高い値を
示すことより、関節炎の診断を簡便に行うことができ
る。特に、リウマチ性関節炎か変形性膝関節炎かを正確
に識別する診断法として非常に有効な診断用キットとな
り得る。また、肝疾患患者では著しく高い値を示す傾向
が見られることにより、肝疾患の診断法として非常に有
効な診断用キットともなり得る。

【００３８】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を説
明する。本発明のサンドイッチ法による測定方法の好ま
しい一形態を以下に説明する。まず、固相体にＣＤ４４
を固着（コーティング）させる。固着方法としては、例
えば、ＣＤ４４をpH７〜９程度の緩衝液（例えば、リン
酸緩衝液、ＰＢＳ、炭酸緩衝液等）に溶解して固相体
（例えばマイクロプレートのウェル）に加え、37℃程度
で１〜２時間保存するか、４℃程度で一晩保存して固着
させる方法等を挙げることができる。

【００３９】上記固着後、血清アルブミン等のブロッキ
ング物質を添加して、37℃程度で30分〜２時間保存する
か、常温（15〜25℃) で１〜２時間保存して、該ＣＤ４
４が固着していない部分を被覆しておくことが好まし
い。次いで、上記ＣＤ４４が固着した固相体に、ＳＨＡ
Ｐ−ＨＡ結合体を含む検体試料を添加し、例えば、37℃
で20〜80分間の最適な時間静置あるいは撹拌し、上記Ｃ
Ｄ４４にＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を結合させる。

【００４０】その後、この複合体が結合した固相体を、
トゥイーン系界面活性剤等を添加した緩衝液（例えばリ
ン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液等）等の洗浄液
で洗浄する。さらに、前記固相体に、標識物質で標識さ
れた抗ＩＴＩ抗体または抗ＩＴＩ抗体と標識物質で標識
された抗イムノグロブリン抗体を添加して、例えば、37
℃で20〜80分間の最適な時間静置あるいは撹拌し、ＳＨ
ＡＰ−ＨＡ結合体に前記抗ＩＴＩ抗体（または抗ＩＴＩ
抗体−抗イムノグロブリン抗体）を結合させる。この操
作によって、抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）
−ＣＤ４４−固相体からなる複合体を形成させる。次
に、前記複合体の標識物質を検出してＳＨＡＰ−ＨＡ結
合体を測定する。

【００４１】別に、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体標準品の濃度
と標識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係につい
て検量線を作成し、未知試料についての検出結果と前記
検量線とを用いて、未知試料中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体
を定量する。

【００４２】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

【００４３】

【調製例１】 （融合タンパク質の調製）ＣＤ４４の細胞外領域とヒト
免疫グロブリン(Ig)のＦｃフラグメントとの融合タンパ
ク質（以下、単に「融合タンパク質」ということがあ
る）を、シード（B.Seed）らの方法（Cell, 61, 1303-1
313(1990))に従って調製した。すなわち、ＣＤ４４の細
胞外領域をコードするｃＤＮＡに、その細胞内領域側
（カルボキシル末端側）にヒトIgG1のＦｃフラグメント
をコードするｃＤＮＡとそのアミノ末端側にＣＤ５のシ
グナル配列をコードするｃＤＮＡとをそれぞれ連結した
ｃＤＮＡ断片を作成し、これをＣＤＭ８ベクターに組み
込み、ＤＥＡＥデキストランを用いる公知の方法でＣＯ
Ｓ細胞に移入して、融合タンパク質をＣＯＳ細胞に一過
性に発現させた。ＣＯＳ細胞は無血清培地で培養し、細
胞外に分泌した融合タンパク質を含む培養上清を回収し
た。融合タンパク質の精製は、その分子中のイムノグロ
ブリン部位を利用し、プロテインＡ結合樹脂を用いたア
フィニティーカラムクロマトグラフィーにより行った。

【００４４】

【調製例２】 （ヒアルロン酸結合性タンパク質の調製）ヒアルロン酸
結合性タンパク質を、特開平4-262797号公報に記載の製
造例（ヒアルロン酸結合性蛋白）の項に準じて調製し
た。即ち、牛鼻中隔軟骨から４Ｍ塩酸グアニジン溶液を
用いて抽出操作を行い、次いで抽出物の上清を採取し、
これを脱イオン水で透析した後、凍結乾燥して粗抽出物
を得た。この粗抽出物をトリプシン消化後、ヒアルロン
酸結合樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィー
により精製した。

【００４５】

【調製例３】 (ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の調製)ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体
を、特開平7-157500号公報に記載の実施例（ヒアルロナ
ン結合性タンパク質の調製）の項に準じて調製した。即
ち、リウマチ性膝関節炎患者の関節液を採取し、軽く遠
心分離して不溶物を取り除き、ハンクス液によって５〜
６倍に希釈した。これに１／10体積の４M グアニジン塩
酸塩溶液を加え、アジ化ナトリウムを微量加えた後、塩
化セシウムを加えて50％(W/V) とした。超遠心チューブ
に入れて４℃に静置後、４℃、123,000 ×g の超遠心
（タンパク質非解離条件下での超遠心；アソシエイティ
ブ超遠心）を48時間行うことにより精製した。

【００４６】

【調製例４】 （血清検体の調製）抗血液凝固剤を入れないで採決した
血液３mlを、４℃に１時間静置した後、1,000 ×ｇ、10
分間遠心処理することにより血清を得、これを血清検体
とした。

【００４７】

【実施例１】 （ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の定量）調製例１で精製された
ＣＤ４４の細胞外領域を含む融合タンパク質をリン酸緩
衝生理食塩水(pH7.2〜7.5 、二価イオン不含）（以下、
ＰＢＳ（−）と略す）で、それぞれ２μg/mlに希釈し、
この溶液50μl (100ng／ウエル）ずつをヌンクイムノプ
レート（商品名：マキシソープ、ヌンク社製）の各ウエ
ルに加え、４℃で16時間保存することにより、均一にコ
ーティングした。このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗
浄し、ウエルの融合タンパク質が被覆されていない部分
を被覆するために、ブロッキング物質として３％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ、生化学工業（株）販売）を含む
ＰＢＳ（−）溶液を加え、室温で２時間静置した。

【００４８】次いで、このプレートを洗浄液（0.05％ト
ゥイーン20（和光純薬工業（株）製）を含むＰＢＳ
(−))で３回洗浄後、調製例３で精製された各濃度のＳ
ＨＡＰ−ＨＡ結合体標準液 (16〜4000ng/ml の各濃度）
50μl を前記プレートに加え、３７℃で60分間静置して
反応させた。なお、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体標準液の溶媒
としては、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ (−) （以下、「反
応希釈液」という）を用いた。

【００４９】この後、このプレートを前記洗浄液にて３
回洗浄し、反応液で希釈した１μg/ml抗ＩＴＩ抗体（ダ
コ社製）25μl および反応液で 1,250倍に希釈したペル
オキシダーゼ標識抗ウサギイムノグロブリン抗体（生化
学工業（株）販売）25μl を加え、37℃で60分間静置し
て反応させた。さらに、このプレートを前記洗浄液で３
回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチル
ベンジジン溶液（モス社製：以下、ＴＭＢと略す）を50
μl 加え、37℃で15分間反応させ、発色させた。

【００５０】発色後、プレートに１Ｎ−HC1 を50μl 加
えて反応を停止させ、ＴＭＢの分解による着色液の波長
450nmでの吸光度（対照波長630nm)(A450/630)をウェル
リーダーSK601(生化学工業（株）販売）にて測定した。
得られた結果を図１に示す。これにより、本発明の測定
法によれば、16〜4,000ng/mlのＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の
定量が可能であることがわかる。また、該測定法で用い
たＣＤ４４の代わりに調製例２で精製したヒアルロン酸
結合性タンパク質の溶液をＰＢＳ (−) で10μg/mlに希
釈して使用することも可能である。得られた結果を図２
に示す。この方法では64〜4,000ng/mlのＳＨＡＰ−ＨＡ
結合体の定量が可能であり、ＣＤ４４を用いた場合より
やや感度が劣る。

【００５１】

【実施例２】 （ヒアルロン酸およびヒアルロニダーゼの測定系への影
響）20μg/mlのヒアルロン酸を共存させた10倍希釈血清
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体含量を実施例１の方法で
測定し、測定結果へのヒアルロン酸（ＨＡ）共存の影響
を検討した。また、100mU/mlのヒアルロニダーゼで10倍
希釈血清検体を37℃で60分間処理した後、実施例１の方
法で測定し、測定結果への影響を検討した。無処理の血
清検体を測定して得られたＳＨＡＰ−ＨＡ結合体濃度を
100％としてヒアルロン酸存在下あるいはヒアルロニダ
ーゼ処理した血清検体から得られた測定値を百分率
（％）に換算した。ヒアルロン酸結合性タンパク質を固
着したプレートを用いた測定方法で得られた結果を図３
に、ＣＤ４４を固着したプレートを用いた測定方法で得
られた結果を図４に示した。これらの結果から、本発明
の測定方法はヒアルロン酸の共存あるいはヒアルロニダ
ーゼ処理により著しく阻害を受ける。このことはヒアル
ロン酸結合性タンパク質あるいはＣＤ４４を固着したプ
レートと検体との反応でＳＨＡＰ−ＨＡ結合体のヒアル
ロン酸部分を特異的に検出していることが示された。

【００５２】

【実施例３】 （健常人および関節炎患者の血清中ＳＨＡＰ−ＨＡ結合
体の定量）健常人（10例）、変形性膝関節炎（以下ＯＡ
と略す）患者（10例）、リウマチ性関節炎（以下ＲＡと
略す）患者（10例）の各血清中に存在するＳＨＡＰ−Ｈ
Ａ結合体の定量を実施例１に記載した方法にて行った。
ヒアルロン酸結合性タンパク質を固着したプレートを用
いた測定方法で得られた結果を図５に、ＣＤ４４を固着
したプレートを用いた測定方法で得られた結果を図６に
示した。また、これらの測定結果を表１に示した。表
１、図５および図６より、ＲＡ患者の血清中のＳＨＡＰ
−ＨＡ結合体の平均値は、健常人に比べ、ヒアルロン酸
結合性タンパク質法で約320 倍、ＣＤ４４法で約560 倍
の高値を示した。さらにＯＡ患者の血清に対してもＲＡ
患者の血清は前者の方法で約115 倍、後者の方法で約38
0 倍の高値を示した。これらの結果より、血清中のＳＨ
ＡＰ−ＨＡ結合体の値はＲＡとＯＡとの識別が可能な診
断マーカーとして有用であることが示された。

【００５３】

【表１】 健常人、ＯＡ患者およびＲＡ患者の血清中の ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体（タンパク質）含量 ───────────────────────────────── 測定方法 平均 (μg/ml) ±Ｓ．Ｄ ───────────────────────────────── ヒアルロン酸結合性タンパク質法 健常人 1.17 0.39 (n=10) ＯＡ患者 3.28 4.54 (n=10) ＲＡ患者 379.49 445.96 (n=10) ───────────────────────────────── ＣＤ４４法 健常人 0.20 0.02 (n=10) ＯＡ患者 0.29 0.13 (n=10) ＲＡ患者 111.72 90.88 (n=10) ─────────────────────────────────

【００５４】

【実施例４】 （健常人、関節炎患者及び肝疾患患者の血清中ＳＨＡＰ
−ＨＡ結合体の定量と比較）健常人（87例）、関節炎患
者（OA:42 例、RA:82 例）及び肝疾患患者（54例）の各
血清中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の定量を、実施
例１に記載した方法に準じ、ヒアルロン酸結合タンパク
質を固着したプレートを用いた測定方法によって行っ
た。なお、測定値はｕｎｉｔに変換して結果を図７に示
した。図中に記載の unit/mlとは、450nm における吸光
度が０．５となる標準検体のＳＨＡＰ−ＨＡ濃度を１un
it/ml としたとき、測定検体のこの標準検体に対する希
釈率の逆数として表した値である。当該単位を用いて標
準検体の検量線を作成した後、検体の測定値のunitへの
変換を前記検量線を用いて行った。ＲＡ患者群同様に肝
疾患患者群も血清中ＳＨＡＰ−ＨＡ量が高値を示す傾向
が見られた。この結果より、本発明測定法はＲＡの識別
と同様に肝疾患の識別が可能な診断マーカーとしても有
用であることが示唆された。また、仮に２unit/ml を血
中ＳＨＡＰ−ＨＡ濃度の正常値と異常値の臨界値とした
場合の各検体の異常値を示す割合は、正常（健常人）が
1.10％（87検体中１検体）、ＯＡ患者が 19.00％（42検
体中８検体）、ＲＡ患者が 74.40％（82検体中61検体）
及び肝疾患患者が 42.59％（54検体中23検体）となり、
診断マーカーとしての有用性が裏付けられた。

【００５５】

【発明の効果】本発明のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の測定方
法によりＩＴＩに対する抗体およびヒアルロン酸と結合
能を有するタンパク質を用いた方法で血液等に含まれる
ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を簡便に測定することが可能であ
り、かつ、関節炎の診断においてＯＡかＲＡかを正確に
識別し、また肝疾患の検出を行う診断法として有効な方
法である。また、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の生理的意義は
不明であるが高転移性ガン細胞は多量にヒアルロン酸を
持ち、血清存在下で培養すると細胞周囲のヒアルロン酸
にＳＨＡＰが結合し、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体が形成する
ことが報告されている (生化学、67, 458-465 (199
5)）。このことより、癌の転移にＳＨＡＰ−ＨＡ結合体
が関与している可能性が考えられ、本発明のＳＨＡＰ−
ＨＡ結合体測定法は癌転移機構の解明および医薬品開発
の有用な評価方法となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１のＣＤ４４を用いて測定したＳＨＡＰ
−ＨＡ結合体含量の標準曲線を示す。

【図２】実施例１のヒアルロン酸結合性タンパク質を用
いて測定したＳＨＡＰ−ＨＡ結合体含量の標準曲線を示
す。

【図３】実施例２の検体（血清）中のＳＨＡＰ−ＨＡ結
合体含量測定におけるヒアルロン酸およびヒアルロニダ
ーゼの阻害作用（ヒアルロン酸結合性タンパク質使用）
を示す。

【図４】実施例２の検体（血清）中のＳＨＡＰ−ＨＡ結
合体含量測定におけるヒアルロン酸およびヒアルロニダ
ーゼの阻害作用（ＣＤ４４使用）を示す。

【図５】実施例３の健常人、ＯＡ患者およびＲＡ患者の
血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の濃度を示す（ヒアルロ
ン酸結合性タンパク質使用）。

【図６】実施例３の健常人、ＯＡ患者およびＲＡ患者の
血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の濃度を示す（ＣＤ４４
使用）。

【図７】実施例４の健常人、ＯＡ患者、ＲＡ患者および
肝疾患患者の血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の濃度(uni
t/ml) の比較を示す（ヒアルロン酸結合性タンパク質使
用）。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体中の血清由来ヒアルロナン結合性タ
   ンパク質−ヒアルロン酸（ＳＨＡＰ−ＨＡ）結合体を、
   抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体（抗ＩＴ
   Ｉ抗体）と反応させて抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ
   結合体）の複合体を形成させ、この複合体を測定するこ
   とを特徴とする検体中の血清由来ヒアルロナン結合性タ
   ンパク質−ヒアルロン酸結合体の測定方法。
2. 【請求項２】 検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体と、ヒア
   ルロン酸と結合能を有するタンパク質とを反応させてヒ
   アルロン酸と結合能を有するタンパク質とＳＨＡＰ−Ｈ
   Ａ結合体との複合体を形成させ、この複合体を抗ＩＴＩ
   抗体と反応させて、抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結
   合体）−（ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク質）
   の複合体を形成させ、この複合体を測定することを特徴
   とする検体中の血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質
   −ヒアルロン酸結合体の測定方法。
3. 【請求項３】 ヒアルロン酸と結合能を有するタンパク
   質がヒアルロン酸結合性タンパク質およびヒアルロン酸
   受容体から選択される少なくとも１種のタンパク質であ
   る請求項２記載の測定方法。
4. 【請求項４】 ヒアルロン酸結合性タンパク質がヒアル
   ロン酸結合性プロテオグリカン、ヒアルロン酸結合性プ
   ロテオグリカンのコアタンパク質、リンクプロティン、
   ヒアルロネクチンおよびそれらタンパク質のヒアルロン
   酸結合領域を含む部分タンパク質よりなる群から選択さ
   れる少なくとも１種のタンパク質である請求項３記載の
   測定方法。
5. 【請求項５】 ヒアルロン酸受容体がＣＤ４４、そのヒ
   アルロン酸結合領域を含む部分タンパク質またはそれら
   の融合タンパク質である請求項３記載の測定方法。
6. 【請求項６】 抗ＩＴＩ抗体がＩＴＩの長鎖である HC1
   および／またはHC2と反応するポリクローナル抗体また
   はモノクローナル抗体である請求項１〜３のいずれかに
   記載の測定方法。
7. 【請求項７】 キットの構成成分として、抗ＩＴＩ抗体
   を含むことを特徴とし、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体
   と抗ＩＴＩ抗体とを結合させて抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡ
   Ｐ−ＨＡ結合体）の複合体を形成させ、ＳＨＡＰ−ＨＡ
   結合体を測定する方法に使用するための測定キット。
8. 【請求項８】 抗ＩＴＩ抗体がＩＴＩの長鎖である HC1
   および／またはHC2と反応するポリクローナル抗体また
   はモノクローナル抗体である請求項７記載の測定キッ
   ト。
9. 【請求項９】 請求項１〜６のいずれかの測定方法を用
   いて検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定し、それによ
   って関節炎を診断することを特徴とする関節炎の診断方
   法。
10. 【請求項１０】 請求項１〜６のいずれかの測定方法を
    用いて検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定し、それに
    よって肝疾患を診断することを特徴とする肝疾患の診断
    方法。
11. 【請求項１１】 検体が血液、血清または血漿である請
    求項９又は１０記載の診断方法。
12. 【請求項１２】 キットの構成成分として抗ＩＴＩ抗体
    を含み、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体と抗ＩＴＩ抗体
    とを結合させて抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合
    体）の複合体を形成させ、ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定
    することを特徴とする関節炎又は肝疾患の診断用キッ
    ト。