JPH1087621A - ルシゲニン化学発光の増強剤 - Google Patents
ルシゲニン化学発光の増強剤Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Other In-Based Heterocyclic Compounds (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ルシゲニン化学発光の増強剤を提供し、高感
度でイムノアッセイやＤＮＡプローブアッセイを可能に
する。 【解決手段】 式 【化１】 （式中、Ｘは水素原子又はーＣＳＮＨＲ基を表し、Ｒは
低級アルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
で示されるチオ尿素誘導体、これをルシゲニン化学発光
の増強剤として用い、その存在下にルシゲニン化学発光
により生体物質の検出を行う。
度でイムノアッセイやＤＮＡプローブアッセイを可能に
する。 【解決手段】 式 【化１】 （式中、Ｘは水素原子又はーＣＳＮＨＲ基を表し、Ｒは
低級アルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
で示されるチオ尿素誘導体、これをルシゲニン化学発光
の増強剤として用い、その存在下にルシゲニン化学発光
により生体物質の検出を行う。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ルシゲニン化学発
光の増強剤として用いうるチオ尿素誘導体、その化学発
光の増強剤としての用途及びその存在下で行う化学発光
による生体物質の検出法に関する。
光の増強剤として用いうるチオ尿素誘導体、その化学発
光の増強剤としての用途及びその存在下で行う化学発光
による生体物質の検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ルシゲニンの発光は、迅速かつ高感度で
生体物質を検出することができるため、イムノアッセイ
等の生体物質の検出に広く用いられている。従来ルシゲ
ニン発光を測定するには、下記反応式に示すように、ル
シゲニンがアルカリの存在下に、過酸化水素又はアスコ
ルビン酸、ジヒドロキシアセトン、グルコースのような
還元剤と反応し、ペルオキシドの中間体をへて、発光種
であるＮ−メチルアクリドンを生成し、これが励起状態
から基底状態に戻る過程での化学発光を利用している。
生体物質を検出することができるため、イムノアッセイ
等の生体物質の検出に広く用いられている。従来ルシゲ
ニン発光を測定するには、下記反応式に示すように、ル
シゲニンがアルカリの存在下に、過酸化水素又はアスコ
ルビン酸、ジヒドロキシアセトン、グルコースのような
還元剤と反応し、ペルオキシドの中間体をへて、発光種
であるＮ−メチルアクリドンを生成し、これが励起状態
から基底状態に戻る過程での化学発光を利用している。
【０００３】
【化２】
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、ルシゲニ
ンの発光強度を増強する各種物質を検討し、下記新規物
質であるチオ尿素誘導体の存在下では、ルシゲニンの発
光能を著しく増強することを見出し、本発明をなした。
ンの発光強度を増強する各種物質を検討し、下記新規物
質であるチオ尿素誘導体の存在下では、ルシゲニンの発
光能を著しく増強することを見出し、本発明をなした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明のルシゲニン発光
の増強剤は、次式（Ｉ）
の増強剤は、次式（Ｉ）
【０００６】
【化３】
【０００７】（式中、Ｘは水素原子又は−ＣＳＮＨＲ基
を表し、Ｒは低級アルキル基、アリール基又はアラルキ
ル基を表し、ｎは１又は２を表す）で示されるチオ尿素
誘導体である。
を表し、Ｒは低級アルキル基、アリール基又はアラルキ
ル基を表し、ｎは１又は２を表す）で示されるチオ尿素
誘導体である。
【０００８】上記式（Ｉ）において、Ｒが示すアルキル
基としては、メチル、エチルもしくはプロピルが挙げら
れ、Ｒがメチル又はエチルである化合物は最大の増強効
果を示す。アリール基としては、フェニルもしくは２−
ナフチル基が挙げられ、アラルキル基としては、ベンジ
ルが挙げられる。
基としては、メチル、エチルもしくはプロピルが挙げら
れ、Ｒがメチル又はエチルである化合物は最大の増強効
果を示す。アリール基としては、フェニルもしくは２−
ナフチル基が挙げられ、アラルキル基としては、ベンジ
ルが挙げられる。
【０００９】式（Ｉ）のチオ尿素誘導体は、次の反応式
に示すように、α−アミノ−ε−カプロラクタム又はα
−アミノ−δ−バレノラクタムにイソチオシアネート
（ＲＮＣＳ）を反応させることにより製造される。
に示すように、α−アミノ−ε−カプロラクタム又はα
−アミノ−δ−バレノラクタムにイソチオシアネート
（ＲＮＣＳ）を反応させることにより製造される。
【００１０】
【化４】
【００１１】本発明の式（Ｉ）のチオ尿素誘導体は、ル
シゲニンによる化学発光をＨ2 Ｏ２又は還元剤の存在下
に行う場合に比べて著しく増強することができる。
シゲニンによる化学発光をＨ2 Ｏ２又は還元剤の存在下
に行う場合に比べて著しく増強することができる。
【００１２】ルシゲニン１０−６Ｍ の溶液にチオ尿素
誘導体（Ｉ）を１mmol/L添加した場合の発光強度を表１
に示す。なお、発光強度の測定は１５秒間放置後の１０
秒間のカウントで示した。
誘導体（Ｉ）を１mmol/L添加した場合の発光強度を表１
に示す。なお、発光強度の測定は１５秒間放置後の１０
秒間のカウントで示した。
【００１３】
【表１】
【００１４】チオ尿素誘導体（Ｉ）の添加による発光経
時変化は、チオ尿素誘導体添加後直ちに極大に達し、そ
の後速やかに減少し、発光が極大に達する時間は、チオ
尿素誘導体の濃度が高くなるにつれて短縮された。発光
スペクトルはチオ尿素誘導体の添加においても、無添加
の場合と同じく、λmax ＝４３３nm及び４７３nmを示
し、Ｎ−メチルアクリドンを経由しており、チオ尿素誘
導体の添加による発光増強効果は発光反応の促進に寄与
しているものと考えられる。
時変化は、チオ尿素誘導体添加後直ちに極大に達し、そ
の後速やかに減少し、発光が極大に達する時間は、チオ
尿素誘導体の濃度が高くなるにつれて短縮された。発光
スペクトルはチオ尿素誘導体の添加においても、無添加
の場合と同じく、λmax ＝４３３nm及び４７３nmを示
し、Ｎ−メチルアクリドンを経由しており、チオ尿素誘
導体の添加による発光増強効果は発光反応の促進に寄与
しているものと考えられる。
【００１５】図１に示すように、ルシゲニン濃度を段階
希釈して、実施例１の化合物及び比較としてジヒドロキ
シアセトン（ＤＨＡ）又はＨ2 Ｏ2 を添加して測定した
ところ、実施例１の化合物は、１２×１０-11 〜１２×
１０-6 M発光強度との間に直線関係を示した。各点での
変動係数は６．８〜２．１％であった。この測定におけ
る検出限界は１２fmol（signal/noise＝Ｓ／Ｎ比＝３、
ｎ＝５）であった。この値はＨ2 Ｏ2 を用いた発光より
約１００倍高感度であった。
希釈して、実施例１の化合物及び比較としてジヒドロキ
シアセトン（ＤＨＡ）又はＨ2 Ｏ2 を添加して測定した
ところ、実施例１の化合物は、１２×１０-11 〜１２×
１０-6 M発光強度との間に直線関係を示した。各点での
変動係数は６．８〜２．１％であった。この測定におけ
る検出限界は１２fmol（signal/noise＝Ｓ／Ｎ比＝３、
ｎ＝５）であった。この値はＨ2 Ｏ2 を用いた発光より
約１００倍高感度であった。
【００１６】本発明のチオ尿素誘導体（Ｉ）を添加する
ルシゲニンの化学発光を測定する方法は、ルシゲニンを
化学発光剤として用いるイムノアッセイやＤＮＡプロー
ブアッセイ、あるいはルシゲニンを直接抗原やＤＮＡに
標識することによる分析方法も可能である。
ルシゲニンの化学発光を測定する方法は、ルシゲニンを
化学発光剤として用いるイムノアッセイやＤＮＡプロー
ブアッセイ、あるいはルシゲニンを直接抗原やＤＮＡに
標識することによる分析方法も可能である。
【００１７】イムノアッセイにおいては、マイクロタイ
タプレートに結合させた抗体に、測定対象の抗原を抗原
抗体反応させ、これにビオチン標識した抗体を反応させ
た後、アビジンを結合させ、次いでルシゲニン含包ビオ
チン標識リポソームを反応させる。結合したルシゲニン
含包ビオチン標識リポソームは本発明のルシゲニン化学
発光法によりルシゲニン測定を行う。すなわち抗原の存
在量に比例してルシゲニン含包リポソームが固相上に抗
体を介して結合するため、抗原濃度にしたがって発光量
が増大することになる。測定対象物質としては、生体成
分のＩｇＧ、ホルモン、ビタミン、更に薬物、細菌、ウ
イルスなどが挙げられる。
タプレートに結合させた抗体に、測定対象の抗原を抗原
抗体反応させ、これにビオチン標識した抗体を反応させ
た後、アビジンを結合させ、次いでルシゲニン含包ビオ
チン標識リポソームを反応させる。結合したルシゲニン
含包ビオチン標識リポソームは本発明のルシゲニン化学
発光法によりルシゲニン測定を行う。すなわち抗原の存
在量に比例してルシゲニン含包リポソームが固相上に抗
体を介して結合するため、抗原濃度にしたがって発光量
が増大することになる。測定対象物質としては、生体成
分のＩｇＧ、ホルモン、ビタミン、更に薬物、細菌、ウ
イルスなどが挙げられる。
【００１８】ＤＮＡプローブアッセイにおいては、測定
対象遺伝子に相補的にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチド（２０〜５０塩基）の５′末端にビオチンを化学
的に結合させたＤＮＡプローブを用意し、測定するＤＮ
Ａは生体の細胞あるいは血液中の白血球により抽出し、
マイクロタイタプレートに吸着させる。次いで上記ビオ
チン標識ＤＮＡプローブをハイブリダイゼーション反応
により特異的に結合させる。プレート上に結合したＤＮ
Ａプローブは、アビジンを介し、ルシゲニン含包ビオチ
ン標識リポソームを反応させた後、本発明のルシゲニン
化学発光により測定する。この場合も対象遺伝子の増加
と共に発光は増大することになる。対象遺伝子として
は、ガン遺伝子、ウイルス遺伝子、細菌の遺伝子やさら
にヒトの遺伝子などがある。
対象遺伝子に相補的にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチド（２０〜５０塩基）の５′末端にビオチンを化学
的に結合させたＤＮＡプローブを用意し、測定するＤＮ
Ａは生体の細胞あるいは血液中の白血球により抽出し、
マイクロタイタプレートに吸着させる。次いで上記ビオ
チン標識ＤＮＡプローブをハイブリダイゼーション反応
により特異的に結合させる。プレート上に結合したＤＮ
Ａプローブは、アビジンを介し、ルシゲニン含包ビオチ
ン標識リポソームを反応させた後、本発明のルシゲニン
化学発光により測定する。この場合も対象遺伝子の増加
と共に発光は増大することになる。対象遺伝子として
は、ガン遺伝子、ウイルス遺伝子、細菌の遺伝子やさら
にヒトの遺伝子などがある。
【００１９】
［実施例１］ α−（３−メチルチオウレイド）−ε−カプロラクタム
の合成 ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム１２．８ｇ
（０．１mole）をメタノール１００mlに溶かし、室温で
撹拌しながら、メチルイソチオシアネート８．８ｇ
（０．１２mole）を含むメタノール溶液２０mlを加え
た。５分後に白色沈殿が析出しはじめ、１５分撹拌後吸
引ろ取し、少量のメタノール、約５０mlの水、そして少
量のメタノールで順次洗浄した。乾燥後目的の白色析出
物１８．５ｇを得、エタノールから再結晶した。収量
９．５４ｇ（収率４７．４％）、ｍ．ｐ．１５６〜１５
７℃、ＵＶλ2-ProH max nm：２１１（１０．５００）、
２４１（１０．１００）、ＩＲ：１６５５cm-1（ＮＨＣ
Ｏ）。
の合成 ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム１２．８ｇ
（０．１mole）をメタノール１００mlに溶かし、室温で
撹拌しながら、メチルイソチオシアネート８．８ｇ
（０．１２mole）を含むメタノール溶液２０mlを加え
た。５分後に白色沈殿が析出しはじめ、１５分撹拌後吸
引ろ取し、少量のメタノール、約５０mlの水、そして少
量のメタノールで順次洗浄した。乾燥後目的の白色析出
物１８．５ｇを得、エタノールから再結晶した。収量
９．５４ｇ（収率４７．４％）、ｍ．ｐ．１５６〜１５
７℃、ＵＶλ2-ProH max nm：２１１（１０．５００）、
２４１（１０．１００）、ＩＲ：１６５５cm-1（ＮＨＣ
Ｏ）。
【００２０】［実施例２］ デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）−スルフェ
ートの測定 ルシゲニンとのイオン対抽出法によるＤＨＥＡ−スルフ
ェートの測定を次の方法で行った。発光測定装置はアロ
カ社製ルミネッセンスリーダＢＬＲ−３０１を使用し
た。１．５ml容のマイクロチューブに５０mmol/L炭酸ナ
トリウム溶液に溶解したルシゲニン１００μl に、各種
濃度のＤＨＥＡ−スルフェート１００μlを加え、１，
２−ジクロロエタン２００μl を加えて撹拌した。さら
に１分間遠心分離し、下層１００μl を試験管に移し、
窒素ガス気流下で溶媒を揮散した。残渣に水１．５mlを
加えて残渣を溶解した、その溶液を検体として、１０mm
ol/Lの実施例１の化合物１０μl を添加し、発光強度を
測定した。
ートの測定 ルシゲニンとのイオン対抽出法によるＤＨＥＡ−スルフ
ェートの測定を次の方法で行った。発光測定装置はアロ
カ社製ルミネッセンスリーダＢＬＲ−３０１を使用し
た。１．５ml容のマイクロチューブに５０mmol/L炭酸ナ
トリウム溶液に溶解したルシゲニン１００μl に、各種
濃度のＤＨＥＡ−スルフェート１００μlを加え、１，
２−ジクロロエタン２００μl を加えて撹拌した。さら
に１分間遠心分離し、下層１００μl を試験管に移し、
窒素ガス気流下で溶媒を揮散した。残渣に水１．５mlを
加えて残渣を溶解した、その溶液を検体として、１０mm
ol/Lの実施例１の化合物１０μl を添加し、発光強度を
測定した。
【００２１】ＤＨＥＡ−スルフェート１μmol/L から１
mmol/Lの間で定量的に測定が可能であった。検出限界は
５pmol（Ｓ／Ｎ比＝２）であった。
mmol/Lの間で定量的に測定が可能であった。検出限界は
５pmol（Ｓ／Ｎ比＝２）であった。
【００２２】一方、Ｈ2 Ｏ2 の存在下でルシゲニンを発
光させた場合の検出限界は２５pmolであった。これより
本発明の実施例１の化合物を添加することによりＤＨＥ
Ａ−スルフェートを高感度に測定することができた。
光させた場合の検出限界は２５pmolであった。これより
本発明の実施例１の化合物を添加することによりＤＨＥ
Ａ−スルフェートを高感度に測定することができた。
【００２３】［実施例３］ イムノアッセイ 抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体を
固相化した９６ウェルマイクロプレートに、被検検体５
０μl とビオチン標識した抗ＡＦＰモノクローナル抗体
１００μl を添加し、一晩インキュベートした。洗浄
後、２００μl のアビジン及びルシゲニン含包のビオチ
ン標識リポソーム混液（１：１）を加え、３７℃で３０
分間反応させた。
固相化した９６ウェルマイクロプレートに、被検検体５
０μl とビオチン標識した抗ＡＦＰモノクローナル抗体
１００μl を添加し、一晩インキュベートした。洗浄
後、２００μl のアビジン及びルシゲニン含包のビオチ
ン標識リポソーム混液（１：１）を加え、３７℃で３０
分間反応させた。
【００２４】洗浄後、２５０mmol/LＮａ2 ＣＯ3 １００
μl 及び１０mmol/L実施例１の化合物１０μl を加え、
１５秒後から１０秒間の発光を測定した。被検検体中の
ＡＦＰ濃度は、既知濃度のＡＦＰ標準品の発光強度から
作成した較正曲線より算出した。測定にはマイクロルー
マットＬＢ９６Ｐ（ベルトールド）を用いた。
μl 及び１０mmol/L実施例１の化合物１０μl を加え、
１５秒後から１０秒間の発光を測定した。被検検体中の
ＡＦＰ濃度は、既知濃度のＡＦＰ標準品の発光強度から
作成した較正曲線より算出した。測定にはマイクロルー
マットＬＢ９６Ｐ（ベルトールド）を用いた。
【００２５】ＡＦＰ測定系に実施例１の化合物を添加し
た系での検出限界は、０．０１ng/ml であり、無添加の
場合に比べて約１００倍感度が上昇した。
た系での検出限界は、０．０１ng/ml であり、無添加の
場合に比べて約１００倍感度が上昇した。
【００２６】［実施例４］ ＤＮＡプローブアッセイ 血液中の白血球より抽出したＤＮＡを１００mmol/Lリン
酸緩衝液で希釈し、被検検体として１００μl 加え、９
６ウェルのマイクロプレートに一晩物理吸着させた。マ
イクロプレートを洗浄後、ビオチン標識ＤＮＡプローブ
（この場合ビタミンＤレセプター、３００bp）のＤＮＡ
プローブ１００μl を加え、６５℃で一晩ハイブリダイ
ゼーション反応させた。洗浄後、アビジン及びルシゲニ
ン含包のビオチン標識リポソーム溶液（１：１）２００
μl を加え、３７℃で３０分間反応させた。
酸緩衝液で希釈し、被検検体として１００μl 加え、９
６ウェルのマイクロプレートに一晩物理吸着させた。マ
イクロプレートを洗浄後、ビオチン標識ＤＮＡプローブ
（この場合ビタミンＤレセプター、３００bp）のＤＮＡ
プローブ１００μl を加え、６５℃で一晩ハイブリダイ
ゼーション反応させた。洗浄後、アビジン及びルシゲニ
ン含包のビオチン標識リポソーム溶液（１：１）２００
μl を加え、３７℃で３０分間反応させた。
【００２７】洗浄後、２５０mmol/LＮａ2 ＣＯ3 １００
μl 及び１０mmol/L実施例１の化合物１０μl を加え、
１５秒後から１０秒間の発光を測定した。測定にはマイ
クロルーマットＬＢ９６Ｐ（ベルトールド）を用いた。
μl 及び１０mmol/L実施例１の化合物１０μl を加え、
１５秒後から１０秒間の発光を測定した。測定にはマイ
クロルーマットＬＢ９６Ｐ（ベルトールド）を用いた。
【００２８】ビタミンＤレセプター遺伝子測定系に実施
例１の化合物を添加した系での検出は、無添加の場合に
比べて１００倍感度が上昇した。
例１の化合物を添加した系での検出は、無添加の場合に
比べて１００倍感度が上昇した。
【図１】ルシゲニン化学発光における発光増強剤の検量
線を示す。
線を示す。
（１）α−（３−メチルチオウレイド）−ε−カプロラ
クタム （２）ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ） （３）Ｈ2 Ｏ２
クタム （２）ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ） （３）Ｈ2 Ｏ２
Claims (4)
- 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｘは水素原子又は−ＣＳＮＨＲ基を表し、Ｒは
低級アルキル基、アリール基又はアラルキル基を表し、
ｎは１又は２を表す）で示されるチオ尿素誘導体。 - 【請求項２】 Ｒがメチル基又はエチル基である、請求
項１記載のチオ尿素誘導体。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のチオ尿素誘導体か
らなるルシゲニン化学発光の増強剤。 - 【請求項４】 ルシゲニンを用いる化学発光による生体
物質の検出法において、請求項１又は２記載のチオ尿素
誘導体の存在下に発光させることを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24298996A JPH1087621A (ja) | 1996-09-13 | 1996-09-13 | ルシゲニン化学発光の増強剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24298996A JPH1087621A (ja) | 1996-09-13 | 1996-09-13 | ルシゲニン化学発光の増強剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1087621A true JPH1087621A (ja) | 1998-04-07 |
Family
ID=17097248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24298996A Pending JPH1087621A (ja) | 1996-09-13 | 1996-09-13 | ルシゲニン化学発光の増強剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1087621A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7108996B2 (en) | 2000-06-09 | 2006-09-19 | Promega Corporation | Method for increasing luminescence assay sensitivity |
| US7879540B1 (en) | 2000-08-24 | 2011-02-01 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
| US8008006B2 (en) | 2004-09-17 | 2011-08-30 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
-
1996
- 1996-09-13 JP JP24298996A patent/JPH1087621A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7108996B2 (en) | 2000-06-09 | 2006-09-19 | Promega Corporation | Method for increasing luminescence assay sensitivity |
| US7879540B1 (en) | 2000-08-24 | 2011-02-01 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
| US7906282B2 (en) | 2000-08-24 | 2011-03-15 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
| US8008006B2 (en) | 2004-09-17 | 2011-08-30 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
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