JPH1093A - アポトーシス誘導タンパク質およびそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アポトーシスを誘導するタンパク質、それを
コードする塩基配列、および悪性腫瘍治療剤の提供。 【解決手段】 プロテインキナーゼ触媒領域を有し、か
つＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナー
ゼ活性を亢進するタンパク質（ＡＳＫ１）またはその誘
導体。図はＡＳＫ１の発現によるアポトーシスの誘導を
示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本発明は、アポトーシス（細胞死）を誘導するタンパク
質およびこれをコードする遺伝子に関する。

【０００２】背景技術 Mitogen-activated protein （ＭＡＰ）キナーゼによる
シグナル伝達カスケードは、酵母から脊椎動物に至るま
でよく保存された細胞内シグナル伝達経路であり、ＭＡ
Ｐキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫ
Ｋ）およびＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）を含む
タンパク質キナーゼの３つの異なるメンバーより構成さ
れる（T. Sturgill & J. Wu, Biochim. Biophys. Acta.
1092, 350 (1991); E. Nishida & Y. Gotoh, Trends
Biochem. Sci., 18, 128 (1993);B. Errede & D. Levi
n, Curr. Opin. Cell Biol., 5, 254 (1993); C. Mars
hall, Curr. Opin. Genet. Dev., 4, 82 (1994)）。Ｍ
ＡＰＫＫＫはＭＡＰＫＫをリン酸化しこれによりＭＡＰ
ＫＫが活性化し、活性化型ＭＡＰＫＫはＭＡＰＫをリン
酸化しこれによりＭＡＰＫが活性化する。活性化された
ＭＡＰＫは細胞核へ移動し、転写因子の活性を調節し、
それによって種々の遺伝子発現が制御される（T. Sturg
ill & J. Wu, Biochim. Biophys. Acta. 1092, 350 (19
91); E. Nishida & Y. Gotoh, Trends Biochem. Sci.,
18, 128 (1993); B. Errede & D. Levin, Curr. Opi
n. Cell Biol., 5, 254 (1993); C. Marshall, Curr.
Opin. Genet. Dev., 4, 82 (1994)）。

【０００３】ＭＡＰＫシグナル伝達経路に関する知見の
最近の進歩によって、哺乳動物の細胞では少なくとも明
らかに異なる２種類のＭＡＰＫＫＫ−ＭＡＰＫＫ−ＭＡ
ＰＫシグナル伝達経路が機能していることが明らかにな
った（R. Davis, Trends Biochem. Sci., 19, 470 (199
4); A. Waskiewicz & J. Cooper, Curr. Opin. CellBi
ol., 7, 798 (1995); J. Kyriakis & J. Avruch, J. B
iol. Chem., 265, 17355 (1990); B. Derijard et a
l., Cell, 76, 1025 (1994); M. Yan et al.,Nature,
372, 798 (1994); K. Yamaguchi et al., Science 27
0, 2008 (1995);J. Kyriakis et al., Nature, 369, 15
6 (1994); I. Sanchez et al., Nature, 372, 794 (19
94); B. Derijard et al., Science, 267, 682 (199
5); S. Matsuda et al., J. Biol. Chem., 270, 12781
(1995)）。これらの２種類の経路はそれぞれ、Ｒａｆ
−ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫ経路およびＭＥＫＫ−ＳＥＫ１
（またはＭＫＫ４）−ＳＡＰＫ（またはＪＮＫ）経路よ
り成る。

【０００４】ＭＫＫ３／ＭＡＰＫＫ６（またはＭＫＫ
６；ＭＫＫ３に極めて近縁のタンパク質）およびｐ３８
タンパク質キナーゼは、それぞれＭＡＰＫＫおよびＭＡ
ＰＫの段階に相当するタンパク質キナーゼであり、これ
は別のＭＡＰＫシグナル伝達経路を形成していることが
知られている（R. Davis, Trends Biochem. Sci., 19,4
70 (1994); A. Waskiewicz & J. Cooper, Curr. Opin.
Cell Biol., 7, 798 (1995); J. Han et al., J. Bio
l. Chem., 271, 2886 (1996); J. Raingeaud etal., M
ol. Cell. Biol., 16, 1247 (1996) ; T. Moriguchi et
al., J. Biol.Chem, 271, 13675 (1996) ）。

【０００５】最近の研究より、ＳＡＰＫおよび／または
ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達カスケードが、
アポトーシスを誘導するシグナル伝達経路の少なくとも
一部に関係していることが示唆されている（Z. Xia et
al., Science, 270, 1326 (1995); Y.-R. Chen et a
l., J. Biol. Chem., 271, 631 (1996); N. Johnson e
t al., J. Biol. Chem., 271, 3229 (1996); M. Verhe
ij et al., Nature 380,75 (1996)）。ここで、アポト
ーシスは、壊死とは異なる細胞死、すなわち、プログラ
ム細胞死、を意味する。アポトーシスでは、ヌクレオソ
ームごとにＤＮＡが断片化され電気泳動で断片化したＤ
ＮＡが梯子状に観察できる。また、アポトーシスは、ガ
ンの退縮のみならず、自己免疫疾患、ＨＩＶ感染、神経
疾患、肝炎、白血病、腎疾患、皮膚疾患、眼疾患および
老化等にも関与していると考えられている（三浦正幸、
刀祢重信、木崎治俊編集「アポトーシス研究の最前
線」、実験医学Ｖｏｌ．１３（１９９５）。

【０００６】一方、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αは、強
力な細胞性アポトーシス開始物質として知られている。
最近、これらの細胞性アポトーシス開始物質によってＳ
ＡＰＫシグナル伝達系が活性化されることが示された
（J. Kyriakis et al., Nature372, 794 (1994); J. R
aingeaud et al., J. Biol. Chem., 270, 7420 (199
5)）。

【０００７】しかしながら、ＭＫＫ３−ｐ３８経路およ
びＳＥＫ１−ＳＡＰＫ経路の上流のＭＡＰＫＫＫに相当
するタンパク質や、該経路の活性化のメカニズム、更に
は、これらの経路を介したアポトーシスの機構について
は、本発明者らが知る限り報告されていない。

【０００８】

【発明の概要】今般、本発明者らは、ＳＥＫ１−ＳＡＰ
Ｋシグナル伝達経路ばかりでなくＭＫＫ３−ｐ３８シグ
ナル伝達経路をも活性化する、ＭＡＰＫＫＫに相当する
哺乳類の新規タンパク質（ＡＳＫ１）を同定した。ま
た、前炎症性サイトカインがＡＳＫ１を活性化し、活性
化されたＡＳＫ１がＳＥＫ１−ＳＡＰＫおよびＭＫＫ３
−ｐ３８シグナル伝達カスケードを介して細胞のアポト
ーシス誘導に関与することを見出した。また、本発明者
らは、ＡＳＫ１のドミナントネガティブ変異体がＴＮＦ
−αが誘導するアポトーシスを阻害することを見い出し
た。本発明はかかる知見に基づくものである。

【０００９】従って、本発明は、アポトーシス誘導タン
パク質およびそれをコードする塩基配列の提供をその目
的とする。また、本発明は、悪性腫瘍治療剤または悪性
腫瘍遺伝子治療剤の提供をその目的とする。更に、本発
明は、アポトーシス誘導タンパク質の部分ペプチドおよ
びアポトーシス誘導タンパク質と特異的に反応する抗体
の提供をその目的とする。

【００１０】そして、本発明によるアポトーシス誘導タ
ンパク質は、プロテインキナーゼ触媒領域を有し、かつ
ＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ
活性を亢進するタンパク質またはその誘導体、である。

【００１１】

【発明の具体的説明】定義 本発明において、「アミノ酸」とは、光学異性体、すな
わちＬ体およびＤ体、のいずれをも含む意味で用いられ
るものとする。従って、本発明において「タンパク質」
とは、Ｌ体のアミノ酸のみによって構成されているタン
パク質だけでなく、Ｄ体のアミノ酸を一部または全部含
むタンパク質をも意味するものとする。

【００１２】また、本発明において、「アミノ酸」と
は、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸
のみならず、それら以外のα−アミノ酸、並びにβ−、
γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等を含む意
味で用いられるものとする。従って、下記のようにタン
パク質において置換されるかまたはタンパク質中に挿入
されるアミノ酸としては、天然のタンパク質を構成する
２０種のα−アミノ酸だけに限定されることはなく、そ
れら以外のα−アミノ酸並びにβ−、γ−、δ−アミノ
酸および非天然のアミノ酸等であってもよい。このよう
なβ−、γ−またはδ−アミノ酸としては、β−アラニ
ン、γ−アミノ酪酸あるいはオルニチンが挙げられ、ま
た天然タンパク質を構成するもの以外のアミノ酸あるい
は非天然のアミノ酸としては、３，４−ジヒドロキシフ
ェニルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルグ
リシン、１，２，３，４−テトラハイドロイソキノリン
−３−カルボン酸あるいは二ペコチン酸等が挙げられ
る。

【００１３】タンパク質変異体の変異部位は、置換され
る前のアミノ酸残基（一文字表記）、置換されるアミノ
酸の位置、および置換された後のアミノ酸残基（一文字
表記）を連続して記載することで表した。例えば、「Ｋ
７０９Ｒ」は、７０９番目のアミノ酸残基であるＫ（Ly
s ：リジン）がＲ（Arg ：アルギニン）で置換されたア
ミノ酸配列を表す。

【００１４】本明細書において「タンパク質」とは、ペ
プチドを含む意味で用いられるものとする。また、本明
細書において「本発明によるタンパク質」というとき
は、その誘導体を含む意味で用いられるものとする。

【００１５】アポトーシス誘導タンパク質 本発明によるアポトーシス誘導タンパク質は、プロテイ
ンキナーゼ触媒領域を有し、かつＳＥＫ１キナーゼ活性
および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進するタンパ
ク質またはその誘導体である。アポトーシス誘導タンパ
ク質の起源は特に限定されず、ヒトを含むホ乳類由来の
ものであっても、それ以外を由来とするものであっても
よい。

【００１６】アポトーシス誘導タンパク質は、プロテイ
ンキナーゼ触媒領域を有する。本発明において、「プロ
テインキナーゼ触媒領域を有する」とは、実施例１と同
様の条件において解析した場合に、セリン／スレオニン
・プロテインキナーゼ触媒領域の存在が認められること
をいう。アポトーシス誘導タンパク質は、ＳＥＫ１キナ
ーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進す
る。本発明において、「ＳＥＫ１キナーゼ活性および／
またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進する」タンパク質と
は、実施例３、４および６と同様の条件において実験し
た場合に、ＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ
３キナーゼ活性の亢進が認められたと評価されるタンパ
ク質を意味するものとする。

【００１７】本発明によるタンパク質は、アポトーシス
を誘導するとの性質を有する。前記アポトーシスは、Ｓ
ＡＰＫもしくはＪＮＫおよび／またはｐ３８の活性の亢
進によって媒介されるものである。前記ＳＥＫ１キナー
ゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性亢進活性
は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）によって亢進する。ここ
で、腫瘍壊死因子としては、例えばＴＮＦαが挙げられ
る。

【００１８】本明細書において、「タンパク質の誘導
体」とは、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部、および／またはタンパク質のカルボキシル末端（Ｃ
末端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカル
ボキシル基の一部もしくは全部、および／または、タン
パク質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシ
ル基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミ
ド基等）の一部もしくは全部が、適当な他の置換基によ
って修飾を受けたものをいう。適当な他の置換基による
修飾は、例えば、タンパク質中に存在する官能基の保
護、安全性ならびに組織移行性の向上、あるいは活性の
増強等を目的として行われる。

【００１９】タンパク質の誘導体としては、具体的に
は、（１）タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部の水素原子が、置換または非置換のアルキル基（直
鎖、分岐鎖または環状であってもよい）（例えば、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブ
チル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロプロピル基、
シクロヘキシル基、ベンジル基）、置換または非置換の
アシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、カプロイ
ル基、シクロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フ
タロイル基、トシル基、ニコチノイル基、ピペリジンカ
ルボニル基）、ウレタン型保護基（例えば、ｐ−ニトロ
ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオ
キシカルボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシ
カルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基）またはウレ
ア型置換基（例えば、メチルアミノカルボニル基、フェ
ニルカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル
基）等によって置換されたもの、並びに（２）タンパク
質のカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基また
は各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全
部が、エステル型の修飾を受けているもの（例えば、そ
の水素原子がメチル、エチル、イソプロピル、シクロヘ
キシル、フェニル、ベンジル、ｔ−ブチル、４−ピコリ
ルにより置換されたもの）、アミド型の修飾を受けてい
るもの（例えば、非置換アミド、Ｃ１−Ｃ６アルキルア
ミド（例えば、メチルアミド、エチルアミド、イソプロ
ピルアミド）を形成しているもの、並びに（３）タンパ
ク質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル
基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミノ
基等）の一部もしくは全部が、上述のアミノ基と同様の
置換基あるいはトリチル基などで修飾されたもの等が挙
げられる。

【００２０】本発明によるタンパク質の例としては、配
列番号１のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１のア
ミノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および／また
は挿入され、および／または前記配列番号１のアミノ酸
配列の１以上のアミノ酸が置換および／または欠失され
たタンパク質であって、プロテインキナーゼ活性を有
し、かつＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３
キナーゼ活性を亢進するものが挙げられる。すなわち、
ここにいう付加(addition)、挿入(insertion) 、置換(s
ubstitution)、および欠失(deletion)とは、配列番号１
のアミノ酸配列からなるタンパク質のプロテインキナー
ゼ活性並びにＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫ
Ｋ３キナーゼ活性を亢進する性質を損なわない（not da
mage）ようなものをいう。

【００２１】本発明によるタンパク質は、ＳＥＫ１キナ
ーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進す
る、との性質を有する。また、ＳＥＫ１およびＭＫＫ３
はアポトーシスに関与していることが知られている。従
って、本発明によるタンパク質は、アポトーシスの機構
解明に有用である。

【００２２】本発明によれば、配列番号１のアミノ酸配
列からなり、プロテインキナーゼ活性を損なうように配
列番号１のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加
および／または挿入され、および／または配列番号１の
アミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換および／または
欠失されたタンパク質またはその誘導体（ドミナントネ
ガティブ変異体）が提供される。

【００２３】このタンパク質は、プロテインキナーゼ触
媒活性領域を有し、かつＳＥＫ１キナーゼ活性および／
またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進するタンパク質をプ
ロテインキナーゼ活性を損なうように改変することによ
って得られる。

【００２４】この改変タンパク質は、後記実施例におい
て示されるようにＴＮＦ−αによって引き起こされるア
ポトーシスを阻害する。従って、該改変タンパク質は、
ＡＳＫ１が関与する生命現象の解明に用いることができ
る。

【００２５】このような置換の例としては、Ｋ７０９Ｒ
が挙げられる。

【００２６】塩基配列 本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードする
塩基配列が提供される。本発明によるタンパク質をコー
ドする塩基配列の典型的配列は、配列番号２に記載され
るＤＮＡ配列の一部または全部を有するものである。な
お、本明細書において塩基配列とは、ＤＮＡ配列および
ＲＮＡ配列のいずれをも意味するものとする。

【００２７】前記改変アミノ酸配列が与えられれば、そ
れをコードする塩基配列は容易に定まり、配列番号１に
記載されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を
選択することができる。従って、本発明によるタンパク
質をコードする塩基配列とは、配列番号２に記載のＤＮ
Ａ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコー
ドする配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列
として有する配列をも意味するものとする。更にこの塩
基配列は、これらに対応するＲＮＡ配列も含む。

【００２８】本発明による塩基配列は、天然由来のもの
であっても、全合成したものであってもよい。また、天
然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであっ
てもよい。ＤＮＡの典型的な取得方法としては、染色体
ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工
学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配
列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用
いてスクリーニングを行う方法、等が挙げられる。

【００２９】本発明によるタンパク質をコードする塩基
配列としては、例えば、配列番号２に記載されるＤＮＡ
配列の２６８〜４３９２番の配列（オープンリーディン
グフレームに相当）からなる配列が挙げられる。

【００３０】ベクターおよび形質転換された宿主細胞 本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、宿主
細胞内で複製可能でかつその塩基配列がコードするタン
パク質を発現可能な状態で含んでなるベクターが提供さ
れる。更に、本発明によれば、このベクターによって形
質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクタ
ー系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合
タンパク質発現系などを用いることができる。融合タン
パク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトース結合タンパ
ク質）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラー
ゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、Ｈｉｓ（ヘキサヒスチ
ジン）、ｍｙｃ、Ｆａｓ等を用いたものが挙げられる。

【００３１】ベクターとしては、プラスミドベクター
（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞動物細胞等での発
現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイ
ウイルスベクター、ＨＩＶベクター、ワクシニアウイル
スベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニ
ックリポソームベクター）等が挙げられる。

【００３２】本発明によるベクターは、これを実際に宿
主細胞に導入して所望のアミノ酸配列を発現させるため
には、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を
制御する配列や微生物、昆虫細胞または動物培養細胞等
を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいてもよ
い。また、このベクターは、本発明による塩基配列を反
復した形で（例えば、タンデムリピートで）含んでいて
もよい。これらは常法に従いベクターに存在させてよ
く、このベクターによる微生物、昆虫細胞または動物培
養細胞等の形質転換の方法も、この分野で慣用されてい
るものを用いることができる。

【００３３】本発明によるベクター構築の手順および方
法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いる
ことができる。また、宿主細胞としては、例えば、大腸
菌、酵母、昆虫細胞、並びにＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯ
Ｓ７細胞）、ミンク肺上皮細胞（例えば、Ｍｖ１Ｌ
ｕ）、リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細
胞、および腫瘍細胞等のような動物細胞が挙げられる。

【００３４】上記形質転換された宿主細胞を適当な培地
で培養し、その培養物から本発明によるタンパク質を得
ることができる。従って、本発明の別の面によれば、本
発明によるタンパク質の製造法が提供される。形質転換
された宿主細胞の培養およびその条件は、使用する細胞
についてのそれと本質的に同様であってよい。また、培
養液からの本発明によるタンパク質の回収、精製も常法
に従って行うことができる。

【００３５】形質転換される細胞が例えばガン患者体内
のガン細胞（例えば、白血病細胞、消化器ガン細胞、肺
ガン細胞、スイ臓ガン細胞、卵巣ガン細胞、子宮ガン細
胞、メラノーマ細胞、脳腫瘍細胞等）であるときは、そ
の前記の本発明による塩基配列を含むベクターをヒトを
含む生体内のガン細胞に適当な方法によって導入し、本
発明によるタンパク質を発現させることにより、悪性腫
瘍等について遺伝子治療を行うことができる。例えば、
本発明によるタンパク質がヒトを含む生体内、特に、悪
性腫瘍細胞、で発現されることにより、アポトーシスが
誘導され、その結果として悪性腫瘍が退縮し、悪性腫瘍
を治療することができると考えられる（後記実施例５参
照）。

【００３６】遺伝子治療用のベクターについては、高久
史磨監修の実験医学（増刊号）第１２巻、第１５号「遺
伝子治療の最前線」（１９９４年）を参照することがで
きる。

【００３７】用途／医薬組成物 本発明によるタンパク質は、プロテインキナーゼ触媒領
域を有し、かつＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭ
ＫＫ３キナーゼ活性を亢進する（実施例３および４）。
また、本発明によるタンパク質は、不死化細胞のアポト
ーシスを誘導する（実施例５）。従って、本発明による
タンパク質は、悪性腫瘍の形成および／または転移の抑
制に有効であると考えられる。

【００３８】従って、本発明によるタンパク質は、悪性
腫瘍治療剤として用いることができる。ここで、悪性腫
瘍としては、例えば、前記ガン細胞が挙げられる。

【００３９】本発明による悪性腫瘍治療剤は、また、経
口または非経口投与（例えば、筋注、静注、皮下投与、
直腸投与、経皮投与、経鼻投与など）、好ましくは経口
投与することができ、薬剤として経口または非経口投与
に適した種々の剤型で、ヒトおよびヒト以外の動物に使
用される。

【００４０】悪性腫瘍治療剤は、例えばその用途に応じ
て、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、
トローチ錠などの経口剤、静注および筋注などの注射
剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などのいずれ
かの製剤形態に調製することができる。これらの各種製
剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿
潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝
剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化
剤、安定化剤などを用いて常法により製造することがで
きる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば
乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネ
シウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン
酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチル
セルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレン
グリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノ
ール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウ
ム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどが挙げられ
る。

【００４１】薬剤中における本発明のタンパク質の含有
量はその剤形に応じて異なるが、通常全組成物中約０．
１〜約５０重量％、好ましくは約１〜約２０重量％濃度
である。

【００４２】悪性腫瘍の治療のために必要な投与量は、
用法、患者の年齢、性別、症状の程度などを考慮して適
宜決定されるが、通常成人１日当り約０．１〜約５００
ｍｇ、好ましくは約０．５〜約５０ｍｇ程度とするのが
よく、これを１日１回または数回に分けて投与すること
ができる。

【００４３】本発明によるタンパク質をコードする塩基
配列は、これを有する前記ベクターを用いて標的細胞を
形質転換し、悪性腫瘍の形成および／または転移を抑制
する様な態様で用いることができる。すなわち、該塩基
配列は悪性腫瘍遺伝子治療剤（以下、単に「遺伝子治療
剤」ということがある）として用いることができる。遺
伝子治療剤の投与方法、有効投与量、および含んでいて
もよい担体等は悪性腫瘍治療剤のそれに準ずることがで
きる。

【００４４】本発明による遺伝子治療剤は、ＨＶＪリポ
ソーム法（金田，実験医学，Vol.12No.2, 78(184)，199
4および森下等，実験医学， Vol.12 No.15 158(1928),1
994）、本発明による塩基配列を注射等によってそのま
ま投与する方法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃によ
る方法（T. M. Klein et al., Bio/Technology 10, 286
-291(1992)) 、リポフェクション法によって投与する方
法（Nabel et al.：Science 244 ,1285,1990)、適当な
ベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ関
連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワク
シニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等）
を使う方法等によって、ヒトを含むほ乳類やその他の動
物に投与することができる。

【００４５】本発明による遺伝子治療剤は、局所的また
は一時的なアポトーシスの誘導の点から、ＡＳＫ１が生
体内に一過的（transient ）に存在する様な態様で投与
することが好ましい。このような態様としては、本発明
による塩基配列を注射等によってそのまま投与する方
法、リポフェクション法、ＨＶＪリポソーム法、アデノ
ウイルスベクターを用いた方法、ワクシニアウイルスベ
クターを用いた方法のような非経口投与が挙げられる。

【００４６】本発明による別の面によれば、本発明によ
るタンパク質または塩基配列の使用、特に、本発明によ
る治療剤の製造における使用および本発明による治療剤
としての使用、が提供される。

【００４７】本発明による更に別の面によれば、本発明
によるタンパク質または塩基配列を投与することを含ん
でなる、悪性腫瘍に罹ったヒトを含むほ乳類やその他の
動物の治療法が提供される。この場合の有効投与量、投
与方法、および投与形態等は、前記に準ずることができ
る。

【００４８】ペプチドおよび抗体 本発明によれば、配列番号１の６５４〜６６９番のアミ
ノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１の６５４
〜６６９番のアミノ酸配列を含んでなるペプチドが提供
される。

【００４９】配列番号１の６５４〜６６９番のアミノ酸
配列を含んでなるペプチドとしては、該アミノ酸配列の
Ｎ末端および／またはＣ末端に任意のアミノ酸配列を付
加したペプチドが挙げられ、これには本発明によるタン
パク質も含まれる。

【００５０】このペプチドは、本発明によるタンパク質
に対する抗体を得るための抗原として用いることができ
る。また、本発明によるタンパク質は、前述のようにア
ポトーシスの機構に密接に関与している。従って、本発
明によるペプチドは、これらの機構の解明等に有用であ
る。

【００５１】本発明によれば、前記ペプチドと特異的に
反応する抗体が提供される。本発明において、抗体とし
ては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が
挙げられる。

【００５２】本発明による抗体は、当業界において通常
用いられる方法によって製造することができる。例え
ば、配列番号１に記載される前記ペプチドを、任意の担
体（例えば、ウシ血清アルブミン）とともに動物体内
（例えば、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ヒツジ）に
注射し、一定期間の後に、その動物の血清を精製するこ
とによって得ることができる。

【００５３】本発明によるペプチドは、本発明によるタ
ンパク質のアミノ酸配列の一部である。従って、本発明
による抗体の特異的な反応（すなわち、免疫交差反応）
は、本発明によるタンパク質の存在の１つの指標とな
る。

【００５４】従って、本発明のもう一つの面によれば、
本発明による抗体と特異的に反応するタンパク質、およ
び本発明によるタンパク質であって上記抗体と特異的に
反応するもの、が提供される。

【００５５】

【実施例】実施例１ ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Ｐ
ＣＲ）法によるＡＳＫ１ ｃＤＮＡのクローニングとＡ
ＳＫ１のアミノ酸配列の決定 （１）ｃＤＮＡの単離 P. ten Dijke et al., Oncogene, 8, 2879 (1993) 、P.
Franzen et al., Cell, 75, 681 (1993) 、およびP. t
en Dijke et al., Science, 264, 101 (1994)に記載の
方法に従って、degenerate PCR-based strategy を用い
て新規のセリン／スレオニン・キナーゼｃＤＮＡの取得
を試みた。その結果、受容体型セリン／スレオニン・キ
ナーゼのファミリーとともに、より遠縁の機能不明のタ
ンパク質キナーゼをコードするヒトｃＤＮＡ断片が幾つ
か得られた。

【００５６】まず、セリン／スレオニン・キナーゼ・フ
ァミリーの保存されたサブドメインＶＩＩおよびＶＩＩ
Ｉ（S. Hanks et al., Science, 241, 42 (1988)）を由
来とするＰＣＲプライマーのセットを用いてＰＣＲ断片
を得た。これを用いて、相当するほとんど全長のｃＤＮ
Ａクローンを単離した（以下、このｃＤＮＡにコードさ
れるセリン／スレオニン・キナーゼを、その特徴によ
り、ａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆ ＳＥＫ１ ａｎｄ ＭＫ
Ｋ３（ＡＳＫ１）と呼ぶ）。

【００５７】具体的には、オリゴ（ｄＴ）を用いてプラ
イムすることにより増幅したλｇｔ１１ ヒト赤白血病
細胞（ＨＥＬ細胞）由来ｃＤＮＡライブラリー（M. Pon
cz et al., Blood, 69, 219 (1987)）を^３２Ｐ−標識Ｐ
ＣＲ断片でスクリーニングした。ハイブリダイゼーショ
ンおよび陽性のバクテリオファージの精製はH. Ichijo
et al., J. Biol. Chem., 268, 14505 (1993) に記載の
方法に従って実施した。塩基配列の決定は、シーケナー
ゼＤＮＡシーケンシング・キット（U. S. Biochemical
Corp. ）を用いて、両方のストランドについて実施し
た。得られた１８クローンの中から、最も長い３つのク
ローン（クローン２０、２７および７２）について完全
に塩基配列を決定した。クローン７２の配列は、オープ
ン・リーディング・フレームの中間付近から始まりポリ
Ａのストレッチまで伸長して終結していた。クローン２
０および２７の配列は、ＡＳＫ１ ｃＤＮＡの５′末端
部分をカバーし、クローン７２とオーバーラップする部
分は配列がそれと完全に一致した。クローン２０および
クローン７２を合わせることにより、ＡＳＫ１ ｃＤＮ
Ａ配列が４５３３塩基対の配列からなり、２６８番目の
塩基で始まるＡＴＧコドンに続いて４１２５塩基対のオ
ープン・リーディング・フレームを含み、このオープン
・リーディング・フレームには１３７５のアミノ酸から
なるタンパク質がコードされ（図１）、このタンパク質
（ＡＳＫ１タンパク質）の推定分子量は１５４，７１５
Ｄａであることがわかった。

【００５８】一方、クローン２０の３７５番目のアミノ
酸に相当する部位からオープン・リーディング・フレー
ムが始まるもうひとつのクローン（クローン２７）が得
られた。クローン２７は、ＡＳＫ１ ｃＤＮＡの８０５
〜８０８番目の４塩基が欠失しているために、イン・フ
レームで上流にストップ・コドンが形成されていた。

【００５９】ＡＳＫ１のセリン／スレオニン・キナーゼ
領域はＡＳＫ１タンパク質の中間に見出され、Ｎ末側と
Ｃ末側に長いフランキング配列が存在していた（図
１）。また、ＲＮＡブロット解析を行った結果、５キロ
塩基の単一転写産物が、様々なヒト組織に発現している
ことがわかった（図３）。様々なヒト組織からのｍＲＮ
Ａ（クロンテック社）を用いたブロットは、ランダム・
プライミングすることによって標識したＡＳＫ１ ｃＤ
ＮＡをプローブとして実施した。

【００６０】（２）データ・ベースによるホモロジー検
索 キナーゼ領域の外側のＡＳＫ１配列を用いてデータ・ベ
ース・サーチを実施した結果、Ｎ末端の短いアミノ酸配
列に、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）型のペプ
チジル・プロリル シス−トランス・イソメラーゼに見
られるモチーフが存在していた（図１、下線部分）。対
照的に、ＡＳＫ１のキナーゼ領域には、ＭＡＰＫＫＫフ
ァミリーのメンバーのキナーゼ領域と明らかな配列のホ
モロジーが認められた。そのホモロジーの程度は、哺乳
類のＭＥＫＫ１とは３０．０％、出芽酵母（Saccharomy
ces cerevisiae）のＳＳＫ２およびＳＴＥ１１とはそれ
ぞれ３２．３％および３０．４％であった。

【００６１】系統進化学的な比較を行なったところ、Ａ
ＳＫ１は、哺乳類のＭＡＰＫＫＫ（ＲＡＦ−１、ＫＳＲ
−１、ＴＡＫ−１およびＴＰＬ−２）とかなり遠縁のタ
ンパク質であるが、酵母のＭＡＰＫＫＫタンパク質であ
り酵母のＨＯＧ１ ＭＡＰＫ（T. Maeda et al., Scien
ce, 269, 554 (1995) ）の上流の調節タンパク質である
ＳＳＫ２／ＳＳＫ２２ファミリーに最も類縁性が高いこ
とがわかった（図２）。

【００６２】ＡＳＫ１のキナーゼ領域と他のＭＡＰＫＫ
Ｋのキナーゼ領域との間のアミノ酸配列比較はレーザー
ジーン・プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ社）のクラスタル
（clustal ）・コンピュータ・アラインメント・プログ
ラム（D. Higgins & P. Sharp, Comput. Appl. Biosc
i., 5, 151 (1989) ）を用いて実施した。

【００６３】実施例２ 酵母を用いたＡＳＫ１キナーゼ
活性の分子遺伝学的な解析 ＡＳＫ１と酵母ＭＡＰＫＫＫであるＳＳＫ２／ＳＳＫ２
２では、全体的な構造に差異（即ち、ＳＳＫ２やＳＳＫ
２２のキナーゼ領域はこれらのタンパク質の最もＣ末端
部分に位置する（T. Maeda et al., Science, 269, 554
(1995) ）がある。しかしながら、前述のようにＡＳＫ
１はＳＳＫ２／ＳＳＫ２２と類縁性が高いことから、Ａ
ＳＫ１が酵母でキナーゼとして機能し、それによって酵
母のＭＡＰＫＫＫの欠損を相補するという可能性がある
と考え、これについて検討した。

【００６４】まず、ＡＳＫ１をコードするｃＤＮＡを酵
母発現ベクターｐＮＶ１１（H. Shibuya et al., Natur
e, 357, 700 (1992)）中に導入し、 通常のＹＰＤ培地
では生育できるが高浸透圧培地では生育できない酵母変
異株ＴＭ２５７−Ｈ１（ｓｓｋ２Δ ｓｓｋ２２Δ ｓ
ｈｏ１Δ）（T. Maeda et al., Science, 269, 554 (19
95) ）において、ＡＳＫ１が、ＳＳＫ２またはＳＳＫ２
２ ＭＡＰＫＫＫのシグナルの欠損を回復させることが
できるかどうかについて検討した。因みに、ＳＨＯ１
は、ＳＨ３領域を含む膜貫通浸透圧センサーであり、Ｓ
ＳＫ２／ＳＳＫ２２とは独立的に、ＨＯＧ１活性化を介
して高浸透圧に対する種々の応答を導くもうひとつのシ
グナル経路に関係している。ＳＨＯ１、ＳＳＫ２または
ＳＳＫ２２に単一の変異もしくは２つの変異を有する変
異株は高浸透圧培地に抵抗性を示す。しかしながら、Ｓ
ＨＯ１、ＳＳＫ２およびＳＳＫ２２を同時に破壊する
と、高浸透圧培地で酵母が生育できなくなることがわか
っている。

【００６５】そこで、形質転換体が１．５Ｍのソルビト
ール存在下で生育できるかどうかについて試験した（図
４）。具体的には、５つの独立した形質転換体を選択
し、１．５Ｍ ソルビトール存在下または非存在下でＹ
ＰＤプレート上で生育させた。図４は、６日間、３０℃
で生育させた後にプレートを撮影した写真である。ｐＮ
Ｖ１１ベクター単独またはＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）（Ｌ
ｙｓ７０９をＡｒｇに置換することによってキナーゼ触
媒活性を不活性化した変異ＡＳＫ１）ベクターを用いて
形質転換して得た形質転換体も同時にテストした。

【００６６】その結果、ＡＳＫ１を発現させると、ＴＭ
２５７−Ｈ１が高浸透圧環境で生育できるようになった
が、ベクターだけを発現させた場合やＡＳＫ１（Ｋ７０
９Ｒ）を発現させた場合には、ＴＭ２５７−Ｈ１が高浸
透圧環境で生育できるようにならなかった（図４）。Ａ
ＳＫ１はＰＢＳ２（ＳＨＯ１、ＳＳＫ２およびＳＳＫ２
２の下流の標的タンパク質（Maeda, T. et al., Scienc
e 269, 554 (1995) ）が変異した酵母株では浸透圧応答
を相補できなかった（データ省略）。このことより、Ｔ
Ｍ２５７−Ｈ１で観察されたＡＳＫ１活性はＰＢＳ−Ｈ
ＯＧ１シグナル経路によってメディエートされるが、Ｈ
ＯＧ１活性化以外の別の経路によってはメディエートさ
れないことが強く示唆された。

【００６７】これらの結果と、酵母のＨＯＧ１に相当す
る哺乳類カウンターパートがｐ３８ＭＡＰキナーゼであ
るという事実（J. Rouse et al., Cell, 78, 1027 (199
4); J. Han et al., Science, 265, 808 (1994); J.
Lee et al., Nature 372,739 (1994)）とによって、Ａ
ＳＫ１は新規の哺乳類ＭＡＰＫＫＫであって、ＭＫＫ３
をリン酸化することによりＭＫＫ３−ｐ３８のシグナル
伝達経路の活性化にかかわっていることが示唆された。

【００６８】実施例３ 哺乳類細胞を用いたＡＳＫ１キ
ナーゼ活性の細胞生物学的な解析 ＡＳＫ１が哺乳類の細胞でＭＡＰＫＫＫとして機能する
かどうかを検討するために、ＡＳＫ１プラスミドを既知
のＭＡＰＫおよびＭＡＰＫＫ発現プラスミドとともに、
ＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした（図５）。Ｍ
ＡＰＫおよびＭＡＰＫＫのコンストラクトには全てヘマ
グルチニン（ＨＡ）−エピトープ−タグを付加し、これ
らをＡＳＫ１とともに、またはＡＳＫ１なしに発現さ
せ、抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降した。具体的には、下
記に記載した方法に従って実施した。

【００６９】アフリカツメガエル（Xenopus ）のＭＡＰ
Ｋ（Y. Gotoh et al., EMBO J., 10, 2661 (1991) ）お
よびアフリカツメガエルＭＡＰＫＫ（H. Kosako et a
l., EMBO J., 12, 787 (1993) ）のｃＤＮＡは、過去に
記載の方法に従ってクローニングした。ラットＳＡＰＫ
α（ J. Kyriakis et al., Nature, 369, 156 (199
4)）、ヒトｐ３８（J. Han et al., Biochim. Biophys.
Acta. 1265, 224 (1995) ）、マウスＳＥＫ１（I. San
chez et al., Nature, 372, 794 (1994)）およびヒトＭ
ＫＫ３（B. Derijard et al., Science, 267, 682 (199
5)）のコーディング領域はＰＣＲ法によって増幅した。
ＨＡ−タグを哺乳類用発現ベクターｐＳＲα４５６（Y.
Takebe et al., Mol. Cell. Biol., 8, 466 (1988) ）
のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位中に導入することによっ
て、ｐＳＲα−ＨＡ１を構築した。ＭＡＰＫ、ＳＡＰＫ
α、ｐ３８、ＭＡＰＫＫ、ＳＥＫ１、およびＭＫＫ３の
ｃＤＮＡを、ｐＳＲα−ＨＡ１のＢｇｌＩＩ部位中にサ
ブクローニングした。ＡＳＫ１ｃＤＮＡは別の哺乳類用
発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）中に
導入した。一過的に発現させるために、ＣＯＳ７細胞を
製造業者（ライフ・テクノロジー社）の使用説明書に従
って、リポフェクトアミンを用いてトランスフェクトし
た。抽出液を調製するために、バッファー溶液（２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２ｍＭ β−
グリセロホスフェート、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ
ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＮａＦ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、０．５％ デオキシコレート、３ｍＭ ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ バナジン酸ナト
リウム、１ｍＭ フェニルメチルスルホニル・フルオラ
イド（ＰＭＳＦ）、２０μｇ／ｍｌ アプロチニン）中
で細胞をリシスした。細胞抽出液を１５，０００×ｇで
１０分間遠心分離して懸濁を除いた。

【００７０】免疫沈降を行なうために、上清を抗ＨＡモ
ノクローナル抗体（１２ＣＡ５）とともに、１時間、４
℃でインキュベートした。プロテインＡ−セファロース
（ファルマシア・バイオテク社）を添加した後、ライゼ
ートをさらに１時間インキュベートした。ビーズを、溶
液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ トリトン
Ｘ−１００、２ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）を用い
て２回洗浄した後、溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＧ
ＴＡ、２ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）を用いてさら
に２回洗浄した後、キナーゼ・アッセイにかけた。

【００７１】沈降させた免疫複合体をリン酸化アッセイ
にかけた。アッセイに際しては、基質タンパク質を外か
ら加えた。ここで用いた基質タンパク質は、ＭＡＰＫに
対してはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（シグマ
社）、ＳＡＰＫに対してはｃ−Ｊｕｎ、ｐ３８に対して
はＡＴＦ−２、ＭＡＰＫＫに対してはキナーゼ・ネガテ
ィブＭＡＰＫ、ＳＥＫ１およびＭＫＫ３に対してはキナ
ーゼ・ネガティブｐ３８（ＭＰＫ２）とした。ここで用
いたＡＴＦ２は過去に記載の方法（S.Gupta etal.,Scie
nce 267,389-393(1995)）に従って調製した。ヘキサヒ
スチジン（Ｈｉｓ）−タグを融合したｃ−Ｊｕｎ（S. M
atsuda et al., J. Biol. Chem., 270,12781 (1995)）
およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）を融合したキナーゼ・ネガティブのアフリカツメガ
エルＭＡＰＫ（Ｋ５７Ｄ）はH. Kosako et al., EMBO
J., 12, 787 (1993) に記載の方法に従って調製した。
ヒトｐ３８に対するアフリカツメガエルのカウンターパ
ートであるＭＰＫ２（J. Rouseet al., Cell, 78, 1027
(1994)）は、ＳＥＫ１およびＭＫＫ３の基質タンパク
質としてアッセイに使用した。

【００７２】Ｈｉｓ−タグと融合したキナーゼ・ネガテ
ィブのＭＰＫ２（Ｋ５４Ｒ）はT. Moriguchi et al.,
J. Biol. Chem., 270, 12969 (1995)に記載の方法に従
って調製した。ＭＢＰ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、キナー
ゼ・ネガティブＭＡＰＫおよびキナーゼ・ネガティブＭ
ＰＫ２をリン酸化する活性を測定するために、免疫複合
体を、それぞれの基質タンパク質（各３μｇ）ととも
に、最終量２５μｌの溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００μＭ
［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（０．３μＣｉ））中で３０分
間、３０℃でインキュベートした。反応は、Laemmli's
サンプル・バッファーの添加後、煮沸することによって
停止した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡ
ＧＥ）を行なった後、これらのタンパク質のリン酸化を
イメージ・アナライザー（ＦｕｊｉＸＢＡＳ２０００）
を用いて定量した。

【００７３】その結果、ＡＳＫ１の発現によって、ＳＡ
ＰＫおよびｐ３８ ＭＡＰキナーゼはそれぞれ７．６倍
および５．０倍活性化された。ＭＡＰＫでは極めて弱い
活性化しか観察されなかった（図５）。また、ＡＳＫ１
によって、ＭＫＫ３およびＳＥＫ１はそれぞれ１１．８
倍および７．０倍まで活性化された。これに対してＭＡ
ＰＫＫの活性化は全く検出されなかった（図５）。

【００７４】実施例４ インビトロでの組換えタンパク
質を用いたカップル・キナーゼ・アッセイ 図５で観察されたＭＫＫ３の活性化がＡＳＫ１による直
接的な効果かどうかを検討するため、組換えＳＥＫ１、
ＭＫＫ３、ＭＡＰＫＫ６および組換えキナーゼ・ネガテ
ィヴｐ３８（ＭＰＫ２）タンパク質を用いてインビトロ
・キナーゼ・アッセイを実施した。本実施例では、実施
例３に記載の方法に準じて、ＣＯＳ７細胞中に発現させ
たＡＳＫ１を抗ＡＳＫ１ポリクローナル抗体を用いて免
疫沈降させ、免疫複合体をＡＳＫ１酵素標品とした。免
疫沈降に用いた抗ＡＳＫ１ポリクローナル血清は、ＡＳ
Ｋ１のアミノ酸６５４〜６６９に相当するペプチド配列
（ＴＥＥＫＧＲＳＴＥＥＧＤＣＥＳＤ）に対するもの
で、H. Ichijo et al., J. Biol. Chem., 270, 7420 (1
995)に記載の方法に従って、グルタルアルデヒド法を用
いてKeyhole limpet hemocyanin とカップルさせ、Freu
nd's adjuvant と混合し、ウサギを免疫して作製したも
のである。この免疫複合体とともに、組換え型ＳＥＫ
１、ＭＫＫ３、ＭＡＰＫＫ６と組換え型キナーゼ・ネガ
ティブｐ３８タンパク質を用いて、下記に記載する方法
に従って、カップル・キナーゼ・アッセイを実施した。

【００７５】Y. Gotoh et al., Oncogene, 9, 1891 (19
94) に記載の方法に従って、Ｈｉｓ−タグを付加したア
フリカツメガエルＭＡＰＫＫおよびヒトＭＫＫ３を大腸
菌で発現し、精製した。免疫複合体がＭＡＰＫＫまたは
ＭＫＫ３を活性化する活性を測定するために、まず０．
２μｇのＨｉｓ−ＭＡＰＫＫまたはＨｉｓ−ＭＫＫ３を
免疫複合体とともに、最終量２５μｌの溶液（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２、１００μＭ ＡＴＰ）中で１５分間、３０℃でイ
ンキュベートした。次いで、０．３μＣｉの［γ−^３２
Ｐ］ＡＴＰおよび３μｇのＧＳＴ−キナーゼ・ネガティ
ブＭＡＰＫ（ＭＡＰＫＫに対して）またはＨｉｓ−キナ
ーゼ・ネガティブＭＰＫ２（ＭＫＫ３に対して）を同一
のバッファー（最終量、３５μｌ）中で７分間、２５℃
でインキュベートした。その後、サンプルをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにかけ、イメージ・アナライザーで解析した。結
果は図６に示される通りであった。

【００７６】ＣＯＳ７細胞からのＡＳＫ１の免疫沈降物
は、ＳＥＫ１、ＭＫＫ３およびＭＡＰＫＫ６活性を強く
（それぞれ４０倍以上）活性化し、ＡＳＫ１がキナーゼ
・アッセイに存在しているときにのみｐ３８のリン酸化
が観察された。さらに野生型ｐ３８およびＡＴＦ２を用
いることによってＡＳＫ１依存的なｐ３８のリン酸化
が、ｐ３８の活性化を誘導することを確認した。対照的
に、ＭＡＰＫＫについては、ＭＡＰＫＫが存在していて
も弱い活性化（２．２倍）が観察されただけであった。

【００７７】一方、ＲａｆをＭＡＰＫＫＫとしてポジテ
ィブ・コントロールに用いた場合には、２７．８倍のＭ
ＡＰＫＫの活性化が観察された（データ省略）。以上の
結果（実施例４）および実施例３の結果より、ＡＳＫ１
は新規のＭＡＰＫＫＫであり、ＳＥＫ１−ＳＡＰＫ経路
およびＭＫＫ３／ＭＡＰＫＫ６−ｐ３８径路を選択的に
活性化することが示された。

【００７８】実施例５ ＡＳＫ１発現によるアポトーシ
スの誘導 （１）ＡＳＫの発現の確認 メタロチオネイン・プロモーターをベースとした発現プ
ラスミドを安定的にトランスフェクトしたミンク肺上皮
細胞株（Ｍｖ１Ｌｕ）を用いることによって、ＡＳＫ１
の生物活性を検討した。構成的に発現したＡＳＫ１が細
胞死を誘導し、結果として安定な形質転換体の取得に失
敗するという可能性を排除するために、メタロチオネイ
ン誘導性プロモーター・システムを用いた。

【００７９】まず、ＡＳＫ１およびＡＳＫ１（Ｋ７０９
Ｒ）ｃＤＮＡをｐＭＥＰ４ベクター（インビトロジェン
社）中の制限酵素切断部位にサブクローニングした。ｃ
ＤＮＡのトランスフェクションは、トランスフェクタム
（プロメガ社）を用いて、製造業者の使用説明書に従っ
て実施した。ハイグロマイシンＢによる選択は、M. Sai
toh et al., J. Biol. Chem., 271, 2769 (1996)に記載
の方法に従って実施した。独立したクローンを幾つかリ
ング・クローニングし、ＡＳＫ１タンパク質の発現を抗
ＡＳＫ１血清を用いた免疫沈降（H. Ichijo et al., J.
Biol. Chem.,268, 14505 (1993) ）によって決定し
た。独立した陽性のクローン２つを下記に記載のアッセ
イに用いたが、どちらのクローンを用いても結果は本質
的に同じであった。

【００８０】［^３５Ｓ］メチオニンおよび［^３５Ｓ］シ
ステイン混合液を用いて、１００μＭ ＺｎＣｌ_２存在
下または非存在下で５時間、細胞を代謝標識した。次い
で、細胞のライゼートを特異的な抗ＡＳＫ１抗血清を用
いた免疫沈降にかけ、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびフ
ルオログラフィーを用いた解析を行なった。

【００８１】結果は図７に示した通りであった。即ち、
ＺｎＣｌ_２によって誘導したときにのみ、ＡＳＫ１が強
く発現することがわかった。ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）を
トランスフェクションした細胞も同じ程度の組換え型タ
ンパク質を発現していることがわかった。

【００８２】（２）チミジンの取り込みへの効果 ＡＳＫ１が細胞増殖に何らかの効果を示すかどうかを検
討するために、ベクター単独（図８、黒四角）、ＡＳＫ
１（図８、黒丸）およびＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）（図
８、白丸）を用いて安定的にトランスフェクトしたＭｖ
１Ｌｕ細胞を、１％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と図示し
た濃度のＺｎＣｌ_２を含むＭＥＭ培地中で１６時間イン
キュベートした。その後、細胞を［^３Ｈ］チミジンを用
いて１時間パルスラベルし、ＤＮＡ中に取り込まれた［
^３Ｈ］放射能活性を液体シンチレーション・カウンター
によって測定した。結果は図８に示される通りであっ
た。

【００８３】ＡＳＫ１をトランスフェクトした細胞では
［^３Ｈ］チミジンの取り込みの劇的な抑制が観察され
た。これに対して、ベクターのみをトランスフェクトし
た細胞やＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）ベクターでトランスフ
ェクトした細胞では、［^３Ｈ］チミジンの取り込みの抑
制は観察されなかった（図８）。

【００８４】ＺｎＣｌ_２による用量依存的な［^３Ｈ］チ
ミジンの取り込みの抑制と、ＡＳＫ１の用量依存的な発
現と活性化との相関性について検討した。ＡＳＫ１をト
ランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞を、様々な量のＺｎ
Ｃｌ_２で５時間処理した後、免疫沈降によってＡＳＫ１
の発現レベルを決定した（図９上段）。また、細胞を様
々な量のＺｎＣｌ_２で５時間処理し、免疫沈降によって
ＡＳＫ１を細胞から回収した後、ＭＫＫ３−ＭＰＫ２カ
ップル・キナーゼ・アッセイにかけた（図９下）。その
結果、ＺｎＣｌ_２による用量依存的な［^３Ｈ］チミジン
の取り込みの抑制は、ＡＳＫ１の用量依存的な発現と活
性化によく相関していた（図９）。

【００８５】（３）ＳＡＰＫおよびｐ３８のキナーゼ活
性の亢進への効果 次に、ＡＳＫ１活性と内在性のＳＡＰＫおよびｐ３８の
活性化との相関性を検討するために下記の実験を実施し
た。ＡＳＫ１を安定的にトランスフェクトしたＭｖ１Ｌ
ｕ細胞を、図示した濃度のＺｎＣｌ_２と５時間インキュ
ベートした。ＳＡＰＫの活性を測定するために、S.Mats
uda et al., J. Biol. Chem., 270, 12781 (1995)に記
載の方法に従って、各々の細胞抽出液をｃ−Ｊｕｎを基
質タンパク質として含むポリアクリルアミドゲル内での
キナーゼ検出アッセイ（イン−ゲルキナーゼ・アッセ
イ）にかけた。ｐ３８の活性を検出するために、抗ｐ３
８ポリクローナル抗体（Ｃー２０、サンタ・クルーズ
社）を用いて、０．１％ＳＤＳ存在下で免疫沈降を実施
した以外は実施例３に記載の方法に準じて、免疫沈降し
た。その後、ＡＴＦ２を基質タンパク質として用いてキ
ナーゼ活性を検出した。結果は図１０に示される通りで
あった。内在性のＳＡＰＫおよびｐ３８も、ＡＳＫ１活
性と相関して活性化されていることがわかった。

【００８６】（４）細胞の形態変化およびＤＮＡの断片
化への効果 さらに、１００μＭ ＺｎＣｌ_２によって細胞を処理
し、ＡＳＫ１を継続的に発現させたところ、ＺｎＣｌ_２
添加後６時間以内に形態変化（すなわち、cytoplasmic
shrinkage およびcellular condensation ）が誘導され
ることがわかった（データ省略）。このような形態変化
は、ＡＳＫ１（Ｋ７０９）を発現させた細胞では観察さ
れなかった。細胞を、１００μＭ ＺｎＣｌ_２の存在下
または非存在下で、１％ＦＢＳを含むＭＥＭと２６時間
インキュベートした。アポトーシスを起こしている細胞
に典型的な特徴であるcytoplasmic shrinkage およびce
llular condensation が、長時間誘導（２６時間）の
後、最も著しくなった（図１１上段）。

【００８７】ＡＳＫ１によってアポトーシスによる細胞
死が誘導されるかどうかについて、ターミナル・デオキ
シヌクレオチジル・トランスフェラーゼ−メディエーテ
ィッド ｄＵＴＰニック・エンド・ラベリング（ＴＵＮ
ＥＬ）法によって細胞をｉｎｓｉｔｕ染色することによ
り（図１１下段）、およびゲノミックＤＮＡ断片化によ
り検討した。具体的には、ＡＳＫ１をトランスフェクト
したＭｖ１Ｌｕ細胞を１００μＭ ＺｎＣｌ_２存在下ま
たは非存在下で、ＦＢＳを含まないＭＥＭ培地中で２５
時間培養した。その後、ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キッ
ト（ベーリンガー・マンハイム社）を用いてＴＵＮＥＬ
法で染色（図１１下段）、あるいはトータルＤＮＡを単
離し、２％アガロースゲル電気泳導にかけた（図１
２）。その結果、ＺｎＣｌ_２によるＡＳＫ１発現の誘導
後に、アポトーシスおよびＤＮＡ断片化が観察された
（図１１下段および図１２）。

【００８８】実施例６ ＴＮＦαによるＡＳＫ１の活性
化 本実施例では、ＴＮＦαで細胞を処理することによっ
て、ＡＳＫ１が活性化されるかどうかを検討した。ＡＳ
Ｋ１をトランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞を、５０μ
Ｍ ＺｎＣｌ_２で５時間前処理し、ＡＳＫ１発現を誘導
した。その後、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで様々な時
間細胞を刺激した。ＴＮＦαで処理した細胞由来のＡＳ
Ｋ１免疫沈降物を、ＭＫＫ３およびキナーゼ・ネガティ
ブｐ３８を用いたカップル・キナーゼ・アッセイにかけ
た（図１３上段および下段および図１４）。

【００８９】その結果、ＴＮＦαは、ＡＳＫ−１をトラ
ンスフェクトしたＭｖＩＬｕ細胞において刺激後５分以
内にＡＳＫ１活性を活性化した（図１３上段および下
段）。ＴＮＦαによるＡＳＫ１活性化は用量依存的な様
式で観察された（図１４）。次に、ＡＳＫ１をトランス
フェクトしていない２９３細胞およびＡ６７３細胞を１
００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで処理した。その結果、Ｔ
ＮＦ−αによってアポトーシスが誘導されることが知ら
れている（データ省略）様々なタイプの細胞、即ちヒト
２９３胎児腎臓細胞、Ａ６７３ラブドミオサルコーマ
（rhabdomyosarcoma）細胞（図１３下段）、Jurkat T細
胞およびＫＢ上皮性カルシノーマ細胞（データ省略）に
おいて、内在性のＡＳＫ１もまたＴＮＦ−αによって活
性化された。

【００９０】さらに、ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）を一過性
に２９３細胞（図１５）あるいはJurkat T細胞（図１
６）にトランスフェクトさせた。具体的には下記に記載
の方法に従って実験を実施した。２９３細胞（２×１０
^６）を、２μｇのｐｃＤＮＡ３コントロール・ベクター
またはｐｃＤＮＡ３−ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）で、Ｔｆ
ｘ−５０（Promega 社）を用いて製造業者のプロトコー
ルに従って一過性にトランスフェクトさせた。トランス
フェクションの８時間後より、細胞をＴＮＦ−α（１０
０ｎｇ／ｍｌ）で、３００ｎＭのアクチノマイシンＤ
（ActD）の存在下または非存在下で、１６時間処理し
た。培養プレートより遊離したアポトーシスを起こした
細胞を回収し、トータルＤＮＡを単離し、２％アガロー
ス・ゲル電気泳動によって解析した（図１５）。

【００９１】また、ｐｃＤＮＡ３−ＡＳＫ１（Ｋ７０９
Ｒ）をJurkat細胞に、ＤＭＲＩＥ−Ｃ リエージェント
（Life Technologies 社）によって、ｐＨｏｏｋ−１プ
ラスミド（Invitrogen社）とともにトランスフェクトし
た。因みに、ｐＨｏｏｋ−１プラスミドには、ハプテン
ｐｈＯｘ（4-ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-
5-one ）に対する単鎖抗体融合タンパク質がコードされ
ている。従って、ｐｈＯｘをコートした磁石ビーズを用
いることによって、トランスフェクトされた細胞を選択
的に単離することが可能である。 ＡＳＫ１（Ｋ７０９
Ｒ）をトランスフェクトした細胞のポピュレーション
（β−ガラクトシダーゼ染色によって測定したコトラン
スフェクションの効率はほとんど１００％であった）
を、 ｐｈＯｘをコートした磁石ビーズによって、Capt
ure-Tec kit （Invitrogen社）を用いて単離した後、細
胞を様々な濃度のＴＮＦ−αとともに５．５時間培養し
た。細胞質の小さく断片化したＤＮＡを、過去に記載の
方法（Selins, K. & Cohen, J., J. Immunol. 139, 319
9 (1987)）を若干改良した方法によって単離した。３×
１０^６細胞を２００μｌの緩衝溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．
５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）でリシスした。得ら
れたライゼートを、０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼ
Ｋと０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ｎとともに、４２
℃で１時間インキュベートした。その後、ＤＮＡをエタ
ノール抽出後にフェノール／クロロホルム抽出によって
精製した。抽出した細胞質ＤＮＡを２％アガロース・ゲ
ル電気泳動によって解析した（図１６）。

【００９２】その結果、ＴＮＦ−αによるＤＮＡ断片化
は効率的に減少した。尚、ＤＮＡ断片化アッセイにおい
て、トランスフェクトされていないJurkat細胞および単
離したJurkat細胞（ｐＨｏｏｋ−１および対照のｐｃＤ
ＮＡ３プラスミドでトランスフェクトしたもの）は同様
にＴＮＦ−αに感受性であった（データ省略）。このこ
とより、ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）がドミナント・ネガテ
ィブ変異体として機能することが示唆されたとともに、
より重要な事には、ＴＮＦ−αによって誘導されるアポ
トーシスにＡＳＫ１が必須であることが示唆された。

【００９３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１３７５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ヒト 配列 Met Ser Thr Glu Ala Asp Glu Gly Ile Thr Phe Ser Val Pro Pro Phe 1 5 10 15 Ala Pro Ser Gly Phe Cys Thr Ile Pro Glu Gly Gly Ile Cys Arg Arg 20 25 30 Gly Gly Ala Ala Ala Val Gly Glu Gly Glu Glu His Gln Leu Pro Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Gly Ser Phe Trp Asn Val Glu Ser Ala Ala Ala Pro Gly 50 55 60 Ile Gly Cys Pro Ala Ala Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Arg Gly Arg 65 70 75 80 Gly Ser Ser Val Gly Gly Gly Ser Arg Arg Thr Thr Val Ala Tyr Val 85 90 95 Ile Asn Glu Ala Ser Gln Gly Gln Leu Val Val Ala Glu Ser Glu Ala 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Arg Glu Ala Cys Glu Thr Val Gly Ala Thr Leu Glu 115 120 125 Thr Leu His Phe Gly Lys Leu Asp Phe Gly Glu Thr Thr Val Leu Asp 130 135 140 Arg Phe Tyr Asn Ala Asp Ile Ala Val Val Glu Met Ser Asp Ala Phe 145 150 155 160 Arg Gln Pro Ser Leu Phe Tyr His Leu Gly Val Arg Glu Ser Phe Ser 165 170 175 Met Ala Asn Asn Ile Ile Leu Tyr Cys Asp Thr Asn Ser Asp Ser Leu 180 185 190 Gln Ser Leu Lys Glu Ile Ile Cys Gln Lys Asn Thr Met Cys Thr Gly 195 200 205 Asn Tyr Thr Phe Val Pro Tyr Met Ile Thr Pro His Asn Lys Val Tyr 210 215 220 Cys Cys Asp Ser Ser Phe Met Lys Gly Leu Thr Glu Leu Met Gln Pro 225 230 235 240 Asn Phe Glu Leu Leu Leu Gly Pro Ile Cys Leu Pro Leu Val Asp Arg 245 250 255 Phe Ile Gln Leu Leu Lys Val Ala Gln Ala Ser Ser Ser Gln Tyr Phe 260 265 270 Arg Glu Ser Ile Leu Asn Asp Ile Arg Lys Ala Arg Asn Leu Tyr Thr 275 280 285 Gly Lys Glu Leu Ala Ala Glu Leu Ala Arg Ile Arg Gln Arg Val Asp 290 295 300 Asn Ile Glu Val Leu Thr Ala Asp Ile Val Ile Asn Leu Leu Leu Ser 305 310 315 320 Tyr Arg Asp Ile Gln Asp Tyr Asp Ser Ile Val Lys Leu Val Glu Thr 325 330 335 Leu Glu Lys Leu Pro Thr Phe Asp Leu Ala Ser His His His Val Lys 340 345 350 Phe His Tyr Ala Phe Ala Leu Asn Arg Arg Asn Leu Pro Gly Asp Arg 355 360 365 Ala Lys Ala Leu Asp Ile Met Ile Pro Met Val Gln Ser Glu Gly Gln 370 375 380 Val Ala Ser Asp Met Tyr Cys Leu Val Gly Arg Ile Tyr Lys Asp Met 385 390 395 400 Phe Leu Asp Ser Asn Phe Thr Asp Thr Glu Ser Arg Asp His Gly Ala 405 410 415 Ser Trp Phe Lys Lys Ala Phe Glu Ser Glu Pro Thr Leu Gln Ser Gly 420 425 430 Ile Asn Tyr Ala Val Leu Leu Leu Ala Ala Gly His Gln Phe Glu Ser 435 440 445 Ser Phe Glu Leu Arg Lys Val Gly Val Lys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 450 455 460 Lys Lys Gly Asn Leu Glu Lys Leu Gln Ser Tyr Trp Glu Val Gly Phe 465 470 475 480 Phe Leu Gly Ala Ser Val Leu Ala Asn Asp His Met Arg Val Ile Gln 485 490 495 Ala Ser Glu Lys Leu Phe Lys Leu Lys Thr Pro Ala Trp Tyr Leu Lys 500 505 510 Ser Ile Val Glu Thr Ile Leu Ile Tyr Lys His Phe Val Lys Leu Thr 515 520 525 Thr Glu Gln Pro Val Ala Lys Gln Glu Leu Val Asp Phe Trp Met Asp 530 535 540 Phe Leu Val Glu Ala Thr Lys Thr Asp Val Thr Val Val Arg Phe Pro 545 550 555 560 Val Leu Ile Leu Glu Pro Thr Lys Ile Tyr Gln Pro Ser Tyr Leu Ser 565 570 575 Ile Asn Asn Glu Val Glu Glu Lys Thr Ile Ser Ile Trp His Val Leu 580 585 590 Pro Asp Asp Lys Lys Gly Ile His Glu Trp Asn Phe Ser Ala Ser Ser 595 600 605 Val Arg Gly Val Ser Ile Ser Lys Phe Glu Glu Arg Cys Cys Phe Leu 610 615 620 Tyr Val Leu His Asn Ser Asp Asp Phe Gln Ile Tyr Phe Cys Thr Glu 625 630 635 640 Leu His Cys Lys Lys Phe Phe Glu Met Val Asn Thr Ile Thr Glu Glu 645 650 655 Lys Gly Arg Ser Thr Glu Glu Gly Asp Cys Glu Ser Asp Leu Leu Glu 660 665 670 Tyr Asp Tyr Glu Tyr Asp Glu Asn Gly Asp Arg Val Val Leu Gly Lys 675 680 685 Gly Thr Tyr Gly Ile Val Tyr Ala Gly Arg Asp Leu Ser Asn Gln Val 690 695 700 Arg Ile Ala Ile Lys Glu Ile Pro Glu Arg Asp Ser Arg Tyr Ser Gln 705 710 715 720 Pro Leu His Glu Glu Ile Ala Leu His Lys His Leu Lys His Lys Asn 725 730 735 Ile Val Gln Tyr Leu Gly Ser Phe Ser Glu Asn Gly Phe Ile Lys Ile 740 745 750 Phe Met Glu Gln Val Pro Gly Gly Ser Leu Tyr Ala Leu Leu Arg Ser 755 760 765 Lys Trp Gly Pro Leu Lys Asp Asn Glu Gln Thr Ile Gly Phe Tyr Thr 770 775 780 Lys Gln Ile Leu Glu Gly Leu Lys Tyr Leu His Asp Asn Gln Ile Val 785 790 795 800 His Arg Asp Ile Lys Gly Asp Asn Val Leu Ile Asn Thr Tyr Ser Gly 805 810 815 Val Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly Thr Ser Lys Arg Leu Ala Gly Ile 820 825 830 Asn Pro Cys Thr Glu Thr Phe Thr Gly Thr Leu Gln Tyr Met Ala Pro 835 840 845 Glu Ile Ile Asp Lys Gly Pro Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Ala Asp Ile 850 855 860 Trp Ser Leu Gly Cys Thr Ile Ile Glu Met Ala Thr Gly Lys Pro Pro 865 870 875 880 Phe Tyr Glu Leu Gly Glu Pro Gln Ala Ala Met Phe Lys Val Gly Met 885 890 895 Phe Lys Val His Pro Glu Ile Pro Glu Ser Met Ser Ala Glu Ala Lys 900 905 910 Ala Phe Ile Leu Lys Cys Phe Glu Pro Asp Pro Asp Lys Arg Ala Cys 915 920 925 Ala Asn Asp Leu Leu Val Asp Glu Phe Leu Lys Val Ser Ser Lys Lys 930 935 940 Lys Lys Thr Gln Pro Lys Leu Ser Ala Leu Ser Ala Gly Ser Asn Ala 945 950 955 960 Glu Tyr Leu Arg Ser Ile Ser Leu Pro Val Pro Val Leu Val Glu Asp 965 970 975 Thr Ser Ser Ser Ser Glu Tyr Gly Ser Val Ser Pro Asp Thr Glu Leu 980 985 990 Lys Val Asp Pro Phe Ser Phe Lys Thr Arg Ala Lys Ser Cys Gly Glu 995 1000 1005 Arg Asp Val Lys Gly Ile Arg Thr Leu Phe Leu Gly Ile Pro Asp Glu 1010 1015 1020 Asn Phe Glu Asp His Ser Ala Pro Pro Ser Pro Glu Glu Lys Asp Ser 1025 1030 1035 1040 Gly Phe Phe Met Leu Arg Lys Asp Ser Glu Arg Arg Ala Thr Leu His 1045 1050 1055 Arg Ile Leu Thr Glu Asp Gln Asp Lys Ile Val Arg Asn Leu Met Glu 1060 1065 1070 Ser Leu Ala Gln Gly Ala Glu Glu Pro Lys Leu Lys Trp Glu His Ile 1075 1080 1085 Thr Thr Leu Ile Ala Ser Leu Arg Glu Phe Val Arg Ser Thr Asp Arg 1090 1095 1100 Lys Ile Ile Ala Thr Thr Leu Ser Lys Leu Lys Leu Glu Leu Asp Phe 1105 1110 1115 1120 Asp Ser His Gly Ile Ser Gln Val Gln Val Val Leu Phe Gly Phe Gln 1125 1130 1135 Asp Ala Val Asn Lys Val Leu Arg Asn His Asn Ile Lys Pro His Trp 1140 1145 1150 Met Phe Ala Leu Asp Ser Ile Ile Arg Lys Ala Val Gln Thr Ala Ile 1155 1160 1165 Thr Ile Leu Val Pro Glu Leu Arg Pro His Phe Ser Leu Ala Ser Glu 1170 1175 1180 Ser Asp Thr Ala Asp Gln Glu Asp Leu Asp Val Glu Asp Asp His Glu 1185 1190 1195 1200 Glu Gln Pro Ser Asn Gln Thr Val Arg Arg Pro Gln Ala Val Ile Glu 1205 1210 1215 Asp Ala Val Ala Thr Ser Gly Val Ser Thr Leu Ser Ser Thr Val Ser 1220 1225 1230 His Asp Ser Gln Ser Ala His Arg Ser Leu Asn Val Gln Leu Gly Arg 1235 1240 1245 Met Lys Ile Glu Thr Asn Arg Leu Leu Glu Glu Leu Val Arg Lys Glu 1250 1255 1260 Lys Glu Leu Gln Ala Leu Leu His Arg Ala Ile Glu Glu Lys Asp Gln 1265 1270 1275 1280 Glu Ile Lys His Leu Lys Leu Lys Ser Gln Pro Ile Glu Ile Pro Glu 1285 1290 1295 Leu Pro Val Phe His Leu Asn Ser Ser Gly Thr Asn Ile Glu Asp Ser 1300 1305 1310 Glu Leu Thr Asp Trp Leu Arg Val Asn Gly Ala Asp Glu Asp Thr Ile 1315 1320 1325 Ser Arg Phe Leu Ala Glu Asp Tyr Thr Leu Leu Asp Val Leu Tyr Tyr 1330 1335 1340 Val Thr Arg Asp Asp Leu Lys Cys Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Leu 1345 1350 1355 1360 Cys Thr Leu Trp Lys Ala Ile Ile Asp Phe Arg Asn Lys Gln Thr 1365 1370 1375

【００９４】配列番号：２ 配列の長さ：４５３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ 起源： 生物名：ヒト 配列 ACCCGGCTTC CCCACCCCTT GTACTCTAAA CTCTGCAGAG GGCGAGCGTG CGGCCACGGA 60 GGCGCCGAGG AGGAGCGAGC GCCGCCGGGC AGCGGCGTGC CCTCGGGGGA GAGGGCGCCG 120 GAGAGGAGGC GGCGGCGCGG CGGCGAGGGC GCGGCGCGCG ATGGCAGCTG CTTAGCCCGG 180 CGGGCGCGGA GCAGCCCCGA GCTGTGGCTG GCCAGGCGGT GCGGCTGGGC GGGGGACGCC 240 GCCGCCGTTG CTGCCCGGCC CGGAGAG ATG AGC ACG GAG GCG GAC GAG GGC ATC 294 Met Ser Thr Glu Ala Asp Glu Gly Ile 1 5 ACT TTC TCT GTG CCA CCC TTC GCC CCC TCG GGC TTC TGC ACC ATC CCC 342 Thr Phe Ser Val Pro Pro Phe Ala Pro Ser Gly Phe Cys Thr Ile Pro 10 15 20 25 GAG GGC GGC ATC TGC AGG AGG GGA GGA GCG GCG GCG GTG GGC GAG GGC 390 Glu Gly Gly Ile Cys Arg Arg Gly Gly Ala Ala Ala Val Gly Glu Gly 30 35 40 GAG GAG CAC CAG CTG CCA CCG CCG CCG CCG GGC AGT TTC TGG AAC GTG 438 Glu Glu His Gln Leu Pro Pro Pro Pro Pro Gly Ser Phe Trp Asn Val 45 50 55 GAG AGC GCC GCT GCC CCT GGC ATC GGT TGT CCG GCG GCC ACC TCC TCG 486 Glu Ser Ala Ala Ala Pro Gly Ile Gly Cys Pro Ala Ala Thr Ser Ser 60 65 70 AGC AGT GCC ACC CGA GGC CGG GGC AGC TCT GTT GGC GGG GGC AGC CGA 534 Ser Ser Ala Thr Arg Gly Arg Gly Ser Ser Val Gly Gly Gly Ser Arg 75 80 85 CGG ACC ACG GTG GCA TAT GTG ATC AAC GAA GCG AGC CAA GGG CAA CTG 582 Arg Thr Thr Val Ala Tyr Val Ile Asn Glu Ala Ser Gln Gly Gln Leu 90 95 100 105 GTG GTG GCC GAG AGC GAG GCC CTG CAG AGC TTG CGG GAG GCG TGC GAG 630 Val Val Ala Glu Ser Glu Ala Leu Gln Ser Leu Arg Glu Ala Cys Glu 110 115 120 ACA GTG GGC GCC ACC CTG GAA ACC CTG CAT TTT GGG AAA CTC GAC TTT 678 Thr Val Gly Ala Thr Leu Glu Thr Leu His Phe Gly Lys Leu Asp Phe 125 130 135 GGA GAA ACC ACC GTG CTG GAC CGC TTT TAC AAT GCA GAT ATT GCG GTG 726 Gly Glu Thr Thr Val Leu Asp Arg Phe Tyr Asn Ala Asp Ile Ala Val 140 145 150 GTG GAG ATG AGC GAT GCC TTC CGG CAG CCG TCC TTG TTT TAC CAC CTT 774 Val Glu Met Ser Asp Ala Phe Arg Gln Pro Ser Leu Phe Tyr His Leu 155 160 165 GGG GTG AGA GAA AGT TTC AGC ATG GCC AAC AAC ATC ATC CTC TAC TGC 822 Gly Val Arg Glu Ser Phe Ser Met Ala Asn Asn Ile Ile Leu Tyr Cys 170 175 180 185 GAT ACT AAC TCG GAC TCT CTG CAG TCA CTG AAG GAA ATC ATT TGC CAG 870 Asp Thr Asn Ser Asp Ser Leu Gln Ser Leu Lys Glu Ile Ile Cys Gln 190 195 200 AAG AAT ACT ATG TGC ACT GGG AAC TAC ACC TTT GTT CCT TAC ATG ATA 918 Lys Asn Thr Met Cys Thr Gly Asn Tyr Thr Phe Val Pro Tyr Met Ile 205 210 215 ACT CCA CAT AAC AAA GTC TAC TGC TGT GAC AGC AGC TTC ATG AAG GGG 966 Thr Pro His Asn Lys Val Tyr Cys Cys Asp Ser Ser Phe Met Lys Gly 220 225 230 TTG ACA GAG CTC ATG CAA CCG AAC TTC GAG CTG CTT CTT GGA CCC ATC 1014 Leu Thr Glu Leu Met Gln Pro Asn Phe Glu Leu Leu Leu Gly Pro Ile 235 240 245 TGC TTA CCT CTT GTG GAT CGT TTT ATT CAA CTT TTG AAG GTG GCA CAA 1062 Cys Leu Pro Leu Val Asp Arg Phe Ile Gln Leu Leu Lys Val Ala Gln 250 255 260 265 GCA AGT TCT AGC CAG TAC TTC CGG GAA TCT ATA CTC AAT GAC ATC AGG 1110 Ala Ser Ser Ser Gln Tyr Phe Arg Glu Ser Ile Leu Asn Asp Ile Arg 270 275 280 AAA GCT CGT AAT TTA TAC ACT GGT AAA GAA TTG GCA GCT GAG TTG GCA 1158 Lys Ala Arg Asn Leu Tyr Thr Gly Lys Glu Leu Ala Ala Glu Leu Ala 285 290 295 AGA ATT CGG CAG CGA GTA GAT AAT ATC GAA GTC TTG ACA GCA GAT ATT 1206 Arg Ile Arg Gln Arg Val Asp Asn Ile Glu Val Leu Thr Ala Asp Ile 300 305 310 GTC ATA AAT CTG TTA CTT TCC TAC AGA GAT ATC CAG GAC TAT GAT TCT 1254 Val Ile Asn Leu Leu Leu Ser Tyr Arg Asp Ile Gln Asp Tyr Asp Ser 315 320 325 ATT GTG AAG CTG GTA GAG ACT TTA GAA AAA CTG CCA ACC TTT GAT TTG 1302 Ile Val Lys Leu Val Glu Thr Leu Glu Lys Leu Pro Thr Phe Asp Leu 330 335 340 345 GCC TCC CAT CAC CAT GTG AAG TTT CAT TAT GCA TTT GCA CTG AAT AGG 1350 Ala Ser His His His Val Lys Phe His Tyr Ala Phe Ala Leu Asn Arg 350 355 360 AGA AAT CTC CCT GGT GAC AGA GCA AAA GCT CTT GAT ATT ATG ATT CCC 1398 Arg Asn Leu Pro Gly Asp Arg Ala Lys Ala Leu Asp Ile Met Ile Pro 365 370 375 ATG GTG CAA AGC GAA GGA CAA GTT GCT TCA GAT ATG TAT TGC CTA GTT 1446 Met Val Gln Ser Glu Gly Gln Val Ala Ser Asp Met Tyr Cys Leu Val 380 385 390 GGT CGA ATC TAC AAA GAT ATG TTT TTG GAC TCT AAT TTC ACG GAC ACT 1494 Gly Arg Ile Tyr Lys Asp Met Phe Leu Asp Ser Asn Phe Thr Asp Thr 395 400 405 GAA AGC AGA GAC CAT GGA GCT TCT TGG TTC AAA AAG GCA TTT GAA TCT 1542 Glu Ser Arg Asp His Gly Ala Ser Trp Phe Lys Lys Ala Phe Glu Ser 410 415 420 425 GAG CCA ACA CTA CAG TCA GGA ATT AAT TAT GCG GTC CTC CTC CTG GCA 1590 Glu Pro Thr Leu Gln Ser Gly Ile Asn Tyr Ala Val Leu Leu Leu Ala 430 435 440 GCT GGA CAC CAG TTT GAA TCT TCC TTT GAG CTC CGG AAA GTT GGG GTG 1638 Ala Gly His Gln Phe Glu Ser Ser Phe Glu Leu Arg Lys Val Gly Val 445 450 455 AAG CTA AGT AGT CTT CTT GGT AAA AAG GGA AAC TTG GAA AAA CTC CAG 1686 Lys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Lys Lys Gly Asn Leu Glu Lys Leu Gln 460 465 470 AGC TAC TGG GAA GTT GGA TTT TTT CTG GGG GCC AGC GTC CTA GCC AAT 1734 Ser Tyr Trp Glu Val Gly Phe Phe Leu Gly Ala Ser Val Leu Ala Asn 475 480 485 GAC CAC ATG AGA GTC ATT CAA GCA TCT GAA AAG CTT TTT AAA CTG AAG 1782 Asp His Met Arg Val Ile Gln Ala Ser Glu Lys Leu Phe Lys Leu Lys 490 495 500 505 ACA CCA GCA TGG TAC CTC AAG TCT ATT GTA GAG ACA ATT TTG ATA TAT 1830 Thr Pro Ala Trp Tyr Leu Lys Ser Ile Val Glu Thr Ile Leu Ile Tyr 510 515 520 AAG CAT TTT GTG AAA CTG ACC ACA GAA CAG CCT GTG GCC AAG CAA GAA 1878 Lys His Phe Val Lys Leu Thr Thr Glu Gln Pro Val Ala Lys Gln Glu 525 530 535 CTT GTG GAC TTT TGG ATG GAT TTC CTG GTC GAG GCC ACA AAG ACA GAT 1926 Leu Val Asp Phe Trp Met Asp Phe Leu Val Glu Ala Thr Lys Thr Asp 540 545 550 GTT ACT GTG GTT AGG TTT CCA GTA TTA ATA TTA GAA CCA ACC AAA ATC 1974 Val Thr Val Val Arg Phe Pro Val Leu Ile Leu Glu Pro Thr Lys Ile 555 560 565 TAT CAA CCT TCT TAT TTG TCT ATC AAC AAT GAA GTT GAG GAA AAG ACA 2022 Tyr Gln Pro Ser Tyr Leu Ser Ile Asn Asn Glu Val Glu Glu Lys Thr 570 575 580 585 ATC TCT ATT TGG CAC GTG CTT CCT GAT GAC AAG AAA GGT ATA CAT GAG 2070 Ile Ser Ile Trp His Val Leu Pro Asp Asp Lys Lys Gly Ile His Glu 590 595 600 TGG AAT TTT AGT GCC TCT TCT GTC AGG GGA GTG AGT ATT TCT AAA TTT 2118 Trp Asn Phe Ser Ala Ser Ser Val Arg Gly Val Ser Ile Ser Lys Phe 605 610 615 GAA GAA AGA TGC TGC TTT CTT TAT GTG CTT CAC AAT TCT GAT GAT TTC 2166 Glu Glu Arg Cys Cys Phe Leu Tyr Val Leu His Asn Ser Asp Asp Phe 620 625 630 CAA ATC TAT TTC TGT ACA GAA CTT CAT TGT AAA AAG TTT TTT GAG ATG 2214 Gln Ile Tyr Phe Cys Thr Glu Leu His Cys Lys Lys Phe Phe Glu Met 635 640 645 GTG AAC ACC ATT ACC GAA GAG AAG GGG AGA AGC ACA GAG GAA GGA GAC 2262 Val Asn Thr Ile Thr Glu Glu Lys Gly Arg Ser Thr Glu Glu Gly Asp 650 655 660 665 TGT GAA AGT GAC TTG CTG GAG TAT GAC TAT GAA TAT GAT GAA AAT GGT 2310 Cys Glu Ser Asp Leu Leu Glu Tyr Asp Tyr Glu Tyr Asp Glu Asn Gly 670 675 680 GAC AGA GTC GTT TTA GGA AAA GGC ACT TAT GGG ATA GTC TAC GCA GGT 2358 Asp Arg Val Val Leu Gly Lys Gly Thr Tyr Gly Ile Val Tyr Ala Gly 685 690 695 CGG GAC TTG AGC AAC CAA GTC AGA ATT GCT ATT AAG GAA ATC CCA GAG 2406 Arg Asp Leu Ser Asn Gln Val Arg Ile Ala Ile Lys Glu Ile Pro Glu 700 705 710 AGA GAC AGC AGA TAC TCT CAG CCC CTG CAT GAA GAA ATA GCA TTG CAT 2454 Arg Asp Ser Arg Tyr Ser Gln Pro Leu His Glu Glu Ile Ala Leu His 715 720 725 AAA CAC CTG AAG CAC AAA AAT ATT GTC CAG TAT CTG GGC TCT TTC AGT 2502 Lys His Leu Lys His Lys Asn Ile Val Gln Tyr Leu Gly Ser Phe Ser 730 735 740 745 GAG AAT GGT TTC ATT AAA ATC TTC ATG GAG CAG GTC CCT GGA GGA AGT 2550 Glu Asn Gly Phe Ile Lys Ile Phe Met Glu Gln Val Pro Gly Gly Ser 750 755 760 CTT TAT GCT CTC CTT CGT TCC AAA TGG GGT CCA TTA AAA GAC AAT GAG 2598 Leu Tyr Ala Leu Leu Arg Ser Lys Trp Gly Pro Leu Lys Asp Asn Glu 765 770 775 CAA ACA ATT GGC TTT TAT ACA AAG CAA ATA CTG GAA GGA TTA AAA TAT 2646 Gln Thr Ile Gly Phe Tyr Thr Lys Gln Ile Leu Glu Gly Leu Lys Tyr 780 785 790 CTC CAT GAC AAT CAG ATA GTT CAC CGG GAC ATA AAG GGT GAC AAT GTG 2694 Leu His Asp Asn Gln Ile Val His Arg Asp Ile Lys Gly Asp Asn Val 795 800 805 TTG ATT AAT ACC TAC AGT GGT GTT CTC AAG ATC TCT GAC TTC GGA ACA 2742 Leu Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly Thr 810 815 820 825 TCA AAG AGG CTT GCT GGC ATA AAC CCC TGT ACT GAA ACT TTT ACT GGT 2790 Ser Lys Arg Leu Ala Gly Ile Asn Pro Cys Thr Glu Thr Phe Thr Gly 830 835 840 ACC CTC CAG TAT ATG GCA CCA GAA ATA ATA GAT AAA GGA CCA AGA GGC 2838 Thr Leu Gln Tyr Met Ala Pro Glu Ile Ile Asp Lys Gly Pro Arg Gly 845 850 855 TAC GGA AAA GCA GCA GAC ATC TGG TCT CTG GGC TGT ACA ATC ATT GAA 2886 Tyr Gly Lys Ala Ala Asp Ile Trp Ser Leu Gly Cys Thr Ile Ile Glu 860 865 870 ATG GCC ACA GGA AAA CCC CCA TTT TAT GAA CTG GGA GAA CCA CAA GCA 2934 Met Ala Thr Gly Lys Pro Pro Phe Tyr Glu Leu Gly Glu Pro Gln Ala 875 880 885 GCT ATG TTC AAG GTG GGA ATG TTT AAA GTC CAC CCT GAG ATC CCA GAG 2982 Ala Met Phe Lys Val Gly Met Phe Lys Val His Pro Glu Ile Pro Glu 890 895 900 905 TCC ATG TCT GCA GAG GCC AAG GCA TTC ATA CTG AAA TGT TTT GAA CCA 3030 Ser Met Ser Ala Glu Ala Lys Ala Phe Ile Leu Lys Cys Phe Glu Pro 910 915 920 GAT CCT GAC AAG AGA GCC TGT GCT AAC GAC TTG CTT GTT GAT GAG TTT 3078 Asp Pro Asp Lys Arg Ala Cys Ala Asn Asp Leu Leu Val Asp Glu Phe 925 930 935 TTA AAA GTT TCA AGC AAA AAG AAA AAG ACA CAA CCT AAG CTT TCA GCT 3126 Leu Lys Val Ser Ser Lys Lys Lys Lys Thr Gln Pro Lys Leu Ser Ala 940 945 950 CTT TCA GCT GGA TCA AAT GCA GAA TAT CTC AGG AGT ATA TCC TTG CCG 3174 Leu Ser Ala Gly Ser Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Ser Ile Ser Leu Pro 955 960 965 GTA CCT GTG CTG GTG GAG GAC ACC AGC AGC AGC AGT GAG TAC GGC TCA 3222 Val Pro Val Leu Val Glu Asp Thr Ser Ser Ser Ser Glu Tyr Gly Ser 970 975 980 985 GTT TCA CCC GAC ACG GAG TTG AAA GTG GAC CCC TTC TCT TTC AAA ACA 3270 Val Ser Pro Asp Thr Glu Leu Lys Val Asp Pro Phe Ser Phe Lys Thr 990 995 1000 AGA GCC AAG TCC TGC GGA GAA AGA GAT GTC AAG GGA ATT CGG ACA CTC 3318 Arg Ala Lys Ser Cys Gly Glu Arg Asp Val Lys Gly Ile Arg Thr Leu 1005 1010 1015 TTT TTG GGC ATT CCA GAT GAG AAT TTT GAA GAT CAC AGT GCT CCT CCT 3366 Phe Leu Gly Ile Pro Asp Glu Asn Phe Glu Asp His Ser Ala Pro Pro 1020 1025 1030 TCC CCT GAA GAA AAA GAT TCT GGA TTC TTC ATG CTG AGG AAG GAC AGT 3414 Ser Pro Glu Glu Lys Asp Ser Gly Phe Phe Met Leu Arg Lys Asp Ser 1035 1040 1045 GAG AGG CGA GCT ACC CTT CAC AGG ATC CTG ACG GAA GAC CAA GAC AAA 3462 Glu Arg Arg Ala Thr Leu His Arg Ile Leu Thr Glu Asp Gln Asp Lys 1050 1055 1060 1065 ATT GTG AGA AAC CTA ATG GAA TCT TTA GCT CAG GGG GCT GAA GAA CCG 3510 Ile Val Arg Asn Leu Met Glu Ser Leu Ala Gln Gly Ala Glu Glu Pro 1070 1075 1080 AAA CTA AAA TGG GAA CAC ATC ACA ACC CTC ATT GCA AGC CTC AGA GAA 3558 Lys Leu Lys Trp Glu His Ile Thr Thr Leu Ile Ala Ser Leu Arg Glu 1085 1090 1095 TTT GTG AGA TCC ACT GAC CGA AAA ATC ATA GCC ACC ACA CT GTCA AAG 3606 Phe Val Arg Ser Thr Asp Arg Lys Ile Ile Ala Thr Thr Leu Ser Lys 1100 1105 1110 CTG AAA CTG GAG CTG GAC TTC GAC AGC CAT GGC ATT AGC CAA GTC CAG 3654 Leu Lys Leu Glu Leu Asp Phe Asp Ser His Gly Ile Ser Gln Val Gln 1115 1120 1125 GTG GTA CTC TTT GGT TTT CAA GAT GCT GTC AAT AAA GTT CTT CGG AAT 3702 Val Val Leu Phe Gly Phe Gln Asp Ala Val Asn Lys Val Leu Arg Asn 1130 1135 1140 1145 CAT AAC ATC AAG CCG CAC TGG ATG TTT GCC TTA GAC AGT ATC ATT CGG 3750 His Asn Ile Lys Pro His Trp Met Phe Ala Leu Asp Ser Ile Ile Arg 1150 1155 1160 AAG GCG GTA CAG ACA GCC ATT ACC ATC CTG GTT CCA GAA CTA AGG CCA 3798 Lys Ala Val Gln Thr Ala Ile Thr Ile Leu Val Pro Glu Leu Arg Pro 1165 1170 1175 CAT TTC AGC CTT GCA TCT GAG AGT GAT ACT GCT GAT CAA GAA GAC TTG 3846 His Phe Ser Leu Ala Ser Glu Ser Asp Thr Ala Asp Gln Glu Asp Leu 1180 1185 1190 GAT GTA GAA GAT GAC CAT GAG GAA CAG CCT TCA AAT CAA ACT GTC CGA 3894 Asp Val Glu Asp Asp His Glu Glu Gln Pro Ser Asn Gln Thr Val Arg 1195 1200 1205 AGA CCT CAG GCT GTC ATT GAA GAT GCT GTG GCT ACC TCA GGC GTG AGC 3942 Arg Pro Gln Ala Val Ile Glu Asp Ala Val Ala Thr Ser Gly Val Ser 1210 1215 1220 1225 ACG CTC AGT TCT ACT GTG TCT CAT GAT TCC CAG AGT GCT CAC CGG TCA 3990 Thr Leu Ser Ser Thr Val Ser His Asp Ser Gln Ser Ala His Arg Ser 1230 1235 1240 CTG AAT GTA CAG CTT GGA AGG ATG AAA ATA GAA ACC AAT AGA TTA CTG 4038 Leu Asn Val Gln Leu Gly Arg Met Lys Ile Glu Thr Asn Arg Leu Leu 1245 1250 1255 GAA GAA TTG GTT CGG AAA GAG AAA GAA TTA CAA GCA CTC CTT CAT CGA 4086 Glu Glu Leu Val Arg Lys Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Leu His Arg 1260 1265 1270 GCT ATT GAA GAA AAA GAC CAA GAA ATT AAA CAC CTG AAG CTT AAG TCC 4134 Ala Ile Glu Glu Lys Asp Gln Glu Ile Lys His Leu Lys Leu Lys Ser 1275 1280 1285 CAA CCC ATA GAA ATT CCT GAA TTG CCT GTA TTT CAT CTA AAT TCT TCT 4182 Gln Pro Ile Glu Ile Pro Glu Leu Pro Val Phe His Leu Asn Ser Ser 1290 1295 1300 1305 GGC ACA AAT ATT GAA GAT TCT GAA CTT ACC GAC TGG CTG AGA GTG AAT 4230 Gly Thr Asn Ile Glu Asp Ser Glu Leu Thr Asp Trp Leu Arg Val Asn 1310 1315 1320 GGA GCT GAT GAA GAC ACT ATA AGC CGG TTT TTG GCT GAA GAT TAT ACA 4278 Gly Ala Asp Glu Asp Thr Ile Ser Arg Phe Leu Ala Glu Asp Tyr Thr 1325 1330 1335 CTA TTG GAT GTT CTC TAC TAT GTT ACA CGT GAT GAC TTA AAA TGC TTG 4326 Leu Leu Asp Val Leu Tyr Tyr Val Thr Arg Asp Asp Leu Lys Cys Leu 1340 1345 1350 AGA CTA AGG GGA GGG ATG CTG TGC ACA CTG TGG AAG GCT ATC ATT GAC 4374 Arg Leu Arg Gly Gly Met Leu Cys Thr Leu Trp Lys Ala Ile Ile Asp 1355 1360 1365 TTT CGA AAC AAA CAG ACT TGACTGTTGC TCAATCTAAT CTTCGATGGA AATTCTAA 4430 Phe Arg Asn Lys Gln Thr 1370 1375 AAATTAATAC AGAGCTGATC TTCTTGGGGG TGGGAAAATC GAAGGGAGAG GAGAAAGGCG 4490 CTGCACTTTA AATCCAGTAT TTGTTTACTC ATGTTAAAAA AAA 4533

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＡＳＫ１の推定アミノ酸配列を示した図で
ある。２つの独立したクローン（クローン２０およびク
ローン２７）で想定される翻訳開始部位を矢印で示し
た。タンパク質キナーゼ領域は太字で示した。Ｎ末端の
非触媒領域に見出されたＦＫＢＰ型のペプチジル−プロ
リル シス−トランス イソメラーゼのモチーフは下線
で示した。アミノ酸残基の略語は、Ａ：Ａｌａ、Ｃ：Ｃ
ｙｓ、Ｄ：Ａｓｐ、Ｅ：Ｇｌｕ、Ｆ：Ｐｈｅ、Ｇ：Ｇｌ
ｙ、Ｈ：Ｈｉｓ、Ｉ：Ｉｌｅ、Ｋ：Ｌｙｓ、Ｌ：Ｌｅ
ｕ、Ｍ：Ｍｅｔ、Ｎ：Ａｓｎ、Ｐ：Ｐｒｏ、Ｑ：Ｇｌ
ｎ、Ｒ：Ａｒｇ、Ｓ：Ｓｅｒ、Ｔ：Ｔｈｒ、Ｖ：Ｖａ
ｌ、Ｗ：Ｔｒｐ、Ｙ：Ｔｙｒである。

【図２】系統進化学的なＭＡＰＫＫＫの類縁関係を示し
た図である。

【図３】ＡＳＫ１の組織分布を示したＲＮＡブロット
（電気泳動写真）である。Ｈｅａｒｔ：心臓、Ｂｒａｉ
ｎ：脳、Ｐｌａｃｅｎｔａ：胎盤、Ｌｕｎｇ：肺、Ｌｉ
ｖｅｒ：肝臓、Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ：骨格
筋、Ｋｉｄｎｅｙ：腎臓、Ｐａｎｃｒｅａｓ：膵臓、Ｓ
ｐｌｅｅｎ：脾臓、Ｔｈｙｍｕｓ：胸腺、Ｐｒｏｓｔａ
ｔｅ：前立腺、Ｔｅｓｔｉｓ：精巣、Ｏｖｅｒｙ：卵
巣、Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：小腸、Ｃｏｌｏ
ｎ：結腸、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ：白血球。

【図４】ＡＳＫ１遺伝子を発現させた間（ＡＳＫ１、Ａ
ＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ））または発現させなかった（vect
or）酵母変異株ＴＭ２５７−Ｈ１の生育（コロニー形
成）を示した写真（生物の形態の写真）である。１．５
Ｍソルビトール（sorbitol）存在下または非存在下にお
いて試験した。

【図５】インビボでのＡＳＫ１によるＭＡＰＫＫおよび
ＭＡＰＫの活性化を示した写真（電気泳動写真）であ
る。活性化は、基質タンパク質のリン酸化を指標とし
た。各基質タンパク質の位置は、］印および矢尻印で示
した。ＡＳＫ１の共発現によるキナーゼ活性の増加の倍
率を、各レーンの上に示した。倍率は、３回の独立した
実験の平均値である。分子量はキロダルトン（ｋＤａ）
である。

【図６】インビトロでのＡＳＫ１によるＭＡＰＫＫの活
性化を示した写真（電気泳動写真）である。ＣＯＳ７細
胞にｐｃＤＮＡ３−ＡＳＫ１をトランスフェクトし、細
胞のライゼートを免疫前血清（ｍｏｃｋ ｐｐｔ）また
は抗ＡＳＫ１抗血清（ＡＳＫ１ ｐｐｔ）で免疫沈降し
た。免疫複合体またはバッファー溶液（ｂｕｆｆｅｒ）
をＨｉｓ−ＭＡＰＫＫ、Ｈｉｓ−ＳＥＫ１、Ｈｉｓ−Ｍ
ＫＫ３またはＨｉｓ−ＭＡＰＫＫ６の存在下（＋）また
は非存在下（−）でインキュベートした後、それぞれの
ＭＡＰＫＫのキナーゼ活性を、ＭＡＰＫＫにはＧＳＴ−
キナーゼネガティヴＭＡＰＫを基質として、ＳＥＫ１、
ＭＫＫ３およびＭＡＰＫＫ６にはＨｉｓ−キナーゼ・ネ
ガティヴＭＰＫ２を基質として測定した。写真中「ＫＮ
−ＭＡＰＫ」は、ＧＳＴ−キナーゼ・ネガティブＭＡＰ
Ｋを、「ＫＮ−ＭＰＫ２」は、Ｈｉｓ−キナーゼ・ネガ
ティブＭＰＫ２を、それぞれ表す。

【図７】安定的にトランスフェクト（transfection）し
たＭｖ１Ｌｕ細胞でのＡＳＫ１およびＡＳＫ１（Ｋ７０
９Ｒ）のＺｎＣｌ_２依存的な発現を示した写真（電気泳
動写真）である。

【図８】ＡＳＫ１依存的な［^３Ｈ］チミジンの取り込み
の抑制を示した図である。黒四角形：ベクター単独、黒
丸：ＡＳＫ１、白丸：ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）。図は３
回の独立した実験の代表例である。エラー・バーは標準
偏差を表わす。

【図９】ＺｎＣｌ_２誘導による用量依存的なＡＳＫ１タ
ンパク質の発現（上段）とＡＳＫ１の活性化（下段）を
示した写真（電気泳動写真）である。「ｎｏ−ＩＰ」
は、免疫沈降を行わずに細胞ライゼートを酵素標品とし
て用いた場合を表わす。

【図１０】ＡＳＫ１依存的な内在性のＳＡＰＫ（上段）
およびｐ３８（下段）の活性化を示した写真（電気泳動
写真）である。ｐ５４およびｐ４６ ＳＡＰＫ（上段）
およびＡＴＦ２（下段）の位置は、矢尻印および矢印で
それぞれ示した。

【図１１】代表的な細胞の形態を位相差顕微鏡で同じ拡
大率で撮影した写真（生物の形態の写真）である。ＡＳ
Ｋ１依存的な細胞死が示されている。（上段）細胞を１
％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地中で、１００μＭ ＺｎＣｌ
_２存在下または非存在下で２６時間培養した。代表的な
細胞の形態を位相差顕微鏡で同じ拡大率で撮影した写真
（生物の形態の写真）である。（下段）細胞をＦＢＳを
含まないＭＥＭ培地中で、１００μＭ ＺｎＣｌ_２存在
下または非存在下で２５時間培養した。その後、ＴＵＮ
ＥＬ法により染色した。アポトーシスを起こした細胞
は、ダーク・ブラウンに染色された部分で示されてい
る。写真（生物の形態の写真）は、上段に比べて高い拡
大率で撮影した。

【図１２】ＡＳＫ１依存的なＤＮＡ断片化を示した写真
（電気泳動写真）である。

【図１３】様々な細胞におけるＴＮＦαによるＡＳＫ１
の活性化の時間経過を示した図である。（上段）ＡＳＫ
１をトランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞におけるＡＳ
Ｋ１活性の値を相対値で示した。結果は少なくとも５回
の独立した実験からの平均値である。エラー・バーは標
準偏差を示している。（下段）ＡＳＫ１をトランスフェ
クトしたＭｖ１Ｌｕ細胞、ＡＳＫ１をトランスフェクト
していない２９３細胞およびＡ６７３細胞におけるＴＮ
ＦαによるＡＳＫ１活性の時間経過（ｍｉｎ：分）を示
した図である。

【図１４】ＴＮＦαの用量依存的なＡＳＫ１の活性化を
示した図である。ＡＳＫ１活性の値は平均値で示した。
結果は少なくとも５回の独立した実験からの平均値であ
る。エラー・バーは標準偏差を示している。

【図１５】アクチノマイシンＤ存在下または非存在下
（none）でＴＮＦ−αで刺激（Stimulation ）した２９
３細胞におけるＤＮＡ断片化が、ＡＳＫ１（Ｋ７０９
Ｒ）のトランスフェクション（Transfection）によって
阻害されることを示した電気泳動写真である。

【図１６】ＴＮＦ−αで刺激（Stimulation ）したJurr
kat T 細胞におけるＤＮＡ断片化が、ＡＳＫ１（Ｋ７０
９Ｒ）のトランスフェクション（Transfection）によっ
て阻害されることを示した電気泳動写真である。図中、
「ｎｏｎｅ」は、トランスフェクションしなかった場合
または刺激がなかった場合を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年２月２６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１３】様々な細胞におけるＴＮＦαによるＡＳＫ１
の活性化の時間経過を示した図および電気泳動写真であ
る。（上段）ＡＳＫ１をトランスフェクトしたＭｖ１Ｌ
ｕ細胞におけるＡＳＫ１活性の値を相対値で示した。結
果は少なくとも５回の独立した実験からの平均値であ
る。エラー・バーは標準偏差を示している。（下段）Ａ
ＳＫ１をトランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞、ＡＳＫ
１をトランスフェクトしていない２９３細胞およびＡ６
７３細胞におけるＴＮＦαによるＡＳＫ１活性の時間経
過（ｍｉｎ：分）を示した電気泳動写真である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 9/12 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9/12 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ 21/08 Ｔ // Ａ６１Ｋ 39/395 37/02 ＡＤＵ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】プロテインキナーゼ触媒領域を有し、かつ
   ＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ
   活性を亢進する、タンパク質またはその誘導体。
2. 【請求項２】アポトーシスを誘導する、請求項１に記載
   のタンパク質またはその誘導体。
3. 【請求項３】前記アポトーシスが、ＳＡＰＫもしくはＪ
   ＮＫおよび／またはｐ３８の活性の亢進によって媒介さ
   れる、請求項２に記載のタンパク質またはその誘導体。
4. 【請求項４】腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）によって前記ＳＥ
   Ｋ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性
   亢進活性が亢進する、請求項１〜３のいずれか一項に記
   載のタンパク質またはその誘導体。
5. 【請求項５】プロテインキナーゼ触媒領域が、セリン／
   スレオニン・プロテインキナーゼ触媒領域である、請求
   項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質またはその
   誘導体。
6. 【請求項６】ヒト由来である、請求項１〜５のいずれか
   一項に記載のタンパク質またはその誘導体。
7. 【請求項７】配列番号１に記載のアミノ酸配列からな
   る、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質ま
   たはその誘導体。
8. 【請求項８】配列番号１のアミノ酸配列に１以上のアミ
   ノ酸配列が付加および／または挿入され、および／また
   は前記配列番号１のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が
   置換および／または欠失された、請求項７に記載のタン
   パク質またはその誘導体。
9. 【請求項９】配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質またはその誘導体。
10. 【請求項１０】配列番号１のアミノ酸配列からなり、プ
    ロテインキナーゼ活性を損なうように配列番号１のアミ
    ノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および／または
    挿入され、および／または配列番号１のアミノ酸配列の
    １以上のアミノ酸が置換および／または欠失された、タ
    ンパク質またはその誘導体。
11. 【請求項１１】置換：Ｋ７０９Ｒを有する、請求項１０
    に記載のタンパク質またはその誘導体。
12. 【請求項１２】請求項１〜９に記載のタンパク質または
    その誘導体をコードする塩基配列。
13. 【請求項１３】配列番号２のＤＮＡ配列の一部または全
    部を有する、請求項１２に記載の塩基配列。
14. 【請求項１４】請求項１０または１１に記載のタンパク
    質またはその誘導体をコードする塩基配列。
15. 【請求項１５】請求項１２または１３に記載の塩基配列
    を含んでなる、ベクター。
16. 【請求項１６】請求項１４に記載の塩基配列を含んでな
    る、ベクター。
17. 【請求項１７】プラスミドベクター、ウイルスベクタ
    ー、およびリポソームベクターからなる群から選択され
    る、請求項１５または１６に記載のベクター。
18. 【請求項１８】請求項１５〜１７のいずれか一項に記載
    のベクターによって形質転換された、宿主細胞（ただ
    し、ヒト細胞にあってはヒトから単離された細胞に限
    る）。
19. 【請求項１９】大腸菌、酵母、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、
    ミンク肺上皮細胞、リンパ細胞、繊維芽細胞、ＮＩＨ／
    ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、および腫瘍細胞
    からなる群から選択されるものである、請求項１８に記
    載の宿主細胞。
20. 【請求項２０】請求項１８または１９に記載の宿主細胞
    を培養し、そしてその培養物から請求項１〜１１のいず
    れか一項に記載のタンパク質またはそれらの誘導体を単
    離することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記
    載のタンパク質またはその誘導体の製造法。
21. 【請求項２１】請求項１〜９のいずれか一項に記載のタ
    ンパク質またはその誘導体を含んでなる、悪性腫瘍治療
    剤。
22. 【請求項２２】請求項１２または１３に記載の塩基配列
    を含んでなる悪性腫瘍遺伝子治療剤。
23. 【請求項２３】悪性腫瘍治療剤の製造のための、請求項
    １〜９のいずれか一項に記載のタンパク質またはその誘
    導体の使用。
24. 【請求項２４】悪性腫瘍遺伝子治療剤の製造のための、
    請求項１２または１３に記載の塩基配列の使用。
25. 【請求項２５】配列番号１の６５４〜６６９番のアミノ
    酸配列からなるペプチド。
26. 【請求項２６】配列番号１の６５４〜６６９番のアミノ
    酸配列を含んでなるペプチド。
27. 【請求項２７】請求項２５または２６に記載のペプチド
    と特異的に反応する、抗体。
28. 【請求項２８】ポリクローナル抗体である、請求項２７
    に記載の抗体。
29. 【請求項２９】請求項２７または２８に記載の抗体と特
    異的に反応する、タンパク質またはその誘導体。
30. 【請求項３０】請求項２７または２８に記載の抗体と特
    異的に反応する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の
    タンパク質またはその誘導体。