JPH1099078A - Ｒ−（−）−マンデル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子 - Google Patents
Ｒ−（−）−マンデル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子Info
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- JPH1099078A JPH1099078A JP8258785A JP25878596A JPH1099078A JP H1099078 A JPH1099078 A JP H1099078A JP 8258785 A JP8258785 A JP 8258785A JP 25878596 A JP25878596 A JP 25878596A JP H1099078 A JPH1099078 A JP H1099078A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 以下の(a) 又は(b) のタンパク質をコー
ドする遺伝子。 (a) 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b) 配列番号２記載のアミノ酸配列において一若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナ
ーゼ活性を有するタンパク質 【効果】 S-(+)-マンデル酸の効率的な生産を可能にす
るR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子を提供す
る。
ドする遺伝子。 (a) 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b) 配列番号２記載のアミノ酸配列において一若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナ
ーゼ活性を有するタンパク質 【効果】 S-(+)-マンデル酸の効率的な生産を可能にす
るR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子を提供す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なR-(-)-マン
デル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子に関する。この遺伝子
がコードするR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼは、
ラセミ体マンデル酸の中のR-(-)-マンデル酸のみを安息
香酸に変換する。従って、この酵素により、ラセミ体マ
ンデル酸からS-(+)-マンデル酸のみを特異的に精製する
ことができる。
デル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子に関する。この遺伝子
がコードするR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼは、
ラセミ体マンデル酸の中のR-(-)-マンデル酸のみを安息
香酸に変換する。従って、この酵素により、ラセミ体マ
ンデル酸からS-(+)-マンデル酸のみを特異的に精製する
ことができる。
【０００２】
【従来の技術】マンデル酸は、分子内に一つの不斉炭素
原子を持つ化合物であり、R-(-)-マンデル酸とS-(+)-マ
ンデル酸の２つの光学異性体がある。光学活性を有する
マンデル酸は、医薬合成品の原料として有用であるが、
効率的な合成方法等が開発されていないため、ラセミ体
マンデル酸が安価であるにもかかわらず、高価なものと
なっている。このため、従来から光学活性を有するマン
デル酸を効率的に合成又は精製するための様々な試みが
なされてきた。第一の方法は、異性体分離用カラムを用
いた方法である（例えば、パテントno.58177933）。し
かし、この方法では、光学的純度の高いものを得るのは
難しく、純度を上げると収量が減少する傾向がある。第
二の方法は、光学異性体を特異的に合成できる化学的方
法を用いるものである (Elliot,J.D. ら (1983)J.Org.C
hem.,46,2294）。
原子を持つ化合物であり、R-(-)-マンデル酸とS-(+)-マ
ンデル酸の２つの光学異性体がある。光学活性を有する
マンデル酸は、医薬合成品の原料として有用であるが、
効率的な合成方法等が開発されていないため、ラセミ体
マンデル酸が安価であるにもかかわらず、高価なものと
なっている。このため、従来から光学活性を有するマン
デル酸を効率的に合成又は精製するための様々な試みが
なされてきた。第一の方法は、異性体分離用カラムを用
いた方法である（例えば、パテントno.58177933）。し
かし、この方法では、光学的純度の高いものを得るのは
難しく、純度を上げると収量が減少する傾向がある。第
二の方法は、光学異性体を特異的に合成できる化学的方
法を用いるものである (Elliot,J.D. ら (1983)J.Org.C
hem.,46,2294）。
【０００３】これらの化学的方法は純度や収率、コスト
の点で問題があり、それに代わる方法として、種々の酵
素学的方法による光学分割が提案されてきた。例えば、
ラセミ体マンデル酸あるいはその誘導体中のS-(+)-マン
デル酸（あるいはその誘導体）を微生物の酵素を用いて
選択的に除去する方法がある (Yamamoto,K. ら(1992)J.
Ferment.Bioeng.,73,425-430 、Mori,K. ら(1980)Tetra
hedron 36,91-96、Tuchiya,S ら(1992)Biotech.Lett.1
4,1137-1142 、Hosono,K. ら(1990) J.Biotech.14,149-
156 ）。
の点で問題があり、それに代わる方法として、種々の酵
素学的方法による光学分割が提案されてきた。例えば、
ラセミ体マンデル酸あるいはその誘導体中のS-(+)-マン
デル酸（あるいはその誘導体）を微生物の酵素を用いて
選択的に除去する方法がある (Yamamoto,K. ら(1992)J.
Ferment.Bioeng.,73,425-430 、Mori,K. ら(1980)Tetra
hedron 36,91-96、Tuchiya,S ら(1992)Biotech.Lett.1
4,1137-1142 、Hosono,K. ら(1990) J.Biotech.14,149-
156 ）。
【０００４】YamazakiとMaeda は（Yamazaki,Y.,and Ma
eda,H.(1986) Arg.Biol.Chem.50,2621-2631 ）、ベンゾ
イル蟻酸よりR-(-)-マンデル酸を生産する方法を報告し
ている。この方法は、ストレプトコッカス(Streptococc
us faecalis IFO 12964)のベンゾイル蟻酸還元酵素を用
いるものであり、細胞抽出液に、ベンゾイル蟻酸、ベン
ゾイル蟻酸還酵素、ＮＡＤＨ及びＮＡＨ+ よりＮＡＤＨ
を再生産する系（例えばアルコールと脱水素酵素）を作
用させることによりほぼ純粋な(R)-(-)-マンデル酸を得
ている。また、1-フェニル-1,2-ジヒドロキシエタンの
酸化によって光学活性を持つマンデル酸を得る合成法も
提唱されている（Oda,S.ら(1992) Biosci.Biotech.Bioc
hem.56,1216-1220）。さらにα-ケトアルデヒドを原料
とした酵素的合成法も発表されている（Patterson,M.A.
ら(1981)J.Org.Chem.,46,4682-4685）。
eda,H.(1986) Arg.Biol.Chem.50,2621-2631 ）、ベンゾ
イル蟻酸よりR-(-)-マンデル酸を生産する方法を報告し
ている。この方法は、ストレプトコッカス(Streptococc
us faecalis IFO 12964)のベンゾイル蟻酸還元酵素を用
いるものであり、細胞抽出液に、ベンゾイル蟻酸、ベン
ゾイル蟻酸還酵素、ＮＡＤＨ及びＮＡＨ+ よりＮＡＤＨ
を再生産する系（例えばアルコールと脱水素酵素）を作
用させることによりほぼ純粋な(R)-(-)-マンデル酸を得
ている。また、1-フェニル-1,2-ジヒドロキシエタンの
酸化によって光学活性を持つマンデル酸を得る合成法も
提唱されている（Oda,S.ら(1992) Biosci.Biotech.Bioc
hem.56,1216-1220）。さらにα-ケトアルデヒドを原料
とした酵素的合成法も発表されている（Patterson,M.A.
ら(1981)J.Org.Chem.,46,4682-4685）。
【０００５】YamazakiとMaeda の方法は、第一に基質
（ベンゾイル蟻酸）が高価であること、第二にこの反応
はＮＡＤＨを消費するので、ＮＡＤＨをリサイクルする
方法をカップルさせなけらばならない等の欠点がある。
Oda らの方法は、(RS)-1-フェニル-1,2ジヒドロキシエ
タンを出発材料とし、これにペプトン等の培地で生育さ
せたBordetella paratertussis KPPA 20005を作用させ
ることにより、R-1-フェニル-1,2ジヒドロキシエタンの
みをR-(-)-マンデル酸に変換させるものである。この方
法の問題点は、菌をブロース等で培養しなければならな
いこと、この菌はR-(-)-マンデル酸脱水系酵素を持って
いるので、その発現を抑制するためにエタノールを適当
量加えなければならないこと等が挙げられる。
（ベンゾイル蟻酸）が高価であること、第二にこの反応
はＮＡＤＨを消費するので、ＮＡＤＨをリサイクルする
方法をカップルさせなけらばならない等の欠点がある。
Oda らの方法は、(RS)-1-フェニル-1,2ジヒドロキシエ
タンを出発材料とし、これにペプトン等の培地で生育さ
せたBordetella paratertussis KPPA 20005を作用させ
ることにより、R-1-フェニル-1,2ジヒドロキシエタンの
みをR-(-)-マンデル酸に変換させるものである。この方
法の問題点は、菌をブロース等で培養しなければならな
いこと、この菌はR-(-)-マンデル酸脱水系酵素を持って
いるので、その発現を抑制するためにエタノールを適当
量加えなければならないこと等が挙げられる。
【０００６】おそらく、最も有望なR-(-)-マンデル酸の
調整法はラセミ体マンデル酸中のS-(+)-マンデル酸をこ
の基質に特異的な脱水素酵素によって除去する方法であ
ろう。例えば、Evans,D.A.ら(1985)J.Am.Chem.Soc.107,
4346-4348 、Whitesides,G.M. ら(1981)J.Org.Chem.46,
4682-4685 、及びTakahashi E.らJ.Ferm.Bioeng 79,439
-442にその方法が述べられている。例えば、最近、Taka
hashi らは、Pseudomonas polycolor IFO 3918を用いる
ことにより、高純度のR-(-)-マンデル酸を高収率で得ら
れると報告している。ただし、この方法では、菌の培養
とR-(-)-マンデル酸の生産とは別れたステップであり、
また生産中にベンゾイルフォルメートの蓄積が起こり、
この中間物の完全分解には48時間を要するなどの欠点が
ある。Tuchiya らは、ラセミ体マンデル酸をほぼ完全に
R-(-)-マンデル酸に変換する方法を開発した。先ず、ラ
セミ体をアルカリゲネス(Alcaligenes brochisepticas
KU1201)の培養に加えると(S)-(+)-マンデル酸のみが特
異的にベンゾイル蟻酸に変換される。次に、ベンゾイル
蟻酸をストレプトコッカス(Streptococcus faecalis IF
O 12964)のベンゾイル蟻酸還元酵素を用いて、(R)-(-)-
マンデル酸に変換する方法である。しかし論文のデータ
によれば0.2％のマンデル酸を処理するのに、一週間を
要し、また、ベンゾイル蟻酸の還元は細胞抽出液を用
い、また、ＮＡＤＨを加えなければならないなどの理由
からYamazakiとMaeda の方法同様実用的なものではな
い。Oda らは、1-フェニル-1,2-エタンジオールより光
学純度の高いR-(-)-マンデル酸を醗酵によって作る方法
を提唱している。しかしその収量は低かった。一方、嶋
尾らは、マンデル酸分解菌であるPseudomonas putida A
10L株由来のマンデル酸ラセマーゼ欠損株を用いると、
ラセミ体マンデル酸中のS-(+)-マンデル酸のみが分解さ
れることを示し、この菌を用いたR-(-)-マンデル酸の光
学分割の可能性を示唆した（嶋尾ら、日本農芸化学会19
92年度大会講演要旨集、p551）。このように、 R-(-)-
マンデル酸の生産に関してはいくつかの方法が提案され
ているが、S-(+)-マンデル酸を光学分割によって得るこ
との出来る、安価な生物学的方法は示されていなかっ
た。
調整法はラセミ体マンデル酸中のS-(+)-マンデル酸をこ
の基質に特異的な脱水素酵素によって除去する方法であ
ろう。例えば、Evans,D.A.ら(1985)J.Am.Chem.Soc.107,
4346-4348 、Whitesides,G.M. ら(1981)J.Org.Chem.46,
4682-4685 、及びTakahashi E.らJ.Ferm.Bioeng 79,439
-442にその方法が述べられている。例えば、最近、Taka
hashi らは、Pseudomonas polycolor IFO 3918を用いる
ことにより、高純度のR-(-)-マンデル酸を高収率で得ら
れると報告している。ただし、この方法では、菌の培養
とR-(-)-マンデル酸の生産とは別れたステップであり、
また生産中にベンゾイルフォルメートの蓄積が起こり、
この中間物の完全分解には48時間を要するなどの欠点が
ある。Tuchiya らは、ラセミ体マンデル酸をほぼ完全に
R-(-)-マンデル酸に変換する方法を開発した。先ず、ラ
セミ体をアルカリゲネス(Alcaligenes brochisepticas
KU1201)の培養に加えると(S)-(+)-マンデル酸のみが特
異的にベンゾイル蟻酸に変換される。次に、ベンゾイル
蟻酸をストレプトコッカス(Streptococcus faecalis IF
O 12964)のベンゾイル蟻酸還元酵素を用いて、(R)-(-)-
マンデル酸に変換する方法である。しかし論文のデータ
によれば0.2％のマンデル酸を処理するのに、一週間を
要し、また、ベンゾイル蟻酸の還元は細胞抽出液を用
い、また、ＮＡＤＨを加えなければならないなどの理由
からYamazakiとMaeda の方法同様実用的なものではな
い。Oda らは、1-フェニル-1,2-エタンジオールより光
学純度の高いR-(-)-マンデル酸を醗酵によって作る方法
を提唱している。しかしその収量は低かった。一方、嶋
尾らは、マンデル酸分解菌であるPseudomonas putida A
10L株由来のマンデル酸ラセマーゼ欠損株を用いると、
ラセミ体マンデル酸中のS-(+)-マンデル酸のみが分解さ
れることを示し、この菌を用いたR-(-)-マンデル酸の光
学分割の可能性を示唆した（嶋尾ら、日本農芸化学会19
92年度大会講演要旨集、p551）。このように、 R-(-)-
マンデル酸の生産に関してはいくつかの方法が提案され
ているが、S-(+)-マンデル酸を光学分割によって得るこ
との出来る、安価な生物学的方法は示されていなかっ
た。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、異性体の混
合したラセミ体マンデル酸を出発材量として、簡単な発
酵方法を用いつつ、高純度のS-(+)-マンデル酸を得るこ
とを目的とする。
合したラセミ体マンデル酸を出発材量として、簡単な発
酵方法を用いつつ、高純度のS-(+)-マンデル酸を得るこ
とを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため、鋭意検討を重ねた結果、P. putida A10L
株のＤＮＡ中にR-(-)-マンデル酸を酸素分子存在下で安
息香酸に変換する酵素をコードするＤＮＡ断片が存在す
ることを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
即ち、 本発明は、以下の(a) 又は(b) のタンパク質を
コードする遺伝子である。
解決するため、鋭意検討を重ねた結果、P. putida A10L
株のＤＮＡ中にR-(-)-マンデル酸を酸素分子存在下で安
息香酸に変換する酵素をコードするＤＮＡ断片が存在す
ることを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
即ち、 本発明は、以下の(a) 又は(b) のタンパク質を
コードする遺伝子である。
【０００９】(a) 配列番号２記載のアミノ酸配列からな
るタンパク質 (b) 配列番号２記載のアミノ酸配列において一若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナ
ーゼ活性を有するタンパク質
るタンパク質 (b) 配列番号２記載のアミノ酸配列において一若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナ
ーゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼは、以下
の(a) 又は(b) のタンパク質をコードする。 (a) 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b) 配列番号２記載のアミノ酸配列において一若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナ
ーゼ活性を有するタンパク質 ここでいう「欠失、置換若しくは付加」は、本願の出願
時において常用される技術、例えば、部位特異的変異誘
発法（Nucleic Acid Research, Vol.10,No.20,P6487-65
00(1982)）により生じさせることができる。
本発明のR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼは、以下
の(a) 又は(b) のタンパク質をコードする。 (a) 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b) 配列番号２記載のアミノ酸配列において一若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナ
ーゼ活性を有するタンパク質 ここでいう「欠失、置換若しくは付加」は、本願の出願
時において常用される技術、例えば、部位特異的変異誘
発法（Nucleic Acid Research, Vol.10,No.20,P6487-65
00(1982)）により生じさせることができる。
【００１１】本遺伝子は、以下の手順で得ることができ
る。まず、P. putida A10L株からＤＮＡを抽出し、これ
を適当な制限酵素で部分分解する。得られたＤＮＡ断片
を適当なベクターにつなげ、これを用いて適当な宿主微
生物を形質転換し、P. putida A10L株由来のＤＮＡライ
ブラリーを作成する。次に、配列番号１記載のＤＮＡの
一部と同一のＤＮＡを合成し、それを標識する。この標
識したＤＮＡをプローブとして前記P. putida A10L株由
来のＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、プロ
ーブと強く結合する陽性クローンを選抜する。これによ
り、本遺伝子を得ることができる。ここで、抽出したＤ
ＮＡを部分分解する制限酵素としては、例えば、Sau3AI
を用いることができるが、これに限定されるわけではな
い。ＤＮＡ断片を挿入するベクターとしては、pLAFL3を
例示することができ、それを導入する宿主微生物として
は、大腸菌S17-1 株を例示することができる。
る。まず、P. putida A10L株からＤＮＡを抽出し、これ
を適当な制限酵素で部分分解する。得られたＤＮＡ断片
を適当なベクターにつなげ、これを用いて適当な宿主微
生物を形質転換し、P. putida A10L株由来のＤＮＡライ
ブラリーを作成する。次に、配列番号１記載のＤＮＡの
一部と同一のＤＮＡを合成し、それを標識する。この標
識したＤＮＡをプローブとして前記P. putida A10L株由
来のＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、プロ
ーブと強く結合する陽性クローンを選抜する。これによ
り、本遺伝子を得ることができる。ここで、抽出したＤ
ＮＡを部分分解する制限酵素としては、例えば、Sau3AI
を用いることができるが、これに限定されるわけではな
い。ＤＮＡ断片を挿入するベクターとしては、pLAFL3を
例示することができ、それを導入する宿主微生物として
は、大腸菌S17-1 株を例示することができる。
【００１２】また、本発明の遺伝子はＰＣＲを利用して
得ることも可能である。例えば、P.putida A10L株から
抽出したＤＮＡを鋳型とし、配列番号１に記載の塩基配
列の5'末端及び3'末端付近の塩基配列と同一又は相補的
なオリゴヌクレオチドを合成し、それらをプライマーと
して、ＰＣＲを行うことによっても本発明の遺伝子を得
ることができる。なお、本発明の遺伝子が導入された大
腸菌 JM101（pMS1638-42-6）は、工業技術院生命工学工
業技術研究所にFERM P-15884として寄託されている（寄
託日：平成８年９月26日）。本発明の遺伝子は、ラセミ
体マンデル酸中からR-(-)-マンデル酸のみを除去するこ
とのできるR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼをコー
ドするので、本遺伝子を利用することによりラセミ体マ
ンデル酸からS-(+)-マンデル酸を効率的に生産すること
ができる。
得ることも可能である。例えば、P.putida A10L株から
抽出したＤＮＡを鋳型とし、配列番号１に記載の塩基配
列の5'末端及び3'末端付近の塩基配列と同一又は相補的
なオリゴヌクレオチドを合成し、それらをプライマーと
して、ＰＣＲを行うことによっても本発明の遺伝子を得
ることができる。なお、本発明の遺伝子が導入された大
腸菌 JM101（pMS1638-42-6）は、工業技術院生命工学工
業技術研究所にFERM P-15884として寄託されている（寄
託日：平成８年９月26日）。本発明の遺伝子は、ラセミ
体マンデル酸中からR-(-)-マンデル酸のみを除去するこ
とのできるR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼをコー
ドするので、本遺伝子を利用することによりラセミ体マ
ンデル酸からS-(+)-マンデル酸を効率的に生産すること
ができる。
【００１３】
〔実施例１〕P. putida A10L株（Shimao,M. ら(1996)Bi
osci.Biotech.Biochem.60.1051-1055 ）及びその変異体
であるP. putida A10L-168株（Shimao,M. ら(1996)Bios
ci.Biotech.Biochem.60.1051-1055 ）を用いて、R-(-)-
マンデル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子のクローニングを
行った。P. putida A10L株は、R-(-)-及びS-(+)-マンデ
ル酸を資化でき、その物質を唯一の炭素源として良好な
生育を示す。この菌では、マンデル酸は、図１に示すよ
うに、マンデル酸ラセマーゼ（ＭＲ）、マンデル酸脱水
素酵素（ＭＤＨ）、ベンゾイル蟻酸脱炭酸酵素（ＢＦＤ
Ｃ）、ＮＡＤ+ −及びＮＡＤＰ+ −依存性ベンズアルデ
ヒド脱水素酵素（ＢＤＨ）によって代謝される。
osci.Biotech.Biochem.60.1051-1055 ）及びその変異体
であるP. putida A10L-168株（Shimao,M. ら(1996)Bios
ci.Biotech.Biochem.60.1051-1055 ）を用いて、R-(-)-
マンデル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子のクローニングを
行った。P. putida A10L株は、R-(-)-及びS-(+)-マンデ
ル酸を資化でき、その物質を唯一の炭素源として良好な
生育を示す。この菌では、マンデル酸は、図１に示すよ
うに、マンデル酸ラセマーゼ（ＭＲ）、マンデル酸脱水
素酵素（ＭＤＨ）、ベンゾイル蟻酸脱炭酸酵素（ＢＦＤ
Ｃ）、ＮＡＤ+ −及びＮＡＤＰ+ −依存性ベンズアルデ
ヒド脱水素酵素（ＢＤＨ）によって代謝される。
【００１４】一方、P. putida A10Lに由来する突然変異
株P. putida A10L-168株は、親株と同様に(S)-(+)-マン
デル酸、ベンゾイル蟻酸、又はベズアルデヒドを唯一の
炭素源として生育したが、親株と異なり(R)-(-)-マンデ
ル酸を唯一の炭素源としては生育できなかった。このこ
とから、P. putida A10L-168株はＭＲに欠損を持つ突然
変異体であると推定された。実際この株より調整した粗
抽出液では、ＭＤＨ、ＢＦＤＣ、ＢＤＨの活性が認めら
れたが、ＭＲの活性は認められなかった。
株P. putida A10L-168株は、親株と同様に(S)-(+)-マン
デル酸、ベンゾイル蟻酸、又はベズアルデヒドを唯一の
炭素源として生育したが、親株と異なり(R)-(-)-マンデ
ル酸を唯一の炭素源としては生育できなかった。このこ
とから、P. putida A10L-168株はＭＲに欠損を持つ突然
変異体であると推定された。実際この株より調整した粗
抽出液では、ＭＤＨ、ＢＦＤＣ、ＢＤＨの活性が認めら
れたが、ＭＲの活性は認められなかった。
【００１５】以下、クローニング工程について述べる。
P.putida A10L 株からMarmeer,J.(1961)J.Mol.Biol.3.2
08-218. 記載の方法によりＤＮＡを抽出し、これをSau3
AI制限酵素で部分分解した。このＤＮＡ断片を、広宿主
域クローニングベクターであるpLAFL3にクローン化し、
大腸菌S17-1 株（Simon,R.ら(1983)Bio/Technology 1,7
84-790）を形質転換することによって、P.putida A10L
株遺伝子ライブラリーを作成した。このライブラリーの
プラスミドを、前記のSimon らの方法に従って、P.puti
da A10L-168 株に接合伝達し、これらを(R)-(-)-マンデ
ル酸を唯一の炭素源として含む培地で培養し、同培地で
生育できるものだけを選抜した。この結果、４株が選抜
された。選抜された菌株に導入されているプラスミドを
Sambrook,J. ら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s,Cold Spring harbor,new York で記載されている方法
で抽出し、制限酵素EcoRI 、HindIII 、BamHI 、BgIII
を用いて制限酵素地図を作成し、プラスミドの構造を解
析したところ、二つのタイプが存在することが判明し
た。第一のタイプは、ＭＲをコードする遺伝子を有し、
P.putida A10L-168 株のＭＲをコードする遺伝子の欠損
を相補していた。第二のタイプは、ＭＲをコードするＤ
ＮＡを含んでおらず、予想されなかった形でＭＲをコー
ドする遺伝子の欠損を相補しているものと考えられた。
この第二のタイプに属するプラスミドの一つをpMS1638
と命名し、以下の解析に用いた。
P.putida A10L 株からMarmeer,J.(1961)J.Mol.Biol.3.2
08-218. 記載の方法によりＤＮＡを抽出し、これをSau3
AI制限酵素で部分分解した。このＤＮＡ断片を、広宿主
域クローニングベクターであるpLAFL3にクローン化し、
大腸菌S17-1 株（Simon,R.ら(1983)Bio/Technology 1,7
84-790）を形質転換することによって、P.putida A10L
株遺伝子ライブラリーを作成した。このライブラリーの
プラスミドを、前記のSimon らの方法に従って、P.puti
da A10L-168 株に接合伝達し、これらを(R)-(-)-マンデ
ル酸を唯一の炭素源として含む培地で培養し、同培地で
生育できるものだけを選抜した。この結果、４株が選抜
された。選抜された菌株に導入されているプラスミドを
Sambrook,J. ら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s,Cold Spring harbor,new York で記載されている方法
で抽出し、制限酵素EcoRI 、HindIII 、BamHI 、BgIII
を用いて制限酵素地図を作成し、プラスミドの構造を解
析したところ、二つのタイプが存在することが判明し
た。第一のタイプは、ＭＲをコードする遺伝子を有し、
P.putida A10L-168 株のＭＲをコードする遺伝子の欠損
を相補していた。第二のタイプは、ＭＲをコードするＤ
ＮＡを含んでおらず、予想されなかった形でＭＲをコー
ドする遺伝子の欠損を相補しているものと考えられた。
この第二のタイプに属するプラスミドの一つをpMS1638
と命名し、以下の解析に用いた。
【００１６】pMS1638 プラスミドに含まれるＤＮＡ断片
を種々の制限酵素で切断し、pKT231(Bagdasarian,M. ら
(1981)Gene 16:237-247.）などの広宿主域クローニング
ベクターに挿入した。この組換えプラスミドをP.putida
A10L-168 株に導入し、その菌株が(R)-(-)-マンデル酸
を唯一の炭素源として含む培地で生育できるかどうかを
調べた。この結果、約１kbのEcoRI-HindIII 断片をサブ
クローン化したpKT231プラスミドを導入した場合に、P.
putida A10L-168 株は(R)-(-)-マンデル酸を資化できる
ようになることがわかった。そこで、このEcoRI-HindII
I 断片をpUC18ベクターにサブクローン化し、pMS1638-4
2-6プラスミドを作成した。このpMS1638-42-6プラスミ
ドにサブクローン化されたＤＮＡ断片をdye terminator
cycle sequencing kit(Perkin Elmer Japan) を用い、
塩基配列決定を行い、373A DNA sequencer(Perkin Elme
r Japan)で解析した。これを図３に示す。また、決定し
た塩基配列のＯＦＲ領域を配列番号１に、それから推定
されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２記
載のアミノ酸配列により表されるタンパク質の分子量は
28016.9 と計算された。
を種々の制限酵素で切断し、pKT231(Bagdasarian,M. ら
(1981)Gene 16:237-247.）などの広宿主域クローニング
ベクターに挿入した。この組換えプラスミドをP.putida
A10L-168 株に導入し、その菌株が(R)-(-)-マンデル酸
を唯一の炭素源として含む培地で生育できるかどうかを
調べた。この結果、約１kbのEcoRI-HindIII 断片をサブ
クローン化したpKT231プラスミドを導入した場合に、P.
putida A10L-168 株は(R)-(-)-マンデル酸を資化できる
ようになることがわかった。そこで、このEcoRI-HindII
I 断片をpUC18ベクターにサブクローン化し、pMS1638-4
2-6プラスミドを作成した。このpMS1638-42-6プラスミ
ドにサブクローン化されたＤＮＡ断片をdye terminator
cycle sequencing kit(Perkin Elmer Japan) を用い、
塩基配列決定を行い、373A DNA sequencer(Perkin Elme
r Japan)で解析した。これを図３に示す。また、決定し
た塩基配列のＯＦＲ領域を配列番号１に、それから推定
されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２記
載のアミノ酸配列により表されるタンパク質の分子量は
28016.9 と計算された。
【００１７】〔実施例２〕pMS1638-42-6により大腸菌JM
101 株（宝酒造）を形質転換し、これを培養し、無細胞
抽出液を得た。この無細胞抽出液（10 mg protein/ml）
200 μl を100 μM の(R)-(-)-マンデル酸を含む1.8ml
のリン酸緩衝液（pH 7.0）に加え、30℃で一時間作用さ
せたところ、(R)-(-)-マンデル酸は完全に分解されてお
り、その代わりに約100 μM の安息香酸が生成してい
た。以上のことから、上記大腸菌の生産する酵素は、一
分子の(R)-(-)-マンデル酸と一分子の酸素を消費して一
分子の安息香酸を生成するものであり（図２）、(R)-
(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼと呼ばれるべきもの
である。
101 株（宝酒造）を形質転換し、これを培養し、無細胞
抽出液を得た。この無細胞抽出液（10 mg protein/ml）
200 μl を100 μM の(R)-(-)-マンデル酸を含む1.8ml
のリン酸緩衝液（pH 7.0）に加え、30℃で一時間作用さ
せたところ、(R)-(-)-マンデル酸は完全に分解されてお
り、その代わりに約100 μM の安息香酸が生成してい
た。以上のことから、上記大腸菌の生産する酵素は、一
分子の(R)-(-)-マンデル酸と一分子の酸素を消費して一
分子の安息香酸を生成するものであり（図２）、(R)-
(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼと呼ばれるべきもの
である。
【００１８】〔実施例３〕pMS1638-42-6により大腸菌JM
101 株を形質転換した。この大腸菌を、(S)-(+)-マンデ
ル酸及び(R)-(-)-マンデル酸をそれぞれ１g/l 、ブトウ
糖を５mM、アンピシリン100 μg/mlを含む無機塩培地中
で培養した。一昼夜培養後、(S)-(+)-マンデル酸と(R)-
(-)-マンデル酸の残存量を計測したところ、培地中の
(R)-(-)-マンデル酸は完全に分解されたが、(S)-(+)-マ
ンデル酸の濃度は、培養初期のそれと同じであった。こ
の実験より、pMS1638-42-6を導入した大腸菌をラセミ体
マンデル酸に作用させることにより、(S)-(+)-マンデル
酸を容易に濃縮できることが示された。
101 株を形質転換した。この大腸菌を、(S)-(+)-マンデ
ル酸及び(R)-(-)-マンデル酸をそれぞれ１g/l 、ブトウ
糖を５mM、アンピシリン100 μg/mlを含む無機塩培地中
で培養した。一昼夜培養後、(S)-(+)-マンデル酸と(R)-
(-)-マンデル酸の残存量を計測したところ、培地中の
(R)-(-)-マンデル酸は完全に分解されたが、(S)-(+)-マ
ンデル酸の濃度は、培養初期のそれと同じであった。こ
の実験より、pMS1638-42-6を導入した大腸菌をラセミ体
マンデル酸に作用させることにより、(S)-(+)-マンデル
酸を容易に濃縮できることが示された。
【００１９】
【発明の効果】本発明は、新規なR-(-)-マンデル酸モノ
オキシゲナーゼ遺伝子を提供する。この遺伝子がコード
するR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼは、ラセミ体
マンデル酸の中のR-(-)-マンデル酸のみを安息香酸に変
換するので、この酵素を利用すれば、ラセミ体マンデル
酸を原料としてS-(+)-マンデル酸を効率的に生産するこ
とができる。
オキシゲナーゼ遺伝子を提供する。この遺伝子がコード
するR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼは、ラセミ体
マンデル酸の中のR-(-)-マンデル酸のみを安息香酸に変
換するので、この酵素を利用すれば、ラセミ体マンデル
酸を原料としてS-(+)-マンデル酸を効率的に生産するこ
とができる。
【００２０】
配列番号：１ 配列の長さ：７５６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putid
a） 株名 ：A10L 配列 ATGATGACCGCAACGGAACAAAGCCTGCGCCAGGAGCTGGCCGCCTGCTATCGGCTGATCGCCCATTTCCGC ATGAGCGACCTGATATTCACCCATATTTCCCTGCGCCTGCCGGGGCCGGAGCACCACTTCCTGATCAACCCG TACGGCTTGCTGTTCGATGAGATCACGGCCTCCAGCCTGGTGAAGATCGACCTGCAAGGCCGGCCAGTGGAA GCGACGCCGCACCCGGTCAACCCGGCCGGTTTCGTCATCCACAGCGCCATCCATGCTGCCCGCGAGGATGCC CGTTGTGTGCTGCACACCCACACCCGGGCAGGTTGTGCGGTGGCGGCGCTGGAATGTGGGCTGCTGCCGCTC AATCAGATGTCCATGGAGTTTTATGGCAAGGTGGCGTACCACGCCTATGAAGGGATTGCGCTGGACATGGAT GAGCAGCGAAGGCTGGTAGCCGACCTGGGCGACAAGCCGGTGATGATCCTGCGTAACCATGGCCTGCTGACC ACCGGGCGCAGCGTGGCCGAAGCGTTCCTGCGCATGTACTACCTGGAGAAGGCGTGCGAGATCCAGTTGGCG GCACAGAGTGCCGGGCAGGTGATTTTACCGCCCGCCGAAGTGTGTAGGCATACCGAGCGGCAGTTCAATGAT CCGGGGCGGGGCTTGAAGCAGGGCGAGCTGGCGGATCCGGATGCGCTGCAGCTGGCGTGGGCGGCGTTGTTG CGGATGCTGGAAAGGGTGGCGCCTGGTTATCGGAAC
a） 株名 ：A10L 配列 ATGATGACCGCAACGGAACAAAGCCTGCGCCAGGAGCTGGCCGCCTGCTATCGGCTGATCGCCCATTTCCGC ATGAGCGACCTGATATTCACCCATATTTCCCTGCGCCTGCCGGGGCCGGAGCACCACTTCCTGATCAACCCG TACGGCTTGCTGTTCGATGAGATCACGGCCTCCAGCCTGGTGAAGATCGACCTGCAAGGCCGGCCAGTGGAA GCGACGCCGCACCCGGTCAACCCGGCCGGTTTCGTCATCCACAGCGCCATCCATGCTGCCCGCGAGGATGCC CGTTGTGTGCTGCACACCCACACCCGGGCAGGTTGTGCGGTGGCGGCGCTGGAATGTGGGCTGCTGCCGCTC AATCAGATGTCCATGGAGTTTTATGGCAAGGTGGCGTACCACGCCTATGAAGGGATTGCGCTGGACATGGAT GAGCAGCGAAGGCTGGTAGCCGACCTGGGCGACAAGCCGGTGATGATCCTGCGTAACCATGGCCTGCTGACC ACCGGGCGCAGCGTGGCCGAAGCGTTCCTGCGCATGTACTACCTGGAGAAGGCGTGCGAGATCCAGTTGGCG GCACAGAGTGCCGGGCAGGTGATTTTACCGCCCGCCGAAGTGTGTAGGCATACCGAGCGGCAGTTCAATGAT CCGGGGCGGGGCTTGAAGCAGGGCGAGCTGGCGGATCCGGATGCGCTGCAGCTGGCGTGGGCGGCGTTGTTG CGGATGCTGGAAAGGGTGGCGCCTGGTTATCGGAAC
【００２１】配列番号：２ 配列の長さ：２５２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putid
a） 株名 ：A10L 配列 ＭＭＴＡＴＥＱＳＬＲＱＥＬＡＡＣＹＲＬＩＡＨＦＲＭＳＤＬＩＦＴＨＩＳＬＲ
ＬＰＧＰＥＨＨＦＬＩＮＰＹＧＬＬＦＤＥＩＴＡＳＳＬＶＫＩＤＬＱＧＲＰＶＥ ＡＴＰＨＰＶＮＰＡＧＦＶＩＨＳＡＩＨＡＡＲＥＤＡＲＣＶＬＨＴＨＴＲＡＧＣ
ＡＶＡＡＬＥＣＧＬＬＰＬＮＱＭＳＭＥＦＹＧＫＶＡＹＨＡＹＥＧＩＡＬＤＭＤ ＥＱＲＲＬＶＡＤＬＧＤＫＰＶＭＩＬＲＮＨＧＬＬＴＴＧＲＳＶＡＥＡＦＬＲＭ
ＹＹＬＥＫＡＣＥＩＱＬＡＡＱＳＡＧＱＶＩＬＰＰＡＥＶＣＲＨＴＥＲＱＦＮＤ ＰＧＲＧＬＫＱＧＥＬＡＤＰＤＡＬＱＬＡＷＡＡＬＬＲＭＬＥＲＶＡＰＧＹＲＮ
a） 株名 ：A10L 配列 ＭＭＴＡＴＥＱＳＬＲＱＥＬＡＡＣＹＲＬＩＡＨＦＲＭＳＤＬＩＦＴＨＩＳＬＲ
ＬＰＧＰＥＨＨＦＬＩＮＰＹＧＬＬＦＤＥＩＴＡＳＳＬＶＫＩＤＬＱＧＲＰＶＥ ＡＴＰＨＰＶＮＰＡＧＦＶＩＨＳＡＩＨＡＡＲＥＤＡＲＣＶＬＨＴＨＴＲＡＧＣ
ＡＶＡＡＬＥＣＧＬＬＰＬＮＱＭＳＭＥＦＹＧＫＶＡＹＨＡＹＥＧＩＡＬＤＭＤ ＥＱＲＲＬＶＡＤＬＧＤＫＰＶＭＩＬＲＮＨＧＬＬＴＴＧＲＳＶＡＥＡＦＬＲＭ
ＹＹＬＥＫＡＣＥＩＱＬＡＡＱＳＡＧＱＶＩＬＰＰＡＥＶＣＲＨＴＥＲＱＦＮＤ ＰＧＲＧＬＫＱＧＥＬＡＤＰＤＡＬＱＬＡＷＡＡＬＬＲＭＬＥＲＶＡＰＧＹＲＮ
【図１】Ｐ．ｐｕｔｉｄａ Ａ１０Ｌ 株でのマンデル
酸の分解経路を示す図である。
酸の分解経路を示す図である。
【図２】R-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼの作用機
作を示す図である。
作を示す図である。
【図３】R-(-)-マンデル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子を
含むEcoRI-HindIII 断片の塩基配列を示す図である。
含むEcoRI-HindIII 断片の塩基配列を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】 以下の(a) 又は(b) のタンパク質をコー
ドする遺伝子。 (a) 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b) 配列番号２記載のアミノ酸配列において一若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつR-(-)-マンデル酸モノオキシゲナ
ーゼ活性を有するタンパク質
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8258785A JPH1099078A (ja) | 1996-09-30 | 1996-09-30 | Ｒ−（−）−マンデル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8258785A JPH1099078A (ja) | 1996-09-30 | 1996-09-30 | Ｒ−（−）−マンデル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1099078A true JPH1099078A (ja) | 1998-04-21 |
Family
ID=17325047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8258785A Pending JPH1099078A (ja) | 1996-09-30 | 1996-09-30 | Ｒ−（−）−マンデル酸モノオキシゲナーゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1099078A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100372926C (zh) * | 2005-06-23 | 2008-03-05 | 华东理工大学 | 恶臭假单胞菌及其在拆分扁桃酸外消旋体中的应用 |
| US7541168B2 (en) | 2000-07-18 | 2009-06-02 | National Research Council Of Canada | Recombinant cyclopentanone monooxygenase [cpmo] |
| WO2025253874A1 (ja) * | 2024-06-03 | 2025-12-11 | ニプロ株式会社 | マンデル酸の測定方法、及びそれに用いられる測定キット |
-
1996
- 1996-09-30 JP JP8258785A patent/JPH1099078A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7541168B2 (en) | 2000-07-18 | 2009-06-02 | National Research Council Of Canada | Recombinant cyclopentanone monooxygenase [cpmo] |
| CN100372926C (zh) * | 2005-06-23 | 2008-03-05 | 华东理工大学 | 恶臭假单胞菌及其在拆分扁桃酸外消旋体中的应用 |
| WO2025253874A1 (ja) * | 2024-06-03 | 2025-12-11 | ニプロ株式会社 | マンデル酸の測定方法、及びそれに用いられる測定キット |
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