JPH11108929A - 微粒子増強光分散凝集測定法 - Google Patents
微粒子増強光分散凝集測定法Info
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- JPH11108929A JPH11108929A JP10225991A JP22599198A JPH11108929A JP H11108929 A JPH11108929 A JP H11108929A JP 10225991 A JP10225991 A JP 10225991A JP 22599198 A JP22599198 A JP 22599198A JP H11108929 A JPH11108929 A JP H11108929A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、広いダイナミックレンジを有す
る、アナライトの量を測定するための新しい微粒子増強
光分散凝集測定法、およびその測定法を実施するための
微粒子試薬を提供する。 【解決手段】 アナライトに対して高反応性の少なくと
も１つの結合パートナーを有する強い光分散性の粒子
と、アナライトに対して低反応性の少なくとも１つの結
合パートナーを有する弱い光分散性の粒子の混合物を使
用することからなる、アナライトの量を測定するための
微粒子増強光分散凝集測定法は、予想外に広いダイナミ
ックレンジ（ＤＲ）を示す。
る、アナライトの量を測定するための新しい微粒子増強
光分散凝集測定法、およびその測定法を実施するための
微粒子試薬を提供する。 【解決手段】 アナライトに対して高反応性の少なくと
も１つの結合パートナーを有する強い光分散性の粒子
と、アナライトに対して低反応性の少なくとも１つの結
合パートナーを有する弱い光分散性の粒子の混合物を使
用することからなる、アナライトの量を測定するための
微粒子増強光分散凝集測定法は、予想外に広いダイナミ
ックレンジ（ＤＲ）を示す。
Description
【０００１】本発明は、アナライトの量を測定するため
の新しい微粒子増強光分散凝集測定法(microparticle e
nhanced light scattering agglutination assay）、お
よびその測定法を実施するための微粒子試薬に関する。
の新しい微粒子増強光分散凝集測定法(microparticle e
nhanced light scattering agglutination assay）、お
よびその測定法を実施するための微粒子試薬に関する。
【０００２】微粒子凝集試験は、広範囲のサイズを有す
る均一なラテックス粒子を生産するための信頼できる生
産法が出現してから、ジェイ・シンガーとシー・プロッ
ツ（Singer J. and Plotz C.）、１９５６、Ａｍ．Ｊ．
Ｍｅｄ．２１、８８８−８９２により、リウマチ因子の
検出のために、最初に記載された。次に濁度法とネフェ
ロメトリー法による凝集反応の検出により、ジー・デゼ
リック（Dezelic G.）ら、１９７１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．２０、５５３−５６０とジェイ・グランゲ
(Grange J.）ら、１９７７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ、１８、３６５−７５により記載されたよう
な、真に定量的な微粒子増強光分散凝集試験の開発が可
能になった。
る均一なラテックス粒子を生産するための信頼できる生
産法が出現してから、ジェイ・シンガーとシー・プロッ
ツ（Singer J. and Plotz C.）、１９５６、Ａｍ．Ｊ．
Ｍｅｄ．２１、８８８−８９２により、リウマチ因子の
検出のために、最初に記載された。次に濁度法とネフェ
ロメトリー法による凝集反応の検出により、ジー・デゼ
リック（Dezelic G.）ら、１９７１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．２０、５５３−５６０とジェイ・グランゲ
(Grange J.）ら、１９７７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ、１８、３６５−７５により記載されたよう
な、真に定量的な微粒子増強光分散凝集試験の開発が可
能になった。
【０００３】微粒子増強光分散凝集測定試験は、準均一
的であり、分離および洗浄工程を全く必要としない。す
なわちこれは、通常使用される臨床化学分析機または専
用のネフェロメトリー装置を用いる自動化のための要件
を満たしている。このような試験法は、微粒子を使用し
ない直接凝集試験と比較して、２〜３オーダーの高感度
（１０-11mol/lのアナライトまで）を有し、さらにマト
リックスの妨害が少なく、柔軟性が高い。
的であり、分離および洗浄工程を全く必要としない。す
なわちこれは、通常使用される臨床化学分析機または専
用のネフェロメトリー装置を用いる自動化のための要件
を満たしている。このような試験法は、微粒子を使用し
ない直接凝集試験と比較して、２〜３オーダーの高感度
（１０-11mol/lのアナライトまで）を有し、さらにマト
リックスの妨害が少なく、柔軟性が高い。
【０００４】前記のような好ましい特徴のために、微粒
子増強光分散凝集測定試験は、現在腫瘍マーカーのよう
なタンパク質（例えば、エス・エダ（Eda S.）ら、１９
９３、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２
２、９９−１０３、または１９９２、「臨床生化学の進
歩(Progress in Clinical Biochemistry）」、ケー・ミ
ヤイ（K. Miyai）ら、２６５−２６７頁、エルセビア・
パブリッシャーズ(Elsevier Publishers）、アムステル
ダム、オランダ、を参照）、特異的タンパク質（例え
ば、ジェイ・ダブリュー・ウィンケス(Winkes J.W.）
ら、１９８９、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５／２、３０３
−３０７、またはエル・チロ(Chirot L.）ら、１９９
２、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｉｍ．５０、１４３−１４
７を参照）、乱用薬物（drugs of abuse）（例えば、デ
ィー・アムブルスター（Ambruster D.）ら、１９９２、
Ｊ．Ａｎａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１６、１７２−１７５
を参照）および治療用薬剤（例えば、「ＲＤＳ法マニュ
アルコバス（登録商標）インテグラ（登録商標）１９９
６；ジゴキシン」、エフ・ホフマン−ラ・ロッシュ・エ
ー・ジー(F. Hoffmann-La Roche A.G.）、バーゼル、ス
イス、を参照）の定量に日常的に使用されている。
子増強光分散凝集測定試験は、現在腫瘍マーカーのよう
なタンパク質（例えば、エス・エダ（Eda S.）ら、１９
９３、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２
２、９９−１０３、または１９９２、「臨床生化学の進
歩(Progress in Clinical Biochemistry）」、ケー・ミ
ヤイ（K. Miyai）ら、２６５−２６７頁、エルセビア・
パブリッシャーズ(Elsevier Publishers）、アムステル
ダム、オランダ、を参照）、特異的タンパク質（例え
ば、ジェイ・ダブリュー・ウィンケス(Winkes J.W.）
ら、１９８９、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５／２、３０３
−３０７、またはエル・チロ(Chirot L.）ら、１９９
２、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｉｍ．５０、１４３−１４
７を参照）、乱用薬物（drugs of abuse）（例えば、デ
ィー・アムブルスター（Ambruster D.）ら、１９９２、
Ｊ．Ａｎａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１６、１７２−１７５
を参照）および治療用薬剤（例えば、「ＲＤＳ法マニュ
アルコバス（登録商標）インテグラ（登録商標）１９９
６；ジゴキシン」、エフ・ホフマン−ラ・ロッシュ・エ
ー・ジー(F. Hoffmann-La Roche A.G.）、バーゼル、ス
イス、を参照）の定量に日常的に使用されている。
【０００５】しかし、微粒子増強光分散凝集測定法の欠
点は、そのダイナミックレンジが狭いことである。検出
限界に対する上の測定上限の比として定義されるダイナ
ミックレンジは、これらの測定法については通常わずか
に２オーダーの大きさである。このダイナミックレンジ
が狭いことのため、最初の試験は失敗になることがしば
しばあり、試料の希釈の程度を変更して再検査すること
になる。従ってこのダイナミックレンジの狭さは、余分
な費用と時間を必要とし、いずれもこれらの測定を実施
している検査室にとっては決定的に重要である。
点は、そのダイナミックレンジが狭いことである。検出
限界に対する上の測定上限の比として定義されるダイナ
ミックレンジは、これらの測定法については通常わずか
に２オーダーの大きさである。このダイナミックレンジ
が狭いことのため、最初の試験は失敗になることがしば
しばあり、試料の希釈の程度を変更して再検査すること
になる。従ってこのダイナミックレンジの狭さは、余分
な費用と時間を必要とし、いずれもこれらの測定を実施
している検査室にとっては決定的に重要である。
【０００６】従って本発明が取り組むべき問題は、微粒
子増強光分散凝集測定法を提供し、これまで知られてい
る微粒子増強光分散凝集試験より広いダイナミックレン
ジを提供するこの測定法を実施するための微粒子試薬を
提供することである。
子増強光分散凝集測定法を提供し、これまで知られてい
る微粒子増強光分散凝集試験より広いダイナミックレン
ジを提供するこの測定法を実施するための微粒子試薬を
提供することである。
【０００７】米国特許第４，５９５，６６１号は、不均
一サンドイッチ免疫測定法について記載し、その中で、
フック作用（すなわち、高い抗原濃度でシグナルが低下
することとして定義される）は、不溶性の捕捉抗体以外
に、抗原に対して異なる親和性と異なる特異性を有する
２つの可溶性トレーサー抗体を使用することにより、避
けられることを記載している（親和性の弱い抗体は、抗
原濃度の高いところでのみ大きく寄与し、従ってフック
作用が避けられる）。この特許は、その発明の例示され
た２つの測定法は、先行技術の測定法と同じダイナミッ
クレンジを有すると述べている（カラム６の４２〜４３
行、およびカラム８の１４〜１５行を参照）。
一サンドイッチ免疫測定法について記載し、その中で、
フック作用（すなわち、高い抗原濃度でシグナルが低下
することとして定義される）は、不溶性の捕捉抗体以外
に、抗原に対して異なる親和性と異なる特異性を有する
２つの可溶性トレーサー抗体を使用することにより、避
けられることを記載している（親和性の弱い抗体は、抗
原濃度の高いところでのみ大きく寄与し、従ってフック
作用が避けられる）。この特許は、その発明の例示され
た２つの測定法は、先行技術の測定法と同じダイナミッ
クレンジを有すると述べている（カラム６の４２〜４３
行、およびカラム８の１４〜１５行を参照）。
【０００８】ＰＣＴ特許公報８９／１１１０１号は、フ
ローサイトメトリーによる測定法に関し、これは、同じ
アナライトに対して特異性は同じであるが親和性が異な
る免疫学的結合パートナーの固相担体として、２つの区
別可能な粒子（例えば、異なるサイズの粒子）を使用し
ている。異なるサイズの担体粒子は、光分散性が異なる
ため、２つの標準曲線を作成することが可能であり、フ
ローサイトメトリーアナライザーのキャピラリー中で、
分離後区別される。この公報およびその発明者の以後の
文献、ティー・リンドモ(T. Lindmo）、１９９０、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２６、１８３−１
８９は、同じエピトープに対してそれぞれ高親和性抗体
かまたは低親和性抗体、および別のエピトープに対する
結合体として可溶性の標識された第３の抗体でコーティ
ングされた、直径７μｍまたは１０μｍの粒子を使用す
る癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の測定法を具体的に記載して
いる。フローサイトメーターは、両方の型の粒子に結合
した結合体の蛍光強度を記録し、２つの別々の標準曲線
をプロットする。この系は、２つの免疫測定法（１つ
は、高親和性抗体でコーティングされた直径７μｍの粒
子を用いて、好ましくは最初に抗原に結合し、その標準
曲線は低濃度のアナライトで作用するもの、他の１つ
は、低親和性抗体でコーティングされた直径１０μｍの
粒子を用いて、その標準曲線は、最初の標準曲線が平坦
になってから作用するもの）が平行して独立に実施され
たように、データを解析することを可能にする、高性能
の装置および注意深く設計された強力な分析ソフトウェ
アを使用して、広いダイナミックレンジを達成する。
ローサイトメトリーによる測定法に関し、これは、同じ
アナライトに対して特異性は同じであるが親和性が異な
る免疫学的結合パートナーの固相担体として、２つの区
別可能な粒子（例えば、異なるサイズの粒子）を使用し
ている。異なるサイズの担体粒子は、光分散性が異なる
ため、２つの標準曲線を作成することが可能であり、フ
ローサイトメトリーアナライザーのキャピラリー中で、
分離後区別される。この公報およびその発明者の以後の
文献、ティー・リンドモ(T. Lindmo）、１９９０、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２６、１８３−１
８９は、同じエピトープに対してそれぞれ高親和性抗体
かまたは低親和性抗体、および別のエピトープに対する
結合体として可溶性の標識された第３の抗体でコーティ
ングされた、直径７μｍまたは１０μｍの粒子を使用す
る癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の測定法を具体的に記載して
いる。フローサイトメーターは、両方の型の粒子に結合
した結合体の蛍光強度を記録し、２つの別々の標準曲線
をプロットする。この系は、２つの免疫測定法（１つ
は、高親和性抗体でコーティングされた直径７μｍの粒
子を用いて、好ましくは最初に抗原に結合し、その標準
曲線は低濃度のアナライトで作用するもの、他の１つ
は、低親和性抗体でコーティングされた直径１０μｍの
粒子を用いて、その標準曲線は、最初の標準曲線が平坦
になってから作用するもの）が平行して独立に実施され
たように、データを解析することを可能にする、高性能
の装置および注意深く設計された強力な分析ソフトウェ
アを使用して、広いダイナミックレンジを達成する。
【０００９】フローサイトメトリーと微粒子増強光分散
凝集測定法による測定法は、全く異なる原理に依存す
る。フローサイトメトリーによる測定法では、微粒子の
凝集はなく、可溶性標識抗体の量は、粒子が分離される
ため各粒子について個々に測定され、例えば異なるサイ
ズのために区別できるような特徴があるなら、フローサ
イトメーターにより区別される。区別できる特徴がある
ため、多くの較正曲線が作成される。微粒子増強光分散
凝集測定法では、濁度法又はネフェロメトリー法のよう
に、各粒子の個々の寄与を測定することなく、または区
別できる特徴を有する粒子の間を区別することなく、微
粒子およびアナライトに結合した結合パートナーの凝集
が全体として測定され、その結果１つの較正曲線のみが
作成される。
凝集測定法による測定法は、全く異なる原理に依存す
る。フローサイトメトリーによる測定法では、微粒子の
凝集はなく、可溶性標識抗体の量は、粒子が分離される
ため各粒子について個々に測定され、例えば異なるサイ
ズのために区別できるような特徴があるなら、フローサ
イトメーターにより区別される。区別できる特徴がある
ため、多くの較正曲線が作成される。微粒子増強光分散
凝集測定法では、濁度法又はネフェロメトリー法のよう
に、各粒子の個々の寄与を測定することなく、または区
別できる特徴を有する粒子の間を区別することなく、微
粒子およびアナライトに結合した結合パートナーの凝集
が全体として測定され、その結果１つの較正曲線のみが
作成される。
【００１０】上記問題は、添付の特許請求の範囲のセッ
トで定義される本発明により解決される。
トで定義される本発明により解決される。
【００１１】本発明は、アナライトに対して高反応性の
少なくとも１つの結合パートナーを有する強い光分散性
の粒子と、アナライトに対して低反応性の少なくとも１
つの結合パートナーを有する弱い光分散性の粒子の混合
物を使用することからなる、アナライトの量を測定する
ための微粒子増強光分散凝集測定法を提供する。本発明
の測定法は、予想外に広いダイナミックレンジ（ＤＲ）
を示す。
少なくとも１つの結合パートナーを有する強い光分散性
の粒子と、アナライトに対して低反応性の少なくとも１
つの結合パートナーを有する弱い光分散性の粒子の混合
物を使用することからなる、アナライトの量を測定する
ための微粒子増強光分散凝集測定法を提供する。本発明
の測定法は、予想外に広いダイナミックレンジ（ＤＲ）
を示す。
【００１２】「強い光分散性の粒子」および「弱い光分
散性の粒子」という表現は、任意のサイズおよび任意の
材料の微粒子を意味し、粒子あたりの光の分散は、後者
の粒子より前者の粒子にとって実質的により重要であ
る。微粒子は通常、狭いサイズの分布を有してほぼ球形
であり、そのサイズを代表するものはその平均直径であ
る。光分散の法則（ディー・ジェイ・ニューマン（D.J.
Newman）ら、１９９２，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．２９，２２−４２）に従うと、強い光分散性は、
大きい粒子サイズおよび／または粒子と媒体との屈折率
の高い比率に由来し、弱い光分散性は、小さい粒子サイ
ズおよび／または粒子と媒体との屈折率の低い比率に由
来する。例えばレイリー（Rayleigh）の光分散の法則
（ディー・ジェイ・ニューマン（D.J.Newman）ら、上記
引用文献）は、確かに以下の式で表される：
散性の粒子」という表現は、任意のサイズおよび任意の
材料の微粒子を意味し、粒子あたりの光の分散は、後者
の粒子より前者の粒子にとって実質的により重要であ
る。微粒子は通常、狭いサイズの分布を有してほぼ球形
であり、そのサイズを代表するものはその平均直径であ
る。光分散の法則（ディー・ジェイ・ニューマン（D.J.
Newman）ら、１９９２，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．２９，２２−４２）に従うと、強い光分散性は、
大きい粒子サイズおよび／または粒子と媒体との屈折率
の高い比率に由来し、弱い光分散性は、小さい粒子サイ
ズおよび／または粒子と媒体との屈折率の低い比率に由
来する。例えばレイリー（Rayleigh）の光分散の法則
（ディー・ジェイ・ニューマン（D.J.Newman）ら、上記
引用文献）は、確かに以下の式で表される：
【００１３】
【数１】Ｉ＝Ｉ0 １６π4 Ｒ4 （（ｎ2 −１）／（ｎ2
＋２））2 ／ｒ2 λ4 、
＋２））2 ／ｒ2 λ4 、
【００１４】式中、Ｉは、検出器で測定した光強度であ
り、Ｉ0 は、媒体中の光強度であり、λは、媒体中の波
長であり、Ｒは、微粒子の半径であり、ｒは、検出器と
分散機の間の距離であり、ｎは、ｎ1 ／ｎ0 であり、ｎ
1 は、粒子の屈折率であり、ｎ0 は、媒体の屈折率であ
る。
り、Ｉ0 は、媒体中の光強度であり、λは、媒体中の波
長であり、Ｒは、微粒子の半径であり、ｒは、検出器と
分散機の間の距離であり、ｎは、ｎ1 ／ｎ0 であり、ｎ
1 は、粒子の屈折率であり、ｎ0 は、媒体の屈折率であ
る。
【００１５】微粒子のサイズおよび／または屈折率比
は、これらは凝集した微粒子の検出に使用される波長で
光の分散を引き起こすようなものである。このサイズ
は、一般に波長より実質的に小さいかまたはわずかに小
さくなるように選択される。検出波長は、通常３００nm
〜１２００nmである。微粒子の平均経は、３０〜６００
nmが適切であり、好ましくは５０〜５００nmである。
は、これらは凝集した微粒子の検出に使用される波長で
光の分散を引き起こすようなものである。このサイズ
は、一般に波長より実質的に小さいかまたはわずかに小
さくなるように選択される。検出波長は、通常３００nm
〜１２００nmである。微粒子の平均経は、３０〜６００
nmが適切であり、好ましくは５０〜５００nmである。
【００１６】強い光分散性の粒子は、弱い光分散性の粒
子より好ましくは大きいサイズおよび／または大きい屈
折率を有する。
子より好ましくは大きいサイズおよび／または大きい屈
折率を有する。
【００１７】本発明の１つの好適な実施態様によれば、
「強い光分散性の粒子」と「弱い光分散性の粒子」は、
同じサイズの粒子であるが異なる材料でできており、前
者の粒子の材料は、後者の粒子の材料より実質的に大き
な屈折率を有する。強い光分散性の粒子の屈折率と弱い
光分散性の粒子の屈折率の比率は、適切には少なくとも
１．２であり、好ましくは少なくとも１．５である。
「強い光分散性の粒子」と「弱い光分散性の粒子」は、
同じサイズの粒子であるが異なる材料でできており、前
者の粒子の材料は、後者の粒子の材料より実質的に大き
な屈折率を有する。強い光分散性の粒子の屈折率と弱い
光分散性の粒子の屈折率の比率は、適切には少なくとも
１．２であり、好ましくは少なくとも１．５である。
【００１８】本発明の好適な実施態様によれば、「強い
光分散性の粒子」と「弱い光分散性の粒子」は、同じ材
料の粒子であるが異なるサイズの微粒子であり、前者の
粒子（以後、「大きい粒子」と呼ぶ）のサイズは、後者
の粒子（以後、「小さい粒子」と呼ぶ）のサイズより実
質的に大きい。
光分散性の粒子」と「弱い光分散性の粒子」は、同じ材
料の粒子であるが異なるサイズの微粒子であり、前者の
粒子（以後、「大きい粒子」と呼ぶ）のサイズは、後者
の粒子（以後、「小さい粒子」と呼ぶ）のサイズより実
質的に大きい。
【００１９】大きい粒子の平均経は、適切には１６０〜
６００nmであり、好ましくは１９０〜５００nmである。
大きい粒子の平均経と小さい粒子の平均経の比率は、適
切には１．５〜４．０であり、好ましくは１．７〜３．
２である。
６００nmであり、好ましくは１９０〜５００nmである。
大きい粒子の平均経と小さい粒子の平均経の比率は、適
切には１．５〜４．０であり、好ましくは１．７〜３．
２である。
【００２０】混合物中の微粒子の総濃度は、微粒子由来
の吸光度値が正確な測定に影響を与えないが、微粒子の
濃度がシグナルの発生を得るのに充分に高くなるよう
に、微粒子増強光分散免疫測定法の分野で公知の方法に
従って、選択されるであろう。大きい粒子の濃度と小さ
い粒子の濃度の比率(w/w）は、適切には０．０１〜５で
あり、好ましくは０．０５〜２である。
の吸光度値が正確な測定に影響を与えないが、微粒子の
濃度がシグナルの発生を得るのに充分に高くなるよう
に、微粒子増強光分散免疫測定法の分野で公知の方法に
従って、選択されるであろう。大きい粒子の濃度と小さ
い粒子の濃度の比率(w/w）は、適切には０．０１〜５で
あり、好ましくは０．０５〜２である。
【００２１】微粒子の材料は、微粒子増強光分散測定法
に適した任意の無機、有機、またはポリマー材料であ
る。そのような材料は、例えばセレン、炭素、金；炭
素、珪素、またはゲルマニウムの窒化物、例えばＳｉ3
Ｎ4 ；鉄、チタンまたは珪素の酸化物、例えばＴｉＯ2
またはＳｉＯ2 ；およびポリマー材料、例えばポリスチ
レン、ポリ（塩化ビニル）、エポキシ樹脂、ポリ（塩化
ビニリデン）、ポリ（アルファナフチルメタクリレー
ト）、ポリ（ビニルナフタレン）、またはこれらの共重
合体、特にスチレンの共重合体、および共重合可能なエ
チレン性不飽和化合物、例えばスチレン−（メタ）アク
リレート共重合体がある。ポリマー性材料、ならびにス
チレンから重合された内部のコアとスチレンと共重合可
能な不飽和化合物との共重合により形成された外部のシ
ェルからなるコアーシェル粒子から作成された微粒子
（米国特許第４，２１０，７２３号）が特に適してい
る。
に適した任意の無機、有機、またはポリマー材料であ
る。そのような材料は、例えばセレン、炭素、金；炭
素、珪素、またはゲルマニウムの窒化物、例えばＳｉ3
Ｎ4 ；鉄、チタンまたは珪素の酸化物、例えばＴｉＯ2
またはＳｉＯ2 ；およびポリマー材料、例えばポリスチ
レン、ポリ（塩化ビニル）、エポキシ樹脂、ポリ（塩化
ビニリデン）、ポリ（アルファナフチルメタクリレー
ト）、ポリ（ビニルナフタレン）、またはこれらの共重
合体、特にスチレンの共重合体、および共重合可能なエ
チレン性不飽和化合物、例えばスチレン−（メタ）アク
リレート共重合体がある。ポリマー性材料、ならびにス
チレンから重合された内部のコアとスチレンと共重合可
能な不飽和化合物との共重合により形成された外部のシ
ェルからなるコアーシェル粒子から作成された微粒子
（米国特許第４，２１０，７２３号）が特に適してい
る。
【００２２】本発明の測定法は、任意のタイプの微粒子
増強光分散凝集試験、特に濁度試験またはネフェロメト
リー試験である。
増強光分散凝集試験、特に濁度試験またはネフェロメト
リー試験である。
【００２３】本発明の測定法は、微粒子増強光分散測定
法により測定可能な任意のアナライト、すなわち、アナ
ライトを特異的に認識する微粒子に結合可能な結合パー
トナーが存在する任意のアナライトの量の測定に使用で
きる。本発明の測定法により測定できるアナライトは、
抗原性アナライト、従って結合パートナーは適切には免
疫学的結合パートナー、および核酸、従って結合パート
ナーは適切にはハイブリダイゼーションが起きるのに充
分な配列相補性を示すオリゴヌクレオチド捕捉プロー
ブ、を含む。
法により測定可能な任意のアナライト、すなわち、アナ
ライトを特異的に認識する微粒子に結合可能な結合パー
トナーが存在する任意のアナライトの量の測定に使用で
きる。本発明の測定法により測定できるアナライトは、
抗原性アナライト、従って結合パートナーは適切には免
疫学的結合パートナー、および核酸、従って結合パート
ナーは適切にはハイブリダイゼーションが起きるのに充
分な配列相補性を示すオリゴヌクレオチド捕捉プロー
ブ、を含む。
【００２４】抗原性アナライトは、モノマーでもポリマ
ーでもよく、繰り返しエピトープがあってもなくてもよ
い。適切な抗原性アナライトには、以下のものがある。
ーでもよく、繰り返しエピトープがあってもなくてもよ
い。適切な抗原性アナライトには、以下のものがある。
【００２５】（ａ）特異的タンパク質、例えば、アルフ
ァ−１−酸性糖タンパク質（ＡＡＧＰ）、アルファ−１
−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、血清中アルブミン（Ａ
ＬＢＳ）、ミクロアルブミン（ＡＬＢＵ）、アポリポプ
ロテインＡ−１（ＡＰＯＡ）、アポリポプロテインＢ
（ＡＰＯＢ）、アンチストレプトリジンＯ（ＡＳＯ）、
アンチトロンビンIII （ＡＴIII ）、補体Ｃ３ｃ（Ｃ３
Ｃ）、補体Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲ
Ｐ）、フィブリノゲン（ＦＩＢＧ）、フィブロネクチン
（ＦＩＢＲ）、ハプトグロブリン（ＨＡＰＴ）、免疫グ
ロブリンＡ、Ｇ、Ｍ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、リポ
プロテインａ（ＬＰＡ），リウマチ因子（ＲＦ）、トラ
ンスフェリン（ＴＲＳＦ）、血清アミロイドＡ（ＳＡ
Ａ）；
ァ−１−酸性糖タンパク質（ＡＡＧＰ）、アルファ−１
−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、血清中アルブミン（Ａ
ＬＢＳ）、ミクロアルブミン（ＡＬＢＵ）、アポリポプ
ロテインＡ−１（ＡＰＯＡ）、アポリポプロテインＢ
（ＡＰＯＢ）、アンチストレプトリジンＯ（ＡＳＯ）、
アンチトロンビンIII （ＡＴIII ）、補体Ｃ３ｃ（Ｃ３
Ｃ）、補体Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲ
Ｐ）、フィブリノゲン（ＦＩＢＧ）、フィブロネクチン
（ＦＩＢＲ）、ハプトグロブリン（ＨＡＰＴ）、免疫グ
ロブリンＡ、Ｇ、Ｍ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、リポ
プロテインａ（ＬＰＡ），リウマチ因子（ＲＦ）、トラ
ンスフェリン（ＴＲＳＦ）、血清アミロイドＡ（ＳＡ
Ａ）；
【００２６】（ｂ）腫瘍マーカー、例えば、アルファフ
ェトプロテイン（ＡＦＰ）、絨毛性性腺刺激ホルモンベ
ータサブユニット（β−サブユニット）、ベータ−２−
ミクログロブリン、炭水化物抗原（例えば、ＣＡ１２
５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４）、癌
胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェリチン、ムチン様癌関連抗
原（ＭＣＡ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳ
Ｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；
ェトプロテイン（ＡＦＰ）、絨毛性性腺刺激ホルモンベ
ータサブユニット（β−サブユニット）、ベータ−２−
ミクログロブリン、炭水化物抗原（例えば、ＣＡ１２
５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４）、癌
胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェリチン、ムチン様癌関連抗
原（ＭＣＡ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳ
Ｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；
【００２７】−（ｃ）心血管または血栓溶解マーカー、
例えば脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）、フィブリン
およびフィブリノゲン分解生成物（ＦＤＰ）、ＦＤＰ
Ｄ−ダイマー、トロポニン、ミオグロビン、グリコヘモ
グロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）；
例えば脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）、フィブリン
およびフィブリノゲン分解生成物（ＦＤＰ）、ＦＤＰ
Ｄ−ダイマー、トロポニン、ミオグロビン、グリコヘモ
グロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）；
【００２８】（ｄ）ウイルスマーカー、例えばインフル
エンザウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）；
エンザウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）；
【００２９】（ｅ）免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、イン
スリン、シスタチンＣ。
スリン、シスタチンＣ。
【００３０】適切な核酸アナライトには、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａおよびこれらの誘導体があり、その量の測定は診断分
野または薬学分野において重要である。本発明の測定法
を使用して測定されるそのような核酸の例には、ＨＩＶ
１−ＲＮＡ、ＨＩＶ２−ＲＮＡ、ＨＣＶ−ＲＮＡ、エン
テロウイルスＲＮＡ、ＨＴＬＶ−ＤＮＡ、ＣＭＶ−ＤＮ
Ａ、およびマイコバクテリウム・ツベルキュローシス
（Mycobacterium tuberculosis）ＤＮＡがある。
Ａおよびこれらの誘導体があり、その量の測定は診断分
野または薬学分野において重要である。本発明の測定法
を使用して測定されるそのような核酸の例には、ＨＩＶ
１−ＲＮＡ、ＨＩＶ２−ＲＮＡ、ＨＣＶ−ＲＮＡ、エン
テロウイルスＲＮＡ、ＨＴＬＶ−ＤＮＡ、ＣＭＶ−ＤＮ
Ａ、およびマイコバクテリウム・ツベルキュローシス
（Mycobacterium tuberculosis）ＤＮＡがある。
【００３１】核酸アナライトは、多くの場合に体液中に
微量に存在する。従って、核酸増幅反応、例えばポリメ
ラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、リガーゼチェイン反応
（ＬＣＲ）、転写増幅または自立性配列複製は、一般に
本発明の測定法によりアナライトの量を測定する前に行
われる。好ましくはこの増幅は、以下の工程を含むＰＣ
Ｒ（「ＰＣＲプロトコール：方法と応用へのガイド（PC
R Protocols: A Guideto Medhods and Application
s）」、エム・エー・イニス（M.A. Innis）ら、１９９
０、アカデミックプレス(Academic Press）、ニューヨ
ーク、アメリカ合衆国）により行われる：（１）増幅さ
れる配列の末端を決定するオリゴヌクレオチドプライマ
ーを、試料中の１本鎖核酸にアニーリングさせ、（２）
核酸ポリメラーゼはアニーリングしたプライマーの３’
末端を伸長して、プライマーがアニーリングされる核酸
に配列が相補的な核酸鎖を作成する、（３）得られる２
本鎖核酸を変性させて、２つの２本鎖核酸を作成し、そ
して（４）プライマーアニーリング、プライマー伸長お
よび生成物変性を充分な回数だけ繰り返して、プライマ
ーにより規定される容易に同定され測定される量の配列
を作成する。
微量に存在する。従って、核酸増幅反応、例えばポリメ
ラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、リガーゼチェイン反応
（ＬＣＲ）、転写増幅または自立性配列複製は、一般に
本発明の測定法によりアナライトの量を測定する前に行
われる。好ましくはこの増幅は、以下の工程を含むＰＣ
Ｒ（「ＰＣＲプロトコール：方法と応用へのガイド（PC
R Protocols: A Guideto Medhods and Application
s）」、エム・エー・イニス（M.A. Innis）ら、１９９
０、アカデミックプレス(Academic Press）、ニューヨ
ーク、アメリカ合衆国）により行われる：（１）増幅さ
れる配列の末端を決定するオリゴヌクレオチドプライマ
ーを、試料中の１本鎖核酸にアニーリングさせ、（２）
核酸ポリメラーゼはアニーリングしたプライマーの３’
末端を伸長して、プライマーがアニーリングされる核酸
に配列が相補的な核酸鎖を作成する、（３）得られる２
本鎖核酸を変性させて、２つの２本鎖核酸を作成し、そ
して（４）プライマーアニーリング、プライマー伸長お
よび生成物変性を充分な回数だけ繰り返して、プライマ
ーにより規定される容易に同定され測定される量の配列
を作成する。
【００３２】変性後の２本鎖の増幅された核酸は、本発
明の測定法により定量される。
明の測定法により定量される。
【００３３】「アナライトに対して高反応性の結合パー
トナー」および「アナライトに対して低反応性の結合パ
ートナー」という表現は、結合複合体を形成するように
アナライトと反応することができる結合パートナーを意
味し、測定法の条件下での反応性は、後者の結合パート
ナーより前者の結合パートナーについて高い。
トナー」および「アナライトに対して低反応性の結合パ
ートナー」という表現は、結合複合体を形成するように
アナライトと反応することができる結合パートナーを意
味し、測定法の条件下での反応性は、後者の結合パート
ナーより前者の結合パートナーについて高い。
【００３４】微粒子増強光分散測定法の条件下での結合
パートナーの反応性を反映する便利なパラメータは、そ
の結合パートナーでコーティングされる粒子を用いる測
定法の検出限界（ＤＬ）である。ＤＬとは、一定の確率
で標準物質０または陰性対照から区別可能なアナライト
の最小濃度と定義される。このパラメータは、多くの用
量応答曲線の繰り返しに基づき、例えばディー・エー・
アームスブルスター（D.A. Armsbruster）ら、１９９
４、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０、１２３３−１２３８が
記載した２ＳＤまたは３ＳＤ法を使用して、統計的に計
算される。
パートナーの反応性を反映する便利なパラメータは、そ
の結合パートナーでコーティングされる粒子を用いる測
定法の検出限界（ＤＬ）である。ＤＬとは、一定の確率
で標準物質０または陰性対照から区別可能なアナライト
の最小濃度と定義される。このパラメータは、多くの用
量応答曲線の繰り返しに基づき、例えばディー・エー・
アームスブルスター（D.A. Armsbruster）ら、１９９
４、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０、１２３３−１２３８が
記載した２ＳＤまたは３ＳＤ法を使用して、統計的に計
算される。
【００３５】高反応性の結合パートナーと低反応性の結
合パートナーで独立にコーティングされた、同じサイズ
かつ同じ材料の微粒子を用いて行われる測定法の検出限
界の比率は、適切には０．０１〜０．５であり、好まし
くは０．０３〜０．４である。
合パートナーで独立にコーティングされた、同じサイズ
かつ同じ材料の微粒子を用いて行われる測定法の検出限
界の比率は、適切には０．０１〜０．５であり、好まし
くは０．０３〜０．４である。
【００３６】結合パートナーの反応性を決定する他の方
法はまた、アナライトと結合パートナーの性質に依存し
て使用される。
法はまた、アナライトと結合パートナーの性質に依存し
て使用される。
【００３７】核酸アナライトと結合パートナーとしての
オリゴヌクレオチド捕捉プローブについて、後者の反応
性は、一般にプローブの長さおよび標的核酸との相補性
の程度の選択により、これらの公知の可能な変種を考慮
して、確実に調節される。高反応性のオリゴヌクレオチ
ド捕捉プローブおよび低反応性のオリゴヌクレオチド捕
捉プローブは、それぞれ強い光分散性の粒子と弱い光分
散性の粒子に、直接にまたはスペーサーを介して共有結
合する。
オリゴヌクレオチド捕捉プローブについて、後者の反応
性は、一般にプローブの長さおよび標的核酸との相補性
の程度の選択により、これらの公知の可能な変種を考慮
して、確実に調節される。高反応性のオリゴヌクレオチ
ド捕捉プローブおよび低反応性のオリゴヌクレオチド捕
捉プローブは、それぞれ強い光分散性の粒子と弱い光分
散性の粒子に、直接にまたはスペーサーを介して共有結
合する。
【００３８】抗原性アナライトおよび免疫学的結合パー
トナーについて、後者の機能的親和性はまた、一般に微
粒子増強光分散測定法の条件下でその反応性の良好な近
似値を与える便利なパラメータでもある。抗原性アナラ
イトに対する結合パートナーの機能的親和性は、当該分
野で公知の通常使用される方法、特にアイ・エム・ロイ
トとエム・イー・デベイ（I.M. Roit and M.E. Deve
y）、「エンサイクロペジア・オブ・イムノロジー（Enc
yclopedia of Immunology）」、１９９２、３３−３
５、アイ・エム・ロイトとピー・ジェイ・デルベス(I.
M. Roit and P.J. Delves）編、アカデミックプレス（A
cademic Press）、ロンドン、英国、またはエム・ダブ
リュー・スチュワード（M.W. Steward）ら、１９８６、
「ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・イムノロ
ジー(Handbook of Experimental Immunology）、第１
巻、２５章、１−３０頁、ディー・エム・ウェイア(D.
M. Weir）編、オックスフォード：ブラックウェル・サ
イエンティフィック・パブリケーションズ(Blackwell S
cientific Publications）、オックスフォード、英国、
に記載のような、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（登録商
標）装置（ファルマシア(Pharmacia）、スエーデン）、
平衡透析、ＥＬＩＳＡ系における相対的親和性力価測定
により、その見かけの解離定数を決定することにより測
定できる。「見かけの」という用語は、アナライトの可
能な繰り返しエピトープを考慮することなく、単純化さ
れたＡ＋Ｂ＝ＡＢ平衡モデルを意味する（エル・ジー・
フェーゲルスタム(L.G. Faegerstam）ら、１９９２，Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、
５９７、３９７−４１０）。
トナーについて、後者の機能的親和性はまた、一般に微
粒子増強光分散測定法の条件下でその反応性の良好な近
似値を与える便利なパラメータでもある。抗原性アナラ
イトに対する結合パートナーの機能的親和性は、当該分
野で公知の通常使用される方法、特にアイ・エム・ロイ
トとエム・イー・デベイ（I.M. Roit and M.E. Deve
y）、「エンサイクロペジア・オブ・イムノロジー（Enc
yclopedia of Immunology）」、１９９２、３３−３
５、アイ・エム・ロイトとピー・ジェイ・デルベス(I.
M. Roit and P.J. Delves）編、アカデミックプレス（A
cademic Press）、ロンドン、英国、またはエム・ダブ
リュー・スチュワード（M.W. Steward）ら、１９８６、
「ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・イムノロ
ジー(Handbook of Experimental Immunology）、第１
巻、２５章、１−３０頁、ディー・エム・ウェイア(D.
M. Weir）編、オックスフォード：ブラックウェル・サ
イエンティフィック・パブリケーションズ(Blackwell S
cientific Publications）、オックスフォード、英国、
に記載のような、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（登録商
標）装置（ファルマシア(Pharmacia）、スエーデン）、
平衡透析、ＥＬＩＳＡ系における相対的親和性力価測定
により、その見かけの解離定数を決定することにより測
定できる。「見かけの」という用語は、アナライトの可
能な繰り返しエピトープを考慮することなく、単純化さ
れたＡ＋Ｂ＝ＡＢ平衡モデルを意味する（エル・ジー・
フェーゲルスタム(L.G. Faegerstam）ら、１９９２，Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、
５９７、３９７−４１０）。
【００３９】高反応性の免疫学的結合パートナーと低反
応性の免疫学的結合パートナーの見かけの解離定数の比
率は、適切には０．０１〜０．５であり、好ましくは
０．０５〜０．２である。
応性の免疫学的結合パートナーの見かけの解離定数の比
率は、適切には０．０１〜０．５であり、好ましくは
０．０５〜０．２である。
【００４０】本発明の測定法で使用できる免疫学的結合
パートナーは、任意の種のポリクローナル抗体、任意の
種のモノクローナル抗体（キメラ抗体、および／または
組換え抗体を含む）またはこれらの断片、例えば、Ｆａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） 2 断片を含む。無制限な量
で同一のものが産生できるため、モノクローナル抗体ま
たはその断片が一般に好適である。
パートナーは、任意の種のポリクローナル抗体、任意の
種のモノクローナル抗体（キメラ抗体、および／または
組換え抗体を含む）またはこれらの断片、例えば、Ｆａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） 2 断片を含む。無制限な量
で同一のものが産生できるため、モノクローナル抗体ま
たはその断片が一般に好適である。
【００４１】繰り返しエピトープを持たない抗原性アナ
ライトについて、免疫学的結合パートナーとしてモノク
ローナル抗体またはその断片を使用する時、少なくとも
２つの高反応性の結合パートナーおよび２つの低反応性
の結合パートナーを使用することが必要であり、ここ
で、２つの高反応性の結合パートナーは、互いに異なる
エピトープに向かっており、かつ２つの低反応性の結合
パートナーは、互いに異なるエピトープに向かってお
り、そのため、両方の高反応性の結合パートナー間、お
よび両方の低反応性の結合パートナー間で、サンドイッ
チ複合体免疫凝集物が形成される。強い光分散性の粒子
は、２つの高反応性の結合パートナーで同時コーティン
グされるか、または粒子の一部がこれらの結合パートナ
ーのうちの１つでコーティングされ、粒子の残りの部分
は他の１つで別々にコーティングされる。弱い光分散性
の粒子は、２つの低反応性の結合パートナーで同時コー
ティングされるか、または粒子の一部がこれらの結合パ
ートナーのうちの１つでコーティングされ、粒子の残り
の部分は他の１つで別々にコーティングされる。
ライトについて、免疫学的結合パートナーとしてモノク
ローナル抗体またはその断片を使用する時、少なくとも
２つの高反応性の結合パートナーおよび２つの低反応性
の結合パートナーを使用することが必要であり、ここ
で、２つの高反応性の結合パートナーは、互いに異なる
エピトープに向かっており、かつ２つの低反応性の結合
パートナーは、互いに異なるエピトープに向かってお
り、そのため、両方の高反応性の結合パートナー間、お
よび両方の低反応性の結合パートナー間で、サンドイッ
チ複合体免疫凝集物が形成される。強い光分散性の粒子
は、２つの高反応性の結合パートナーで同時コーティン
グされるか、または粒子の一部がこれらの結合パートナ
ーのうちの１つでコーティングされ、粒子の残りの部分
は他の１つで別々にコーティングされる。弱い光分散性
の粒子は、２つの低反応性の結合パートナーで同時コー
ティングされるか、または粒子の一部がこれらの結合パ
ートナーのうちの１つでコーティングされ、粒子の残り
の部分は他の１つで別々にコーティングされる。
【００４２】繰り返しエピトープを有する抗原性アナラ
イトについて、免疫学的結合パートナーとしてモノクロ
ーナル抗体またはその断片を使用する時、強い分散性を
有する粒子上にコーティングされた１つの高反応性の結
合パートナー、および弱い分散性を有する粒子上にコー
ティングされた低反応性の結合パートナーを使用するこ
とが一般に充分である。いずれの場合もアナライトの繰
り返しエピトープのためにサンドイッチ複合体免疫凝集
物が形成され易いため、高反応性の結合パートナーと低
反応性の結合パートナーは、同じかまたは異なるエピト
ープに向かうことができる。
イトについて、免疫学的結合パートナーとしてモノクロ
ーナル抗体またはその断片を使用する時、強い分散性を
有する粒子上にコーティングされた１つの高反応性の結
合パートナー、および弱い分散性を有する粒子上にコー
ティングされた低反応性の結合パートナーを使用するこ
とが一般に充分である。いずれの場合もアナライトの繰
り返しエピトープのためにサンドイッチ複合体免疫凝集
物が形成され易いため、高反応性の結合パートナーと低
反応性の結合パートナーは、同じかまたは異なるエピト
ープに向かうことができる。
【００４３】免疫学的結合パートナーの調製 ポリクローナル抗体は、当該分野で公知の方法、例え
ば、エム・ダブリュー・チェース(Chase, M.W.）、１９
６７、「免疫学および免疫化学の方法(Methods of Immu
nology and Immunochemistry）」中、エー・ウィリアム
ズ（Williams, A.）編、１９７−２０９頁、アカデミッ
クプレス（Academic Press）、ニューヨーク、に記載の
ような方法により調製できる。簡単に説明すると、ある
腫の動物（ウサギ、ヤギまたはヒツジ）を、適切アジュ
バント（例えば、フロイントのアジュバント）中の精製
抗原で繰り返し免疫する。免疫後、動物を出血させ、ポ
リクローナル抗体を、例えば硫酸アンモニウム沈殿法、
陰イオン交換クロマトグラフィー、免疫親和性クロマト
グラフィー、および／または親和性クロマトグラフィー
のような方法により精製する。
ば、エム・ダブリュー・チェース(Chase, M.W.）、１９
６７、「免疫学および免疫化学の方法(Methods of Immu
nology and Immunochemistry）」中、エー・ウィリアム
ズ（Williams, A.）編、１９７−２０９頁、アカデミッ
クプレス（Academic Press）、ニューヨーク、に記載の
ような方法により調製できる。簡単に説明すると、ある
腫の動物（ウサギ、ヤギまたはヒツジ）を、適切アジュ
バント（例えば、フロイントのアジュバント）中の精製
抗原で繰り返し免疫する。免疫後、動物を出血させ、ポ
リクローナル抗体を、例えば硫酸アンモニウム沈殿法、
陰イオン交換クロマトグラフィー、免疫親和性クロマト
グラフィー、および／または親和性クロマトグラフィー
のような方法により精製する。
【００４４】モノクローナル抗体は、当該分野で公知の
方法、特にジー・ケーラー（G. Koehler）ら、１９７
５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６、４９５、ジー・ガルフレ
(G. Galfre）ら、１９８１、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．７３、３−４６、またはアール・ケネット(R. Kenn
et）、１９８０、「ハイビリドーマ：生物学的分析にお
ける新次元(Hybridomas:a new dimension in biologica
l analysis）」中、アール・ケネット(R. Kennet）ら、
プレヌム・プレス（Plenum press）、ニューヨーク・ア
ンド・ロンドン、に記載したような方法により調製する
ことができる。簡単に説明すると、例えば、ポリエチレ
ン融合法を使用して、免疫マウスまたはラットからの脾
臓細胞または末梢血細胞を、ミエローマ細胞株と融合す
る。融合後、細胞を培養プレートで増殖させ、ヒポキサ
ンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）選択を使
用して、正しく融合した細胞を選択する。抗体産生細胞
株は、ＥＩＡ、ＲＩＡ、または凝集測定法のような方法
により同定される。抗体産生細胞株の同定後、細胞を限
界希釈法により繰り返し継代して、１つの細胞から新し
い増殖する細胞株が得られることを確保する。
方法、特にジー・ケーラー（G. Koehler）ら、１９７
５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６、４９５、ジー・ガルフレ
(G. Galfre）ら、１９８１、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．７３、３−４６、またはアール・ケネット(R. Kenn
et）、１９８０、「ハイビリドーマ：生物学的分析にお
ける新次元(Hybridomas:a new dimension in biologica
l analysis）」中、アール・ケネット(R. Kennet）ら、
プレヌム・プレス（Plenum press）、ニューヨーク・ア
ンド・ロンドン、に記載したような方法により調製する
ことができる。簡単に説明すると、例えば、ポリエチレ
ン融合法を使用して、免疫マウスまたはラットからの脾
臓細胞または末梢血細胞を、ミエローマ細胞株と融合す
る。融合後、細胞を培養プレートで増殖させ、ヒポキサ
ンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）選択を使
用して、正しく融合した細胞を選択する。抗体産生細胞
株は、ＥＩＡ、ＲＩＡ、または凝集測定法のような方法
により同定される。抗体産生細胞株の同定後、細胞を限
界希釈法により繰り返し継代して、１つの細胞から新し
い増殖する細胞株が得られることを確保する。
【００４５】キメラ抗体は、当該分野で公知の方法、例
えばジー・エル・ブリアン（G.L. Boulianne）ら、１９
８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２、６４３−６４５に記載の
方法により得られる。この方法は簡単に説明すると以下
の通りである。１つの種のモノクローナル抗体からの抗
原結合部位のＤＮＡまたはその一部を、異なる種の別の
抗体の抗体フレームワークのＤＮＡにトランスフェクシ
ョンする。この新しい作製体を発現ベクターにクローン
化し、これを対応する発現系に移して、抗体を産生す
る。
えばジー・エル・ブリアン（G.L. Boulianne）ら、１９
８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２、６４３−６４５に記載の
方法により得られる。この方法は簡単に説明すると以下
の通りである。１つの種のモノクローナル抗体からの抗
原結合部位のＤＮＡまたはその一部を、異なる種の別の
抗体の抗体フレームワークのＤＮＡにトランスフェクシ
ョンする。この新しい作製体を発現ベクターにクローン
化し、これを対応する発現系に移して、抗体を産生す
る。
【００４６】組換え抗体は、動物ビヒクルを使用せず
に、当該分野で公知の方法、例えばジー・ウィンター
(G. Winter）ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３４９、２
９３、またはジェイ・エスハストン(J.S. Huston）ら、
１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ、８５、５８７９に記載の方法により得ることがで
きる。これらの方法は、以下の工程を含む：抗体または
その断片をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡまたは合成ＤＮ
Ａ）を宿主細胞、例えば大腸菌(E. coli）、真菌、酵
母、植物または真核生物細胞に導入、所望の特異性と親
和性を有する抗体の選択、および対応する発現系での抗
体またはその断片の発現。
に、当該分野で公知の方法、例えばジー・ウィンター
(G. Winter）ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３４９、２
９３、またはジェイ・エスハストン(J.S. Huston）ら、
１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ、８５、５８７９に記載の方法により得ることがで
きる。これらの方法は、以下の工程を含む：抗体または
その断片をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡまたは合成ＤＮ
Ａ）を宿主細胞、例えば大腸菌(E. coli）、真菌、酵
母、植物または真核生物細胞に導入、所望の特異性と親
和性を有する抗体の選択、および対応する発現系での抗
体またはその断片の発現。
【００４７】任意の種のポリクローナル抗体のＦａｂ
−、Ｆａｂ’−、およびＦ（ａｂ’） 2 −断片、任意の
種のモノクローナル抗体（キメラ抗体および／または組
換え抗体を含む）は、当該分野で公知の方法、例えばエ
ー・ニッソノフ（A. Nissonoff）ら、１９６０、Ａｒｃ
ｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ、８９、２３０、
またはアール・ピー・ポーター（R. P. Porter）ら、１
９５９、ＢｉｏｃｈｅｍＪ、７３、１１９、またはイー
・ハーロー（E.Harlow）ら、１９８８、「抗体：実験室
マニュアル（Antibodies−A Laboratory Manual）」、
６２６−６３１、コールド・スプリング・ハーバー・プ
レス（Cold Spring Harbor Press）、ニューヨーク、ア
メリカ合衆国、に記載のような方法により調製すること
ができる。
−、Ｆａｂ’−、およびＦ（ａｂ’） 2 −断片、任意の
種のモノクローナル抗体（キメラ抗体および／または組
換え抗体を含む）は、当該分野で公知の方法、例えばエ
ー・ニッソノフ（A. Nissonoff）ら、１９６０、Ａｒｃ
ｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ、８９、２３０、
またはアール・ピー・ポーター（R. P. Porter）ら、１
９５９、ＢｉｏｃｈｅｍＪ、７３、１１９、またはイー
・ハーロー（E.Harlow）ら、１９８８、「抗体：実験室
マニュアル（Antibodies−A Laboratory Manual）」、
６２６−６３１、コールド・スプリング・ハーバー・プ
レス（Cold Spring Harbor Press）、ニューヨーク、ア
メリカ合衆国、に記載のような方法により調製すること
ができる。
【００４８】アナライトに対して異なる反応性の免疫学
的結合パートナーの選択 結合パートナーとしてモノクローナル抗体またはその断
片を使用する時、高反応性および低反応性の免疫学的結
合パートナーの選択は、各免疫学的結合パートナーを同
じ材料およびサイズの微粒子上に別々にコーティング
し、次に、凝集を引き起こすのに２つの高反応性の免疫
学的結合パートナーと２つの低反応性の免疫学的結合パ
ートナーが必要になるかも知れないため、交互にある一
定の比率、例えば１／１ v/vで微粒子試薬を混合するこ
とにより行われる。同じ条件下で微粒子試薬の較正曲線
を作成した後、低濃度のアナライトについて得られる較
正曲線の勾配が、免疫学的結合パートナーの反応性の最
初の指標を与える。
的結合パートナーの選択 結合パートナーとしてモノクローナル抗体またはその断
片を使用する時、高反応性および低反応性の免疫学的結
合パートナーの選択は、各免疫学的結合パートナーを同
じ材料およびサイズの微粒子上に別々にコーティング
し、次に、凝集を引き起こすのに２つの高反応性の免疫
学的結合パートナーと２つの低反応性の免疫学的結合パ
ートナーが必要になるかも知れないため、交互にある一
定の比率、例えば１／１ v/vで微粒子試薬を混合するこ
とにより行われる。同じ条件下で微粒子試薬の較正曲線
を作成した後、低濃度のアナライトについて得られる較
正曲線の勾配が、免疫学的結合パートナーの反応性の最
初の指標を与える。
【００４９】結合パートナーとしてポリクローナル抗体
を使用する時、高反応性および低反応性ポリクローナル
抗体の調製は、当該分野で公知の方法により、ゲルマト
リックスに共有結合した抗原性アナライトを有する、親
和性クロマトグラフィーカラムにポリクローナル抗体を
導入することにより行われる。溶出緩衝液の濃度勾配を
用いると、低反応性のポリクローナル抗体画分は最初に
カラムから溶出し、次に徐々に高反応性の画分が続く
（エス・ヤマモト(S. Yamamoto）ら、１９９３、「獣医
免疫学および免疫病理学(Veterinary Immunology and I
mmunopathology）」、３６、２５７−２６４、エルセビ
ア・サイエンス・パブリッシャーズ・ビー・ブイ（Else
vier Science Publishers B.V.）、アムステルダム、を
参照）。次に画分の反応性を、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒ
ｅ）（登録商標）装置によるか、またはこれらを同じサ
イズかつ同じ材料の微粒子の上に独立にコーティング
し、対応する較正曲線を作成することにより、チェック
することができる。
を使用する時、高反応性および低反応性ポリクローナル
抗体の調製は、当該分野で公知の方法により、ゲルマト
リックスに共有結合した抗原性アナライトを有する、親
和性クロマトグラフィーカラムにポリクローナル抗体を
導入することにより行われる。溶出緩衝液の濃度勾配を
用いると、低反応性のポリクローナル抗体画分は最初に
カラムから溶出し、次に徐々に高反応性の画分が続く
（エス・ヤマモト(S. Yamamoto）ら、１９９３、「獣医
免疫学および免疫病理学(Veterinary Immunology and I
mmunopathology）」、３６、２５７−２６４、エルセビ
ア・サイエンス・パブリッシャーズ・ビー・ブイ（Else
vier Science Publishers B.V.）、アムステルダム、を
参照）。次に画分の反応性を、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒ
ｅ）（登録商標）装置によるか、またはこれらを同じサ
イズかつ同じ材料の微粒子の上に独立にコーティング
し、対応する較正曲線を作成することにより、チェック
することができる。
【００５０】抗体の選択は、上記方法によりこれらを微
粒子にコーティングし、次に上記の検出限界解析または
上記の機能的親和性の測定により、行われる。高反応性
の結合パートナーと低反応性の結合パートナーで独立に
コーティングされた、同じサイズかつ同じ材料の微粒子
を用いて行なった測定法の検出限界の比率は、適切には
０．０１〜０．５であり、好ましくは０．０３〜０．４
である。高反応性の免疫学的結合パートナーと低反応性
の免疫学的結合パートナーの見かけの解離定数の比率
は、適切には０．０１〜０．５であり、好ましくは０．
０５〜０．２である。
粒子にコーティングし、次に上記の検出限界解析または
上記の機能的親和性の測定により、行われる。高反応性
の結合パートナーと低反応性の結合パートナーで独立に
コーティングされた、同じサイズかつ同じ材料の微粒子
を用いて行なった測定法の検出限界の比率は、適切には
０．０１〜０．５であり、好ましくは０．０３〜０．４
である。高反応性の免疫学的結合パートナーと低反応性
の免疫学的結合パートナーの見かけの解離定数の比率
は、適切には０．０１〜０．５であり、好ましくは０．
０５〜０．２である。
【００５１】免疫学的結合パートナーによる微粒子のコ
ーティング 微粒子への免疫学的結合パートナーのコーティングは、
使用される材料の性質を満足する当該分野で公知の方法
に従って、吸着または共有結合により行われる。
ーティング 微粒子への免疫学的結合パートナーのコーティングは、
使用される材料の性質を満足する当該分野で公知の方法
に従って、吸着または共有結合により行われる。
【００５２】本発明は、また上記で定義した測定法を行
うのに適した微粒子試薬に関する。この試薬は、アナラ
イトに対して高反応性の少なくとも１つの結合パートナ
ーを有する強い光分散性の粒子と、アナライトに対して
低反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する弱
い光分散性の粒子を含む、直径３０〜６００nmの微粒子
の混合物を含む。この混合物は、通常、界面活性剤（例
えば、ツイーン（登録商標）２０またはトリトン（登録
商標）１００）、および、例えばアジ化ナトリウムまた
はアジ化カリウムのような抗菌剤を含む緩衝液中の懸濁
物で維持される。
うのに適した微粒子試薬に関する。この試薬は、アナラ
イトに対して高反応性の少なくとも１つの結合パートナ
ーを有する強い光分散性の粒子と、アナライトに対して
低反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する弱
い光分散性の粒子を含む、直径３０〜６００nmの微粒子
の混合物を含む。この混合物は、通常、界面活性剤（例
えば、ツイーン（登録商標）２０またはトリトン（登録
商標）１００）、および、例えばアジ化ナトリウムまた
はアジ化カリウムのような抗菌剤を含む緩衝液中の懸濁
物で維持される。
【００５３】本発明はまた、強い光分散性を有し、アナ
ライトに対して高反応性の少なくとも１つの結合パート
ナーを有する、直径３０〜６００nmの微粒子と、弱い光
分散性を有し、アナライトに対して低反応性の少なくと
も１つの結合パートナーを有する、直径３０〜６００nm
の微粒子とを、混合することを特徴とする、上記微粒子
試薬の調製方法に関する。
ライトに対して高反応性の少なくとも１つの結合パート
ナーを有する、直径３０〜６００nmの微粒子と、弱い光
分散性を有し、アナライトに対して低反応性の少なくと
も１つの結合パートナーを有する、直径３０〜６００nm
の微粒子とを、混合することを特徴とする、上記微粒子
試薬の調製方法に関する。
【００５４】本発明を、以下の例によりさらに説明す
る。以下の説明は、以下の図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、
２，３Ａ、３Ｂおよび４を参照することによりさらに理
解できるであろう。
る。以下の説明は、以下の図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、
２，３Ａ、３Ｂおよび４を参照することによりさらに理
解できるであろう。
【００５５】図１Ａは、以下の微粒子試薬［低反応性モ
ノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティン
グした直径１２４nmの粒子の１／１混合物（「低反応性
試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」）、およ
び高反応性抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティ
ングした直径１２４nmの粒子の１／１混合物（「高反応
性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１
０」）］の混合物のダイナミックレンジ（ＤＲ）の変動
を、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数として示す。
ノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティン
グした直径１２４nmの粒子の１／１混合物（「低反応性
試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」）、およ
び高反応性抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティ
ングした直径１２４nmの粒子の１／１混合物（「高反応
性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１
０」）］の混合物のダイナミックレンジ（ＤＲ）の変動
を、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数として示す。
【００５６】図１Ｂは、以下の微粒子試薬［低反応性モ
ノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティン
グした直径１２４nmの粒子の１／１混合物（「低反応性
試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」）、およ
び高反応性抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティ
ングした直径２２１nmの粒子の１／１混合物（「高反応
性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１
０」）］の混合物のＤＲの変動を、後者の微粒子試薬の
％(v/v）の関数として示す。
ノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティン
グした直径１２４nmの粒子の１／１混合物（「低反応性
試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」）、およ
び高反応性抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティ
ングした直径２２１nmの粒子の１／１混合物（「高反応
性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１
０」）］の混合物のＤＲの変動を、後者の微粒子試薬の
％(v/v）の関数として示す。
【００５７】図１Ｃは、微粒子試薬［低反応性モノクロ
ーナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした
直径８９nmの粒子の１／１混合物（「低反応性試薬ＰＳ
Ａ−８９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」）、および高反応性
抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直
径２２１nmの粒子の１／１混合物（「高反応性試薬ＰＳ
Ａ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」）］の混合物
のＤＲの変動を、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数と
して示す。
ーナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした
直径８９nmの粒子の１／１混合物（「低反応性試薬ＰＳ
Ａ−８９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」）、および高反応性
抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直
径２２１nmの粒子の１／１混合物（「高反応性試薬ＰＳ
Ａ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」）］の混合物
のＤＲの変動を、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数と
して示す。
【００５８】図１Ｄは、低反応性モノクローナル抗体６
３Ｃ５および１６Ｂ１で同時コーティングした直径８９
nmの粒子の微粒子試薬（「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm
−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」）、および高反応性抗体
３６Ｇ１２および４７Ｆ１０で同時コーティングした直
径２２１nmの粒子の微粒子試薬（「高反応性試薬ＰＳＡ
−２２１nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」）の混合
物のＤＲの変動を、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数
として示す。
３Ｃ５および１６Ｂ１で同時コーティングした直径８９
nmの粒子の微粒子試薬（「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm
−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」）、および高反応性抗体
３６Ｇ１２および４７Ｆ１０で同時コーティングした直
径２２１nmの粒子の微粒子試薬（「高反応性試薬ＰＳＡ
−２２１nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」）の混合
物のＤＲの変動を、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数
として示す。
【００５９】図２は、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm
−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」、「低反応性試薬ＰＳＡ−
８９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」、およびこれらの７５／
２５(v/v）混合物の較正曲線を示す。
−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」、「低反応性試薬ＰＳＡ−
８９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」、およびこれらの７５／
２５(v/v）混合物の較正曲線を示す。
【００６０】図３Ａは、異なる反応性のＣＲＰに対する
抗体でコーティングした直径１２４nmの粒子の混合物
の、高反応性モノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティ
ングした粒子の微粒子試薬（「高反応性試薬ＣＲＰ−１
２４nm−３６Ｆ１２」）の％(v/v）の関数としての、Ｄ
Ｒの変動を示す。
抗体でコーティングした直径１２４nmの粒子の混合物
の、高反応性モノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティ
ングした粒子の微粒子試薬（「高反応性試薬ＣＲＰ−１
２４nm−３６Ｆ１２」）の％(v/v）の関数としての、Ｄ
Ｒの変動を示す。
【００６１】図３Ｂは、ＣＲＰに対する低反応性抗体で
コーティングした直径８９nmの粒子（「低反応性試薬Ｃ
ＲＰ−８９nm−８Ａ１２」）と、ＣＲＰに対する高反応
性抗体でコーティングした直径２２１nmの粒子（「高反
応性試薬ＣＲＰ−２２１nm−３６Ｆ１２」）の微粒子試
薬の混合物の、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数とし
ての、ＤＲの変動を示す。
コーティングした直径８９nmの粒子（「低反応性試薬Ｃ
ＲＰ−８９nm−８Ａ１２」）と、ＣＲＰに対する高反応
性抗体でコーティングした直径２２１nmの粒子（「高反
応性試薬ＣＲＰ−２２１nm−３６Ｆ１２」）の微粒子試
薬の混合物の、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数とし
ての、ＤＲの変動を示す。
【００６２】図４は、「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−
８Ａ１２」、「高反応性試薬ＣＲＰ−２２１nm−３６Ｆ
１２」、およびこれらの７５／２５(v/v）混合物の較正
曲線を示す。
８Ａ１２」、「高反応性試薬ＣＲＰ−２２１nm−３６Ｆ
１２」、およびこれらの７５／２５(v/v）混合物の較正
曲線を示す。
【００６３】例１ 前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の微粒子増強光分散免疫凝
集測定法のダイナミックレンジの上昇
集測定法のダイナミックレンジの上昇
【００６４】１）方法と試薬 ａ）異なる親和性を有するＰＳＡの異なるエピトープに
対するモノクローナル抗体の調製 前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、前立腺癌を追跡するた
めに臨床的に広く使用されている血清成分である。ＰＳ
Ａは、血清中で遊離でまたはアンチキモトリプシンと複
合体を形成して現れる１本のポリペプチド鎖からなる３
４kDa の糖タンパク質である。
対するモノクローナル抗体の調製 前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、前立腺癌を追跡するた
めに臨床的に広く使用されている血清成分である。ＰＳ
Ａは、血清中で遊離でまたはアンチキモトリプシンと複
合体を形成して現れる１本のポリペプチド鎖からなる３
４kDa の糖タンパク質である。
【００６５】ＰＳＡに対するモノクローナル抗体は、当
該分野で公知の方法、例えばハーロー（E.Harlow）ら、
１９８８、「抗体：実験室マニュアル (Antibodies−A
Laboratory Manual)」のセクション６、コールド・スプ
リング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Pres
s）、ニューヨーク、アメリカ合衆国、に記載のような
方法により調製した。ヒトＰＳＡは、センサバウ（Sens
abaugh）ら、１９９０、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １４４，
１５２３に記載のように、ヒト精漿から単離した。マウ
スを規則的な間隔で、ＲＡＳ（リビ・アジュバント・シ
ステム（RIBI adjuvant system）中の５０μg のヒトＰ
ＳＡを４回注射した。最初の注射の４ヶ月後、免疫マウ
スの脾臓から単離したリンパ球を、ジー・ガルフレ(G.
Galfre）ら、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ．７３、３−４６に記載のポリエチレン
グリコール法を使用して、ミエローマ細胞株ＳＰ２／０
−Ａｇ１４と融合させた。
該分野で公知の方法、例えばハーロー（E.Harlow）ら、
１９８８、「抗体：実験室マニュアル (Antibodies−A
Laboratory Manual)」のセクション６、コールド・スプ
リング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Pres
s）、ニューヨーク、アメリカ合衆国、に記載のような
方法により調製した。ヒトＰＳＡは、センサバウ（Sens
abaugh）ら、１９９０、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １４４，
１５２３に記載のように、ヒト精漿から単離した。マウ
スを規則的な間隔で、ＲＡＳ（リビ・アジュバント・シ
ステム（RIBI adjuvant system）中の５０μg のヒトＰ
ＳＡを４回注射した。最初の注射の４ヶ月後、免疫マウ
スの脾臓から単離したリンパ球を、ジー・ガルフレ(G.
Galfre）ら、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ．７３、３−４６に記載のポリエチレン
グリコール法を使用して、ミエローマ細胞株ＳＰ２／０
−Ａｇ１４と融合させた。
【００６６】ＰＳＡに対する抗体を分泌するハイブリド
ーマを、以下のスクリーニングＥＬＩＳＡで同定した：
マイクロタイタープレートを、ウサギ抗ヒトＰＳＡ免疫
グロブリンでコーティングした；この固層に結合したＰ
ＳＡを、ハイブリドーマ培養物の上清とともにインキュ
ベートした。ＰＳＡに結合したモノクローナル抗体を、
抗マウス免疫グロブリンペルオキシダーゼ結合体を使用
して検出した。
ーマを、以下のスクリーニングＥＬＩＳＡで同定した：
マイクロタイタープレートを、ウサギ抗ヒトＰＳＡ免疫
グロブリンでコーティングした；この固層に結合したＰ
ＳＡを、ハイブリドーマ培養物の上清とともにインキュ
ベートした。ＰＳＡに結合したモノクローナル抗体を、
抗マウス免疫グロブリンペルオキシダーゼ結合体を使用
して検出した。
【００６７】ヒトＰＳＡの少なくとも７つの異なるエピ
トープに対する抗体を分泌する１３０個のハイブリドー
マが単離できた。約２５の異なるモノクローナル抗体を
精製し、さらに詳細に性状解析した。
トープに対する抗体を分泌する１３０個のハイブリドー
マが単離できた。約２５の異なるモノクローナル抗体を
精製し、さらに詳細に性状解析した。
【００６８】ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（登録商標）
バイオセンサー技術（ファルマシア(Pharmacia）、スエ
ーデン）を使用して、エピトープ結合を行い、見かけの
解離定数について、抗体の相対的反応性を測定した。後
者は、表面プラスモン共鳴技術（ジェイ・エル・ダイス
（J.L. Daiss）ら、１９９４、「方法：酵素学の方法の
友(Methods: A Companion to Methods in Enzymolog
y）」、６、１４３−１５６、アカデミックプレス社(Ac
ademic Press Inc.）、ニューヨーク、アメリカ合衆
国、を参照）に基づき、生体分子反応の動力学と化学量
論を追跡することを可能にする。細胞培養物の上清から
出発して、モノクローナル抗体をポリクローナルウサギ
抗マウスＦｃ抗体を介して、バイオセンサー表面に結合
させた。抗原ＰＳＡのモノクローナル抗体への会合と解
離を追跡した。データは、単純なＡ＋Ｂ＝ＡＢ平衡モデ
ル（エル・ジー・フェーゲルスタム(L.G. Faegerstam）
ら、１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ、５９７、３９７−４１０）に基づく、
固有のＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して解析した。
バイオセンサー技術（ファルマシア(Pharmacia）、スエ
ーデン）を使用して、エピトープ結合を行い、見かけの
解離定数について、抗体の相対的反応性を測定した。後
者は、表面プラスモン共鳴技術（ジェイ・エル・ダイス
（J.L. Daiss）ら、１９９４、「方法：酵素学の方法の
友(Methods: A Companion to Methods in Enzymolog
y）」、６、１４３−１５６、アカデミックプレス社(Ac
ademic Press Inc.）、ニューヨーク、アメリカ合衆
国、を参照）に基づき、生体分子反応の動力学と化学量
論を追跡することを可能にする。細胞培養物の上清から
出発して、モノクローナル抗体をポリクローナルウサギ
抗マウスＦｃ抗体を介して、バイオセンサー表面に結合
させた。抗原ＰＳＡのモノクローナル抗体への会合と解
離を追跡した。データは、単純なＡ＋Ｂ＝ＡＢ平衡モデ
ル（エル・ジー・フェーゲルスタム(L.G. Faegerstam）
ら、１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ、５９７、３９７−４１０）に基づく、
固有のＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して解析した。
【００６９】それぞれ見かけの解離定数が０．６nMと
０．５nMを有する高親和性モノクローナル抗体の対３６
Ｇ１２と４７Ｆ１０と、見かけの解離定数が３．７nMと
５．６nMを有する低親和性モノクローナル抗体の対６３
Ｃ５と１６Ｂ１の対を、微粒子へのコーティングのため
に選択した。モノクローナル抗体３６Ｇ１２と６３Ｃ５
は、モノクローナル抗体４７Ｆ１０と１６Ｂ１が認識す
るエピトープとは異なるエピトープを認識する（これら
のエピトープはすべて、遊離型およびＰＳＡの複合体型
の両方で存在する）。モノクローナル抗体３６Ｇ１２、
４７Ｆ１０、６３Ｃ５、および１６Ｂ１を産生するハイ
ブリドーマは、ブダペスト条約に従って、１９９７年６
月２日にＤＳＭＺに、それぞれＡＣＣ２３１４、ＡＣＣ
２３１５、ＡＣＣ２３１６、およびＡＣＣ２３１３で寄
託した。
０．５nMを有する高親和性モノクローナル抗体の対３６
Ｇ１２と４７Ｆ１０と、見かけの解離定数が３．７nMと
５．６nMを有する低親和性モノクローナル抗体の対６３
Ｃ５と１６Ｂ１の対を、微粒子へのコーティングのため
に選択した。モノクローナル抗体３６Ｇ１２と６３Ｃ５
は、モノクローナル抗体４７Ｆ１０と１６Ｂ１が認識す
るエピトープとは異なるエピトープを認識する（これら
のエピトープはすべて、遊離型およびＰＳＡの複合体型
の両方で存在する）。モノクローナル抗体３６Ｇ１２、
４７Ｆ１０、６３Ｃ５、および１６Ｂ１を産生するハイ
ブリドーマは、ブダペスト条約に従って、１９９７年６
月２日にＤＳＭＺに、それぞれＡＣＣ２３１４、ＡＣＣ
２３１５、ＡＣＣ２３１６、およびＡＣＣ２３１３で寄
託した。
【００７０】ｂ）微粒子試薬の調製 使用したコーティング法は、セラダイン社（Seradyn In
c.）、インディアナポリス、アメリカ合衆国、の刊行物
「微粒子試薬最適化：微粒子の専門家からの実験室参照
マニュアル（Microparticle Reagent Optimization: a
Laboratory Reference Manual from the Authority on
Microparticles）、１９９４、６６−７３、に記載の方
法を修飾したものである。
c.）、インディアナポリス、アメリカ合衆国、の刊行物
「微粒子試薬最適化：微粒子の専門家からの実験室参照
マニュアル（Microparticle Reagent Optimization: a
Laboratory Reference Manual from the Authority on
Microparticles）、１９９４、６６−７３、に記載の方
法を修飾したものである。
【００７１】直径がそれぞれ８９、１２４、または２２
１nmを有するカルボキシ修飾ポリスチレン球形粒子（セ
ラダイン社（Seradyn Inc.）、インディアナポリス、ア
メリカ合衆国、から、参照番号Ｃ９５５３／２０、２２
８０および５３２Ｇで入手できる）を、２０mMの２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ
６．１）で２％ w/v懸濁液に希釈し、この緩衝液で遠心
分離して２回洗浄した。
１nmを有するカルボキシ修飾ポリスチレン球形粒子（セ
ラダイン社（Seradyn Inc.）、インディアナポリス、ア
メリカ合衆国、から、参照番号Ｃ９５５３／２０、２２
８０および５３２Ｇで入手できる）を、２０mMの２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ
６．１）で２％ w/v懸濁液に希釈し、この緩衝液で遠心
分離して２回洗浄した。
【００７２】各粒子サイズについて、７５０μｌの洗浄
溶液を、チップソニケーターで３０秒間超音波処理（氷
浴、１０秒間隔）し、１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）／スルホ
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｓ−ＮＨＳ）を用い
て、３０mMのＥＤＣと３０mMのｓ−ＮＨＳの溶液３０μ
ｌを添加して活性化した。反応混合物を、ローラーで２
０℃で１時間インキュベートした。微粒子懸濁液を、２
０mM ＭＥＳ（ｐＨ６．１）で遠心分離して２回洗浄し
た。各遠心分離工程後に、微粒子のペレットを、氷上で
３０秒間チップ超音波処理で再懸濁した。
溶液を、チップソニケーターで３０秒間超音波処理（氷
浴、１０秒間隔）し、１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）／スルホ
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｓ−ＮＨＳ）を用い
て、３０mMのＥＤＣと３０mMのｓ−ＮＨＳの溶液３０μ
ｌを添加して活性化した。反応混合物を、ローラーで２
０℃で１時間インキュベートした。微粒子懸濁液を、２
０mM ＭＥＳ（ｐＨ６．１）で遠心分離して２回洗浄し
た。各遠心分離工程後に、微粒子のペレットを、氷上で
３０秒間チップ超音波処理で再懸濁した。
【００７３】モノクローナル抗体を、２０mM ＭＥＳ
（ｐＨ６．１）で３mg/ml に希釈した。コーティングの
ために、この溶液７５０μｌを、上記で得られた活性化
微粒子懸濁液と混合し、激しくボルテックス混合し、ロ
ーラーで２０℃で２時間インキュベートした。
（ｐＨ６．１）で３mg/ml に希釈した。コーティングの
ために、この溶液７５０μｌを、上記で得られた活性化
微粒子懸濁液と混合し、激しくボルテックス混合し、ロ
ーラーで２０℃で２時間インキュベートした。
【００７４】３０μｌの２Ｍグリシン（ｐＨ１１）を加
えて、コーティング反応を停止させ、１５分間インキュ
ベートした。微粒子懸濁液を、０．０３％トリトンＸ−
１００と０．１％ＮａＮ3 を含有する５０mMグリシン
（ｐＨ８）で遠心分離して２回洗浄した。各遠心分離工
程後に微粒子のペレットを、３０秒間チップ超音波処理
して再懸濁した（１０秒間隔、強度２０ミクロン）。最
後の遠心分離工程後、微粒子のペレットを、チップ超音
波処理で前記したように再懸濁し、微粒子のサイズに従
って使用濃度に希釈した。すなわち、直径８９nmについ
ては０．５％(w/v) （すなわち、０．５ｇ／１００m
l）、直径１２４nmについては０．２％(w/v)、そして直
径２２１nmについては０．１％(w/v) 。この使用濃度
は、サイクル５で光学密度（ＯＤ）ブランクが０．３５
と０．４５（下記ｃ）を参照）の間になるように選択し
た。
えて、コーティング反応を停止させ、１５分間インキュ
ベートした。微粒子懸濁液を、０．０３％トリトンＸ−
１００と０．１％ＮａＮ3 を含有する５０mMグリシン
（ｐＨ８）で遠心分離して２回洗浄した。各遠心分離工
程後に微粒子のペレットを、３０秒間チップ超音波処理
して再懸濁した（１０秒間隔、強度２０ミクロン）。最
後の遠心分離工程後、微粒子のペレットを、チップ超音
波処理で前記したように再懸濁し、微粒子のサイズに従
って使用濃度に希釈した。すなわち、直径８９nmについ
ては０．５％(w/v) （すなわち、０．５ｇ／１００m
l）、直径１２４nmについては０．２％(w/v)、そして直
径２２１nmについては０．１％(w/v) 。この使用濃度
は、サイクル５で光学密度（ＯＤ）ブランクが０．３５
と０．４５（下記ｃ）を参照）の間になるように選択し
た。
【００７５】ｃ）較正曲線の決定と検出限界（ＤＬ）、
測定上限（ＵＭＬ）、およびダイナミックレンジ（Ｄ
Ｒ）の計算 免疫凝集反応のすべての測定は、コバス（登録商標）ミ
ラエス（COBAS MIRA S）臨床化学分析機（エフ・ホフマ
ン−ラ・ロッシュ・エー・ジー(F. Hoffmann-La Roche
A.G.）、バーゼル、スイス）で波長５５０nmで、以下の
組成の反応緩衝液（２０mMトリス／塩酸（ｐＨ７．
４）、２０mM ＣａＣｌ2 、３００mM ＮａＣｌ、０．
０５％ツイーン（登録商標）２０、０．２％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）、０．５％ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）および０．１％ＮＡＮ3 ）と、以下のパラメ
ータの設定［（ａ）サイクル１で、１２０μｌの反応緩
衝液および７０μｌの微粒子懸濁液を２０μｌの水とと
もにピペットでキュベットに入れた；（ｂ）２．１分プ
レインキュベート後、サイクル６で１５μｌの標準溶液
（または試料）と３５μｌの水の添加で凝集反応が開始
する；そして（ｃ）５分間の反応後、サイクル１８で終
点を読む］を使用して行なった。結果は、サイクル１８
で測定したシグナルとサイクル５の試薬ブランクの差と
して計算される。
測定上限（ＵＭＬ）、およびダイナミックレンジ（Ｄ
Ｒ）の計算 免疫凝集反応のすべての測定は、コバス（登録商標）ミ
ラエス（COBAS MIRA S）臨床化学分析機（エフ・ホフマ
ン−ラ・ロッシュ・エー・ジー(F. Hoffmann-La Roche
A.G.）、バーゼル、スイス）で波長５５０nmで、以下の
組成の反応緩衝液（２０mMトリス／塩酸（ｐＨ７．
４）、２０mM ＣａＣｌ2 、３００mM ＮａＣｌ、０．
０５％ツイーン（登録商標）２０、０．２％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）、０．５％ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）および０．１％ＮＡＮ3 ）と、以下のパラメ
ータの設定［（ａ）サイクル１で、１２０μｌの反応緩
衝液および７０μｌの微粒子懸濁液を２０μｌの水とと
もにピペットでキュベットに入れた；（ｂ）２．１分プ
レインキュベート後、サイクル６で１５μｌの標準溶液
（または試料）と３５μｌの水の添加で凝集反応が開始
する；そして（ｃ）５分間の反応後、サイクル１８で終
点を読む］を使用して行なった。結果は、サイクル１８
で測定したシグナルとサイクル５の試薬ブランクの差と
して計算される。
【００７６】用量応答曲線は、１回ずつの測定で作成
し、データはエクセル（登録商標）５．０ソフトウェア
で処理しプロットした。
し、データはエクセル（登録商標）５．０ソフトウェア
で処理しプロットした。
【００７７】検出限界（ＤＬ）と測定上限（ＵＭＬ）の
測定のためには、１１重測定値の用量応答曲線の測定を
行なった。約２ｍＯＤの標準偏差が存在した。
測定のためには、１１重測定値の用量応答曲線の測定を
行なった。約２ｍＯＤの標準偏差が存在した。
【００７８】検出限界（ＤＬ）はここでは、確率９５％
で標準物質０と区別できる最小のアナライト濃度として
定義される。このパラメータは、ディー・エー・アムブ
ルスター（D.A. Ambruster）ら、１９９４，Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ．４０、１２３３−１２３８に記載の２つのＳ
Ｄ法を使用して統計計算される。
で標準物質０と区別できる最小のアナライト濃度として
定義される。このパラメータは、ディー・エー・アムブ
ルスター（D.A. Ambruster）ら、１９９４，Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ．４０、１２３３−１２３８に記載の２つのＳ
Ｄ法を使用して統計計算される。
【００７９】用量応答曲線の測定上限（ＵＭＬ）はここ
では、その前の標準物質に対して２０ｍＯＤのシグナル
の差を越えるかまたは等しい最後の標準物質として定義
される。
では、その前の標準物質に対して２０ｍＯＤのシグナル
の差を越えるかまたは等しい最後の標準物質として定義
される。
【００８０】ダイナミックレンジ（ＤＲ）は、ＵＭＬと
ＤＬの比である。
ＤＬの比である。
【００８１】以下に詳述する実験では、３６Ｇ１２、４
７Ｆ１０、６３Ｃ５、および１６Ｂ１から選択される１
つのみのモノクローナル抗体を、特定の直径の粒子のコ
ーティングに使用した。
７Ｆ１０、６３Ｃ５、および１６Ｂ１から選択される１
つのみのモノクローナル抗体を、特定の直径の粒子のコ
ーティングに使用した。
【００８２】２）較正曲線への微粒子サイズの影響 ＰＳＡに対する同じ量の同じ抗体（すなわち、高反応性
モノクローナル抗体３６Ｇ１２と４７Ｆ１０のうちの１
つ、または低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５と１６
Ｂ１のうちの１つ）でコーティングした直径８９、１２
４または２２１nmの粒子の微粒子試薬について、較正曲
線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを決定した。
モノクローナル抗体３６Ｇ１２と４７Ｆ１０のうちの１
つ、または低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５と１６
Ｂ１のうちの１つ）でコーティングした直径８９、１２
４または２２１nmの粒子の微粒子試薬について、較正曲
線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを決定した。
【００８３】下表１ａと１ｂは、２つのそのような微粒
子試薬［その１つは高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ
１２または４７Ｆ１０（その５０／５０w/v 混合物）で
コーティングした直径８９nmの粒子であり、他の１つは
高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２と４７Ｆ１０で
コーティングした直径２２１nmの粒子である］、および
これらの９０／１０(v/v）混合物について、ＰＳＡ濃度
の関数として測定した光学密度（ＯＤ）（すなわち、較
正曲線データ）、およびＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲをそれ
ぞれ示す。
子試薬［その１つは高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ
１２または４７Ｆ１０（その５０／５０w/v 混合物）で
コーティングした直径８９nmの粒子であり、他の１つは
高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２と４７Ｆ１０で
コーティングした直径２２１nmの粒子である］、および
これらの９０／１０(v/v）混合物について、ＰＳＡ濃度
の関数として測定した光学密度（ＯＤ）（すなわち、較
正曲線データ）、およびＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲをそれ
ぞれ示す。
【００８４】直径８９nmの粒子と直径２２１nmの粒子に
ついては表１ｂに示すように、レイリー（Rayleigh）の
分散理論から予測されるように、粒子サイズとともにＤ
ＬとＵＭＬの両方が減少した。直径２２１nmの粒子は、
好ましい低検出限界の０．８６ng/ml ＰＳＡを示した
が、測定中の微粒子の濃度が限定されているため、ＵＭ
ＬとＤＲは欠如している。濃度を増加させることは現実
的でなく、ブランク値が許容できないほど高くなるであ
ろう。
ついては表１ｂに示すように、レイリー（Rayleigh）の
分散理論から予測されるように、粒子サイズとともにＤ
ＬとＵＭＬの両方が減少した。直径２２１nmの粒子は、
好ましい低検出限界の０．８６ng/ml ＰＳＡを示した
が、測定中の微粒子の濃度が限定されているため、ＵＭ
ＬとＤＲは欠如している。濃度を増加させることは現実
的でなく、ブランク値が許容できないほど高くなるであ
ろう。
【００８５】直径８９nmと直径２２１nmの粒子を混合す
ると、８９nm粒子と２２１nm粒子の９０／１０(v/v）混
合物比（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−８９nm／２２１
nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と呼ぶ）で得られる最大
値１２７５のように、ＤＲがわずかに上昇し、比較的高
い検出限界の１４．６２ng/ml を示す。
ると、８９nm粒子と２２１nm粒子の９０／１０(v/v）混
合物比（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−８９nm／２２１
nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と呼ぶ）で得られる最大
値１２７５のように、ＤＲがわずかに上昇し、比較的高
い検出限界の１４．６２ng/ml を示す。
【００８６】３）較正曲線への抗体反応性の影響 微粒子試薬（以後、「高反応性試薬−１２４nm−ＰＳＡ
−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」および「低反応性試薬ＰＳ
Ａ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と呼ぶ）は、それ
ぞれ、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２でコーテ
ィングした直径１２４nmの粒子の微粒子試薬と、高反応
性モノクローナル抗体４７Ｆ１０でコーティングした直
径１２４nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合し、低反応
性モノクローナル抗体６３Ｃ５でコーティングした直径
１２４nmの粒子の微粒子試薬と、低反応性モノクローナ
ル抗体１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子
の微粒子試薬とを等量混合して、調製した。
−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」および「低反応性試薬ＰＳ
Ａ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と呼ぶ）は、それ
ぞれ、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２でコーテ
ィングした直径１２４nmの粒子の微粒子試薬と、高反応
性モノクローナル抗体４７Ｆ１０でコーティングした直
径１２４nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合し、低反応
性モノクローナル抗体６３Ｃ５でコーティングした直径
１２４nmの粒子の微粒子試薬と、低反応性モノクローナ
ル抗体１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子
の微粒子試薬とを等量混合して、調製した。
【００８７】「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ
１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm
−６３Ｃ５／１６Ｂ１」を、以下の比率(v/v）：１００
／０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７
５、０／１００で混合して調製した微粒子試薬につい
て、較正曲線（表２ａの生データを参照）をプロット
し、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm
−６３Ｃ５／１６Ｂ１」を、以下の比率(v/v）：１００
／０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７
５、０／１００で混合して調製した微粒子試薬につい
て、較正曲線（表２ａの生データを参照）をプロット
し、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
【００８８】「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ
１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm
−６３Ｃ５／１６Ｂ１」の間の較正曲線のＤＬの比率
は、０．０７であった（表２ｂを参照）。
１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm
−６３Ｃ５／１６Ｂ１」の間の較正曲線のＤＬの比率
は、０．０７であった（表２ｂを参照）。
【００８９】図１Ａは、％(v/v）「高反応性試薬ＰＳＡ
−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の関数としての
ＤＲの変動を示す。
−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の関数としての
ＤＲの変動を示す。
【００９０】以下の表２ｂは、「高反応性試薬ＰＳＡ−
１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）、高反
応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０で
コーティングした直径１２４nmの粒子の濃度、および低
反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコ
ーティングした直径１２４nmの粒子の濃度で表された上
記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与える。
ＤＲの最適の結果は、５０／５０(v/v）「高反応性試薬
ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」を含有す
る微粒子試薬で得られ、ここで「低反応性試薬ＰＳＡ−
１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と「高反応性試薬ＰＳ
Ａ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」に比較したＤ
Ｒの上昇の係数は、それぞれ約１１３０／３６０と約１
１３０／１５２、すなわち約３．１と７．１であった。
５０／５０(v/v）の「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−
３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」を含有する試薬については、
ＤＬは約１６．６ng/ml であった。
１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）、高反
応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０で
コーティングした直径１２４nmの粒子の濃度、および低
反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコ
ーティングした直径１２４nmの粒子の濃度で表された上
記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与える。
ＤＲの最適の結果は、５０／５０(v/v）「高反応性試薬
ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」を含有す
る微粒子試薬で得られ、ここで「低反応性試薬ＰＳＡ−
１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と「高反応性試薬ＰＳ
Ａ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」に比較したＤ
Ｒの上昇の係数は、それぞれ約１１３０／３６０と約１
１３０／１５２、すなわち約３．１と７．１であった。
５０／５０(v/v）の「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−
３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」を含有する試薬については、
ＤＬは約１６．６ng/ml であった。
【００９１】４）異なる反応性の抗体でコーティングさ
れた異なるサイズの粒子の本発明による混合
れた異なるサイズの粒子の本発明による混合
【００９２】ａ）高反応性抗体でコーティングされた直
径２２１nmの粒子と低反応性抗体でコーティングされた
直径１２４nmの粒子の混合 微粒子試薬（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−
３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１
２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と呼ぶ）は、それぞれ、
高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２でコーティング
した直径２２１nmの粒子の微粒子試薬と、高反応性モノ
クローナル抗体４７Ｆ１０でコーティングした直径２２
１nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合し、低反応性モノ
クローナル抗体６３Ｃ５でコーティングした直径１２４
nmの粒子の微粒子試薬と、低反応性モノクローナル抗体
１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子の微粒
子試薬とを等量混合して、調製した。
径２２１nmの粒子と低反応性抗体でコーティングされた
直径１２４nmの粒子の混合 微粒子試薬（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−
３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１
２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と呼ぶ）は、それぞれ、
高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２でコーティング
した直径２２１nmの粒子の微粒子試薬と、高反応性モノ
クローナル抗体４７Ｆ１０でコーティングした直径２２
１nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合し、低反応性モノ
クローナル抗体６３Ｃ５でコーティングした直径１２４
nmの粒子の微粒子試薬と、低反応性モノクローナル抗体
１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子の微粒
子試薬とを等量混合して、調製した。
【００９３】「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ
１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm
−６３Ｃ５／１６Ｂ１」を、以下の比率(v/v）：１００
／０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７
５、０／１００で混合して調製した微粒子試薬につい
て、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを
求めた。
１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm
−６３Ｃ５／１６Ｂ１」を、以下の比率(v/v）：１００
／０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７
５、０／１００で混合して調製した微粒子試薬につい
て、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを
求めた。
【００９４】以下の表３ａは、「高反応性試薬ＰＳＡ−
２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）、高反
応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０で
コーティングした直径２２１nmの粒子の濃度、および低
反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコ
ーティングした直径１２４nmの粒子の濃度で表された上
記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与える。
２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）、高反
応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０で
コーティングした直径２２１nmの粒子の濃度、および低
反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコ
ーティングした直径１２４nmの粒子の濃度で表された上
記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与える。
【００９５】図１Ｂは、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１
nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）の関数として
のＤＲの変動を示す。
nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）の関数として
のＤＲの変動を示す。
【００９６】表３ａと図１Ｂに含まれるデータは、異な
る反応性の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子
を本発明に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき
高い上昇が得られることを示す。「高反応性試薬ＰＳＡ
−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の約７５％(v/
v）の混合物については、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２
１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳ
Ａ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」に関してＤＲ
の上昇係数は、それぞれ約８６００／２００と約８６０
０／１５２、すなわち約４３と約５７であることを示
す。従って、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ
１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm
−６３Ｃ５／１６Ｂ１」の各試験と比較して、ＤＲは有
意に延長しており、ＤＬの上昇計数は、低親和性モノク
ローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティン
グした直径１２４nmの粒子と、高親和性モノクローナル
抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径１
２４nmの粒子を混合して得られるものより有意に高い
（上記のように約３．１と約７．１）。同時に、約７５
％(v/v）の「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１
２／４７Ｆ１０」の混合物は、約１．０７ng/lＣＲＰの
ＤＬを与え、すなわち、低親和性モノクローナル抗体３
６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした１２４nm
粒子と高親和性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６
Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合した
時得られるもの（上記のように約１６．６ng/l）より約
１５倍低い。
る反応性の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子
を本発明に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき
高い上昇が得られることを示す。「高反応性試薬ＰＳＡ
−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の約７５％(v/
v）の混合物については、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２
１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳ
Ａ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」に関してＤＲ
の上昇係数は、それぞれ約８６００／２００と約８６０
０／１５２、すなわち約４３と約５７であることを示
す。従って、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ
１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm
−６３Ｃ５／１６Ｂ１」の各試験と比較して、ＤＲは有
意に延長しており、ＤＬの上昇計数は、低親和性モノク
ローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティン
グした直径１２４nmの粒子と、高親和性モノクローナル
抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径１
２４nmの粒子を混合して得られるものより有意に高い
（上記のように約３．１と約７．１）。同時に、約７５
％(v/v）の「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１
２／４７Ｆ１０」の混合物は、約１．０７ng/lＣＲＰの
ＤＬを与え、すなわち、低親和性モノクローナル抗体３
６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした１２４nm
粒子と高親和性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６
Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合した
時得られるもの（上記のように約１６．６ng/l）より約
１５倍低い。
【００９７】ｂ）高反応性抗体でコーティングした直径
２２１nmの粒子および低反応性抗体でコーティングした
直径８９nmの粒子の混合 微粒子試薬（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−
３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−８
９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と呼ぶ）は、それぞれ、高
反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２でコーティングし
た直径２２１nmの粒子の微粒子試薬と、高反応性モノク
ローナル抗体４７Ｆ１０でコーティングした直径２２１
nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合し、低反応性モノク
ローナル抗体６３Ｃ５でコーティングした直径８９nmの
粒子の微粒子試薬と、低反応性モノクローナル抗体１６
Ｂ１でコーティングした直径８９nmの粒子の微粒子試薬
とを等量混合して、調製した。
２２１nmの粒子および低反応性抗体でコーティングした
直径８９nmの粒子の混合 微粒子試薬（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−
３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−８
９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と呼ぶ）は、それぞれ、高
反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２でコーティングし
た直径２２１nmの粒子の微粒子試薬と、高反応性モノク
ローナル抗体４７Ｆ１０でコーティングした直径２２１
nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合し、低反応性モノク
ローナル抗体６３Ｃ５でコーティングした直径８９nmの
粒子の微粒子試薬と、低反応性モノクローナル抗体１６
Ｂ１でコーティングした直径８９nmの粒子の微粒子試薬
とを等量混合して、調製した。
【００９８】「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ
１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm−
６３Ｃ５／１６Ｂ１」を、以下の比率(v/v）：１００／
０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７
５、０／１００で混合して調製した微粒子試薬につい
て、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを
求めた。
１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm−
６３Ｃ５／１６Ｂ１」を、以下の比率(v/v）：１００／
０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７
５、０／１００で混合して調製した微粒子試薬につい
て、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを
求めた。
【００９９】以下の表３ｂは、「高反応性試薬ＰＳＡ−
２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」％(v/v）、高反応
性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコ
ーティングした直径２２１nmの粒子の濃度、および低反
応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコー
ティングした直径８９nmの粒子の濃度、で表された上記
混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与える。
２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」％(v/v）、高反応
性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコ
ーティングした直径２２１nmの粒子の濃度、および低反
応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコー
ティングした直径８９nmの粒子の濃度、で表された上記
混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与える。
【０１００】図１Ｃは、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１
nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）の関数として
のＤＲの変動を示す。
nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）の関数として
のＤＲの変動を示す。
【０１０１】表３ｂと図１Ｃに含まれるデータは、異な
る反応性の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子
を本発明に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき
高い上昇が得られることを示す。「高反応性試薬ＰＳＡ
−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の約７５％(v/
v）の混合物については、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２
１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳ
Ａ−８９nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」に関してＤＲの
上昇係数は、それぞれ約１７３００／２００と約１７３
００／６５０、すなわち約８６．５と約２７であること
を示す。従って、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３
６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２
４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」の各試験と比較して、ＤＲ
は有意に延長しており、ＤＬの上昇計数は、低親和性モ
ノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーテ
ィングした直径１２４nmの粒子と、高親和性モノクロー
ナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直
径１２４nmの粒子を混合して得られるものより有意に高
い（上記のように約３．１と約７．１）。同時に、約７
５％(v/v）の「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ
１２／４７Ｆ１０」の混合物は、約１．０７ng/lＣＲＰ
のＤＬを与え、すなわち、低親和性モノクローナル抗体
３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした１２４
nm粒子と高親和性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１
６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合し
た時得られるもの（上記のように約１６．６ng/l）より
約１５倍低い。
る反応性の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子
を本発明に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき
高い上昇が得られることを示す。「高反応性試薬ＰＳＡ
−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の約７５％(v/
v）の混合物については、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２
１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳ
Ａ−８９nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」に関してＤＲの
上昇係数は、それぞれ約１７３００／２００と約１７３
００／６５０、すなわち約８６．５と約２７であること
を示す。従って、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３
６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２
４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」の各試験と比較して、ＤＲ
は有意に延長しており、ＤＬの上昇計数は、低親和性モ
ノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーテ
ィングした直径１２４nmの粒子と、高親和性モノクロー
ナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直
径１２４nmの粒子を混合して得られるものより有意に高
い（上記のように約３．１と約７．１）。同時に、約７
５％(v/v）の「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ
１２／４７Ｆ１０」の混合物は、約１．０７ng/lＣＲＰ
のＤＬを与え、すなわち、低親和性モノクローナル抗体
３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした１２４
nm粒子と高親和性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１
６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合し
た時得られるもの（上記のように約１６．６ng/l）より
約１５倍低い。
【０１０２】図２は、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm
−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」、「低反応性試薬ＰＳＡ−
８９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」、および７５／２５(v/
v）混合物の較正曲線を示す。この図は、これらの各微
粒子試薬の有利な性質（高反応性モノクローナル抗体で
コーティングした直径２２１nmの粒子の高ＤＬに対応す
る低濃度のＰＳＡの急勾配の曲線、および低反応性モノ
クローナル抗体でコーティングした直径８９nmの粒子の
微粒子試薬についての高ＵＭＬに対応する高濃度のＰＳ
Ａの急勾配の曲線）がいかに驚くほど組合さっているか
を示す。
−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」、「低反応性試薬ＰＳＡ−
８９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」、および７５／２５(v/
v）混合物の較正曲線を示す。この図は、これらの各微
粒子試薬の有利な性質（高反応性モノクローナル抗体で
コーティングした直径２２１nmの粒子の高ＤＬに対応す
る低濃度のＰＳＡの急勾配の曲線、および低反応性モノ
クローナル抗体でコーティングした直径８９nmの粒子の
微粒子試薬についての高ＵＭＬに対応する高濃度のＰＳ
Ａの急勾配の曲線）がいかに驚くほど組合さっているか
を示す。
【０１０３】５）一対の高反応性抗体で同時コーティン
グした大きい粒子と、一対の低反応性抗体で同時コーテ
ィングした小さい粒子の本発明による混合 高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２と４７Ｆ１０で
同時コーティングした直径２２１nmの粒子の微粒子試薬
（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２
−ｃｏ−４７Ｆ１０」と呼ぶ）と低反応性モノクローナ
ル抗体６３Ｃ５と１６Ｂ１で同時コーティングした８９
nm粒子の微粒子試薬（以後、「低反応性試薬ＰＳＡ−１
２４nm−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」と呼ぶ）を、上記
１）ｂ）のように調製したが、コーティングにおいて単
一のモノクローナル抗体の代わりに、一対の高反応性モ
ノクローナル抗体または低反応性モノクローナル抗体の
等量混合物を使用した点が異なる。
グした大きい粒子と、一対の低反応性抗体で同時コーテ
ィングした小さい粒子の本発明による混合 高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２と４７Ｆ１０で
同時コーティングした直径２２１nmの粒子の微粒子試薬
（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２
−ｃｏ−４７Ｆ１０」と呼ぶ）と低反応性モノクローナ
ル抗体６３Ｃ５と１６Ｂ１で同時コーティングした８９
nm粒子の微粒子試薬（以後、「低反応性試薬ＰＳＡ−１
２４nm−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」と呼ぶ）を、上記
１）ｂ）のように調製したが、コーティングにおいて単
一のモノクローナル抗体の代わりに、一対の高反応性モ
ノクローナル抗体または低反応性モノクローナル抗体の
等量混合物を使用した点が異なる。
【０１０４】「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ
１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−８
９nm−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」を、以下の比率(v/
v）：１００／０、９０／１０、７５／２５、５０／５
０、２５／７５、０／１００で混合して調製した微粒子
試薬について、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬお
よびＤＲを求めた。
１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−８
９nm−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」を、以下の比率(v/
v）：１００／０、９０／１０、７５／２５、５０／５
０、２５／７５、０／１００で混合して調製した微粒子
試薬について、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬお
よびＤＲを求めた。
【０１０５】以下の表３ｃは、「高反応性試薬ＰＳＡ−
２２１nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」の％(v/
v）、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４
７Ｆ１０でコーティングした直径２２１nmの粒子の濃
度、および低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または
１６Ｂ１でコーティングした直径８９nmの粒子の濃度、
で表された上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤ
Ｒを与える。
２２１nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」の％(v/
v）、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４
７Ｆ１０でコーティングした直径２２１nmの粒子の濃
度、および低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または
１６Ｂ１でコーティングした直径８９nmの粒子の濃度、
で表された上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤ
Ｒを与える。
【０１０６】表３ｃに含まれるデータは、異なる反応性
の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子を本発明
に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき高い上昇
が得られることを示す。「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１
nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」の約７５％(v/v）
の混合物については、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm
−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」と「低反応性試薬Ｐ
ＳＡ−８９nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」に関し
てＤＲの上昇係数は、それぞれ約１０２００／１５４と
約１０２００／２５０、すなわち約６６と約４１である
ことを示す。従って、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm
−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」と「低反応性試薬Ｐ
ＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」の各試験
と比較して、ＤＲは有意に延長しており、ＤＬの上昇計
数は、低親和性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４
７Ｆ１０でコーティングした直径１２４nmの粒子と、高
親和性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコ
ーティングした直径１２４nmの粒子を混合して得られる
ものより有意に高い（上記のように約３．１と約７．
１）。
の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子を本発明
に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき高い上昇
が得られることを示す。「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１
nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」の約７５％(v/v）
の混合物については、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm
−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」と「低反応性試薬Ｐ
ＳＡ−８９nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」に関し
てＤＲの上昇係数は、それぞれ約１０２００／１５４と
約１０２００／２５０、すなわち約６６と約４１である
ことを示す。従って、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm
−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」と「低反応性試薬Ｐ
ＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」の各試験
と比較して、ＤＲは有意に延長しており、ＤＬの上昇計
数は、低親和性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４
７Ｆ１０でコーティングした直径１２４nmの粒子と、高
親和性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコ
ーティングした直径１２４nmの粒子を混合して得られる
ものより有意に高い（上記のように約３．１と約７．
１）。
【０１０７】例２ Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の微粒子増強光分散免疫
凝集測定法のダイナミックレンジの上昇
凝集測定法のダイナミックレンジの上昇
【０１０８】１）方法と試薬 ａ）異なる親和性を有するＣＲＰに対するモノクローナ
ル抗体の調製 Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、局所性または全身性
炎症をスクリーニングし、治療の正確性を追跡するため
に臨床的に使用されている、急性相血清成分である。Ｃ
ＲＰは、閉じた円形の５つの同一の２３kDa サブユニッ
トからなる１１５kDa の非グリコシル化タンパク質であ
る。
ル抗体の調製 Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、局所性または全身性
炎症をスクリーニングし、治療の正確性を追跡するため
に臨床的に使用されている、急性相血清成分である。Ｃ
ＲＰは、閉じた円形の５つの同一の２３kDa サブユニッ
トからなる１１５kDa の非グリコシル化タンパク質であ
る。
【０１０９】ＣＲＰに対するモノクローナル抗体は、当
該分野で公知の方法、例えばハーロー(E. Harlow）ら、
１９８８、「抗体：実験室マニュアル（Antibodies−A
Laboratory Manual）」のセクション６、コールド・ス
プリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Pre
ss）、ニューヨーク、アメリカ合衆国、に記載のような
方法により調製した。ディー・エム・ビグシ（D.M. Vig
ushi）ら、１９９３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９
１、１３５１−１３５７に記載のように、カルシウム依
存性親和性クロマトグラフィー、逆相親和性クロマトグ
ラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む方法
により得た５０μg の精製ヒトＣＲＰを、マウスに規則
的な間隔で４回注射した。最初の注射の３ヶ月後、免疫
マウスの脾臓から単離したリンパ球を、ジー・ガルフレ
(G. Galfre）ら、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．７３、３−４６に記載のポリエチ
レングリコール法を使用して、ミエローマ細胞株ＳＰ２
／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）と融合させ
た。
該分野で公知の方法、例えばハーロー(E. Harlow）ら、
１９８８、「抗体：実験室マニュアル（Antibodies−A
Laboratory Manual）」のセクション６、コールド・ス
プリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Pre
ss）、ニューヨーク、アメリカ合衆国、に記載のような
方法により調製した。ディー・エム・ビグシ（D.M. Vig
ushi）ら、１９９３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９
１、１３５１−１３５７に記載のように、カルシウム依
存性親和性クロマトグラフィー、逆相親和性クロマトグ
ラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む方法
により得た５０μg の精製ヒトＣＲＰを、マウスに規則
的な間隔で４回注射した。最初の注射の３ヶ月後、免疫
マウスの脾臓から単離したリンパ球を、ジー・ガルフレ
(G. Galfre）ら、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．７３、３−４６に記載のポリエチ
レングリコール法を使用して、ミエローマ細胞株ＳＰ２
／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）と融合させ
た。
【０１１０】ＣＲＰに対する抗体を分泌するハイブリド
ーマを、以下のスクリーニングＥＬＩＳＡで同定した：
マイクロタイタープレートを、ウサギ抗ヒトＣＲＰ免疫
グロブリンでコーティングした。この固層に結合したＣ
ＲＰを、ハイブリドーマ培養物の上清とともにインキュ
ベートした。ＣＲＰに結合したモノクローナル抗体を、
抗マウス免疫グロブリンペルオキシダーゼ結合体を使用
して検出した。
ーマを、以下のスクリーニングＥＬＩＳＡで同定した：
マイクロタイタープレートを、ウサギ抗ヒトＣＲＰ免疫
グロブリンでコーティングした。この固層に結合したＣ
ＲＰを、ハイブリドーマ培養物の上清とともにインキュ
ベートした。ＣＲＰに結合したモノクローナル抗体を、
抗マウス免疫グロブリンペルオキシダーゼ結合体を使用
して検出した。
【０１１１】こうして、ヒトＣＲＰの少なくとも３つの
異なるエピトープに対する抗体を分泌する５個のハイブ
リドーマが単離できた。これらのエピトープのうちの１
つは、カルシウムの存在下でのみ利用できた。モノクロ
ーナル抗体を精製し、さらに詳細に性状解析した。
異なるエピトープに対する抗体を分泌する５個のハイブ
リドーマが単離できた。これらのエピトープのうちの１
つは、カルシウムの存在下でのみ利用できた。モノクロ
ーナル抗体を精製し、さらに詳細に性状解析した。
【０１１２】ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（登録商標）
バイオセンサー技術（ファルマシア(Pharmacia）、スエ
ーデン）を使用して、エピトープ結合解析を行い、見か
けの解離定数について、抗体の相対的反応性を測定し
た。後者は、表面プラスモン共鳴技術（ジェイ・エル・
ダイス（J.L. Daiss）ら、１９９４、「方法：酵素学の
方法の友(Methods: A Companion to Methods in Enzymo
logy）」、６、１４３−１５６、アカデミックプレス社
(Academic Press Inc.）、ニューヨーク、アメリカ合衆
国、を参照）に基づき、生体分子反応の動力学と化学量
論を追跡することを可能にする。細胞培養物の上清から
出発して、モノクローナル抗体をポリクローナルウサギ
抗マウスＦｃ抗体を介して、バイオセンサー表面に結合
させた。抗原ＣＲＰのモノクローナル抗体への会合と解
離を追跡した。データは、抗原ＣＲＰの５つの繰り返し
エピトープは考慮せずに、単純なＡ＋Ｂ＝ＡＢ平衡モデ
ル（エル・ジー・フェーゲルスタム(L.G. Faegerstam）
ら、１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ、５９７、３９７−４１０）に基づく、
固有のＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して解析した。
バイオセンサー技術（ファルマシア(Pharmacia）、スエ
ーデン）を使用して、エピトープ結合解析を行い、見か
けの解離定数について、抗体の相対的反応性を測定し
た。後者は、表面プラスモン共鳴技術（ジェイ・エル・
ダイス（J.L. Daiss）ら、１９９４、「方法：酵素学の
方法の友(Methods: A Companion to Methods in Enzymo
logy）」、６、１４３−１５６、アカデミックプレス社
(Academic Press Inc.）、ニューヨーク、アメリカ合衆
国、を参照）に基づき、生体分子反応の動力学と化学量
論を追跡することを可能にする。細胞培養物の上清から
出発して、モノクローナル抗体をポリクローナルウサギ
抗マウスＦｃ抗体を介して、バイオセンサー表面に結合
させた。抗原ＣＲＰのモノクローナル抗体への会合と解
離を追跡した。データは、抗原ＣＲＰの５つの繰り返し
エピトープは考慮せずに、単純なＡ＋Ｂ＝ＡＢ平衡モデ
ル（エル・ジー・フェーゲルスタム(L.G. Faegerstam）
ら、１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ、５９７、３９７−４１０）に基づく、
固有のＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して解析した。
【０１１３】見かけの解離定数が０．１３nMの高親和性
モノクローナル抗体３６Ｆ１２と、見かけの解離定数が
１．２nMの低親和性モノクローナル抗体８Ａ１２を、微
粒子へのコーティングのために選択した。これらのモノ
クローナル抗体は、ＣＲＰの非重複エピトープを認識す
る。モノクローナル抗体３６Ｆ１２と８Ａ１２を産生す
るハイブリドーマは、ブダペスト条約に従って、１９９
７年６月２日にＤＳＭＺに、それぞれＡＣＣ２３１１と
ＡＣＣ２３１２で寄託した。
モノクローナル抗体３６Ｆ１２と、見かけの解離定数が
１．２nMの低親和性モノクローナル抗体８Ａ１２を、微
粒子へのコーティングのために選択した。これらのモノ
クローナル抗体は、ＣＲＰの非重複エピトープを認識す
る。モノクローナル抗体３６Ｆ１２と８Ａ１２を産生す
るハイブリドーマは、ブダペスト条約に従って、１９９
７年６月２日にＤＳＭＺに、それぞれＡＣＣ２３１１と
ＡＣＣ２３１２で寄託した。
【０１１４】ｂ）微粒子試薬の調製 直径がそれぞれ８９、１２４、または２２１nmを有する
上記モノクローナル抗体とカルボキシ修飾ポリスチレン
球形粒子について、例１の１）ｂ）と同じコーティング
法を使用した（セラダイン社（Seradyn Inc.）、インデ
ィアナポリス、アメリカ合衆国、から、参照番号Ｃ９５
５３／２０、２２８０および５３２Ｇで入手できる）
上記モノクローナル抗体とカルボキシ修飾ポリスチレン
球形粒子について、例１の１）ｂ）と同じコーティング
法を使用した（セラダイン社（Seradyn Inc.）、インデ
ィアナポリス、アメリカ合衆国、から、参照番号Ｃ９５
５３／２０、２２８０および５３２Ｇで入手できる）
【０１１５】最後の遠心分離工程後に微粒子のペレット
を、チップ超音波処理で前述の緩衝液に再懸濁し、微粒
子のサイズに従って使用濃度に希釈した。すなわち、直
径８９nmについては０．５％(w/v) 、直径１２４nmにつ
いては０．２％(w/v) 、そして直径２２１nmについては
０．１％(w/v) 。例１の１）ｂ）のように、この使用濃
度は、サイクル５で光学密度（ＯＤ）ブランクが０．３
５と０．４５の間になるように選択した。
を、チップ超音波処理で前述の緩衝液に再懸濁し、微粒
子のサイズに従って使用濃度に希釈した。すなわち、直
径８９nmについては０．５％(w/v) 、直径１２４nmにつ
いては０．２％(w/v) 、そして直径２２１nmについては
０．１％(w/v) 。例１の１）ｂ）のように、この使用濃
度は、サイクル５で光学密度（ＯＤ）ブランクが０．３
５と０．４５の間になるように選択した。
【０１１６】ｃ）較正曲線の決定とＤＬ、ＵＭＬ、およ
びＤＲの計算 免疫凝集反応のすべての測定は、コバス（登録商標）ミ
ラエス（COBAS MIRA S）臨床化学分析機（エフ・ホフマ
ン−ラ・ロッシュ・エー・ジー(F. Hoffmann-La Roche
A.G.）、バーゼル、スイス）で、例１の１）ｂ）と同じ
緩衝液とパラメータ設定を使用して行なった。
びＤＲの計算 免疫凝集反応のすべての測定は、コバス（登録商標）ミ
ラエス（COBAS MIRA S）臨床化学分析機（エフ・ホフマ
ン−ラ・ロッシュ・エー・ジー(F. Hoffmann-La Roche
A.G.）、バーゼル、スイス）で、例１の１）ｂ）と同じ
緩衝液とパラメータ設定を使用して行なった。
【０１１７】ＤＬ、ＵＭＬ、およびＤＲは、例１の１）
ｂ）のように統計的に求めた。
ｂ）のように統計的に求めた。
【０１１８】２）較正曲線への微粒子サイズの影響 ＣＲＰに対する同じ量の同じ抗体（すなわち、高反応性
モノクローナル抗体３６Ｆ１２、または低反応性モノク
ローナル抗体８Ａ１２）でコーティングした直径８９、
１２４または２２１nmの粒子の微粒子試薬について、較
正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを決定し
た。
モノクローナル抗体３６Ｆ１２、または低反応性モノク
ローナル抗体８Ａ１２）でコーティングした直径８９、
１２４または２２１nmの粒子の微粒子試薬について、較
正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを決定し
た。
【０１１９】下表４ａと４ｂは、それぞれ２つのそのよ
うな微粒子試薬［その１つは高反応性モノクローナル抗
体３６Ｆ１２でコーティングした直径８９nmの粒子であ
り、他の１つはモノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーテ
ィングした直径２２１nmの粒子］、およびこれらの２５
／７５(v/v）混合物について、ＣＲＰ濃度の関数として
測定した光学密度（ＯＤ）（すなわち、較正曲線デー
タ）、およびＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲをそれぞれ示す。
うな微粒子試薬［その１つは高反応性モノクローナル抗
体３６Ｆ１２でコーティングした直径８９nmの粒子であ
り、他の１つはモノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーテ
ィングした直径２２１nmの粒子］、およびこれらの２５
／７５(v/v）混合物について、ＣＲＰ濃度の関数として
測定した光学密度（ＯＤ）（すなわち、較正曲線デー
タ）、およびＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲをそれぞれ示す。
【０１２０】直径８９nmの粒子と直径２２１nmの粒子に
ついて表４ｂに示すように、レイリー（Rayleigh）の分
散理論から予測されるように、粒子サイズとともにＤＬ
とＵＭＬの両方が減少した。直径２２１nmの粒子は、好
ましい低検出限界の０．０１６mg/lＣＲＰを示したが、
測定中の微粒子の濃度が限定されているため、ＵＭＬと
ＤＲは不充分である（濃度を増加させると、ブランク値
が許容できないほど高くなるであろう）。
ついて表４ｂに示すように、レイリー（Rayleigh）の分
散理論から予測されるように、粒子サイズとともにＤＬ
とＵＭＬの両方が減少した。直径２２１nmの粒子は、好
ましい低検出限界の０．０１６mg/lＣＲＰを示したが、
測定中の微粒子の濃度が限定されているため、ＵＭＬと
ＤＲは不充分である（濃度を増加させると、ブランク値
が許容できないほど高くなるであろう）。
【０１２１】直径８９nmと直径２２１nmの粒子を混合す
ると、８９nm粒子と２２１nm粒子の２５／７５(v/v）混
合物（以後、「高反応性試薬ＣＲＰ−８９nm／２２１nm
−３６Ｆ１２」と呼ぶ）で得られる最大値約２０５のよ
うに、直径８９nmの粒子で得られる値と比較してＤＲが
わずかに上昇し、比較的高い検出限界の約０．０９mg/l
を示す。
ると、８９nm粒子と２２１nm粒子の２５／７５(v/v）混
合物（以後、「高反応性試薬ＣＲＰ−８９nm／２２１nm
−３６Ｆ１２」と呼ぶ）で得られる最大値約２０５のよ
うに、直径８９nmの粒子で得られる値と比較してＤＲが
わずかに上昇し、比較的高い検出限界の約０．０９mg/l
を示す。
【０１２２】３）較正曲線への抗体反応性の影響 微粒子試薬（以後、「高反応性試薬−１２４nm−ＣＲＰ
−３６Ｆ１２」および「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm
−８Ａ１２」と呼ぶ）は、それぞれ、高反応性モノクロ
ーナル抗体３６Ｆ１２で直径１２４nmの粒子をコーティ
ングし、そして低反応性モノクローナル抗体８Ａ１２で
直径１２４nmの粒子コーティングして調製した。「高反
応性試薬−１２４nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」と「低反応
性試薬ＣＲＰ−１２４nm−８Ａ１２」は、以下の比率(v
/v）：１００／０、９０／１０ｙ、７５／２５、５０／
５０、２５／７５、０／１００で混合した。
−３６Ｆ１２」および「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm
−８Ａ１２」と呼ぶ）は、それぞれ、高反応性モノクロ
ーナル抗体３６Ｆ１２で直径１２４nmの粒子をコーティ
ングし、そして低反応性モノクローナル抗体８Ａ１２で
直径１２４nmの粒子コーティングして調製した。「高反
応性試薬−１２４nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」と「低反応
性試薬ＣＲＰ−１２４nm−８Ａ１２」は、以下の比率(v
/v）：１００／０、９０／１０ｙ、７５／２５、５０／
５０、２５／７５、０／１００で混合した。
【０１２３】較正曲線（表５ａの生データを参照）をプ
ロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
ロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
【０１２４】「高反応性試薬１２４nm−ＣＲＰ−３６Ｆ
１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−８Ａ１２」
の間の較正曲線のＤＬの比率は、０．２９であった（表
５ｂを参照）。
１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−８Ａ１２」
の間の較正曲線のＤＬの比率は、０．２９であった（表
５ｂを参照）。
【０１２５】図３Ａは、「高反応性試薬１２４nm−ＣＲ
Ｐ−３６Ｆ１２」の％(v/v）の関数としてのＤＲの変動
を示す。
Ｐ−３６Ｆ１２」の％(v/v）の関数としてのＤＲの変動
を示す。
【０１２６】以下の表５ｂは、「高反応性試薬ＣＲＰ−
１２４nm−３６Ｆ１２」の％(v/v）、高反応性モノクロ
ーナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした直径１２４nm
の粒子の濃度、および低反応性モノクローナル抗体８Ａ
１２でコーティングした直径１２４nmの粒子の濃度、で
表された上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲ
を示す。ＤＲの最適の結果は、２５／７５(v/v）「高反
応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２」を含有する微
粒子試薬（以後、「混合反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−
３６Ｆ１２／８Ａ１２」と呼ぶ）で得られ、ここで「高
反応性試薬ＣＲＰ−８９／２２１nm−３６Ｆ１２」と
「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−８Ａ１２」に比較し
たＤＲの上昇の係数は、それぞれ約４４４／１８６と４
４４／１６４、すなわち約２．４と２．７であった。
「混合反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２／８Ａ
１２」は、約０．０８mg/lＣＲＰのＤＬを示した。
１２４nm−３６Ｆ１２」の％(v/v）、高反応性モノクロ
ーナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした直径１２４nm
の粒子の濃度、および低反応性モノクローナル抗体８Ａ
１２でコーティングした直径１２４nmの粒子の濃度、で
表された上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲ
を示す。ＤＲの最適の結果は、２５／７５(v/v）「高反
応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２」を含有する微
粒子試薬（以後、「混合反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−
３６Ｆ１２／８Ａ１２」と呼ぶ）で得られ、ここで「高
反応性試薬ＣＲＰ−８９／２２１nm−３６Ｆ１２」と
「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−８Ａ１２」に比較し
たＤＲの上昇の係数は、それぞれ約４４４／１８６と４
４４／１６４、すなわち約２．４と２．７であった。
「混合反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２／８Ａ
１２」は、約０．０８mg/lＣＲＰのＤＬを示した。
【０１２７】４）異なる反応性の抗体でコーティングし
た異なるサイズの粒子の本発明による混合
た異なるサイズの粒子の本発明による混合
【０１２８】微粒子試薬（以後、「高反応性試薬２２１
nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−８
９nm−８Ａ１２」と呼ぶ）は、それぞれ、直径２２１nm
の粒子をモノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティング
し、直径８９nmの粒子を低反応性モノクローナル抗体８
Ａ１２でコーティングして調製した。「高反応性試薬２
２１nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ
−８９nm−８Ａ１２」を、以下の比率(v/v）：１００／
０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７
５、０／１００で混合した。
nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−８
９nm−８Ａ１２」と呼ぶ）は、それぞれ、直径２２１nm
の粒子をモノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティング
し、直径８９nmの粒子を低反応性モノクローナル抗体８
Ａ１２でコーティングして調製した。「高反応性試薬２
２１nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ
−８９nm−８Ａ１２」を、以下の比率(v/v）：１００／
０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７
５、０／１００で混合した。
【０１２９】低反応性モノクローナル抗体８Ａ１２でコ
ーティングした８９nmの粒子の微粒子試薬（「低反応性
試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ１２」）と、高反応性モノク
ローナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした２２１nmの
粒子の微粒子試薬（「高反応4 試薬ＣＲＰ−２２１nm−
３６Ｆ１２」）を、以下の比率(v/v）：１００／０、５
０／５０、２５／７５、１０／９０、０／１００で混合
して得られた微粒子試薬について、較正曲線をプロット
し、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
ーティングした８９nmの粒子の微粒子試薬（「低反応性
試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ１２」）と、高反応性モノク
ローナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした２２１nmの
粒子の微粒子試薬（「高反応4 試薬ＣＲＰ−２２１nm−
３６Ｆ１２」）を、以下の比率(v/v）：１００／０、５
０／５０、２５／７５、１０／９０、０／１００で混合
して得られた微粒子試薬について、較正曲線をプロット
し、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
【０１３０】以下の表６は、「高反応性試薬ＣＲＰ−２
２１nm−３６Ｆ１２」の％(v/v）、高反応性モノクロー
ナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした直径２２１nmの
粒子の濃度、および低反応性モノクローナル抗体８Ａ１
２でコーティングした直径８９nmの粒子の濃度、で表さ
れた上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与
える。
２１nm−３６Ｆ１２」の％(v/v）、高反応性モノクロー
ナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした直径２２１nmの
粒子の濃度、および低反応性モノクローナル抗体８Ａ１
２でコーティングした直径８９nmの粒子の濃度、で表さ
れた上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与
える。
【０１３１】図３Ｂは、「高反応性試薬ＣＲＰ−２２１
nm−３６Ｆ１２」の％(v/v）の関数としてのＤＲの変動
を示す。
nm−３６Ｆ１２」の％(v/v）の関数としてのＤＲの変動
を示す。
【０１３２】表６と図３Ｂに含まれるデータは、異なる
反応性の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子を
本発明に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき高
い上昇が得られることを示す。「高反応性試薬ＣＲＰ−
２２１nm−３６Ｆ１２」の約７５％(v/v）の混合物につ
いては、「高反応性試薬ＣＲＰ−８９nm／２２１nm−３
６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ
１２」に関してＤＲの上昇係数は、それぞれ約１６４０
／２００と約１６４０／４４４、すなわち約８．２と約
３．７であることを示す。従って、「高反応性試薬ＣＲ
Ｐ−８９nm／２２１nm−３６Ｆ１２」と「高反応性試薬
ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２」の各試験と比較して、
ＤＲは有意に延長しており、ＤＬの上昇計数は、低親和
性モノクローナル抗体８Ａでコーティングした直径１２
４nmの粒子と、高親和性モノクローナル抗体３６Ｆ１２
でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合して得ら
れるものより有意に高い（上記のように約２．４から約
２．７）。同時に、約７５％(v/v）の「高反応性試薬Ｃ
ＲＰ−２２１nm−３６Ｆ１２」の混合物は、約０．０２
２mg/lＣＲＰのＤＬを与え、すなわち、低親和性モノク
ローナル抗体８Ａ１２でコーティングした直径１２４nm
の粒子と高親和性モノクローナル抗体３６Ｆ１２でコー
ティングした直径１２４nmの粒子を混合した時得られる
もの（上記のように約０．０８mg/l）よりほとんど４倍
低い。
反応性の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子を
本発明に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき高
い上昇が得られることを示す。「高反応性試薬ＣＲＰ−
２２１nm−３６Ｆ１２」の約７５％(v/v）の混合物につ
いては、「高反応性試薬ＣＲＰ−８９nm／２２１nm−３
６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ
１２」に関してＤＲの上昇係数は、それぞれ約１６４０
／２００と約１６４０／４４４、すなわち約８．２と約
３．７であることを示す。従って、「高反応性試薬ＣＲ
Ｐ−８９nm／２２１nm−３６Ｆ１２」と「高反応性試薬
ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２」の各試験と比較して、
ＤＲは有意に延長しており、ＤＬの上昇計数は、低親和
性モノクローナル抗体８Ａでコーティングした直径１２
４nmの粒子と、高親和性モノクローナル抗体３６Ｆ１２
でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合して得ら
れるものより有意に高い（上記のように約２．４から約
２．７）。同時に、約７５％(v/v）の「高反応性試薬Ｃ
ＲＰ−２２１nm−３６Ｆ１２」の混合物は、約０．０２
２mg/lＣＲＰのＤＬを与え、すなわち、低親和性モノク
ローナル抗体８Ａ１２でコーティングした直径１２４nm
の粒子と高親和性モノクローナル抗体３６Ｆ１２でコー
ティングした直径１２４nmの粒子を混合した時得られる
もの（上記のように約０．０８mg/l）よりほとんど４倍
低い。
【０１３３】図４は、「高反応性試薬２２１nm−ＣＲＰ
−３６Ｆ１２」、「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ
１２」、および本発明のこれらの７５／２５(v/v）混合
物の較正曲線を示す。この図は、これらの各試薬の有利
な性質（「高反応性試薬２２１nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１
２」についての高ＤＬに対応する低濃度のＣＲＰの急勾
配の曲線、および「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ
１２」についての高ＵＭＬに対応する高濃度のＣＲＰの
急勾配の曲線）がいかに予測できないほど組合さってい
るかを示す。
−３６Ｆ１２」、「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ
１２」、および本発明のこれらの７５／２５(v/v）混合
物の較正曲線を示す。この図は、これらの各試薬の有利
な性質（「高反応性試薬２２１nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１
２」についての高ＤＬに対応する低濃度のＣＲＰの急勾
配の曲線、および「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ
１２」についての高ＵＭＬに対応する高濃度のＣＲＰの
急勾配の曲線）がいかに予測できないほど組合さってい
るかを示す。
【０１３４】
【表１】
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
【表５】
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
【表７】
【０１４１】
【表８】
【０１４２】
【表９】
【０１４３】
【表１０】
【０１４４】
【表１１】
【０１４５】
【表１２】
【０１４６】
【表１３】
【０１４７】
【表１４】
【０１４８】
【表１５】
【０１４９】
【表１６】
【図１Ａ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの
変動を示す。
変動を示す。
【図１Ｂ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの
変動を示す。
変動を示す。
【図１Ｃ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの
変動を示す。
変動を示す。
【図１Ｄ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの
変動を示す。
変動を示す。
【図２】本発明の試薬の較正曲線を示す。
【図３Ａ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの
変動を示す。
変動を示す。
【図３Ｂ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの
変動を示す。
変動を示す。
【図４】本発明の試薬の較正曲線を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヨルグ ハインリッヒ カウフマン ドイツ連邦共和国 ラインフェルデン，ツ イールガッセ 13 (72)発明者 シュテファン ポール ドイツ連邦共和国 グレンツアッハ − ヴィーレン，ザイデンヴェク ２
Claims (26)
- 【請求項１】 アナライトの量を測定するための微粒子
増強光分散凝集測定法であって、アナライトに対して高
反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する強い
光分散性の粒子と、アナライトに対して低反応性の少な
くとも１つの結合パートナーを有する弱い光分散性の粒
子の混合物を使用することを特徴とする、上記方法。 - 【請求項２】 微粒子の平均経は、３０〜６００nm、好
ましくは５０〜５００nmである、請求項１に記載の測定
法。 - 【請求項３】 強い光分散性の粒子は、弱い光分散性の
粒子より大きなサイズおよび／または大きな屈折率を有
する、請求項１または２に記載の測定法。 - 【請求項４】 強い光分散性の粒子は大きい粒子であ
り、弱い光分散性の粒子は小さい粒子である、請求項３
に記載の測定法。 - 【請求項５】 大きい粒子の平均経と小さい粒子の平均
経との比率は、１．５〜４．０、好ましくは１．７〜
３．２である、請求項４に記載の測定法。 - 【請求項６】 混合物中の大きい粒子の濃度と小さい粒
子の濃度との比率は、０．０１〜５、好ましくは０．０
５〜２である、請求項４または５に記載の測定法。 - 【請求項７】 高反応性の結合パートナーと低反応性の
結合パートナーで独立にコーティングした、同じサイズ
かつ同じ材料の微粒子を用いて行った測定法の検出限界
の比率は、０．０１〜０．５、好ましくは０．０３〜
０．４である、請求項１〜６までのいずれか１項に記載
の測定法。 - 【請求項８】 アナライトは核酸であり、結合パートナ
ーはオリゴヌクレオチド捕捉プローブである、請求項１
〜７までのいずれか１項に記載の測定法。 - 【請求項９】 アナライトは抗原性であり、結合パート
ナーは免疫学的結合パートナーである、請求項１〜７ま
でのいずれか１項に記載の測定法。 - 【請求項１０】 高反応性の免疫学的結合パートナーと
低反応性の免疫学的結合パートナーの見かけの解離定数
の比率は、０．０１〜０．５、好ましくは０．０５〜
０．２である、請求項９に記載の測定法。 - 【請求項１１】 結合パートナーはモノクローナル抗体
またはその断片である、請求項９または１０に記載の測
定法。 - 【請求項１２】 抗原性アナライトは繰り返し性エピト
ープを持たず、高反応性の少なくとも２つの結合パート
ナーと低反応性の少なくとも２つの結合パートナーを使
用する、請求項１１記載の測定法であって、強い光分散
性の粒子は、２つの高反応性の結合パートナーで同時コ
ーティングされているか、または粒子の一部がこれらの
２つの高反応性の結合パートナーのうちの１つでコーテ
ィングされ、粒子の残りの部分は他の１つで別々にコー
ティングされており、弱い光分散性の粒子は、２つの低
反応性の結合パートナーで同時コーティングされている
か、または粒子の一部がこれらの２つの低反応性の結合
パートナーのうちの１つでコーティングされ、粒子の残
りの部分は他の１つで別々にコーティングされており、
２つの高反応性の結合パートナーは、互いに異なるエピ
トープに向かっており、２つの低反応性の結合パートナ
ーは、互いに異なるエピトープに向かっていることを特
徴とする、上記方法。 - 【請求項１３】 測定法は、濁度法またはネフェロメト
リー法である、請求項１〜１２までのいずれか１項に記
載の測定法。 - 【請求項１４】 アナライトの量を測定するための微粒
子増強光分散免疫測定法のための微粒子試薬であって、
アナライトに対して高反応性の少なくとも１つの結合パ
ートナーを有する強い光分散性の粒子と、アナライトに
対して低反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有
する弱い光分散性の粒子を含む、直径３０〜６００nmの
微粒子の混合物を含んでなる、上記試薬。 - 【請求項１５】 強い光分散性の粒子は、弱い光分散性
の粒子より大きなサイズおよび／または大きな屈折率を
有する、請求項１４に記載の試薬。 - 【請求項１６】 強い光分散性の粒子は大きい粒子であ
り、弱い光分散性の粒子は小さい粒子である、請求項１
５に記載の試薬。 - 【請求項１７】 大きい粒子の平均経と小さい粒子の直
径との比率は、１．５〜４．０、好ましくは１．７〜
３．２である、請求項１６に記載の試薬。 - 【請求項１８】 混合物中の大きい粒子の濃度と小さい
粒子の濃度との比率は、０．０１〜５、好ましくは０．
０５〜２である、請求項１６または１７に記載の試薬。 - 【請求項１９】 高反応性の結合パートナーと低反応性
の結合パートナーで独立にコーティングした、同じサイ
ズかつ同じ材料の微粒子を用いて行った測定法の検出限
界の比率は、０．０１〜０．５、好ましくは０．０３〜
０．４である、請求項１４〜１８までのいずれか１項に
記載の試薬。 - 【請求項２０】 結合パートナーはオリゴヌクレオチド
捕捉プローブである、請求項１４〜１９項までのいずれ
か１項に記載の試薬。 - 【請求項２１】 結合パートナーは免疫学的結合パート
ナーである、請求項１４〜１９項までのいずれか１項に
記載の試薬。 - 【請求項２２】 高反応性の免疫学的結合パートナーと
低反応性の免疫学的結合パートナーとの見かけの親和定
数の比率は、０．０１〜０．５、好ましくは０．０５〜
０．２である、請求項２１に記載の試薬。 - 【請求項２３】 免疫学的結合パートナーはモノクロー
ナル抗体またはその断片である、請求項２１または２２
に記載の試薬。 - 【請求項２４】 少なくとも２つの高反応性の結合パー
トナーと少なくとも２つの低反応性の結合パートナーを
含む、請求項２３に記載の試薬であって、強い光分散性
の粒子は、２つの高反応性の結合パートナーで同時コー
ティングされているか、または粒子の一部がこれらの２
つの高反応性の結合パートナーのうちの１つでコーティ
ングされ、粒子の残りの部分は他の１つで別々にコーテ
ィングされており、弱い光分散性の粒子は、２つの低反
応性の結合パートナーで同時コーティングされている
か、または粒子の一部がこれらの２つの低反応性の結合
パートナーのうちの１つでコーティングされ、粒子の残
りの部分は他の１つで別々にコーティングされており、
２つの高反応性の結合パートナーは、互いに異なるエピ
トープに向かっており、２つの低反応性の結合パートナ
ーは、互いに異なるエピトープに向かっていることを特
徴とする、上記試薬。 - 【請求項２５】 ネフェロメトリー法または濁度法にお
ける、請求項１４〜２４までのいずれか１項に記載の試
薬の使用。 - 【請求項２６】 請求項１４〜２４までのいずれか１項
に記載の試薬の調製法であって、強い光分散性を有しか
つアナライトに対して高反応性の少なくとも１つの結合
パートナーを有する、直径３０〜６００nmの微粒子と、
弱い光分散性を有しかつアナライトに対して低反応性の
少なくとも１つの結合パートナーを有する、直径３０〜
６００nmの微粒子とを、混合することを特徴とする、上
記方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97113873.0 | 1997-08-11 | ||
| EP97113873 | 1997-08-11 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11108929A true JPH11108929A (ja) | 1999-04-23 |
| JPH11108929A5 JPH11108929A5 (ja) | 2005-10-20 |
| JP3746902B2 JP3746902B2 (ja) | 2006-02-22 |
Family
ID=8227200
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22599198A Expired - Lifetime JP3746902B2 (ja) | 1997-08-11 | 1998-08-10 | 微粒子増強光分散凝集測定法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6248597B1 (ja) |
| JP (1) | JP3746902B2 (ja) |
| AT (1) | ATE213065T1 (ja) |
| CA (1) | CA2244326C (ja) |
| DE (1) | DE69803729T2 (ja) |
| ES (1) | ES2170984T3 (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2004088317A1 (ja) * | 2003-03-31 | 2004-10-14 | Denka Seiken Co. Ltd. | リポプロテイン(a)の免疫比濁測定法およびその試薬 |
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