JPH11113570A - 粒子移送媒体および細胞成分の入手方法 - Google Patents
粒子移送媒体および細胞成分の入手方法Info
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- JPH11113570A JPH11113570A JP10229620A JP22962098A JPH11113570A JP H11113570 A JPH11113570 A JP H11113570A JP 10229620 A JP10229620 A JP 10229620A JP 22962098 A JP22962098 A JP 22962098A JP H11113570 A JPH11113570 A JP H11113570A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞を溶解もしくは破壊する、又は、細胞が
既に溶解もしくは破壊されている場合には、細胞成分を
互いに分離するために有効な粒子を、細胞を含有する試
料に移送するための媒体および方法を提供する。 【解決手段】 粒子が試料に放出されるまで粒子を保持
する可溶性物質を含む媒体であって、前記粒子は、試料
を攪拌または超音波処理する際に細胞を破壊し、それか
ら核酸を入手可能にするために十分な時間、試料中で未
溶解のままであるような十分に非可溶性であることを特
徴とする細胞を含有する試料への粒子移送媒体、並び
に、その媒体を加える工程を含む細胞成分を入手可能に
する方法。
既に溶解もしくは破壊されている場合には、細胞成分を
互いに分離するために有効な粒子を、細胞を含有する試
料に移送するための媒体および方法を提供する。 【解決手段】 粒子が試料に放出されるまで粒子を保持
する可溶性物質を含む媒体であって、前記粒子は、試料
を攪拌または超音波処理する際に細胞を破壊し、それか
ら核酸を入手可能にするために十分な時間、試料中で未
溶解のままであるような十分に非可溶性であることを特
徴とする細胞を含有する試料への粒子移送媒体、並び
に、その媒体を加える工程を含む細胞成分を入手可能に
する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞を含有する試
料に粒子を移送するための媒体（粒子移送媒体）、並び
に、その媒体を用いて細胞成分を入手する方法に関す
る。
料に粒子を移送するための媒体（粒子移送媒体）、並び
に、その媒体を用いて細胞成分を入手する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】核酸などの細胞成分を入手することは、
様々な分子生物学方法論に絶対に必要である。このよう
な方法論には、核酸配列決定技術、核酸ハイブリダイゼ
ーションによる特定の核酸配列の直接決定技術および核
酸配列増幅技術などがある。一部の生物の細胞では、特
に複雑な方法論や過酷な処理をせずに細胞から核酸を入
手できるが、他の生物の細胞では、核酸や他の細胞成分
を入手することが特に困難である。後者の群の生物に
は、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）
属、酵母および真菌などの種が含まれる。通常、細胞成
分の入手は、生物の細胞壁が溶解や破壊に極めて抵抗性
であり、且つ／または核酸などのある細胞成分が細胞タ
ンパクや、細胞壁の破片など、他の細胞物質に接着する
ため、困難である。近年、核酸を入手する新しい方法が
発見され、１９９６年３月１２日に提出された同時係属
の米国特許出願番号第０８／６１４，１０８号に十分に
開示されており、その開示内容を特別に引用することに
より本明細書の一部をなすものとする。簡単に記載する
と、核酸を入手するための新しい方法は、破壊した細胞
試料を、核酸と他の細胞成分とに分離するための粒子が
存在する条件下で攪拌することを含む。この方法は、ミ
コバクテリア生物の細胞を加熱によって破壊した後、そ
の細胞から核酸を入手するのに特に有用であった。
様々な分子生物学方法論に絶対に必要である。このよう
な方法論には、核酸配列決定技術、核酸ハイブリダイゼ
ーションによる特定の核酸配列の直接決定技術および核
酸配列増幅技術などがある。一部の生物の細胞では、特
に複雑な方法論や過酷な処理をせずに細胞から核酸を入
手できるが、他の生物の細胞では、核酸や他の細胞成分
を入手することが特に困難である。後者の群の生物に
は、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）
属、酵母および真菌などの種が含まれる。通常、細胞成
分の入手は、生物の細胞壁が溶解や破壊に極めて抵抗性
であり、且つ／または核酸などのある細胞成分が細胞タ
ンパクや、細胞壁の破片など、他の細胞物質に接着する
ため、困難である。近年、核酸を入手する新しい方法が
発見され、１９９６年３月１２日に提出された同時係属
の米国特許出願番号第０８／６１４，１０８号に十分に
開示されており、その開示内容を特別に引用することに
より本明細書の一部をなすものとする。簡単に記載する
と、核酸を入手するための新しい方法は、破壊した細胞
試料を、核酸と他の細胞成分とに分離するための粒子が
存在する条件下で攪拌することを含む。この方法は、ミ
コバクテリア生物の細胞を加熱によって破壊した後、そ
の細胞から核酸を入手するのに特に有用であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、細胞の
試料に粒子を加えるには、ある困難が存在することが判
明した。一般に、粒子は大量の中から試料にすくい入れ
られ、それ故、試料に加えられる粒子の量は首尾一貫し
ない傾向がある。また、精確且つ首尾一貫した量の粒子
をすくって試料に加えるには、全工程にさらなる時間を
要する。さらに、精確な量の粒子を試料に加えようとす
る試みで、粒子を加えるひとすくいは、試料容器の開口
部にきわめて近くにもたらされ、それ故、ひとすくいの
汚染、およびその後の多量の粒子の汚染、および粒子が
加えられる試料全体の汚染の危険に曝される。さらに、
時には、適切な密封を確立することができない方式で試
料容器に粒子がつかえることがある。この結果、特に工
程に加熱工程が含まれる場合、試料の損失を招くことが
多い。
試料に粒子を加えるには、ある困難が存在することが判
明した。一般に、粒子は大量の中から試料にすくい入れ
られ、それ故、試料に加えられる粒子の量は首尾一貫し
ない傾向がある。また、精確且つ首尾一貫した量の粒子
をすくって試料に加えるには、全工程にさらなる時間を
要する。さらに、精確な量の粒子を試料に加えようとす
る試みで、粒子を加えるひとすくいは、試料容器の開口
部にきわめて近くにもたらされ、それ故、ひとすくいの
汚染、およびその後の多量の粒子の汚染、および粒子が
加えられる試料全体の汚染の危険に曝される。さらに、
時には、適切な密封を確立することができない方式で試
料容器に粒子がつかえることがある。この結果、特に工
程に加熱工程が含まれる場合、試料の損失を招くことが
多い。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、粒子が試料中
に放出されるまで粒子を保持するためのバリヤーを備え
た媒体を提供することによって、細胞試料に粒子を加え
るときに遭遇する困難を解決することができる。バリヤ
ーは、細胞を破壊し且つ／または細胞成分を互いに分離
するための試料の攪拌に使用するために、粒子を放出さ
せる性質のものであってもよい、媒体の１つの実施態様
は、試料中に溶解する結合剤によって保持される粒子の
マトリックスである。
に放出されるまで粒子を保持するためのバリヤーを備え
た媒体を提供することによって、細胞試料に粒子を加え
るときに遭遇する困難を解決することができる。バリヤ
ーは、細胞を破壊し且つ／または細胞成分を互いに分離
するための試料の攪拌に使用するために、粒子を放出さ
せる性質のものであってもよい、媒体の１つの実施態様
は、試料中に溶解する結合剤によって保持される粒子の
マトリックスである。
【０００５】すなわち、本発明は、粒子が試料に放出さ
れるまで粒子を保持する可溶性物質を含む媒体であっ
て、前記粒子は、試料を攪拌または超音波処理する際に
細胞を破壊し、それから核酸を入手可能にするために十
分な時間、試料中で未溶解のままであるような十分に非
可溶性であることを特徴とする細胞を含有する試料に粒
子を移送するための粒子移送媒体を提供するものであ
る。ここで、前記可溶性物質はトレハロースであるこ
と、前記粒子とトレハロースは粒子がトレハロースによ
って互いに接近して維持されること、前記マトリックス
は錠剤を形成すること、あるいは、前記粒子はガラスビ
ーズ又はジルコニウム／ケイ酸塩ビーズであること、が
好ましい。また、本発明は、（ａ）細胞を含有する試料
に、請求項１に記載の媒体を加える工程と、（ｂ）細胞
を破壊して細胞成分を放出させる工程と、（ｃ）媒体か
ら粒子を放出させる工程と、（ｄ）核酸を他の細胞成分
から分離するために試料を十分に攪拌する工程と、を含
む細胞成分を入手可能にする方法を提供するものであ
る。ここで、試料中の感染性生物を非感染性にするのに
十分な温度および時間、試料を加熱することによって細
胞が破壊されること、あるいは、試料中でバリヤーを溶
解することによって媒体から粒子を放出させること、が
好ましい。以下、本発明について、より詳細に説明す
る。
れるまで粒子を保持する可溶性物質を含む媒体であっ
て、前記粒子は、試料を攪拌または超音波処理する際に
細胞を破壊し、それから核酸を入手可能にするために十
分な時間、試料中で未溶解のままであるような十分に非
可溶性であることを特徴とする細胞を含有する試料に粒
子を移送するための粒子移送媒体を提供するものであ
る。ここで、前記可溶性物質はトレハロースであるこ
と、前記粒子とトレハロースは粒子がトレハロースによ
って互いに接近して維持されること、前記マトリックス
は錠剤を形成すること、あるいは、前記粒子はガラスビ
ーズ又はジルコニウム／ケイ酸塩ビーズであること、が
好ましい。また、本発明は、（ａ）細胞を含有する試料
に、請求項１に記載の媒体を加える工程と、（ｂ）細胞
を破壊して細胞成分を放出させる工程と、（ｃ）媒体か
ら粒子を放出させる工程と、（ｄ）核酸を他の細胞成分
から分離するために試料を十分に攪拌する工程と、を含
む細胞成分を入手可能にする方法を提供するものであ
る。ここで、試料中の感染性生物を非感染性にするのに
十分な温度および時間、試料を加熱することによって細
胞が破壊されること、あるいは、試料中でバリヤーを溶
解することによって媒体から粒子を放出させること、が
好ましい。以下、本発明について、より詳細に説明す
る。
【０００６】
【発明の実施の形態】添付図面を参照しながら、本発明
の実施の形態について、様々な目的、長所および斬新な
特徴とともに説明する。本発明は、広い態様として、細
胞試料に粒子を移送（デリバー）するための媒体（粒子
移送媒体）を提供する。媒体は、試料中に放出されるま
で粒子を保持するバリヤーを含む。本発明の所望の目
的、すなわち、精確で首尾一貫した量の汚染されていな
い粒子を細胞試料に移送することに基づけば、媒体は様
々な形のものであってもよい。適当な媒体は、試料中に
放出されるまで粒子を保持するために、ある種のバリヤ
ーを含む。たとえば、媒体は粒子を保持するための物理
的バリヤーを具有してもよく、それ故、管、カプセル、
袋、パッド、ポーチおよび他の容器などの容器やキャリ
ヤーの形をとってもよい。あるいは、媒体は、粒子を保
持するために粒子を包囲するよりむしろ可溶性結合剤な
ど粒子上にある他の物理的バリヤー、たとえば、トレハ
ロース、糊、モルタルまたは他の接着剤などの可溶性接
着剤を具有していてもよい。さらに別の実施態様は、静
電力など、試料中に放出される前にバリヤーが粒子をユ
ニットとして保持するための非物理的手段用の媒体であ
る。
の実施の形態について、様々な目的、長所および斬新な
特徴とともに説明する。本発明は、広い態様として、細
胞試料に粒子を移送（デリバー）するための媒体（粒子
移送媒体）を提供する。媒体は、試料中に放出されるま
で粒子を保持するバリヤーを含む。本発明の所望の目
的、すなわち、精確で首尾一貫した量の汚染されていな
い粒子を細胞試料に移送することに基づけば、媒体は様
々な形のものであってもよい。適当な媒体は、試料中に
放出されるまで粒子を保持するために、ある種のバリヤ
ーを含む。たとえば、媒体は粒子を保持するための物理
的バリヤーを具有してもよく、それ故、管、カプセル、
袋、パッド、ポーチおよび他の容器などの容器やキャリ
ヤーの形をとってもよい。あるいは、媒体は、粒子を保
持するために粒子を包囲するよりむしろ可溶性結合剤な
ど粒子上にある他の物理的バリヤー、たとえば、トレハ
ロース、糊、モルタルまたは他の接着剤などの可溶性接
着剤を具有していてもよい。さらに別の実施態様は、静
電力など、試料中に放出される前にバリヤーが粒子をユ
ニットとして保持するための非物理的手段用の媒体であ
る。
【０００７】粒子を放出することが可能な粒子１６およ
び１４のマトリックス１２を示す図６に、適当な媒体の
１例を示す。この実施態様で、バリヤーは、マトリック
スの可溶性結合剤１４である。このような実施態様で、
バリヤーは、試料への望ましい放出まで粒子１６が保持
されるように設計することができる任意の物質で製作す
ることができる。たとえば、このようなバリヤーは、物
質の溶解または溶融によって粒子が放出されるまである
形で粒子１６を保持することができる可溶性物質または
溶融可能物質であってもよい。また、バリヤーの一部は
可溶性または溶融可能であってもよいが、粒子放出が媒
体の一部のみから起こるように、バリヤーの残りはそう
ではない。
び１４のマトリックス１２を示す図６に、適当な媒体の
１例を示す。この実施態様で、バリヤーは、マトリック
スの可溶性結合剤１４である。このような実施態様で、
バリヤーは、試料への望ましい放出まで粒子１６が保持
されるように設計することができる任意の物質で製作す
ることができる。たとえば、このようなバリヤーは、物
質の溶解または溶融によって粒子が放出されるまである
形で粒子１６を保持することができる可溶性物質または
溶融可能物質であってもよい。また、バリヤーの一部は
可溶性または溶融可能であってもよいが、粒子放出が媒
体の一部のみから起こるように、バリヤーの残りはそう
ではない。
【０００８】可溶性バリヤー物質の場合、この物質は、
試料の性質および粒子が放出される望ましい時間に基づ
いて選択される。たとえば、粒子構成要素を包含するこ
とによって、より速くまたはよりゆっくり溶解するよう
に、ある糖物質、ペースト、モルタルおよび他の可溶性
接着剤が一般に調整される。１つの好ましい可溶性結合
材料はトレハロースである。トレハロース溶液をペレッ
トと混合してスラリーを作製する。トレハロース溶液の
好ましい濃度は１０％（重量／容量）である。スラリー
の一部を表面または型の中に沈積させ、乾燥させて、粒
子とトレハロースとのマトリックスとして媒体を形成す
る。このような乾燥は、スラリー部分を真空に供するこ
とによって促進することが可能である。粒子とマトリッ
クスを作ることが可能な、他の有用な可溶性結合剤は、
当業者によって容易に決定されることができ、ペレット
と可溶性結合剤の溶液とのスラリーを作り、乾燥させ、
粒子の溶解および放出を決定するために試料に加えられ
るルーチンのスクリーニングアッセイで実施することに
よって応分に成功することが予期される。あるいは、可
溶性結合剤とペレットのマトリックスを、これらの２成
分をたとえば錠剤プレスで圧縮することによって作製す
る。乾燥させたスラリーから作製したマトリックスを使
用した場合と同様、当業者はペレットとの圧縮に有用な
可溶性結合剤を容易に決定することができ、ルーチンの
スクリーニングアッセイで実施することによって応分に
成功することが予期される。このようなルーチンのスク
リーニングアッセイは、無傷のマトリックスが製造され
るかどうかを決定するための結合物質とペレットとの圧
縮、およびマトリックスの溶解およびペレットの試料へ
の放出の測定を含む。
試料の性質および粒子が放出される望ましい時間に基づ
いて選択される。たとえば、粒子構成要素を包含するこ
とによって、より速くまたはよりゆっくり溶解するよう
に、ある糖物質、ペースト、モルタルおよび他の可溶性
接着剤が一般に調整される。１つの好ましい可溶性結合
材料はトレハロースである。トレハロース溶液をペレッ
トと混合してスラリーを作製する。トレハロース溶液の
好ましい濃度は１０％（重量／容量）である。スラリー
の一部を表面または型の中に沈積させ、乾燥させて、粒
子とトレハロースとのマトリックスとして媒体を形成す
る。このような乾燥は、スラリー部分を真空に供するこ
とによって促進することが可能である。粒子とマトリッ
クスを作ることが可能な、他の有用な可溶性結合剤は、
当業者によって容易に決定されることができ、ペレット
と可溶性結合剤の溶液とのスラリーを作り、乾燥させ、
粒子の溶解および放出を決定するために試料に加えられ
るルーチンのスクリーニングアッセイで実施することに
よって応分に成功することが予期される。あるいは、可
溶性結合剤とペレットのマトリックスを、これらの２成
分をたとえば錠剤プレスで圧縮することによって作製す
る。乾燥させたスラリーから作製したマトリックスを使
用した場合と同様、当業者はペレットとの圧縮に有用な
可溶性結合剤を容易に決定することができ、ルーチンの
スクリーニングアッセイで実施することによって応分に
成功することが予期される。このようなルーチンのスク
リーニングアッセイは、無傷のマトリックスが製造され
るかどうかを決定するための結合物質とペレットとの圧
縮、およびマトリックスの溶解およびペレットの試料へ
の放出の測定を含む。
【０００９】溶融可能なバリヤー物質を使用する場合、
この物質はその溶融特徴（温度および時間または速度）
に基づいて選択されることだけが必要である。たとえ
ば、感染性生物を非感染性にするためおよび／または細
胞を破壊するための加熱工程を含む試料処理方法で使用
する場合、このような加熱工程は少なくとも約８０℃の
温度を試料に加えるため、約８０℃より高い温度で溶融
するバリヤー物質が適当である。
この物質はその溶融特徴（温度および時間または速度）
に基づいて選択されることだけが必要である。たとえ
ば、感染性生物を非感染性にするためおよび／または細
胞を破壊するための加熱工程を含む試料処理方法で使用
する場合、このような加熱工程は少なくとも約８０℃の
温度を試料に加えるため、約８０℃より高い温度で溶融
するバリヤー物質が適当である。
【００１０】粒子１６は、たとえば、ガラス、プラスチ
ック、砂、ケイ酸塩、ラテックス、ジルコニウムなどの
金属、金属酸化物など、様々な組成のものであってもよ
い。細胞を破壊したり、破壊された細胞の試料中で細胞
成分を互いに分離させる攪拌工程で粒子を使用するた
め、粒子は、攪拌工程を完了するのに十分な時間、試料
中で溶解されないままであることが好ましい。不溶性粒
子が好ましいが、溶解速度が遅い粒子も適当であろう。
粒子は、たとえば、球形、立方形、楕円形、カプセル
形、錠剤形、名状しがたい任意の形状など、様々な形の
ものであってもよく、一様な形であっても、一様でない
形であってもよい。粒子の形が何であれ、粒子の最も広
い箇所の直径は一般に約０．１ｍｍ〜約０．１５ｍｍの
範囲内である。直径が約０．５ｍｍより大きい粒子は、
細胞成分を違いに分離するのにさほど有効でないことが
判明している。
ック、砂、ケイ酸塩、ラテックス、ジルコニウムなどの
金属、金属酸化物など、様々な組成のものであってもよ
い。細胞を破壊したり、破壊された細胞の試料中で細胞
成分を互いに分離させる攪拌工程で粒子を使用するた
め、粒子は、攪拌工程を完了するのに十分な時間、試料
中で溶解されないままであることが好ましい。不溶性粒
子が好ましいが、溶解速度が遅い粒子も適当であろう。
粒子は、たとえば、球形、立方形、楕円形、カプセル
形、錠剤形、名状しがたい任意の形状など、様々な形の
ものであってもよく、一様な形であっても、一様でない
形であってもよい。粒子の形が何であれ、粒子の最も広
い箇所の直径は一般に約０．１ｍｍ〜約０．１５ｍｍの
範囲内である。直径が約０．５ｍｍより大きい粒子は、
細胞成分を違いに分離するのにさほど有効でないことが
判明している。
【００１１】媒体に保持される粒子の量は、媒体を加え
る試料の粘度によって異なる。一般に、臨床医が診断の
ために核酸を入手したい対象である典型的な臨床試料の
量は約１ｍＬ以下である。しかし、環境試料や食品試料
など、量がもっと多い試料もあるが、量がもっと少ない
試料もある。異なる試料の粘度は異なると考えられる。
たとえば、臨床試料の範疇では、一般に唾液試料は血液
試料や尿試料よりも粘度が高い。同様に、異なる環境試
料の粘度も異なると考えられる。概して、唾液などの粘
性試料の場合、所与の量の試料に加えられる粒子の量
は、約０．２５：１〜約１：１の比率である。粘度がよ
り低い試料では、粒子と試料の比率（容量／容量）が低
くても、試料から核酸を入手するのに十分であると考え
られる。
る試料の粘度によって異なる。一般に、臨床医が診断の
ために核酸を入手したい対象である典型的な臨床試料の
量は約１ｍＬ以下である。しかし、環境試料や食品試料
など、量がもっと多い試料もあるが、量がもっと少ない
試料もある。異なる試料の粘度は異なると考えられる。
たとえば、臨床試料の範疇では、一般に唾液試料は血液
試料や尿試料よりも粘度が高い。同様に、異なる環境試
料の粘度も異なると考えられる。概して、唾液などの粘
性試料の場合、所与の量の試料に加えられる粒子の量
は、約０．２５：１〜約１：１の比率である。粘度がよ
り低い試料では、粒子と試料の比率（容量／容量）が低
くても、試料から核酸を入手するのに十分であると考え
られる。
【００１２】本発明の媒体は、様々な目的で粒子を試料
に移送するのに使用することができる。しかし、一般
に、媒体は、試料の攪拌や超音波処理を含め、細胞破壊
工程用または細胞溶解工程用の細胞試料に粒子を移送す
る。このような細胞溶解工程または細胞破壊工程は、ビ
ーズおよび溶原性薬剤フェノールを使用したBiospec Mi
ni-Beadbeater 内でのミコバクテリウム細胞試料の攪拌
について記載されているHurley, S.S. et al., J. Cli
n. Microbiol. 25 (11) 2227-2229 (1987) 、並びにビ
ーズおよび溶原性薬剤チオシアン酸グアニジニウム(GuS
CN) を使用した GENE-TRAK Sample Processing内での
M. tuberculosis細胞の試料の攪拌について記載されて
いるJ.S. et al., J. Clin. Microbiol. 33 (2) 3222-3
28 (1995) などの参考文献から、当業者に周知である。
に移送するのに使用することができる。しかし、一般
に、媒体は、試料の攪拌や超音波処理を含め、細胞破壊
工程用または細胞溶解工程用の細胞試料に粒子を移送す
る。このような細胞溶解工程または細胞破壊工程は、ビ
ーズおよび溶原性薬剤フェノールを使用したBiospec Mi
ni-Beadbeater 内でのミコバクテリウム細胞試料の攪拌
について記載されているHurley, S.S. et al., J. Cli
n. Microbiol. 25 (11) 2227-2229 (1987) 、並びにビ
ーズおよび溶原性薬剤チオシアン酸グアニジニウム(GuS
CN) を使用した GENE-TRAK Sample Processing内での
M. tuberculosis細胞の試料の攪拌について記載されて
いるJ.S. et al., J. Clin. Microbiol. 33 (2) 3222-3
28 (1995) などの参考文献から、当業者に周知である。
【００１３】本発明の媒体の別の使用方法は、すでに溶
解または破壊された細胞の試料に粒子を移送することで
ある。このような破壊された細胞の試料を粒子で攪拌す
ると、タンパクや細胞壁フラグメントなど他の細胞成分
から核酸を分離または剥奪することにより入手可能な核
酸を最適に得ることができる。破壊された細胞から核酸
を入手するためのこのような方法は、１９９６年３月１
２日に提出された同時係属米国特許出願第０８／６１
４，１０４号にさらに詳細に教示されており、その開示
内容を特別に引用することにより本明細書の一部をなす
ものとする。破壊されていても破壊されていなくても、
細胞試料は一般に、図１に示す通り試料管２０に入って
いる。攪拌中または他の操作中の試料損失を避けるため
に、このような管は一般にスクリューキャップ２２およ
び試料管の最上部とスクリューキャップとの間の気密を
助けるためのガスケット（Ｏリング）２４を有する。
解または破壊された細胞の試料に粒子を移送することで
ある。このような破壊された細胞の試料を粒子で攪拌す
ると、タンパクや細胞壁フラグメントなど他の細胞成分
から核酸を分離または剥奪することにより入手可能な核
酸を最適に得ることができる。破壊された細胞から核酸
を入手するためのこのような方法は、１９９６年３月１
２日に提出された同時係属米国特許出願第０８／６１
４，１０４号にさらに詳細に教示されており、その開示
内容を特別に引用することにより本明細書の一部をなす
ものとする。破壊されていても破壊されていなくても、
細胞試料は一般に、図１に示す通り試料管２０に入って
いる。攪拌中または他の操作中の試料損失を避けるため
に、このような管は一般にスクリューキャップ２２およ
び試料管の最上部とスクリューキャップとの間の気密を
助けるためのガスケット（Ｏリング）２４を有する。
【００１４】図２および図３に示す通り、試料２６を加
える前または加えた後のいずれかに、媒体１２を試料管
２２に入れる。上述の通り、試料２６は無傷の破壊され
ていない細胞であっても、破壊された細胞であっても、
あるいはその組み合わせであってもよい。図３に示す通
り、可溶性結合剤１４を含む媒体１２は一般に、媒体１
２が試料２６と接触するとすぐに粒子１６の放出を開始
する。対照的に、溶融可能なバリヤーを含む媒体１２は
一般に、試料２６の温度がバリヤー１４が溶融するのに
十分になるまで無傷のままであり、粒子１６を放出しな
い。図４に示す通り、いったん試料管２０にキャップを
すると試料管を攪拌することが可能であり、試料２６お
よび粒子１６を、管全体を移動させることができる。図
４に示す通り、粒子１６が試料中を移動すると、このよ
うな粒子は試料２６全体に分布する。図５に示す通り、
試料の攪拌完了後、粒子１６は試料２６の底に沈み、そ
の結果、粒子に妨害されることなく、ピペッティングま
たは他の類似した手段によって試料を管から除くことが
できる。
える前または加えた後のいずれかに、媒体１２を試料管
２２に入れる。上述の通り、試料２６は無傷の破壊され
ていない細胞であっても、破壊された細胞であっても、
あるいはその組み合わせであってもよい。図３に示す通
り、可溶性結合剤１４を含む媒体１２は一般に、媒体１
２が試料２６と接触するとすぐに粒子１６の放出を開始
する。対照的に、溶融可能なバリヤーを含む媒体１２は
一般に、試料２６の温度がバリヤー１４が溶融するのに
十分になるまで無傷のままであり、粒子１６を放出しな
い。図４に示す通り、いったん試料管２０にキャップを
すると試料管を攪拌することが可能であり、試料２６お
よび粒子１６を、管全体を移動させることができる。図
４に示す通り、粒子１６が試料中を移動すると、このよ
うな粒子は試料２６全体に分布する。図５に示す通り、
試料の攪拌完了後、粒子１６は試料２６の底に沈み、そ
の結果、粒子に妨害されることなく、ピペッティングま
たは他の類似した手段によって試料を管から除くことが
できる。
【００１５】可溶性結合剤１４と粒子１６のマトリック
スである媒体１２の長所の幾つかは、製造が容易なこ
と、低価格であること、および異なる量のペレットを異
なる量の試料または異なるタイプの試料に移送するよう
に調整することが容易なことである。特に、１９９６年
３月１２日に提出された米国特許出願第０８／６１４，
２３０号に記載されているものの幾つかのように、もろ
いバリヤーを有する媒体と比較すると、本発明の媒体は
製造が容易であり、破損の危険が少なく、量が少ない。
以下の実施例は、本願明細書に記載の本発明の具体的な
実施態様を示す。熟練者に明らかな通り、様々な変更お
よび修正が可能であり、記載の本発明の範囲内であると
考えられる。
スである媒体１２の長所の幾つかは、製造が容易なこ
と、低価格であること、および異なる量のペレットを異
なる量の試料または異なるタイプの試料に移送するよう
に調整することが容易なことである。特に、１９９６年
３月１２日に提出された米国特許出願第０８／６１４，
２３０号に記載されているものの幾つかのように、もろ
いバリヤーを有する媒体と比較すると、本発明の媒体は
製造が容易であり、破損の危険が少なく、量が少ない。
以下の実施例は、本願明細書に記載の本発明の具体的な
実施態様を示す。熟練者に明らかな通り、様々な変更お
よび修正が可能であり、記載の本発明の範囲内であると
考えられる。
【００１６】
実施例１ ＜可溶性バリヤーを有する媒体の調製＞この例は、粒子
を試料に移送するための可溶性バリヤーを有する媒体を
調製する実現可能性を示すために実施した。材料 この実施例で使用した材料は次の通りであった。 ・５０％トレハロース溶液 ・ジルコニウムビーズ（直径０．１ｍｍ）(BioSpec) ・逆浸透脱イオン（ＲＯＤＩ）水 ・LabcraftTM容量２．０ｍｌの円錐底微量遠沈管
を試料に移送するための可溶性バリヤーを有する媒体を
調製する実現可能性を示すために実施した。材料 この実施例で使用した材料は次の通りであった。 ・５０％トレハロース溶液 ・ジルコニウムビーズ（直径０．１ｍｍ）(BioSpec) ・逆浸透脱イオン（ＲＯＤＩ）水 ・LabcraftTM容量２．０ｍｌの円錐底微量遠沈管
【００１７】手順 水１２ｍｌと５０％トレハロース溶液３ｍｌを混合する
ことによって、１０％トレハロース溶液を調製した。少
量のケイ酸ジルコニウムビーズを１０％トレハロース溶
液に加えてスラリーを作った。スラリーの部分標本（〜
２００μｌ）を個々の重量ボート内に沈澱させ、乾燥さ
せた。部分標本を真空チャンバに入れ、部分標本を１．
０Ｔｏｒｒの真空に１０分間供することによって乾燥を
促進した。このようにして得られたトレハロースとジル
コニウム／ケイ酸塩ビーズとのマトリックスの形の媒体
を、水１．０ｍｌが入った各管に挿入した。結果 媒体が溶解して、ジルコニウム／ケイ酸塩ビーズが試料
管中の水に放出された。結論 一般的な試料体積に移送するのに十分な量の粒子を含有
する媒体を製造することが可能であった。さらに、媒体
は望み通りに溶解して粒子を放出した。
ことによって、１０％トレハロース溶液を調製した。少
量のケイ酸ジルコニウムビーズを１０％トレハロース溶
液に加えてスラリーを作った。スラリーの部分標本（〜
２００μｌ）を個々の重量ボート内に沈澱させ、乾燥さ
せた。部分標本を真空チャンバに入れ、部分標本を１．
０Ｔｏｒｒの真空に１０分間供することによって乾燥を
促進した。このようにして得られたトレハロースとジル
コニウム／ケイ酸塩ビーズとのマトリックスの形の媒体
を、水１．０ｍｌが入った各管に挿入した。結果 媒体が溶解して、ジルコニウム／ケイ酸塩ビーズが試料
管中の水に放出された。結論 一般的な試料体積に移送するのに十分な量の粒子を含有
する媒体を製造することが可能であった。さらに、媒体
は望み通りに溶解して粒子を放出した。
【００１８】実施例２ ＜媒体の再現性の決定＞この実施例は、比較的一様な媒
体を繰り返し作製することができるかどうかを決定する
ために実施した。材料 この実施例では、以下の材料を使用した。 ・トレハロース (Pfanstiehl) ・ジルコニウムビーズ（０．１ｍｍ）(BioSpec) ・ＲＯＤＩ水 ・P200 Pipetman ・Raininフィルターチップ ・Nunc 8ウェルストリップキャップ、ポリエチレン ・大型ポリスチレン重量ボート
体を繰り返し作製することができるかどうかを決定する
ために実施した。材料 この実施例では、以下の材料を使用した。 ・トレハロース (Pfanstiehl) ・ジルコニウムビーズ（０．１ｍｍ）(BioSpec) ・ＲＯＤＩ水 ・P200 Pipetman ・Raininフィルターチップ ・Nunc 8ウェルストリップキャップ、ポリエチレン ・大型ポリスチレン重量ボート
【００１９】手順 ２種のトレハロース溶液を調製した。トレハトースの部
分標本２．５ｇをＲＯＤＩ水５０ｍｌと混合して５％溶
液とし、トレハロース５．０ｇをＲＯＤＩ水５０ｍｌと
混合して１０％とした。全てのオーバーフローを捕らえ
るために、ジルコニウム溶液を、大型重量ボート内のス
トリップキャップのウェルに入れた。５％トレハロース
溶液３０〜３２μｌを、ウェル８０個に加え、同量の１
０％トレハロース溶液を別のウェル８０個に加えた。両
組のウェルを室温で一晩乾燥させた。５％トレハロース
媒体および１０％トレハトース媒体をウェルから回収
し、減損を最小限に抑えた。両組ともに、各媒体の重量
は約０．２ｇであった。結果 ５％トレハロースまたは１０％トレハロース溶液のいず
れを使用しても、一定重量約２．５ｇの、トレハロース
とジルコニウムビーズとのマトリックスの形の媒体が再
現性良く製造された。
分標本２．５ｇをＲＯＤＩ水５０ｍｌと混合して５％溶
液とし、トレハロース５．０ｇをＲＯＤＩ水５０ｍｌと
混合して１０％とした。全てのオーバーフローを捕らえ
るために、ジルコニウム溶液を、大型重量ボート内のス
トリップキャップのウェルに入れた。５％トレハロース
溶液３０〜３２μｌを、ウェル８０個に加え、同量の１
０％トレハロース溶液を別のウェル８０個に加えた。両
組のウェルを室温で一晩乾燥させた。５％トレハロース
媒体および１０％トレハトース媒体をウェルから回収
し、減損を最小限に抑えた。両組ともに、各媒体の重量
は約０．２ｇであった。結果 ５％トレハロースまたは１０％トレハロース溶液のいず
れを使用しても、一定重量約２．５ｇの、トレハロース
とジルコニウムビーズとのマトリックスの形の媒体が再
現性良く製造された。
【００２０】実施例３ ＜再現性のある媒体製造＞この実施例は、再現性のある
媒体製造方法を評価するために実施した。材料 ・トレハロース（Pfanstiehl） ・０．１ｍｍジルコニウムビーズ（BioSpec) ・ＲＯＤＩ水 ・パラフィンシート ・直径１／４インチの穴がある１／２×２×１６インチ
のDelrinシート（Delrin錠剤）
媒体製造方法を評価するために実施した。材料 ・トレハロース（Pfanstiehl） ・０．１ｍｍジルコニウムビーズ（BioSpec) ・ＲＯＤＩ水 ・パラフィンシート ・直径１／４インチの穴がある１／２×２×１６インチ
のDelrinシート（Delrin錠剤）
【００２１】手順 実施例２と同様に１０％トレハロース溶液を調製した。
ジルコニウムビーズと１０％トレハロース溶液のスラリ
ーを調製した。Delrin錠剤をパラフィンシート上に載
せ、Ｐ−１０００ピペットを使用して、Delrinの錠剤形
成穴を０．５８ｇのレベルまで満たした。満たされた型
を室温で一晩乾燥させた。次に、満たされた型を０．２
Ｔｏｒｒの真空に３時間４０分供した。結果 トレハロースとジルコニウムビーズとのマトリックの形
の媒体は、型から容易にはずれ、一様な重量および密度
を有していた。
ジルコニウムビーズと１０％トレハロース溶液のスラリ
ーを調製した。Delrin錠剤をパラフィンシート上に載
せ、Ｐ−１０００ピペットを使用して、Delrinの錠剤形
成穴を０．５８ｇのレベルまで満たした。満たされた型
を室温で一晩乾燥させた。次に、満たされた型を０．２
Ｔｏｒｒの真空に３時間４０分供した。結果 トレハロースとジルコニウムビーズとのマトリックの形
の媒体は、型から容易にはずれ、一様な重量および密度
を有していた。
【００２２】実施例４ ＜媒体から試料への粒子のデリバリー＞この実施例は、
本発明の媒体を使用して試料への粒子のデリバリーを評
価するために実施した。材料 この実施例で使用した材料は次の通りであった。 ・０．１ｍｍ遊離ジルコニウムビーズ（Cole Palmer) ・３．０ｍｍのガラスビーズを含む長さ１．０ｃｍのガ
ラス媒体 ・ＫＰＤＧ ・陰性ＮＡＣＬ沈澱物 ・Mtb H37Rv ・LabcraftTM管 ・増幅前緩衝液（Pre-Amplification Buffer） ・汚染除去前緩衝液（Pre-decontamination buffer） ・汚染除去ミックス（Decontamination mix) ・増幅ミックス（Amplification mix) ・Ｍｔｂハイブリダイゼーションミックス ・属ハイブリダイゼーションミックス ・内部増幅コントロール（ＩＡＣ）ハイブリダイゼーシ
ョンミックス ・LumiPhos 530TM ・ＡＤ ・Stringency洗浄液 ・システム液（System Fluid） ・実施例３の媒体（ジルコニウムビーズ錠剤）
本発明の媒体を使用して試料への粒子のデリバリーを評
価するために実施した。材料 この実施例で使用した材料は次の通りであった。 ・０．１ｍｍ遊離ジルコニウムビーズ（Cole Palmer) ・３．０ｍｍのガラスビーズを含む長さ１．０ｃｍのガ
ラス媒体 ・ＫＰＤＧ ・陰性ＮＡＣＬ沈澱物 ・Mtb H37Rv ・LabcraftTM管 ・増幅前緩衝液（Pre-Amplification Buffer） ・汚染除去前緩衝液（Pre-decontamination buffer） ・汚染除去ミックス（Decontamination mix) ・増幅ミックス（Amplification mix) ・Ｍｔｂハイブリダイゼーションミックス ・属ハイブリダイゼーションミックス ・内部増幅コントロール（ＩＡＣ）ハイブリダイゼーシ
ョンミックス ・LumiPhos 530TM ・ＡＤ ・Stringency洗浄液 ・システム液（System Fluid） ・実施例３の媒体（ジルコニウムビーズ錠剤）
【００２３】手順 ジルコニウムビーズを含有するガラス媒体１個を、陰性
コントロール管３本および陽性コントロール管（Mycoba
cterium tuberculosi 配列ＩＳ６１１０プラスミド）９
本の各々に加えた。各陰性コントロール管および陽性コ
ントロール管について内部増殖コントロール（ＩＡＣ）
配列プラスミドが入った比較用管を実施した。陰性コン
トロール管３本および陽性コントロール管９本の各々
に、ジルコニウムビーズ錠剤媒体１個も加えた。上記陰
性コントロール管および陽性コントロール管の各々につ
いてＩＡＣ配列プラスミドが入った比較用管も実施し
た。M. tuberculosis 粒子を陰性ＮＡＣＬ沈澱物にスパ
イクし、最終濃度５００粒子／０．２５ｍｌとすること
によって、陽性コントロール管を製作した。ＫＰＤＧ１
ｍｌを各管に加え、各管を１２，０００ｇで３．０分間
遠心分離した。各管から上澄み液を移し取り、ＫＰＤＧ
１．０ｍｌを各管に加えた。この管を再度１２，００
０で３．０分間遠心分離し、上澄み液を移し取った。全
ての管を強制熱気炉内、１０５℃で３０分間加熱し、
５．０ｍ／ｓに設定した BIO 101 Savant FastPrepTMを
使用して４５秒間攪拌した。
コントロール管３本および陽性コントロール管（Mycoba
cterium tuberculosi 配列ＩＳ６１１０プラスミド）９
本の各々に加えた。各陰性コントロール管および陽性コ
ントロール管について内部増殖コントロール（ＩＡＣ）
配列プラスミドが入った比較用管を実施した。陰性コン
トロール管３本および陽性コントロール管９本の各々
に、ジルコニウムビーズ錠剤媒体１個も加えた。上記陰
性コントロール管および陽性コントロール管の各々につ
いてＩＡＣ配列プラスミドが入った比較用管も実施し
た。M. tuberculosis 粒子を陰性ＮＡＣＬ沈澱物にスパ
イクし、最終濃度５００粒子／０．２５ｍｌとすること
によって、陽性コントロール管を製作した。ＫＰＤＧ１
ｍｌを各管に加え、各管を１２，０００ｇで３．０分間
遠心分離した。各管から上澄み液を移し取り、ＫＰＤＧ
１．０ｍｌを各管に加えた。この管を再度１２，００
０で３．０分間遠心分離し、上澄み液を移し取った。全
ての管を強制熱気炉内、１０５℃で３０分間加熱し、
５．０ｍ／ｓに設定した BIO 101 Savant FastPrepTMを
使用して４５秒間攪拌した。
【００２４】この実施例の全ての管に対して、鎖置換増
幅 Strand Displacement Amplification（ＳＤＡ）、お
よび１９９６年３月１２日に提出した同時係属米国特許
出願第０８／６１４，１０８号の実施例１（特別に援用
して本願明細書の一部をなすものとする）に記載の検出
手順を実施した。さらに詳細には、下記の条件下で下記
の試薬を使用して、ＳＤＡアッセイで各試料の部分標本
３０μｌ（「非希釈試料」）を直接実施した。０．５ｍ
Ｌ微量遠沈管内で試料３０μｌを増幅前緩衝液５μｌと
合せた。この試料を熱湯浴中で３分間加熱した。これ
に、Decontamination Drydown Mix １０ｕｌを加え、ア
ンプリコン汚染除去反応を４１℃で５０分間実施した。
アンプリコン汚染除去は、米国特許第５，０３５，９９
６号などの参考文献（その開示内容を特別に援用して本
願明細書の一部をなすものとする）から、当業者に周知
の方法を使用して実施した。簡単に記載すると、核酸増
幅工程中に、ヌクレオチドｄＵＴＰをｄＴＴＰの代わり
に使用し、それ故、標的ＤＮＡ配列（アンプリコン）か
ら複製された全ての生成物はｄＴＴＰの代わりにｄＵＴ
Ｐを含む。次に、核酸増殖工程の前に、試料を酵素ウラ
シルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と接触させる。ｄ
ＵＴＰがＤＮＡ分子に組込まれると、ＵＤＧは、ウラシ
ルと糖デオキシリボースとの間のグリコシド結合を切断
する。それ故、前の核酸増幅工程のアンプリコンは増幅
不能になる（すなわち、複製用鋳型として不適当であ
る）。したがって、試料中の真の標的配列のみが核酸増
幅用鋳型の役割をする。
幅 Strand Displacement Amplification（ＳＤＡ）、お
よび１９９６年３月１２日に提出した同時係属米国特許
出願第０８／６１４，１０８号の実施例１（特別に援用
して本願明細書の一部をなすものとする）に記載の検出
手順を実施した。さらに詳細には、下記の条件下で下記
の試薬を使用して、ＳＤＡアッセイで各試料の部分標本
３０μｌ（「非希釈試料」）を直接実施した。０．５ｍ
Ｌ微量遠沈管内で試料３０μｌを増幅前緩衝液５μｌと
合せた。この試料を熱湯浴中で３分間加熱した。これ
に、Decontamination Drydown Mix １０ｕｌを加え、ア
ンプリコン汚染除去反応を４１℃で５０分間実施した。
アンプリコン汚染除去は、米国特許第５，０３５，９９
６号などの参考文献（その開示内容を特別に援用して本
願明細書の一部をなすものとする）から、当業者に周知
の方法を使用して実施した。簡単に記載すると、核酸増
幅工程中に、ヌクレオチドｄＵＴＰをｄＴＴＰの代わり
に使用し、それ故、標的ＤＮＡ配列（アンプリコン）か
ら複製された全ての生成物はｄＴＴＰの代わりにｄＵＴ
Ｐを含む。次に、核酸増殖工程の前に、試料を酵素ウラ
シルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と接触させる。ｄ
ＵＴＰがＤＮＡ分子に組込まれると、ＵＤＧは、ウラシ
ルと糖デオキシリボースとの間のグリコシド結合を切断
する。それ故、前の核酸増幅工程のアンプリコンは増幅
不能になる（すなわち、複製用鋳型として不適当であ
る）。したがって、試料中の真の標的配列のみが核酸増
幅用鋳型の役割をする。
【００２５】アンプリコン汚染除去後、Amplification
Drydown Mix １０μｌを加え、試料を４１℃でさらに２
時間インキュベートして、鎖置換増幅（ＳＤＡ）工程を
進行させた。ＳＤＡは当業者に周知の核酸増幅方法であ
る。簡単に記載すると、鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、プラ
イマーの延長、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識／切
断部位のニッキング、１本鎖延長生成物の置換、プライ
マーの延長生成物へのアニーリング（または最初の標的
配列）およびその後のプライマーの延長が反応混合物中
で同時に起こる等温核酸増幅法である。これは、反応の
温度循環特性の結果として反応の各工程が不連続相また
は周期で起こるＰＣＲと著しく異なる。ＳＤＡは、１）
制限エンドヌクレアーゼが、そのヘミホスホロチオエー
ト型２本鎖認識／開裂部位の未改変鎖をニッキングする
能力、および２）あるポリメラーゼが切断点で複製を開
始し、非鋳型鎖の下流を置換する能力に基づく。プライ
マーアニーリング用の２本鎖標的配列を変性させるため
に高温（約９５℃）で最初にインキュベーションした
後、新たに合成された鎖の重合および置換が一定の温度
で行われる。標的配列の各々の新しいコピーの産生は、
次の５工程から成る。 １）増幅プライマーを、最初の標的配列または予め重合
されている置換された１本鎖延長生成物に結合するこ
と、 ２）α−チオデオキシヌクレオシドトリホスフェート
（αチオｄＮＴＰ）を組込む５′−３′エキソヌクレア
ーゼ欠失ポリメラーゼによるプライマーの延長、 ３）半改変２本鎖制限部位のニッキング、 ４）ニック部位からの制限酵素の解離、および ５）５′−３′エキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼに
よるニックの３′末端からの延長と新たに合成された鎖
の下流の置換。 ニックからの延長によって別のニック可能な制限部位が
再生するため、ニッキング、重合および置換が一定の温
度で同時かつ連続的に起こる。各々が２本鎖標的配列の
２本の鎖のうちの１本とハイブリッドをする１対の増幅
プライマーを使用するとき、増幅は指数関数的である。
これは、センス鎖およびアンチセンス鎖が後続の増幅で
反対プライマーの鋳型の役割をするためである。増幅プ
ライマー１種を使用するとき、唯一の鎖がプライマー延
長の鋳型の役割をするため、増幅は線形である。α−チ
オｄＮＴＰが組込まれるとき、二本鎖認識／切断部位を
切断する制限エンドヌクレアーゼの例は、ＨｉｎｃＩ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩ、ＡｖａＩ、ＮｃｉＩ、およびＦｕｎ
４ＨＩである。これらの制限ヌクレアーゼおよび必要な
ニッキング活性を示す他のヌクレアーゼはすべて、従来
のＳＤＡで使用するのに適している。しかし、これらは
比較的熱不安定であり、約４０℃より高い温度で活性を
失う。
Drydown Mix １０μｌを加え、試料を４１℃でさらに２
時間インキュベートして、鎖置換増幅（ＳＤＡ）工程を
進行させた。ＳＤＡは当業者に周知の核酸増幅方法であ
る。簡単に記載すると、鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、プラ
イマーの延長、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識／切
断部位のニッキング、１本鎖延長生成物の置換、プライ
マーの延長生成物へのアニーリング（または最初の標的
配列）およびその後のプライマーの延長が反応混合物中
で同時に起こる等温核酸増幅法である。これは、反応の
温度循環特性の結果として反応の各工程が不連続相また
は周期で起こるＰＣＲと著しく異なる。ＳＤＡは、１）
制限エンドヌクレアーゼが、そのヘミホスホロチオエー
ト型２本鎖認識／開裂部位の未改変鎖をニッキングする
能力、および２）あるポリメラーゼが切断点で複製を開
始し、非鋳型鎖の下流を置換する能力に基づく。プライ
マーアニーリング用の２本鎖標的配列を変性させるため
に高温（約９５℃）で最初にインキュベーションした
後、新たに合成された鎖の重合および置換が一定の温度
で行われる。標的配列の各々の新しいコピーの産生は、
次の５工程から成る。 １）増幅プライマーを、最初の標的配列または予め重合
されている置換された１本鎖延長生成物に結合するこ
と、 ２）α−チオデオキシヌクレオシドトリホスフェート
（αチオｄＮＴＰ）を組込む５′−３′エキソヌクレア
ーゼ欠失ポリメラーゼによるプライマーの延長、 ３）半改変２本鎖制限部位のニッキング、 ４）ニック部位からの制限酵素の解離、および ５）５′−３′エキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼに
よるニックの３′末端からの延長と新たに合成された鎖
の下流の置換。 ニックからの延長によって別のニック可能な制限部位が
再生するため、ニッキング、重合および置換が一定の温
度で同時かつ連続的に起こる。各々が２本鎖標的配列の
２本の鎖のうちの１本とハイブリッドをする１対の増幅
プライマーを使用するとき、増幅は指数関数的である。
これは、センス鎖およびアンチセンス鎖が後続の増幅で
反対プライマーの鋳型の役割をするためである。増幅プ
ライマー１種を使用するとき、唯一の鎖がプライマー延
長の鋳型の役割をするため、増幅は線形である。α−チ
オｄＮＴＰが組込まれるとき、二本鎖認識／切断部位を
切断する制限エンドヌクレアーゼの例は、ＨｉｎｃＩ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩ、ＡｖａＩ、ＮｃｉＩ、およびＦｕｎ
４ＨＩである。これらの制限ヌクレアーゼおよび必要な
ニッキング活性を示す他のヌクレアーゼはすべて、従来
のＳＤＡで使用するのに適している。しかし、これらは
比較的熱不安定であり、約４０℃より高い温度で活性を
失う。
【００２６】ＳＤＡによる増幅の標的は、大きい核酸
を、標的配列を切断しないエンドヌクレアーゼを使用し
て制限することによって破片にすることにより、製作す
ることが可能である。しかし、一般に、Walker et al.
1992. Proc. Natl. Acad. SciUSA 89, 392-396, Walker
et al. 1992. Nucl. Acids Res. 20, 1691-1696 およ
び米国特許第５，２７０，１８４号（特別に援用して本
願明細書の一部をなすものとする）に記載の通りに、Ｓ
ＤＡ反応におけるニッキング用に選択された制限ヌクレ
アーゼ認識／切断部位を有する標的核酸を作製すること
が好ましい。簡単に記載すると、標的配列が２本鎖であ
る場合、４種のプライマーが標的配列にハイブリッド形
成される。このプライマーのうち２種（Ｓ1 および
Ｓ2 ）はＳＤＡ増幅プライマーであり、２種（Ｂ1 およ
びＢ2 ）は外部プライマーまたはバンパープライマーで
ある。Ｓ1 およびＳ2 は標的配列に隣接する２本鎖核酸
の反対の鎖に結合する。Ｂ1 およびＢ2 は、それぞれＳ
1 およびＳ2 の標的配列５′（すなわち上流）に結合す
る。次に、３種の三リン酸デオキシヌクレオシドおよび
少なくとも１種の改変三リン酸デオキシヌクレオシド
（たとえば、２′−デオキシアデノシン５′−Ｏ−（１
−チオトリホスフェート）、「ｄＡＴＰαＳ」）の存在
下で、エキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼを使用して
４種のプライマーを同時に延長する。その結果、Ｓ1 お
よびＳ2 の延長生成物は、Ｂ1 およびＢ2 の延長によっ
て、最初の標的配列鋳型から置換される。置換された、
増幅プライマーの１本鎖延長生成物は、反対の増幅プラ
イマーおよびバンパープライマーを結合する標的の役割
をする（たとえば、Ｓ1 の延長生成物はＳ2 およびＢ2
に結合する）。次の延長サイクルおよび置換で、各末端
に半改変制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を有す
る２種の２本鎖核酸フラグメントが生じる。これらは、
ＳＤＡによる増幅に適当した基質である。ＳＤＡの場合
と同様、標的生成反応の個々の工程が同時且つ連続的に
起こり、ＳＤＡでの制限酵素によるニッキングに必要な
末端に認識／切断配列を含む標的配列が生じる。ＳＤＡ
反応の成分全部が既に標的生成反応に存在するため、標
的配列が自動的に生成し、ＳＤＡサイクルに連続的に入
って増幅される。
を、標的配列を切断しないエンドヌクレアーゼを使用し
て制限することによって破片にすることにより、製作す
ることが可能である。しかし、一般に、Walker et al.
1992. Proc. Natl. Acad. SciUSA 89, 392-396, Walker
et al. 1992. Nucl. Acids Res. 20, 1691-1696 およ
び米国特許第５，２７０，１８４号（特別に援用して本
願明細書の一部をなすものとする）に記載の通りに、Ｓ
ＤＡ反応におけるニッキング用に選択された制限ヌクレ
アーゼ認識／切断部位を有する標的核酸を作製すること
が好ましい。簡単に記載すると、標的配列が２本鎖であ
る場合、４種のプライマーが標的配列にハイブリッド形
成される。このプライマーのうち２種（Ｓ1 および
Ｓ2 ）はＳＤＡ増幅プライマーであり、２種（Ｂ1 およ
びＢ2 ）は外部プライマーまたはバンパープライマーで
ある。Ｓ1 およびＳ2 は標的配列に隣接する２本鎖核酸
の反対の鎖に結合する。Ｂ1 およびＢ2 は、それぞれＳ
1 およびＳ2 の標的配列５′（すなわち上流）に結合す
る。次に、３種の三リン酸デオキシヌクレオシドおよび
少なくとも１種の改変三リン酸デオキシヌクレオシド
（たとえば、２′−デオキシアデノシン５′−Ｏ−（１
−チオトリホスフェート）、「ｄＡＴＰαＳ」）の存在
下で、エキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼを使用して
４種のプライマーを同時に延長する。その結果、Ｓ1 お
よびＳ2 の延長生成物は、Ｂ1 およびＢ2 の延長によっ
て、最初の標的配列鋳型から置換される。置換された、
増幅プライマーの１本鎖延長生成物は、反対の増幅プラ
イマーおよびバンパープライマーを結合する標的の役割
をする（たとえば、Ｓ1 の延長生成物はＳ2 およびＢ2
に結合する）。次の延長サイクルおよび置換で、各末端
に半改変制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を有す
る２種の２本鎖核酸フラグメントが生じる。これらは、
ＳＤＡによる増幅に適当した基質である。ＳＤＡの場合
と同様、標的生成反応の個々の工程が同時且つ連続的に
起こり、ＳＤＡでの制限酵素によるニッキングに必要な
末端に認識／切断配列を含む標的配列が生じる。ＳＤＡ
反応の成分全部が既に標的生成反応に存在するため、標
的配列が自動的に生成し、ＳＤＡサイクルに連続的に入
って増幅される。
【００２７】上記出版物に初めて報告されたＳＤＡ反応
（「従来のＳＤＡ」）は、一般に約３５〜４５℃の温度
で実施され、約２時間で標的配列の１０8 倍の増幅が可
能である。近年，ＳＤＡはより高い反応温度（約４５〜
６５℃，「好熱性ＳＤＡ」または「ｔＳＤＡ」）に合せ
て改質された。ｔＳＤＡは、約５０〜６０℃で、約１５
〜３０分で１０9 〜１０10倍の増幅が可能である。反応
速度の上昇に加えて、ｔＳＤＡでは従来のＳＤＡに比べ
て非特異的バックグラウンド増幅が顕著に減少する。増
幅した標的M. tuberculosis 複合種配列（ＩＳ６１１
０）の検出を BDPProbeTec機で二重に実施した。この反
応システムは C.A. Spargo et al. によりMolec. Cellu
lar pribes 7:395-404 (1993) に十分に記載されてい
る。BDTProbeTecTM機は、ＳＤＡアッセイを実施するた
めの自動システムである。この実施例のＳＤＡアッセイ
後に、増幅された標的配列の検出を自動的に実施するた
めに使用された BDTProbeTecTM機の実施態様の個々の詳
細は、１９９５年３月２４日に提出された米国特許出願
第０８／４０９，８２１号に開示されており、その開示
内容を援用して本願明細書の一部をなすものとする。結果 この実施例の結果を下記表１および表２に記載する。
（「従来のＳＤＡ」）は、一般に約３５〜４５℃の温度
で実施され、約２時間で標的配列の１０8 倍の増幅が可
能である。近年，ＳＤＡはより高い反応温度（約４５〜
６５℃，「好熱性ＳＤＡ」または「ｔＳＤＡ」）に合せ
て改質された。ｔＳＤＡは、約５０〜６０℃で、約１５
〜３０分で１０9 〜１０10倍の増幅が可能である。反応
速度の上昇に加えて、ｔＳＤＡでは従来のＳＤＡに比べ
て非特異的バックグラウンド増幅が顕著に減少する。増
幅した標的M. tuberculosis 複合種配列（ＩＳ６１１
０）の検出を BDPProbeTec機で二重に実施した。この反
応システムは C.A. Spargo et al. によりMolec. Cellu
lar pribes 7:395-404 (1993) に十分に記載されてい
る。BDTProbeTecTM機は、ＳＤＡアッセイを実施するた
めの自動システムである。この実施例のＳＤＡアッセイ
後に、増幅された標的配列の検出を自動的に実施するた
めに使用された BDTProbeTecTM機の実施態様の個々の詳
細は、１９９５年３月２４日に提出された米国特許出願
第０８／４０９，８２１号に開示されており、その開示
内容を援用して本願明細書の一部をなすものとする。結果 この実施例の結果を下記表１および表２に記載する。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】結論 ジルコニウムビーズを含有するガラスカプセル媒体で処
理した試料とジルコニウム錠剤媒体で処理した試料との
間で、視覚的に認められた差はなかった（すなわち、流
体工学、粘度、色など）。ジルコニウムビーズ錠剤媒体
を溶解するために管を攪拌することが必要であった。ガ
ラスカプセル媒体で処理した試料とジルコニウム錠剤媒
体で処理した試料との間で、ＲＬＵの統計学的差はＴ−
検定で認められなかった。
理した試料とジルコニウム錠剤媒体で処理した試料との
間で、視覚的に認められた差はなかった（すなわち、流
体工学、粘度、色など）。ジルコニウムビーズ錠剤媒体
を溶解するために管を攪拌することが必要であった。ガ
ラスカプセル媒体で処理した試料とジルコニウム錠剤媒
体で処理した試料との間で、ＲＬＵの統計学的差はＴ−
検定で認められなかった。
【００３１】実施例５ ＜媒体から試料への粒子のデリバリーのさらなる評価＞
この実施例は、本発明の媒体を使用して試料への粒子の
デリバリーをさらに評価するために実施した。材料 この実施例で使用した材料は実施例４で使用したものと
同じであった。手順 この実施例の手順は、実施例４に記載のｔＳＤＡを使用
したこと、ならびに媒体および試料の体積が下記の通り
であったこと以外は、実施例４の手順と実質的に同じで
あった。 媒体 陽性コントロール 管数 試料の体積 （管当たりの反復数） 錠剤 １ｍｌ ３（４） 錠剤 ０．４ｍｌ ６（２） ガラスカプセル ０．４ｍｌ ６（２） また、上記実験の各媒体／陽性コントロール試料につい
て陰性コントロール管２本を処理した。これらの陰性コ
ントロールを二重に実行し、各陰性コントロール管およ
び陽性コントロール管についてＩＡＣ試料を実施した。結果 この実施例の結果を表２に記載する。
この実施例は、本発明の媒体を使用して試料への粒子の
デリバリーをさらに評価するために実施した。材料 この実施例で使用した材料は実施例４で使用したものと
同じであった。手順 この実施例の手順は、実施例４に記載のｔＳＤＡを使用
したこと、ならびに媒体および試料の体積が下記の通り
であったこと以外は、実施例４の手順と実質的に同じで
あった。 媒体 陽性コントロール 管数 試料の体積 （管当たりの反復数） 錠剤 １ｍｌ ３（４） 錠剤 ０．４ｍｌ ６（２） ガラスカプセル ０．４ｍｌ ６（２） また、上記実験の各媒体／陽性コントロール試料につい
て陰性コントロール管２本を処理した。これらの陰性コ
ントロールを二重に実行し、各陰性コントロール管およ
び陽性コントロール管についてＩＡＣ試料を実施した。結果 この実施例の結果を表２に記載する。
【００３２】
【表３】
【００３３】
【表４】
【００３４】結論 処理した試料との間で、視覚的に認められた差はなかっ
た（すなわち、流体工学、粘度、色など）。ジルコニウ
ムビーズ錠剤媒体を溶解するために管を攪拌することが
必要であった。本発明の媒体は、分子生物学的処理に供
せられる試料に粒子を移送する有用な方法である。
た（すなわち、流体工学、粘度、色など）。ジルコニウ
ムビーズ錠剤媒体を溶解するために管を攪拌することが
必要であった。本発明の媒体は、分子生物学的処理に供
せられる試料に粒子を移送する有用な方法である。
【００３５】実施例６ ＜ジルコニウム粒子を含有するガラスカプセル媒体で処
理した試料とジルコニウム粒子錠剤媒体で処理した試料
との比較＞この実施例は、ジルコニウム粒子を含有する
ガラスカプセル媒体で処理した試料の上清（「カプセ
ル」）と、ジルコニウム粒子錠剤媒体で処理した試料の
上清（「錠剤」）との間に、差があるかどうかを評価す
るために実施したものである。材料 この実施例で使用した材料は次の通りであった。 ・ジルコニウム粒子／トレハロース錠０．３ｇ ・３ｍｍガラスボールを含むジルコニウム粒子カプセル
１００μＬ ・M. tuberculosis 複合アッセイ用試料希釈剤 ・２ｍｌ試料処理管
理した試料とジルコニウム粒子錠剤媒体で処理した試料
との比較＞この実施例は、ジルコニウム粒子を含有する
ガラスカプセル媒体で処理した試料の上清（「カプセ
ル」）と、ジルコニウム粒子錠剤媒体で処理した試料の
上清（「錠剤」）との間に、差があるかどうかを評価す
るために実施したものである。材料 この実施例で使用した材料は次の通りであった。 ・ジルコニウム粒子／トレハロース錠０．３ｇ ・３ｍｍガラスボールを含むジルコニウム粒子カプセル
１００μＬ ・M. tuberculosis 複合アッセイ用試料希釈剤 ・２ｍｌ試料処理管
【００３６】手順 清潔な使い捨てピンセットを使用して、試料処理管５本
の各々にカプセル１個を加えた。清潔な使い捨てピンセ
ットを使用して、試料処理管５本の各々に錠剤１個を加
えた。試料希釈剤４００μｌで、全ての試料処理管を再
懸濁した。５ｍ／秒2 に設定した BIO 101 Savant FAST
PREPTM機で、各管を４５秒間処理した。処理後、各管か
ら顕微鏡のスライド上に上清１００μＬを移し、倍率１
０倍でスライドを検査することによって、上清の透明度
を観察した。観察／結果 錠剤で処理した試料の上清は、５本の管すべてで一貫し
て透き通っていた。対照的に、カプセルで処理した試料
の上清は、５本の管すべてで濁っていた。検鏡で、カプ
セルで処理した試料の上清中に破片様屑が認められた
が、錠剤で処理した試料の上清中には、そのような屑は
全く見られなかった。結論 カプセルで処理した試料の上清中に見られた破片様屑
は、ハイブリダイセーションや増幅など、試料が供せら
れる後続の工程における望ましくない相互作用または反
応に寄与する可能性がある。したがって、試料の処理に
錠剤を使用すると、このような潜在的に有害な屑がない
ため、好ましいと考えられる。
の各々にカプセル１個を加えた。清潔な使い捨てピンセ
ットを使用して、試料処理管５本の各々に錠剤１個を加
えた。試料希釈剤４００μｌで、全ての試料処理管を再
懸濁した。５ｍ／秒2 に設定した BIO 101 Savant FAST
PREPTM機で、各管を４５秒間処理した。処理後、各管か
ら顕微鏡のスライド上に上清１００μＬを移し、倍率１
０倍でスライドを検査することによって、上清の透明度
を観察した。観察／結果 錠剤で処理した試料の上清は、５本の管すべてで一貫し
て透き通っていた。対照的に、カプセルで処理した試料
の上清は、５本の管すべてで濁っていた。検鏡で、カプ
セルで処理した試料の上清中に破片様屑が認められた
が、錠剤で処理した試料の上清中には、そのような屑は
全く見られなかった。結論 カプセルで処理した試料の上清中に見られた破片様屑
は、ハイブリダイセーションや増幅など、試料が供せら
れる後続の工程における望ましくない相互作用または反
応に寄与する可能性がある。したがって、試料の処理に
錠剤を使用すると、このような潜在的に有害な屑がない
ため、好ましいと考えられる。
【００３７】実施例７ ＜カプセルおよび錠剤を用いたM. tuberculosis 陽性コ
ントロール試料の処理の比較＞この実施例は、カプセル
で処理したM. tuberculosis 陽性コントロール試料を、
錠剤で処理したこのような陽性コントロール試料と比較
するために実施した。 材料 この実施例で使用した材料は次の通りであった。 ・実施例６と同様のジルコニウム粒子／トレハロース錠
０．３ｇ ・実施例６と同様の３ｍｍガラスボールを含むジルコニ
ウム粒子カプセル１００μＬ ・実施例６と同様のM. tuberculosis 複合アッセイ用試
料希釈剤 ・M. tuberculosis 陽性コントロール試料またはM. tub
erculosis 陰性コントロール試料のいずれかが入ってい
る２ｍｌ試料処理管
ントロール試料の処理の比較＞この実施例は、カプセル
で処理したM. tuberculosis 陽性コントロール試料を、
錠剤で処理したこのような陽性コントロール試料と比較
するために実施した。 材料 この実施例で使用した材料は次の通りであった。 ・実施例６と同様のジルコニウム粒子／トレハロース錠
０．３ｇ ・実施例６と同様の３ｍｍガラスボールを含むジルコニ
ウム粒子カプセル１００μＬ ・実施例６と同様のM. tuberculosis 複合アッセイ用試
料希釈剤 ・M. tuberculosis 陽性コントロール試料またはM. tub
erculosis 陰性コントロール試料のいずれかが入ってい
る２ｍｌ試料処理管
【００３８】手順 M. tuberculosis 陽性コントロール試料管４４本を調製
した（＃１〜４４）。清潔な使い捨てピンセットを使用
して、管＃１〜２２の各々に錠剤１個を加えた。清潔な
使い捨てピンセットを使用して、管＃２３〜３３の各々
にカプセル１個を加えた。管３４〜４４には、錠剤もカ
プセルも加えなかった。試料希釈剤４００μＬで全ての
管を再懸濁させた。各管を処理した。５ｍ／秒 2 に設定
した BIO 101 Savant FASTPREP機で、各管を４５秒間処
理した。管＃１〜１１をクイックスピン（すなわち、３
０秒で１５，５００相対遠心力）に供してから加工し
た。次に、全ての試験管をｔＳＤＡ工程および実施例４
と同様の検出工程に供した。結果 この実施例の結果を下表３に記載する。
した（＃１〜４４）。清潔な使い捨てピンセットを使用
して、管＃１〜２２の各々に錠剤１個を加えた。清潔な
使い捨てピンセットを使用して、管＃２３〜３３の各々
にカプセル１個を加えた。管３４〜４４には、錠剤もカ
プセルも加えなかった。試料希釈剤４００μＬで全ての
管を再懸濁させた。各管を処理した。５ｍ／秒 2 に設定
した BIO 101 Savant FASTPREP機で、各管を４５秒間処
理した。管＃１〜１１をクイックスピン（すなわち、３
０秒で１５，５００相対遠心力）に供してから加工し
た。次に、全ての試験管をｔＳＤＡ工程および実施例４
と同様の検出工程に供した。結果 この実施例の結果を下表３に記載する。
【００３９】
【表５】
【００４０】結論 M. tuberculosis （Ｍ．ｔｂ）の平均ＲＬＵも内部増幅
コントロール（ＬＡＣ）平均ＲＬＵも、他の条件と比べ
て錠剤で高値であった。この実施例で使用した試料の場
合、錠剤処理にクイックスピン工程の必要性はないよう
であった。本発明をかなり詳細に説明してきたが、本発
明の範囲から逸脱せずに、当業者に明らかな修正を行う
ことが可能である。本発明の様々な特徴を以下の請求の
範囲に述べる。
コントロール（ＬＡＣ）平均ＲＬＵも、他の条件と比べ
て錠剤で高値であった。この実施例で使用した試料の場
合、錠剤処理にクイックスピン工程の必要性はないよう
であった。本発明をかなり詳細に説明してきたが、本発
明の範囲から逸脱せずに、当業者に明らかな修正を行う
ことが可能である。本発明の様々な特徴を以下の請求の
範囲に述べる。
【図１】図１は、本発明の媒体の１実施態様および媒体
を入れる典型的なスクリューキャップ試料管の分解透視
図である。
を入れる典型的なスクリューキャップ試料管の分解透視
図である。
【図２】図２は、図１の媒体および試料管の分解断面図
である。
である。
【図３】図３は、試料管内の試料中の媒体の断面図であ
る。
る。
【図４】図４は、攪拌中の、密封された試料管内に放出
された粒子の断面図である。
された粒子の断面図である。
【図５】図５は、攪拌完了後の、密封された試料管内に
放出された粒子の断面図である。
放出された粒子の断面図である。
【図６】図６は、媒体の拡大断面図である。
フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 スティーヴン・エイチ・スチェパニック アメリカ合衆国メリーランド州21228，ケ イトンズヴィル，ホワイト・オーク・アヴ ェニュー 746
Claims (9)
- 【請求項１】 粒子が試料に放出されるまで粒子を保持
する可溶性物質を含む媒体であって、前記粒子は、試料
を攪拌または超音波処理する際に細胞を破壊し、それか
ら核酸を入手可能にするために十分な時間、試料中で未
溶解のままであるように十分に非可溶性であることを特
徴とする細胞を含有する試料への粒子移送媒体。 - 【請求項２】 前記可溶性物質が、トレハロースである
ことを特徴とする請求項１に記載の粒子移送媒体。 - 【請求項３】 前記粒子とトレハロースが、粒子がトレ
ハロースによって互いに接近して維持されることを特徴
とするマトリックスを形成する、請求項２に記載の粒子
移送媒体。 - 【請求項４】 前記マトリックスが、錠剤を形成するこ
とを特徴とする請求項３に記載の粒子移送媒体。 - 【請求項５】 前記粒子が、ガラスビーズであることを
特徴とする請求項１に記載の粒子移送媒体。 - 【請求項６】 前記粒子が、ジルコニウム／ケイ酸塩ビ
ーズであることを特徴とする請求項１に記載の粒子移送
媒体。 - 【請求項７】 （ａ）細胞を含有する試料に、請求項１
に記載の媒体を加える工程と、 （ｂ）細胞を破壊して細胞成分を放出させる工程と、 （ｃ）媒体から粒子を放出させる工程と、 （ｄ）核酸を他の細胞成分から分離するために試料を十
分に攪拌する工程とを含む細胞成分の入手方法。 - 【請求項８】 試料中の感染性生物を非感染性にするの
に十分な温度および時間、試料を加熱することによって
細胞が破壊されることを特徴とする請求項７記載の細胞
成分の入手方法。 - 【請求項９】 試料中でバリヤーを溶解することによっ
て媒体から粒子を放出させることを特徴とする請求項７
記載の細胞成分の入手方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/911697 | 1997-08-15 | ||
| US08/911,697 US5840878A (en) | 1996-03-12 | 1997-08-15 | Vehicle for delivery of particles to a sample |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11113570A true JPH11113570A (ja) | 1999-04-27 |
Family
ID=25430711
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10229620A Pending JPH11113570A (ja) | 1997-08-15 | 1998-08-14 | 粒子移送媒体および細胞成分の入手方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5840878A (ja) |
| EP (1) | EP0897989A3 (ja) |
| JP (1) | JPH11113570A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101978270B1 (ko) * | 2017-12-27 | 2019-05-14 | 연세대학교 산학협력단 | 3차원 세포 배양에서의 물질 전달 장치 및 방법 |
Families Citing this family (9)
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