JPH11113584A - オリゴヌクレオチドバンク - Google Patents

オリゴヌクレオチドバンク

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JPH11113584A
JPH11113584A JP10221012A JP22101298A JPH11113584A JP H11113584 A JPH11113584 A JP H11113584A JP 10221012 A JP10221012 A JP 10221012A JP 22101298 A JP22101298 A JP 22101298A JP H11113584 A JPH11113584 A JP H11113584A
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ヘルムート ブロッカー
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヘキサメリック、ヘプタメリック、オクタメ
リック、ノナメリックなオリゴヌクレオチドを含むオリ
ゴヌクレオチドバンク。 【解決手段】 これらは、マルチプライマー法による塩
基配列の決定においてプライマーサイトにハイブリダイ
ズさせ、続いてライゲーションしてプライマーを等作製
するためのオリゴヌクレオチドバンクとして用いられ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は DNA塩基配列決定の
ために用いられるオリゴヌクレオチドバンクに関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸フラグメント、特に DNAの配列決定
分析は現代の生物化学と現代のバイオテクノロジーにお
けるキープロセス(Schluesselverfahren) として位置づ
けられるかも知れない。最近の配列決定技術の絶え間の
ない進歩に伴なって、複雑なゲノム全体であっても分析
の可能性が現実的なものとなってきた。あまり一般的で
ない2, 3の方法を除くと、現時点において、２つの基礎
的に異なった方法が配列決定のために特によく用いられ
る。つまり、 ──化学修飾と分解とによる配列決定分析（マキシム／
ギルバート）ならびに、 ──異種のヌクレオチドのコントロールされた条件下で
のポリメラーゼ添加による配列決定分析（サンガー
法）： 例えば、Gassen 及び Schaefer, Sequenzbestimmung v
on Nucleinsaeuren und Proteinen, in: Gassen et al,
Gentechnik, 2. Auflage, Gustav-Fischer-Verlag, 19
87, Seite 241 ff. 参照。
【０００３】サンガー法は、配列決定用に特に調製され
た一本鎖 DNAを用いて行なわれるか、又はここ数年のケ
ースとして充分に純粋な２本鎖 DNAを用いて行なわれ
る。しかしながら、サンガー法の一般的特徴として用い
られる酵素(DNAポリメララーゼ) に依存するという問題
点を残している。この酵素は鋳型(Matrize)(鋳型＝配列
決定されるべき DNA) と短い鎖長の分子 (ブライマー)
の両方に用いられるものである。
【０００４】このプライマーは、一般に、短くて化学的
に合成されたオリゴヌクレオチドであって、且つ配列決
定をするための DNAセクションの全長の中でより3'未満
側に位置づけられた部位と塩基対が相補的な関係にある
ものである (図１参照）。まず、明瞭な配列決定の結果
を得るために、実験条件下で、プライマーが望んでいる
結合部位のみを見出し、いかなる他の接合部位にも見出
されないように、プライマーの結合部位 (ハイブリダイ
ズされる部位) を選択しなければならない。プライマー
の特異性は実験に用いられた DNAの複雑さとその長さに
直接依存する。統計的な考察と実際の経験から24塩基対
(Basen)までの鎖長を持ったプライマーが全ての考えら
れるケースに対して充分であることが見出されている。
非常に長い DNAの配列決定分析の場合 (例えば、ゲノム
の配列決定) には、現在、本質的に２つの異なったスト
ラテジ(Strateg) が用いられる。
【０００５】ストラテジ１： シングル−プライマー法 この方法において配列決定される DNAはより大きな或い
はより小さなランダムな断片に分断されるか、もしくは
部分的に組織的な断片（方法の若干の違いに依存して）
に分断される。次にこの断片は同じ種類のベクター内に
挿入される。細胞のトランスフォーメーション後、個々
のクローンの DNA調製物を調製し、配列決定分析を行な
う。全ての DNA調製物は最大挿入された DNAによって異
なっているので、例えばベクター DNA上の挿入部位に直
接に隣接してハイブリダイズしたシングルプライマー
は、原理的に、すべて要求される配列決定分析のために
用いることができる。しかしながら、この利点と対比さ
れる顕著な欠点がある。
【０００６】第１に、クローンはランダムに捜さねばな
らないので、オリジナル DNAの個々の断片は、しばしば
必要であるよりもはるかに多くの配列決定がなされる。
そして、第２に、適当なコンピュータープログラムを用
いて配列決定した部分配列結果のパターン分析におい
て、大きなギャップをしばしば見出す。これは、例えば
分析されるべきオリジナル DNAのある断片が容易にクロ
ーンを作らない（"SchwerKlonierbar")ためである。
【０００７】ストラテジ２：マルチ−プライマー法 この場合に、配列決定用 DNAはストラテジ１におけるよ
うに、ショットガン法によって分析されない、抑制され
た処理方法によってなられる。最初の実験において確実
に分解された(DNA）配列の断片は次の実験等のためプラ
イマー結合部位の選択に用いられる。この方法の利点
は、ストラテジ１におけるように不必要な多くの回数の
配列決定分析がさけられていると言う事実にある。この
方法が、なぜ「比較的長い DNA断片の分析のために用い
られる唯一のものでないか？」という本質的理由は、た
ぶん現在利用されている化学的 DNA合成の方法に横たわ
っている技術的限界に起因していると思われる。
【０００８】上述した方法の欠点を、例えば、ストラテ
ジ１における複式配列決定法("Multiplex-Sequencing")
の手段と、ストラテジ２において異なった部位からの自
動進行型配列決定による方法の欠点を軽減するための試
みはこれまで無かった。ストランジ２の本質的欠点を取
り除くひとつの方法は理論的には全ての可能なプライマ
ーのバンクを準備することである。しかしながら、その
ためには24の鎖長をもっている424 通りの異なったプラ
イマーを用意しなければならないので、直接化学的合成
では実際上不可能である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】それゆえ比較的短い化
学合成されたオリゴヌクレオチドの使用が本発明によっ
て提案される。
【００１０】
【課題を解決するための手段】比較的長い配列は原理と
して、２あるいはそれ以上の比較的短い配列から作られ
るので、望んでいるプライマーの代わりに、望んでいる
プライマーに一致した短いオリゴヌクレオチドを配列決
定される DNAに加えて、そして適当な操作によって、た
とえばT4-DNAライゲースを用いて、望んでいるプライマ
ーを形成するように結合させる。次に、配列決定反応は
一般的な標準の条件下で実際に実施される。発明が基礎
としている課題はクレームされている手段によって解決
される。
【００１１】
【実施例１】典型的な実験において、プラスミドpTZ18R
(Phramacia-LKB) の約 2.5p mol DNA をNaOHで変成処理
した。次にエタノールで沈澱させ、乾燥後、水に溶解し
た。おのおの２種の異なったオリゴヌクレオチド溶液そ
れぞれ 2.5p mol をこの DNA溶液に加えた。これらのオ
リゴヌクレオチドとして鎖長８個（オクタマー）から成
るものを選択した。これらのオリゴヌクレオチドはプラ
スミド DNA上の既知のヌクレオチド配列のセクション上
でそれぞれ隣接して直接にハイブリダイズされた。公知
の通常の方法に従って、ハイブリダイズされた状態にお
いて、オクタマーの5'未満は、前もってT4- ポリヌクレ
オチドキナーゼとATP によりリン酸化されていた。な
お、オクタマーの5'未満は、他のもう一方のオリゴヌク
レオチドの3'未満に隣接した位置にあった。
【００１２】次に、T4-DNAライゲースによるライゲーシ
ョンのため、公知の通常のとおりに緩衝液の条件を調整
し、T4-DNAライゲースの１ユニットを加え、反応溶液
（溶液の実験時における体積は10μl)を15℃で４時間イ
ンキュベートした。こうして得られたライゲーション溶
液は配列決定操作の前に37℃で５分間保温された。ライ
ゲーションによってもたらされる16- マーの数を増や
し、ハイブリダイズされうるオクタマーをできるだけ少
なくするためである。
【００１３】続いて、配列決定を選択したベクターの配
列を試験するために行なった。米国バイオケミカルコー
ポレーション社〔Firma United States Biochemical Co
rporation(USB)〕の標準プロトコールに従って配列決定
反応を行なうために、ライゲーション溶液の 8μl が用
いられた。上のプロトコールからは離れるので、鋳型と
プライマーのアニーリング("Annealing") はオミットさ
れた。上記で使われたリン酸化は〔γ-32P〕 ATPを用い
て行ない、〔α-32P〕dATPの後での使用はオミットされ
た。
【００１４】この発明はマルチ- プライマー法によって
DNAの配列を決定するためのオリゴヌクレオチドバンク
及び DNA配列決定法に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】プライマーを用いて配列決定をするための概略
図を示す。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 可能な全ての４6 通りの異なったメキサ
    メリックオリゴヌクレオチド(hexamere Oligonucleotid
    e)を含むオリゴヌクレオチドバンク。
  2. 【請求項２】 可能な全ての４7 通りの異なったヘプタ
    メリックオリゴヌクレオチド(hexamere Oligonucleotid
    e)を含むオリゴヌクレオチドバンク。
  3. 【請求項３】 可能な全ての４8 通りの異なったオクタ
    メリックオリゴヌクレオチド(Octamere Oligonucleotid
    e)を含むオリゴヌクレオチドバンク。
  4. 【請求項４】 可能な全ての４9 通りの異なったオリゴ
    ヌクレオチド(Oligonucleotide) を含むオリゴヌクレオ
    チドバンク。
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