JPH11123092A - 新規血管平滑筋細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 創傷治癒不全、難治性皮膚潰瘍あるいは繊維
芽細胞成長因子等による異常な血管新生疾患に対する診
断および治療に有用な新規血管平滑筋細胞増殖因子を提
供することにある。 【解決手段】 本発明は、新規血管平滑筋細胞増殖因
子、VSGFをコードするDNA、該DNAを含むベクター、該ベ
クターで形質転換された形質転換体およびVSGFの製造方
法、さらに、VSGFに特異的に反応する抗体および該抗体
の製造方法を提供することにある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規血管平滑筋細
胞増殖因子（Vascular Smooth muscle cell Growth Fac
tor;以下、VSGFと略記する）、VSGFをコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターで形質転換さ
れた形質転換体およびVSGFの製造方法に関する。また、
本発明はVSGFに特異的に反応する抗体および該抗体の製
造方法に関する。さらに、本発明はVSGFを含有してなる
創傷治癒剤ならびに異常血管新生に対する治療剤に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】血管平滑筋細胞増殖促進活性を有する因
子としては、繊維芽細胞増殖因子［エンドクリノロジー
（Endocrinology）, 118, 82 (1986)］、血小板由来増
殖因子［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA）, 79, 5867 (1982) ］、トロンボスポンジン
［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A）, 83, 9050 (1986)］が知られている。また、異常な
血管新生因子の一つとして繊維芽細胞成長因子が知られ
ている［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i.USA ）,86, 9911 (1989)］。しかし、これらの因子は
本発明の因子とは異なる性質を有している。

【０００３】ラットにおいて神経細胞の接着、突起進展
を促進する因子としてF-スポンジンが知られている[セ
ル（Cell）, 69, 95(1992)] が、本因子の血管平滑筋細
胞の増殖に対する作用は知られていない。血管新生不全
疾患としては、創傷治癒不全、難治性皮膚潰瘍等が知ら
れているが、これらの疾患に対して十分な効果を有する
薬剤は知られていない。また、異常な血管新生性疾患と
して、糖尿病性網膜症、乾せん症、関節リウマチ、血管
腫瘍、動脈硬化、固形腫瘍等が知られており［サイエン
ス（Science）, 235, 442,(1987); 実験医学、8, 369
(1990) ］、これらの疾患に繊維芽細胞成長因子が関わ
っていることも示唆されている。しかしながら、血管新
生性疾患の治療薬ならびに、特に血管新生因子の主要な
因子の一つである繊維芽細胞成長因子が関与する血管新
生性疾患の治療薬はこれまでのところ知られていない。
さらに、本因子と特異的に反応する抗体もこれまでのと
ころ知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、創傷
治癒不全、難治性皮膚潰瘍あるいは繊維芽細胞成長因子
等による異常な血管新生疾患に対する診断および治療を
行うために、血管平滑筋細胞の増殖を促進させる新規血
管平滑筋細胞増殖因子(以下、VSGFと略記する)、VSGFを
コードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクタ
ーで形質転換された形質転換体およびVSGFの製造方法、
さらに、VSGFに特異的に反応する抗体および該抗体を用
いた免疫学的検出方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、哺乳動物に由
来するポリペプチドであって、血管平滑筋増殖促進活性
を有するポリペプチドに関する。哺乳動物としては、ヒ
ト、ウシなどがあげられる。本発明は、配列番号１ある
いは配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、または配列番号１あるいは配列番号３で表される
アミノ酸配列において一個以上のアミノ酸が置換、欠失
もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ血管平滑
筋細胞増殖促進活性を有するポリペプチド、ならびにそ
れらのポリペプチドをコードするＤＮＡまたは配列番号
２あるいは配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮ
Ａもしくは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつ血管平滑筋細胞増殖促進活性を有す
るヒト由来のポリペプチドをコードするＤＮＡに関す
る。また本発明は該ＤＮＡとベクターとからなる組み換
えベクター、該組み換えベクターを宿主細胞に導入して
得られる形質転換体、および形質転換体を培地に培養
し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、
該培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする
ポリペプチドの製造方法に関する。

【０００６】また、本発明のポリペプチドと特異的に反
応する抗体、該抗体を製造する方法および該抗体を用い
た、創傷治癒不全、難治性皮膚潰瘍、糖尿病性網膜症、
乾せん症、関節リウマチ、血管腫瘍、動脈硬化、固形腫
瘍の免疫学的検出方法を提供する。さらに、本発明は、
本発明のポリペプチドおよび配列番号５記載のポリペプ
チドを含有してなる創傷治癒剤あるいは異常血管新生阻
害剤に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明者らは、上記課題に基づい
て鋭意研究を行った結果、新規血管平滑筋細胞増殖因子
の単離・精製ならびに本発明のＤＮＡのクローニングに
成功した。さらに、本発明の因子をコードするＤＮＡを
含む発現ベクターにより形質転換された形質転換体の作
製ならびに形質転換体を用いた血管平滑筋細胞増殖因子
の製造方法にも成功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】本発明のポリペプチドとしては、例えば配
列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド、または、配列番号１あるいは３で表されるアミノ酸
配列において一個以上のアミノ酸が置換、欠失もしくは
付加されたアミノ酸配列を含み、かつ血管平滑筋細胞増
殖促進活性を有するポリペプチドなどがあげられる。

【０００９】アミノ酸の置換、欠失もしくは付加とは、
部位特異的変異誘発法［ヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ(Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982)］など
に準じて行うことができる。血管平滑筋細胞増殖促進活
性を測定する方法としては、例えば本発明の実施例に記
載されたウシ大動脈平滑筋細胞の細胞数を指標とした測
定方法などがあげられる。

【００１０】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば配列番号２あるいは４で表される塩基
配列を有するＤＮＡ、または配列番号２あるいは４で表
される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、かつ血管平滑筋細胞増殖促進
活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡなどがあ
げられる。

【００１１】配列番号２および４で表される塩基配列を
有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡとは、配列番号２および４で表される
塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・
ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼ
ーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等
を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的に
は、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化し
たフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存
在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、
０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣ溶液の
組成は、１５０ｍＭ塩基ナトリウム、１５ｍＭクエン酸
ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルタ
ーを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげること
ができる。

【００１２】ハイブリダイゼーションは、Molecular Cl
oning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold S
pring Harbor Laboratory Press(1989) （以下、モレキ
ュラー・クローニング 第２版と略す）、Current Prot
ocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987
-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレ
キュラー・バイオロジー、サプルメント１〜３４と略
す）、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical
Approach, Sencond Edition, Oxford University(1995)
等に記載の方法に準じて行うことができる。

【００１３】ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的
には、配列番号２および４で表される塩基配列と少なく
とも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８
０％以上の相同性を有するＤＮＡ、更に好ましくは９５
％の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。

【００１４】本発明の血管平滑筋細胞増殖因子（VSGF）
の取得方法としては、ヒトを含む各種動物の臓器、組織
および細胞株からVSGFを単離する方法、またはVSGFをコ
ードするＤＮＡを有するベクターを宿主細胞に導入した
形質転換体による製造方法、あるいは該ベクターを用い
てインビトロ転写によってmRNAを調製し、これを鋳型と
してインビトロ翻訳を行ない生産する方法等の組換えＤ
ＮＡ技術を用いた方法等があげられる。

【００１５】動物の臓器、組織および細胞株からVSGFを
単離する方法としては、組織を遠心分離した上清から、
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー、ドデシル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）法等の通常の
蛋白質分離精製手段を組み合わせてVSGFを単離・精製す
る方法があげられる。

【００１６】動物の臓器、組織および細胞株としては、
血管新生が行われているものであればいかなるものでも
よいが、実験材料として大量に入手することが可能なも
のが好ましい。特に、性周期における黄体形成過程では
血管新生が盛んであることから、黄体形成の場である脊
椎動物由来の卵巣、卵胞液などがあげられ、かつ大量に
入手するのにウシ卵巣などが好ましい。

【００１７】以下に組換え技術を用いたVSGFの取得方法
を述べる。本発明のVSGFをコードするＤＮＡの調製およ
び発現は、モレキュラー・クローニング 第２版、カレ
ント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロ
ジー、サプルメント１〜３４等に記載された方法によっ
て、行うことができる。なお、断りのない限り、方法に
ついては、上記の文献に準じて行っている。

【００１８】VSGFをコードするＤＮＡは、VSGFを発現し
ている哺乳動物の細胞から抽出したＲＮＡより、ｃＤＮ
Ａを合成し、得られたｃＤＮＡをクローニングベクター
に組み込むことによりｃＤＮＡライブラリーを作製し、
そこから目的とするVSGFをコードするｃＤＮＡを含有す
る形質転換体を選択することにより得られる。VSGFを発
現している哺乳動物、例えばウシあるいはヒトの卵巣、
胎盤由来の細胞などから全RNAを調製する方法として
は、グアニジン／セシウムクロライド法やグアニジンチ
オシアネート法［Methods in Enzymol.,154, 3(1987)］
等があげられる。また、該全RNAからmRNAを調製する方
法としては、オリゴdTセルロースなどを用いたカラム法
またはバッチ法などがあげられる。

【００１９】さらに、ファースト・トラック・ｍＲＮＡ
・アイソレーション・キット［FastTrack mRNA Isolati
on Kit;インビトロジェン（Invitorgen）社製］、クイ
ック・プレップ・ｍＲＮＡ・ピュリフィケーション・キ
ット(Quick Prep mRNA Purification Kit;ファルマシア
社製) 等のキットを用いてmRNAを調製することもでき
る。

【００２０】上述で得られたRNAからcDNAを合成する方
法としては、オカヤマバーグ法[Mol.Cell. Biol.,2, 16
1 (1982)] やグブラーホフマン法[Gene 25, 263 (198
3)] 等の方法に準じ、逆転写酵素を用いて、該mRNAを鋳
型にしてcDNAを合成する方法があげられる。

【００２１】該cDNAをベクターに組み込む方法として
は、サンブルークらの方法[EMBO J.,4, 91 (1985)]やHy
unh, T. V.らの方法[A Practical Approach (D. M. Glo
ver編) 1, 49, IRL Press, Oxford]等の常法に準じ、プ
ラスミドまたはファージベクターに組み込む方法があげ
られる。ここで、mRNAをdTテールを付加したプラスミド
またはファージベクターとアニールさせた状態でcDNAを
合成させ、プラスミドまたはファージベクターに組み込
んでもよい。

【００２２】上記の方法の他に、スーパースクリプト・
プラスミド・システム・フォー・cDNA・シンセシス・ア
ンド・プラスミド・クローニング［SuperScript Plasmi
d System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning;Gi
bco BRL 社製］やザップ−cDNA・シンセシス・キット
［ZAP-cDNA SynthesisKit 、ストラタジーン社製］を用
いる方法などのキットを用いてcDNAの合成、cDNAライブ
ラリーを作製してもよい。

【００２３】cDNAを組み込むためのプラスミドまたはフ
ァージベクターとしては、宿主細胞内で自律複製可能で
該cDNAを安定保持できるものであれば、いかなるもので
もよい。具体的な例として、pBR322やpUC119等のプラス
ミド、λgt10等のファージベクター等をあげることがで
きる。該cDNAをプラスミドに組み込んだ場合には、該プ
ラスミドをエレクトロポレーション法あるいはカルシウ
ムクロライド法等により、大腸菌やバチルス属菌などの
適当な宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換すること
によりcDNAライブラリーを作製する。該cDNAをファージ
ベクターに組み込んだ場合には、インビトロパッケージ
ング法等により、増殖させた宿主細胞に該ファージベク
ターを形質導入することによりcDNAライブラリーを作製
する。

【００２４】上述で得られたcDNAライブラリーから、目
的とするVSGFをコードするcDNAを含有する形質転換株に
ついては、以下のように選択することができる。形質転
換株の有する該cDNAの塩基配列を直接決定し、該塩基配
列のコードするアミノ酸配列を推定したものと、精製し
たVSGF蛋白質を常法により複数のペプチド断片に分解し
た後、シークエンサーなどで解析した該ペプチド断片の
アミノ酸配列とを比較して、相同性の高いアミノ酸配列
をコードしているcDNAを有する形質転換株を、目的とす
る形質転換株として選択することができる。

【００２５】あるいはVSGF蛋白質を上述の方法で決定し
たアミノ酸配列のデータを基に作製したＤＮＡを、蛍光
物質、放射線、酵素などでラベル化してプローブを作製
して、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイ
ブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーションを
行って、ハイブリダイズする形質転換株を目的とする形
質転換株として選択することもできる。ハイブリダイゼ
ーションにおけるＤＮＡプローブとしては、ゲノムＤＮ
Ａ、cDNAおよび化学合成ＤＮＡ等も用いることができ
る。

【００２６】また、cDNAの両端にアダプターを付加し、
該アダプターの塩基配列と増幅断片の塩基配列に基づい
たプライマーでPCR を行う5'-RACE(Rapid amplificatio
n ofcDNA ends) および3'-RACE ［Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 85, 8998(1988)］により目的とするＤＮＡを
取得することができる。

【００２７】本発明のVSGFをコードするcDNAを含むプラ
スミドまたはファージとしては、例えば、プラスミドpc
DNA3HVSGF などがあげられる。pcDNA3HVSGF を含む大腸
菌であるEscherichia coli HVSGFは、平成9年6月12日付
で工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-5965と
して寄託されている。

【００２８】取得されたVSGFをコードするcDNAの塩基配
列の決定は、マキサムギルバート法やジデオキシ法［Pr
oc. Natl. Acad. Sci.,U.S.A., 74, 5463(1977)］など
により行うことができる。

【００２９】次に、取得したVSGFのDNA を用いたVSGFの
製造方法について述べる。上記の方法により得られたVS
GFをコードするＤＮＡ（以下、VSGF-DNAと略記する。）
を適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え
ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入することによ
り、本発明のVSGFを発現する形質転換体を得ることがで
きる。VSGF-DNAを含むＤＮＡ断片を、制限酵素あるいは
ＤＮＡ分解酵素などで、VSGF-DNAを含む適当な長さのＤ
ＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロモーターの下
流に挿入する。次いで上記ＤＮＡ断片を挿入した発現ベ
クターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入す
る。

【００３０】宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細
胞、昆虫細胞など、目的とする遺伝子を発現できるもの
であれば、いかなるものでもよい。細菌としては、エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli ）、バチルス・ズ
ブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリ
クエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens ）、
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flav
um）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Br
evibacterium lactofermentum）、コリネバクテリウム
・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum ）、ミ
クロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacteri
um ammoniaphilum ）等のエシェリヒア属、セラチア
属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シ
ュードモナス属、バチルス属等の微生物があげられる。
具体的には、Escherichia coli XL1-Blue 、Escherichi
a coli XL2-Blue、Escherichia coli JM109、Escherich
ia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Bacillus sub
tilis ATCC6051 、Bacillus amyloliquefaciens ATCC23
842、Brevibacterium immariophilium ATCC14068、Brev
ibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacteri
um flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum
ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microb
acterium ammoniaphilum ATCC15354等をあげることがで
きる。

【００３１】酵母としては、サッカロミセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミセス
・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベ
ロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis ）、トリ
コスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans
）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomycesa
lluvius）等があげられる。具体的には、Saccharomyces
cerevisiae ATCC56072、Schizosaccharomyces pombe A
TCC2476、Klｕyveromyces lactis ATCC8563、Trichospo
ron pullulans ATCC10677、Schwanniomyces alluvius A
TCC26074等をあげることができる。

【００３２】動物細胞としては、ヒト由来のナマルバ細
胞、サル由来のＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター
由来のＣＨＯ細胞等があげられる。昆虫細胞としては、
Spodoptera frugiperdaの卵母細胞であるＳｆ９、Ｓｆ
２１［バキュロウイルス・ イクスプレッション・ベクタ
ーズ、ア・ラボラトリー・マニュアル(Baculovirus Ex
pression Vectors 、A Laboratory Manual)、オレリ
ー(Oreilly) 、ミラー(Miller)、ルーコウ(Luckow)著、
ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー
(W.H.Freeman and Company) 、ニューヨーク(New Yor
k)、1992年版 （以下、バキュロウイル・スイクスプレ
ッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル
と記す）］、Trichoplusia ni の卵細胞であり、ファー
ミンジェン（Pharmingen）社からHigh5 として市販され
ているTn5 等があげられる。

【００３３】発現ベクターとしては、上記宿主細胞にお
いて自律複製可能ないしは染色体中への組込みが可能
で、VSGF-DNAを転写できる位置にプロモーターを含有し
ているものが用いられる。大腸菌等の微生物を宿主細胞
として用いる場合には、発現ベクターは微生物中で自律
複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結
合配列、本発明のVSGF-DNA、転写終結配列、場合によっ
てはプロモーターの制御領域より構成されているのが好
ましい。

【００３４】発現ベクターとしては、pTZ18RP1（特開平
4−117292）、pMALTM-c2（ニューイングランドバイオラ
ボス社製）、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリ
ンガーマンハイム社より市販）、pBluescript （STRATA
GENE社）等を例示することができる。

【００３５】発現ベクターにはプロモーターを制御する
遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターとしては、
大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかな
るものでもよい。例えば、trpプロモーター、lacプロモ
ーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸
菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることが
できる。また、tacプロモーターのように人為的に設計
改変されたプロモーターでもよい。

【００３６】リボソーム結合配列としては、大腸菌等の
宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでも
よいが、リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当
な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用
いることが好ましい。本遺伝子の発現には転写終結配列
は必ずしも必要ではないが、より好適には構造遺伝子直
下に存在することが望ましい。

【００３７】細菌への組換えベクターの導入方法として
は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、カ
ルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA, 69, 2110-2114 (1972) ］、プロトプラスト法
（特開昭63-2483942）等、いずれの方法も用いられる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクタ
ーとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC3
7051）、YCp50（ATCC37419）等を例示することができ
る。

【００３８】プロモーターとしては、酵母菌株の宿主細
胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロ
モーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、
ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモータ
ー、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげること
ができる。

【００３９】酵母への組換えベクターの導入方法として
は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば、いずれの方
法も用いられる。例えば、エレクトロポレーション法
［Methods in Enzymol., 194, 182 (1990) ］、スフェ
ロプラスト法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 192
9 (1978)］、酢酸リチウム法［J. Bacteriol., 153, 16
3(1983)］等があげられる。

【００４０】動物細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、pcDNA I/Amp、pcDNA I、pcDM
8（いずれもフナコシ社より市販）、pKA1（特開平4-117
292）等を例示することができる。

【００４１】プロモーターとしては、動物細胞の宿主細
胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、ヒトCMVのIE(immediate early)遺伝子のプロモ
ーター等のプロモーターをあげることができる。また、
ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共
に用いてもよい。

【００４２】動物細胞への組換えベクターの導入方法と
しては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば、い
ずれの方法も用いられる。例えば、エレクトロポレーシ
ョン法［Cytotechnology, 3, 133(1990)］、リン酸カル
シウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法［Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)］等があ
げられる。

【００４３】昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルス
を昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウ
ィルスを得たのち、さらに組換えウィルスを昆虫細胞に
感染させ、タンパク質発現昆虫細胞を取得する。

【００４４】遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pV
L1392 、pVL1393 、pBlueBacIII （ともにインビトロジ
ェン社製）等が用いられる。バキュロウイルスとして
は、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるア
ウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘド
ロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear
polyhedrosis virus) などが用いられる。

【００４５】組換えウイルスを調製するための、昆虫細
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平2-227075）、リポフェクション法［Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 84,7413 (1987)］等が用いら
れる。上記のようにして得られた形質転換体の培養は、
通常の形質転換体によるポリペプチドの生産に用いる培
養方法に従って行われる。

【００４６】大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主細胞とし
て用いた形質転換体を培養する培地としては、微生物が
資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質
転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、
合成培地のいずれでもよい。炭素源としては、それぞれ
の微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、
フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デ
ンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢
酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノー
ルなどのアルコール類が用いられる。

【００４７】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸
アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体
およびその消化物等が用いられる。

【００４８】無機物としては、りん酸第一カリウム、り
ん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。

【００４９】培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養
などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよ
く、培養時間は、通常16〜96時間である。培養中ｐＨ
は、3.0〜9.0に保持する。ｐHの調整は、無機あるいは
有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アン
モニアなどを用いて行う。

【００５０】また培養中必要に応じて、アンピシリンや
テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。

【００５１】誘導性のプロモーターを用いた発現ベクタ
ーで形質転換した微生物を培養する場合には、必要に応
じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、
lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した
微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオ
ガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを
用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養すると
きにはインドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加し
てもよい。

【００５２】動物細胞を宿主細胞として用いた形質転換
体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI
1640培地［THe Journal of the American Medical Asso
ciation 199, 519(1967)］、EagleのMEM培地［Science,
122, 501(1952)］、ダルベッコ改変MEM 培地［Virolog
y, 8, 396(1959)］またはこれら培地に牛胎児血清等を
添加した培地等が用いられる。

【００５３】昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転
換体を培養する培地としては、一般に使用されているTN
M-FH培地［ファーミンジェン（Pharmingen）社製］、Sf
900IISFM［ライフテクノロジーズ（Life Technologie
s）社製］、ExCell400 、ExCell405 ［いずれもJRH バ
イオサイエンシーズ（JRH Biosciences）社製］等が用
いられる。

【００５４】培養は、5％CO₂存在下等の条件下で行う。
培養温度は35〜37℃がよく、培養時間は、通常3〜7日間
である。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニ
シリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【００５５】以上のように、遺伝子の発現方法として
は、直接発現以外に、モレキュラー・バイオロジー 第
２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合
蛋白質発現等を行うこともできる。

【００５６】融合蛋白質の具体的な例としては、プラス
ミドpMALTM-c2（ニューイングランドバイオラボス社
製）のXmnIとSalI部位の間にVSGF-DNAを挿入し作製した
プラスミドｐＭＡＬＰ１００を用い、大腸菌ＪＭ１０９
を形質転換し、該形質転換体により製造されたマルトー
ス結合蛋白質／Ｐ１００融合蛋白質をあげることができ
る。

【００５７】融合蛋白質として発現させた場合には、適
当なプロテアーゼで切断することによりVSGF部分のみを
取得することができる。プロテアーゼの具体的な例とし
ては、ファクターXa（ニューイングランドバイオラボス
社製）等をあげることができる。培養物から目的蛋白質
の単離・精製には、公知の単離および精製法を用いれば
よい。

【００５８】例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解
状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離
により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フ
レンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイ
ノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該
無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清か
ら、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安
等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、透析
法、ジエチルアミノエチル(DEAE)ーセファロース、DIAl
ON日PA-75(三菱化学社製) 等レジンを用いた陰イオン交
換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF( ファルマシ
ア社製) 等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラ
フィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース
等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、限外
濾過、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロ
マトグラフィ一法、逆相クロマトグラフィー、クロマト
フォーカシング法、等篭点電気泳動、SDS-PAGE等の電気
泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製
標品を得ることができる。

【００５９】また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成し
て発現した場合は、細胞を回収後破砕し、遠心分離する
ことにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収す
る。回収した該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化
する。該可溶化液を、希釈あるいは透析により、該可溶
化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該蛋
白質の構造を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の
単離精製法により該蛋白質の精製標品を得ることができ
る。

【００６０】本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の
誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清から、
該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収する
ことができる。即ち、培養物から遠心分離等の手法によ
り培養上清を回収し、該培養上清から、上記と同様の単
離精製法を用いることにより、精製標品を得ることがで
きる。

【００６１】このようにして取得される蛋白質として、
例えば、配列番号１および３に表されるアミノ酸配列か
ら選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることが
できる。また、上記方法により発現させた蛋白質を、Fm
oc法( フルオレニルメチルオキシカルボニル法) 、tBoc
法(t- ブチルオキシカルボニル法) 等の化学合成法によ
っても製造することができる。また、桑和貿易（Advanc
ed chemTech 社製）、パーキンエルマージャパン（Perk
in-Elmer社製）、ファルマシアバイオテク（Pharmacia
Biotech 社製）、アロカ（Protein Technology Instrum
ent 社製）、クラボウ（Synthecell-Vega 社製）、日本
パーセプティブ・リミテッド（PerSeptive社製）、島津
製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもでき
る。

【００６２】また、本発明のポリペプチド、あるいは配
列番号１、３もしくは５記載のアミノ酸配列に基づいて
化学合成した本発明の蛋白質の一部であるペプチドを抗
原として免疫することにより抗体を製造することができ
る。すなわち免疫した動物の脾細胞とマウスのミエロー
マ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、このハ
イブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹
水癌化させ、該培養液または腹水を採取することにより
本発明の蛋白質に対するモノクローナル抗体を製造する
ことができる。また、免疫した動物の免疫血清を採取す
ることにより本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗
体を製造することができる。

【００６３】動物の免疫は、次のように行う。すなわ
ち、３〜２０週令のマウス、ラット、ハムスターなどの
非ヒトほ乳動物の皮下、静脈内あるいは腹腔内に、後述
のように調製した抗原を免疫して、その動物の脾細胞、
リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。

【００６４】抗原の調製方法としては、ヒトを含む各種
動物の臓器および細胞株からVSGFを単離・精製するか、
配列番号１、３もしくは５に示されるアミノ酸配列、ま
たは配列番号１、３もしくは５に示されるアミノ酸配列
のうち１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され
たアミノ酸配列を有する蛋白質、または該アミノ酸配列
の部分配列を有するポリペプチドをコードするDNAを含
む組換えベクターを大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞
などの宿主に導入して、蛋白質あるいはポリペプチドを
発現させる方法などがあげられる。さらに部分配列を有
するポリペプチドは、アミノ酸合成機を用いて合成する
ことによっても得られる。免疫の際に、得られた抗原
は、抗原性の高いキャリアタンパク質（キーホールリン
ペットヘモシアニンや牛血清アルブミンなど）と化学修
飾などにより結合させ投与したり、あるいは適当なアジ
ュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃ
ｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎ
ｔ）や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンな
ど〕とともに投与する。

【００６５】抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週
間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静
脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素
免疫測定法〔Antibodies - A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory,1988；詳細は後述する〕な
どで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分
な抗体価を示した非ヒトほ乳動物を抗体産生細胞の供給
源として提供する。ポリクローナル抗体は、該動物から
得られた血清を分離、精製して得られる。

【００６６】骨髄腫細胞としては、マウスから得られた
株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３
Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐ
ｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、18:1-7, 1978）、P3-NS1/1-Ag41
（NS-1）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ, 6: ５１１−５１９,１９７６）、 ＳＰ２／Ｏ
−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Ｎａｔｕｒｅ,276:２６９
−２７０,１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３
（６５３） Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, 123:１５４８
−１５５０,１９７９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６
３）（Ｎａｔｕｒｅ, 256:４９５−４９７,１９７５）
などが用いられる。

【００６７】上述で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞
を混合し、ＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン、チ
ミジンおよびアミノプテリンを加えた培地〕に懸濁した
のち、７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部
をとり酵素免疫測定法などにより、抗原として用いたVS
GFに反応し、VSGFを含まない蛋白に反応しないものを選
択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを行
い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認めら
れたものを抗VSGFモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ株として選択する。

【００６８】モノクローナル抗体は、上述の該ハイブリ
ドーマ細胞を培養するか、ハイブリドーマ細胞を動物の
腹腔内に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液また
は腹水を採取、精製することにより作製できる。なお、
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製方
法としては、遠心分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿法、
またはDEAE−セファロースカラム、陰イオン交換カラ
ム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カ
ラムなどを用いたクロマトグラフィーなどを組み合わせ
る方法があげられる。

【００６９】抗VSGFモノクローナル抗体の選択（酵素免
疫測定法） リコンビナントVSGFあるいは精製VSGFを抗原として用
い、それぞれを１〜５０μｇ／ｍｌ、１０〜１００μｌ
／穴で９６穴プレートに分注し、４℃で一晩放置してプ
レートにコートする。ＢＳＡ溶液などでブロッキングし
た後、ハイブリドーマ培養上清もしくは上述の方法で得
られる精製抗体を第一抗体として５０〜１００μｌ／穴
ずつ分注し、室温で２時間または４℃で一晩反応させ
る。ＰＢＳまたはＰＢＳに０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２
０を加えた溶液（ＴｗｅｅｎーＰＢＳ）で洗浄した後、
第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは
放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗
体もしくは抗ラットイムノグロブリン抗体１〜５０μｇ
／ｍｌを５０〜１００μｌ／穴ずつ分注し、室温1〜２
時間反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質
に応じた反応を行ない、VSGFに特異的に反応する穴を抗
VSGFモノクローナル抗体として選択する。

【００７０】以上の製造方法により得られた抗体は、創
傷治癒不全、難治性皮膚潰瘍、糖尿病性網膜症、乾せん
症、関節リウマチ、血管腫瘍、動脈硬化、固形腫瘍など
の、繊維芽細胞成長因子等による異常な血管新生疾患の
組織あるいは細胞の診断などの免疫学的検出に有効であ
る。上述の疾患を免疫学的に検出する方法としては、蛍
光抗体法、免疫酵素抗体法（ELISA ）、放射性物質標識
免疫抗体法（RIA ）、免疫細胞染色法、免疫組織染色
法、ウェスタンブロット法、免疫沈降法などがあげられ
る。

【００７１】蛍光抗体法とは、分離した、ヒトの細胞あ
るいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、血清、胸
水、腹水、眼液などに、本発明のモノクローナル抗体を
反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート
（FITC）などの蛍光物質でラベルした抗マウスIgG 抗体
あるいは結合断片を反応させた後、蛍光色素をフローサ
イトメーターで測定する方法である。

【００７２】免疫酵素抗体法（ELISA ）とは、分離し
た、ヒトの細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその
破砕液、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、
ビオチンなどの酵素標識などを施した抗マウスIgG 抗体
あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度
計で測定する方法である。

【００７３】放射性物質標識免疫抗体法（RIA ）とは、
分離した、ヒトの細胞あるいはその破砕液、組織あるい
はその破砕液、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明
のモノクローナル抗体を反応させ、さらに放射線標識を
施した抗マウスIgG 抗体あるいは結合断片を反応させた
後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法で
ある。

【００７４】免疫細胞染色法、免疫組織染色法とは、分
離した、ヒトの細胞あるいはその破砕液、組織あるいは
その破砕液、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明の
モノクローナル抗体を反応させ、さらにフルオレシン・
イソチオシアネート（FITC）などの蛍光物質、ペルオキ
シダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスIg
G 抗体あるいは結合断片を反応させた後、顕微鏡を用い
て観察する方法である。

【００７５】本発明のポリペプチドを含有してなる創傷
治癒剤、あるいは異常血管新生阻害剤を使用する際に
は、各種注射剤、経皮粘膜投与剤、経口剤等の各種投与
形態が可能であり、該投与形態に応じた種々の剤形で使
用される。投与剤形としては、例えば静脈内注射、筋肉
内注射、皮下注射、皮内注射等用の注射剤、懸濁注射
剤、凍結乾燥などの用時溶解型注射剤、座剤、経鼻剤等
の経粘膜投与剤、あるいは錠剤、カプセル剤、顆粒剤、
懸濁液等の経口剤をあげることができる。

【００７６】これらの剤形の製剤化には、通常知られた
方法が適用される。製剤用担体が液体の場合は、溶解す
るかもしくは分散させ、また、製剤用担体が粉末の場合
は、混合するかもしくはこれに吸着させ、さらに目的に
応じて、これらに医薬品として許容される保存剤、安定
化剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑
沢剤、着色剤、芳香剤、矯味剤、剤皮、懸濁化剤、乳化
剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、塑性剤、界面活性
剤、無痛化剤等を含有させる。

【００７７】使用する製剤用担体としては、例えば、
水、注射用蒸留水、生理食塩水、グルコース、フラクト
ース、白糠、ラクトース、デンプン、セルロース、メチ
ルセルロース、力ルボキシメチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルセルロース、グリセリン、マンニトール、キ
シリトール、ソルビトール、グルクロン酸、ヒアルロン
酸、ヘパリン、キチン、キトサン、グリシン、アラニ
ン、プロリン、セリン、システイン、アスパラギン酸、
グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒト血清アルブミ
ン、ヒト血清グロブリン、コラーゲン、ゼラチン、アル
ギン酸、タルク、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウ
ム、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウ
ム、尿素、シリコーン樹脂、ソルビタン脂肪酸エステ
ル、グリセリン脂肪酸エステル、アスコルビン酸、アル
ファートコフェロール等があげられる。

【００７８】以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明
する。ＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素
反応は、常法［"Molecular Cloning. A Laboratory Man
ual", Cold Spring Harbor Laboratory (1989)］に従っ
た。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合
宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、
並びに反応条件は付属の説明書に従った。

【００７９】本発明において、アミノ酸、ペプチドはIU
PAC-IUB-生化学命名委員会で採用された略記法により表
示される。なお、アミノ酸等に関して光学異性体が存在
し得る場合、とくに明示しなければL体を示すものとす
る。また、とくに断わらない限り、デオキシリボヌクレ
オチド配列の左端は5’末端である。

【００８０】

【実施例】

実施例１ ウシVSGFの精製 屠殺場で採取後すぐに冷凍し-70℃で凍結保存したウシ
卵巣約1,000個を、4℃で解凍し、液状部分を吸引して採
取した。得られた液体を5,000rpmで20分間遠心分離し、
その上清部分をウシ卵胞液（bovine Follicular Fluid;
bFF）として用いた。

【００８１】1LのbFFに4Lの緩衝液A ｛10mMトリス−塩
酸, 0.1% 3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニ
オ]-1-プロパンスルフォネート（CHAPS）, 1mM EDTA, 1
0mg/lロイペプチン, 10mg/lフェニルメチルスルフォニ
ルフルオリド（PMSF）; pH7.5｝を加え、塩化ナトリウ
ム（NaCl）を最終濃度が0.4Mになるよう加えた。5.0×
2.0cmのヘパリン−セファロースカラム（ファルマシア
・バイオテク社製）を0.35MのNaClを含む緩衝液Aで平衡
化した後、上記bFF溶液を通塔し目的蛋白質を吸着させ
た。0.35MのNaClを含む緩衝液A 200mlを通搭しカラム
を洗浄した後、0.75MのNaClを含む緩衝液A 200mlを通
搭し目的蛋白質を溶出させた。溶出液中の蛋白質量は70
mgであった。

【００８２】上記溶出液200ml（蛋白質量70mg）に、NaC
l濃度が0.1Mになるよう緩衝液A 1.4Lを加えて希釈し
た。1.0×2.0cmのDEAE-フラクトゲル（Fractogel） 650
カラム（三菱化学社製）を0.1MのNaClを含む緩衝液Aに
溶液で平衡化した後、上記希釈溶出液を通塔し目的蛋白
質を吸着させた。0.1MのNaClを含む緩衝液A 10mlを通
搭しカラムを洗浄した後、0.5MのNaClを含む緩衝液A 1
0mlを通搭し目的蛋白質を溶出させた。溶出液中の蛋白
質量は32.1mgであった。

【００８３】上記溶出液10ml（蛋白質量32.1mg）に、Na
Cl濃度が0.1Mになるように緩衝液Aを40ml加えて希釈し
た。1.0×7.0cmのDEAE-セファロース CL4B（ファルマシ
ア・バイオテク社製）カラムを0.1MのNaClを含む緩衝液
Aで平衡化した後、上記希釈溶出液を通塔し目的蛋白質
を吸着させた。0.1MのNaClを含む緩衝液A 30mlを通搭
しカラムを洗浄した後、200mlの緩衝液AにNaClの直線濃
度勾配（0.1M〜0.5M）をかけて目的蛋白質を溶出させ
た。流速は45ml/時、溶出液は3mlずつ分画した（計67画
分）。図１に各画分の280nmにおける吸光度と血管平滑
筋細胞の増殖促進活性を示す。また、図１においてA280
nm値の高い溶出フラクションNo.22 〜25およびフラクシ
ョンNo.28 〜32について、4 〜20％グラジェントゲル
（第一化学マルチゲル4-20）を用いた非還元ドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-
PAGE）の結果を図２に示す。血管平滑筋細胞の増殖促進
活性については、以下の方法を用いて測定した。

【００８４】血管平滑筋細胞増殖促進活性の測定 エクスプラント (explant)法［ジャーナル・オブ・セル
・バイオロジー (J. Cell Biol.), 50, 172 (1971)］に
従い単離、培養したウシ大動脈平滑筋細胞（Bovine Aor
tic Smooth Muscle Cell; BASMC）を、10%牛胎仔血清
（Fetal Calf Serum; FCS）含有ダルベッコ変法イーグ
ル培地（Dalbeccos Modified Eagle Medium; DMEM、Gib
co BRL社製）で10cmシャーレに5×10⁵個ずつまいて、3
日ごとに継代し、継代数12代目までを使用した。

【００８５】24ウェルプレートにウェルあたり5×10³個
のBASMCを2%FCS含有DMEMでまき、1晩インキュベートし
て細胞がプレートに接着した後、検体を0.5mlの2%FCS含
有DMEMに溶かして加え、さらに3日間インキュベートす
る。インキュベーション後、細胞を0.25%トリプシン、
0.2%エチレンジアミン四酢酸（Ethylenediamine tetraa
cetic acid; EDTA）を加えて懸濁させ、セルカウンター
（コールカウンター、コールター（株）製）で細胞数を
カウントした。増殖促進活性は以下の式に従い算出され
る。

【００８６】増殖促進活性 (%) = (A/B)×100 A:検体を含む2%FCS含有DMEMで培養後の細胞数 B:検体を含まない2%FCS含有DMEMで培養後の細胞数

【００８７】上記結果より、No. 28〜32の画分を集め
（15ml、蛋白量6.8mg）、このうち1mlを逆相カラム（4.
6×50mm、ナカライ・テスク製）を用いた高速液体クロ
マトグラフィー（HPLC）で精製した。0.1%TFA水溶液に
アセトニトリル10〜60%の直線濃度勾配をかけて溶出さ
せた（0〜5分；10%アセトニトリル、5〜55分；10〜60%
アセトニトリル濃度勾配、55〜70分；60%アセトニトリ
ル、流速；1ml/分）。280nmにおける吸光度で検出した
溶出パターンを図3に示す。検出されたピーク部分を分
取し、非還元SDS-PAGEで純度を確認した結果を図4に示
す。本結果より、VSGFが単一物質として精製されたこ
と、またVSGFの分子量が88〜95kDaの範囲にあることを
確認した。

【００８８】さらに、逆相HPLCによる精製を残り14mlに
ついても行い、3.2mgの蛋白質を得た。本蛋白質は、上
述したように血管平滑筋細胞の増殖促進活性を示すこと
より、ウシ血管平滑筋細胞増殖因子（Vascular Smooth
muscle cell Growth Factor;VSGF）と称する。

【００８９】実施例２ ウシVSGFの部分アミノ酸配列の
決定 実施例１で精製したウシVSGF 1mgを常法（「生物化学実
験法8−SH基の化学修飾」、学会出版センター(1978)）
に従い還元カルボキシメチル化後、リジルエンドペプチ
ダーゼ（Sigma）で一晩消化し、消化分解物を逆相カラ
ム（C18 Cosmosil、ナカライテスク製）を用いたHPLCで
分取した。多くの分解ペプチドのピークのうち、17のペ
プチドのアミノ酸配列をプロテインシークエンサー（ア
プライドバイオシステムズ製、model 492）で部分的に
決定した。配列番号９〜２１にその配列を示す。

【００９０】実施例３ ウシVSGFのcDNAクローニング 採取後すぐに液体窒素で凍結し-70℃で保存したウシ卵
巣を凍結したまま用い、Acid GTC法［アナリティカル・
バイオケミストリー (Anal. Biochem.) 162, 156-159
(1987)］によってRNAを調製した（卵巣3gより全RNA 8.9
6mg）。さらにオリゴテックススーパー（oligotex supe
r、第一化学薬品製）で25μgのmRNAを調製した。このう
ちの10μgを用い、オリゴdT−プライミング（oligo dT-
priming、ファルマシア製）でcDNAを合成した。EcoRI-N
otI-アダプター（ファルマシア）をつけた後、λgt10フ
ァージ（Stratagene製）にライゲーションし、ギガパッ
クゴールドII（gigapack gold II、Stratagene製）イン
ビトロパッケージングを行い、3.1×10⁶個の独立クロー
ンを含む未増幅ライブラリーを得た。

【００９１】先に決定した部分アミノ酸配列からcDNAク
ローニングに適した配列を選び、配列番号７及び８記載
の配列を有する合成ＤＮＡを作製し、それぞれ200ngを
γ-³²P-ATP（アマシャム社製）で５’末端をラベルし
た。それぞれの放射活性は6000万cpm/400μl（300cpm/p
g）であった。このように作製されたプローブを用い
て、以下の手順で5000クローン／シャーレをスクリーニ
ングした。 (1) プレハイブリダイゼーション; 6×SSC（和光純薬
製）, 5×デンハルト（Denharts、和光純薬製）, 0.1mg
/mlサケ精子ＤＮＡ（シグマ社製）, 37℃, 4時間 (2) ハイブリダイゼーション; 6×SSC, 5×Denharts,
0.1mg/mlサケ精子DNA,ラベル化プローブ50μl（1000cp
m, 32ng）, 37℃, 一昼夜 (3) 洗浄; 1) 6×SSC, 0.1%ドデシル硫酸ナトリウム, 4
2℃, 20分×2 2) 3M テトラメチルアンモニウムクロライド, 50℃, 20
分×2 (4) 露光; -70℃, 一昼夜 その結果、２つの陽性クローンを得、それぞれをVSGF-
1、VSGF-2と名づけた。VSGF-1はおよそ4.2kb、VSGF-2は
およそ3.5kbでVSGF-1の３’末端側の非翻訳領域が短い
クローンであった。

【００９２】上記の２クローンをブルースクリプトKS
（Bluescript KS、Stratagene製）にサブクローニン
グ、制限酵素地図を作製した後さらにサブクローニング
し、ジデオキシシークエンス法［プロシーディングス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA）,74, 5463 (1977)］で
塩基配列を決定した。決定された塩基配列および翻訳蛋
白質のアミノ酸配列を配列番号４および３に示す。この
結果から、ウシVSGFはアミノ酸807残基からなる蛋白質
であり、配列解析より、N末端に28アミノ酸残基からな
るシグナル配列を有する分泌型の蛋白質であること、お
よび3ヶ所（214 残基〜216 残基、447 残基〜449 残基
および681 〜683 残基）のN-グリコシレーションサイト
が存在することが明らかとなった。

【００９３】実施例４ ヒトVSGFの遺伝子クローニング 以下の操作により、ウシVSGFをプローブに用いて、ヒト
卵巣cDNAライブラリーからヒトVSGFをcDNAクローニング
した。ウシVSGF全長インサートを³²P-dDCTP（アマシャ
ム社製）でランダムラベルし、プローブとして用いた。
ヒト卵巣からオリゴdT-プライマー（ファルマシア製）
を用いてcDNAライブラリーを作製し、λgt10ファージベ
クターに導入し、1×10⁶の独立したクローンを得た。上
記プローブを用い、先のウシVSGFのクローニングと同様
にして2つの陽性クローンを得た。そのうち1つは3.1kb
全長であり、その塩基配列をウシVSGFの場合と同様に決
定した。配列番号２に塩基配列を、配列番号１に翻訳蛋
白質のアミノ酸配列を示す。

【００９４】実施例５ ヒトVSGF蛋白質の発現 ヒトcDNAインサートをNotI切断により単離し、pcDNA3
（mammalian expressionvector、Invitrogene 製）のNo
tI siteに順方向に導入した。組み換えベクターの構築
を図５に示す。組み換えベクターpcDNA3HVSGF を含む大
腸菌であるEscherichia coli HVSGFは、平成９年6月12
日付で工業技術院生命工学工業研究所（茨城県つくば市
東１丁目１番３号）にFERM BP-5965として寄託されてい
る。ヒトVSGF-pcDNA3プラスミドをCOS-7細胞にリポフェ
クション法でトランスフェクトし、さらに、G418（シグ
マ製）を最終濃度200μg/mlとした10%ＦＣＳ含有DMEMを
用いてパーマネントセルラインを樹立した。G418耐性株
COS-7細胞からのヒトVSGFの分泌はエンザイム・リンク
ト・イムノソルベント・アッセイ（ELISA）法を用いて
確認した。方法について、以下に記す。

【００９５】ELISA法 ５μg/ml VSGFを96ウェルプレートにコーティングし、
抗ウシVSGF抗体を30.000倍希釈した0.4% ブロックエー
ス含有ＰＢＳを加えて室温で2時間放置後、ブロッキン
グ液（1%ブロックエース）を加えて室温で1時間放置し
た。洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗ウサギイ
ムノグロブリン抗体（EYラボラトリーズ社、1000倍希
釈）を加えて4℃で一昼夜放置した。PNPP（ザイメット
社）を用いて室温2時間反応させて発色の後、吸光度410
nmで測定した。

【００９６】上記方法によりヒトVSGFを分泌しているこ
とを確認したのち、G418耐性株COS-7細胞培養液を遠心
分離して、培養上清を回収した。培養上清からヒトVSGF
の精製については実施例１記載の方法により行った。す
なわち、O.35M のNaClを含む緩衝液A でヘパリン・セフ
ァロースカラムを平衡化したのち、培養上清を通塔し目
的蛋白質を吸着させた。O.35M のNaClを含む緩衝液A で
ヘパリン・セファロースカラムを洗浄したのち、O.75M
のNaClを含む緩衝液A で目的蛋白質を溶出した。その
後、O.1MのNaClを含む緩衝液A でDEAE-セファロースCL4
Bカラムを平衡化したのち、先の溶出液を通塔し目的蛋
白質を吸着させた。そして、緩衝液A にNaClの直線濃度
勾配（0.1 〜0.5M）をかけて目的蛋白質であるヒトVSGF
を溶出させた。各画分の280nm における吸光度の高い溶
出分画No.39 〜45について、10％ゲルを用いた非還元SD
S-PAGEの結果を図６に示す。

【００９７】実施例６ 組換えヒトVSGFの平滑筋細胞増
殖促進活性 実施例１記載の方法で、実施例５で生産した組換えヒト
VSGFの平滑筋細胞増殖促進活性を測定した。結果を図７
に示す。

【００９８】実施例７ 抗ウシVSGFポリクローナル抗体
の作製 ０．５ｍｇウシVSGFを完全アジュバントとともにウサギ
（Japanese White）３匹（体重はそれぞれ2.0kg 、2.1k
g 、2.15kg）に数回投与し、ウシVSGFに対する抗体を作
製した。最終免疫時のウサギの体重はそれぞれ3.0kg 、
3.4kg 、3.6kgとなった。血清抗体価は実施例６記載のE
LISA法を用いて検討した。さらにこの抗体のヒトVSGFに
対するクロス反応性をELISAにより検討したところ、ヒ
トVSGFにも反応し、そのアフィニティーはヒトおよびウ
シVSGFの双方に対しほぼ同等であることが判明した。

【００９９】実施例８ 抗ヒトVSGFモノクローナル抗体
の作製 （１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製 実施例５で調製したヒトVSGF３０μｇをアルミニウムゲ
ル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）
１×１０⁹ 細胞とともに5週令雌ラット（SD）およびマ
ウス（Balb/c）に投与し、２週間後、ヒトVSGF３０μｇ
を１週間に１回、計4回投与した。眼底静脈叢より採血
し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調
べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に
脾臓を摘出した。

【０１００】脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細
断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐ
ｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血
球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用い
た。

【０１０１】（２）酵素免疫測定法 ９６ウェルのＥＩＡ用プレート〔グライナー（Ｇｒｅｉ
ｎｅｒ）社製〕に、精製されたヒトVSGF １０μｇ／ｍ
ｌを５０μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置して
抗原をプレートにコートした。次いで、１％ＢＳＡを含
むＰＢＳ溶液（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１００μｌ／ウェル
分注し、室温１時間放置して、プレート上に残った蛋白
質との結合残基をブロック（ブロッキング）した。その
後、ウェル中のＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、ＰＢＳでよく洗
浄した後、第一抗体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した
試料（マウス血清、ハイブリドーマ培養上清、精製モノ
クローナル抗体）を５０μｌ／ウェル分注し、室温で２
時間放置した。ＰＢＳまたは、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで、
よく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識
抗ラットイムノグロブリン抗体〔ダコ（ＤＡＫＯ）社
製〕を５０μｌ／ウェル分注し、室温で１時間放置し
た。

【０１０２】ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、Ａ
ＢＴＳ基質液〔２，２’−アジノビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム５５０
ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１リット
ルに溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１μｌ／ｍ
ｌを加えた溶液〕を用い発色させ、ＯＤ４１５ｎｍの吸
光度を測定した。

【０１０３】（３）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０⁷ 以上の細胞
を確保し、細胞融合に親株として供した。

【０１０４】（４）ハイブリドーマの作製 （１）で得られたラットあるいはマウス脾細胞と（３）
で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、
遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を
捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しなが
ら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，０００
（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌおよび
ジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．２〜１ｍｌ
／１０⁸ ラットあるいはマウス脾細胞を加え、１〜２分
間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培
地を加えて全量が５０ｍｌになるようにした。遠心分離
（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに
細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出し
でゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍｌ中に懸濁し
た。

【０１０５】この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに
１００μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ₂ インキュベ
ーター中、３７℃で１０〜１４日間ＣＯ₂ ５％下で培養
した。この培養上清を（２）に記載した酵素免疫測定法
で調べ、ヒトVSGFに反応するウェルを選び、さらにＨＴ
培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返し
て、抗ヒトVSGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
を確立した。

【０１０６】（５）モノクローナル抗体の精製 プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Balb/c）に
（４）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０⁶
細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、
ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウス
から、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）し、遠心分離
（３，０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去した。
モノクローナル抗体がＩｇＭのときは、５０％硫酸アン
モニウムにて塩析し、塩化ナトリウム０．５Ｍを添加し
たＰＢＳで透析後、セルロファインＧＳＬ２０００（生
化学工業社製）（ベットボリューム７５０ｍｌ）のカラ
ムに流速１５ｍｌ／時で通塔しＩｇＭ画分を集め、精製
モノクローナル抗体とした。

【０１０７】モノクローナル抗体がＩｇＧのときは、カ
プリル酸沈殿法〔Antibodies - A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1988〕により精製
し、精製モノクローナル抗体とした。抗体のサブクラス
はサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法
により決定した。

【０１０８】実施例９ VSGFの血管新生抑制活性 塩基性繊維芽細胞増殖因子 (bFGF) により誘導されるラ
ット角膜の血管新生に対する、組換えヒトVSGFの抑制活
性を文献［セル (Cell),56, 345 (1989)］に記載の方法
で測定した。bFGFおよびVSGFは5μlのPBSに溶解し、5μ
lのメタクリル酸メチル（シグマ社製）の12%エタノール
溶液と混合し、ゲル状にしてラット角膜に注入した。3
日後の角膜組織図を図８に示す。

【０１０９】

【発明の効果】本発明により、新規血管平滑筋細胞増殖
因子が提供される。本因子は血管平滑筋細胞の増殖を促
進し、創傷治癒に効果が期待される一方、繊維芽細胞成
長因子の血管形成能を阻害することより、異常な血管新
生治療に効果が期待されるため、本因子を含有してなる
創傷治癒剤、並びに本因子を含有してなる異常血管新生
に対する治療剤が提供される。また、本発明により、上
記因子を認識する抗体が提供され、本因子の関与する病
態の診断法が提供される。

【０１１０】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：807 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Arg Leu Ser Pro Ala Pro Leu Lys Leu Ser Arg Thr Pro Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ala Leu Pro Leu Ala Ala Ala Leu Ala Phe Ser Asp Glu 20 25 30 Thr Leu Asp Lys Val Pro Lys Ser Glu Gly Tyr Cys Ser Arg Ile Leu 35 40 45 Arg Ala Gln Gly Thr Arg Arg Glu Gly Tyr Thr Glu Phe Ser Leu Arg 50 55 60 Val Glu Gly Asp Pro Asp Phe Tyr Lys Pro Gly Thr Ser Tyr Arg Val 65 70 75 80 Thr Leu Ser Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Phe Arg Gly Phe Thr Leu Ile 85 90 95 Ala Leu Arg Glu Asn Arg Glu Gly Asp Lys Glu Glu Asp His Ala Gly 100 105 110 Thr Phe Gln Ile Ile Asp Glu Glu Glu Thr Gln Phe Met Ser Asn Cys 115 120 125 Pro Val Ala Val Thr Glu Ser Thr Pro Arg Arg Arg Thr Arg Ile Gln 130 135 140 Val Phe Trp Ile Ala Pro Pro Ala Gly Thr Gly Cys Val Ile Leu Lys 145 150 155 160 Ala Ser Ile Val Gln Lys Arg Ile Ile Tyr Phe Gln Asp Glu Gly Ser 165 170 175 Leu Thr Lys LysLeu Cys Glu Gln Asp Ser Thr Phe Asp Gly Val Thr 180 185 190 Asp Lys Pro Ile Leu Asp Cys Cys Ala Cys Gly Thr Ala Lys Tyr Arg 195 200 205 Leu Thr Phe Tyr Gly Asn Trp Ser Glu Lys Thr His Pro Lys Asp Tyr 210 215 220 Pro Arg Arg Ala Asn His Trp Ser Ala Ile Ile Gly Gly Ser His Ser 225 230 235 240 Lys Asn Tyr Val Leu Trp Glu Tyr Gly Gly Tyr Ala Ser Glu Gly Val 245 250 255 Lys Gln Val Ala Glu Leu Gly Ser Pro Val Lys Met Glu Glu Glu Ile 260 265 270 Arg Gln Gln Ser Asp Glu Val Leu Thr Val Ile Lys Ala Lys Ala Gln 275 280 285 Trp Pro Ala Trp Gln Pro Leu Asn Val Arg Ala Ala Pro Ser Ala Glu 290 295 300 Phe Ser Val Asp Arg Thr Arg His Leu Met Ser Phe Leu Thr Met Met 305 310 315 320 Gly Pro Ser Pro Asp Trp Asn Val Gly Leu Ser Ala Glu Asp Leu Cys 325 330 335 Thr Lys Glu Cys Gly Trp Val Gln Lys Val Val Gln Asp Leu Ile Pro 340 345 350 Trp Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Val Thr Tyr Glu Ser Pro Asn Lys 355 360 365 Pro Thr Ile Pro Gln Glu Lys Ile Arg Pro Leu Thr Ser Leu Asp His 370 375 380 Pro Gln Ser Pro Phe Tyr Asp Pro Glu Gly Gly Ser Ile Thr Gln Val 385 390 395 400 Ala Arg Val Val Ile Glu Arg Ile Ala Arg Lys Gly Glu Gln Cys Asn 405 410 415 Ile Val Pro Asp Asn Val Asp Asp Ile Val Ala Asp Leu Ala Pro Glu 420 425 430 Glu Lys Asp Glu Asp Asp Thr Pro Glu Thr Cys Ile Tyr Ser Asn Trp 435 440 445 Ser Pro Trp Ser Ala Cys Ser Ser Ser Thr Cys Asp Lys Gly Lys Arg 450 455 460 Met Arg Gln Arg Met Leu Lys Ala Gln Leu Asp Leu Ser Val Pro Cys 465 470 475 480 Pro Asp Thr Gln Asp Phe Gln Pro Cys Met Gly Pro Gly Cys Ser Asp 485 490 495 Glu Asp Gly Ser Thr Cys Thr Met Ser Glu Trp Ile Thr Trp Ser Pro 500 505 510 Cys Ser Ile Ser Cys Gly Met Gly Met Arg Ser Arg Glu Arg Tyr Val 515 520 525 Lys Gln Phe Pro Glu Asp Gly Ser Val Cys Thr Leu Pro Thr Glu Glu 530 535 540 Met Glu Lys Cys Thr Val Asn Glu Glu Cys Ser Pro Ser Ser Cys Leu 545 550 555 560 Met Thr Glu Trp Gly Glu Trp Asp Glu Cys Ser Ala Thr Cys Gly Met 565 570 575 Gly Met Lys Lys Arg His Arg Met Ile Lys Met Asn Pro Ala Asp Gly 580 585 590 Ser Met Cys Lys Ala Glu Thr Ser Gln Ala Glu Lys Cys Met Met Pro 595 600 605 Glu Cys His Thr Ile Pro Cys Leu Leu Ser Pro Trp Ser Glu Trp Ser 610 615 620 Asp Cys Ser Val Thr Cys Gly Lys Gly Met Arg Thr Arg Gln Arg Met 625 630 635 640 Leu Lys Ser Leu Ala Glu Leu Gly Asp Cys Asn Glu Asp Leu Glu Gln 645 650 655 Val Glu Lys Cys Met Leu Pro Glu Cys Pro Ile Asp Cys Glu Leu Thr 660 665 670 Glu Trp Ser Gln Trp Ser Glu Cys Asn Lys Ser Cys Gly Lys Gly His 675 680 685 Val Ile Arg Thr Arg Met Ile Gln Met Glu Pro Gln Phe Gly Gly Ala 690 695 700 Pro Cys Pro Glu Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Arg Ile Arg Lys Cys 705 710 715 720 Leu Arg Asn Pro Ser Ile Gln Lys Pro Arg Trp Arg Glu Ala Arg Glu 725 730 735 Ser Arg Arg Ser Glu Gln Leu Lys Glu Glu Ser Glu Gly Glu Gln Phe 740 745 750 Pro Gly Cys Arg Met Arg Pro Trp Thr Ala Trp Ser Glu Cys Thr Lys 755 760 765 Leu Cys Gly Gly Gly Ile Gln Glu Arg Tyr Met Thr Val Lys Lys Arg 770 775 780 Phe Lys Ser Ser Gln Phe Thr Ser Cys Lys Asp Lys Lys Glu Ile Arg 785 790 795 800 Ala Cys Asn Val His Pro Cys 805 807

【０１１１】配列番号：2 配列の長さ：3079 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GGCACAAAGT TGGGGGCCGC GAAGATGAGG CTGTCCCCGG CGCCCCTGAA GCTGAGCCGG 60 ACTCCGGCAC TGCTGGCCCT GGCGCTGCCC CTGGCCGCGG CGCTGGCCTT CTCCGACGAG 120 ACCCTGGACA AAGTGCCCAA GTCAGAGGGC TACTGTAGCC GTATCCTGCG CGCCCAGGGC 180 ACGCGGCGCG AGGGCTACAC CGAGTTCAGC CTCCGCGTGG AGGGCGACCC CGACTTCTAC 240 AAGCCGGGAA CCAGCTACCG CGTAACACTT TCAGCTGCTC CTCCCTCCTA CTTCAGAGGA 300 TTCACATTAA TTGCCCTCAG AGAGAACAGA GAGGGTGATA AGGAAGAAGA CCATGCTGGG 360 ACCTTCCAGA TCATAGACGA AGAAGAAACT CAGTTTATGA GCAATTGCCC TGTTGCAGTC 420 ACTGAAAGCA CTCCACGGAG GAGGACCCGG ATCCAGGTGT TTTGGATAGC ACCACCAGCG 480 GGAACAGGCT GCGTGATTCT GAAGGCCAGC ATCGTACAAA AACGCATTAT TTATTTTCAA 540 GATGAGGGCT CTCTGACCAA GAAACTTTGT GAACAAGATT CCACATTTGA TGGGGTGACT 600 GACAAACCCA TCTTAGACTG CTGTGCCTGC GGAACTGCCA AGTACAGACT CACATTTTAT 660 GGGAATTGGT CCGAGAAGAC ACACCCAAAG GATTACCCTC GTCGGGCCAA CCACTGGTCT 720 GCGATCATCG GAGGATCCCA CTCCAAGAAT TATGTACTGT GGGAATATGG AGGATATGCC 780 AGCGAAGGCG TCAAACAAGT TGCAGAATTG GGCTCACCCG TGAAAATGGA GGAAGAAATT 840 CGACAACAGA GTGATGAGGT CCTCACCGTC ATCAAAGCCA AAGCCCAATG GCCAGCCTGG 900 CAGCCTCTCA ACGTGAGAGC AGCACCTTCA GCTGAATTTT CCGTGGACAG AACGCGCCAT 960 TTAATGTCCT TCCTGACCAT GATGGGCCCT AGTCCCGACT GGAACGTAGG CTTATCTGCA 1020 GAAGATCTGT GCACCAAGGA ATGTGGCTGG GTCCAGAAGG TGGTGCAAGA CCTGATTCCC 1080 TGGGACGCTG GCACCGACAG CGGGGTGACC TATGAGTCAC CCAACAAACC CACCATTCCC 1140 CAGGAGAAAA TCCGGCCCCT GACCAGCCTG GACCATCCTC AGAGTCCTTT CTATGACCCA 1200 GAGGGTGGGT CCATCACTCA AGTAGCCAGA GTTGTCATCG AGAGAATCGC ACGGAAGGGT 1260 GAACAATGCA ATATTGTACC TGACAATGTC GATGATATTG TAGCTGACCT GGCTCCAGAA 1320 GAGAAAGATG AAGATGACAC CCCTGAAACC TGCATCTACT CCAACTGGTC CCCATGGTCC 1380 GCCTGCAGCT CCTCCACCTG TGACAAAGGC AAGAGGATGC GACAGCGCAT GCTGAAAGCA 1440 CAGCTGGACC TCAGCGTCCC CTGCCCTGAC ACCCAGGACT TCCAGCCCTG CATGGGCCCT 1500 GGCTGCAGTG ACGAAGACGG CTCCACCTGC ACCATGTCCG AGTGGATCAC CTGGTCGCCC 1560 TGCAGCATCT CCTGCGGCAT GGGCATGAGG TCCCGGGAGA GGTATGTGAA GCAGTTCCCG 1620 GAGGACGGCT CCGTGTGCAC GCTGCCCACT GAGGAAATGG AGAAGTGCAC GGTCAACGAG 1680 GAGTGCTCTC CCAGCAGCTG CCTGATGACC GAGTGGGGCG AGTGGGACGA GTGCAGCGCC 1740 ACCTGCGGCA TGGGCATGAA GAAGCGGCAC CGCATGATCA AGATGAACCC CGCAGATGGC 1800 TCCATGTGCA AAGCCGAGAC ATCACAGGCA GAGAAGTGCA TGATGCCAGA GTGCCACACC 1860 ATCCCATGCT TGCTGTCCCC ATGGTCCGAG TGGAGTGACT GCAGCGTGAC CTGCGGGAAG 1920 GGCATGCGAA CCCGACAGCG GATGCTCAAG TCTCTGGCAG AACTTGGAGA CTGCAATGAG 1980 GATCTGGAGC AGGTGGAGAA GTGCATGCTC CCTGAATGCC CCATTGACTG TGAGCTCACC 2040 GAGTGGTCCC AGTGGTCGGA ATGTAACAAG TCATGTGGGA AAGGCCACGT GATTCGAACC 2100 CGGATGATCC AAATGGAGCC TCAGTTTGGA GGTGCACCCT GCCCAGAGAC TGTGCAGCGA 2160 AAAAAGTGCC GCATCCGAAA ATGCCTTCGA AATCCATCCA TCCAAAAGCC ACGCTGGAGG 2220 GAGGCCCGAG AGAGCCGGCG GAGTGAGCAG CTGAAGGAAG AGTCTGAAGG GGAGCAGTTC 2280 CCAGGTTGTA GGATGCGCCC ATGGACGGCC TGGTCAGAAT GCACCAAACT GTGCGGAGGT 2340 GGAATTCAGG AACGTTACAT GACTGTAAAG AAGAGATTCA AAAGCTCCCA GTTTACCAGC 2400 TGCAAAGACA AGAAGGAGAT CAGAGCATGC AATGTTCATC CTTGTTAGCA AGGGTACGAG 2460 TTCCCCAGGG CTGCACTCTA GATTCCAGAG TCACCAATGG CTGGATTATT TGCTTGTTTA 2520 AGACAATTTA AATTGTGTAC GCTAGTTTTC ATTTTTGCAG TGTGGTTCGC CCAGTAGTCT 2580 TGTGGATGCC AGAGACATCC TTTCTGAATA CTTCTTGATG GGTACAGGCT GAGTGGGGCG 2640 CCCTCACCTC CAGCCAGCCT CTTCCTGCAG AGGAGTAGTG TCAGCCACCT TGTACTAAGC 2700 TGAAACATGT CCCTCTGGAG CTTCCACCTG GCCAGGGAGG ACGGAGACTT TGACCTACTC 2760 CACATGGAGA GGCAACCATG TCTGGAAGTG ACTATGCCTG AGTCCCAGGG TGCGGCAGGT 2820 AGGAAACATT CACAGATGAA GACAGCAGAT TCCCCACATT CTCATCTTTG GCCTGTTCAA 2880 TGAAACCATT GTTTGCCCAT CTCTTCTTAG TGGAACTTTA GGTCTCTTTT CAAGTCTCCT 2940 CAGTCATCAA TAGTTCCTGG GGAAAAACAG AGCTGGTAGA CTTGAAGAGG AGCATTGATG 3000 TTGGGTGGCT TTTGTTCTTT CACTGAGAAA TTCGGAATAC ATTTGTCTCA CCCCTGATAT 3060 TGGTTCCTGA TGCCCCAGC 3079

【０１１２】配列番号：3 配列の長さ：807 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Arg Leu Ser Pro Val Leu Leu Arg Leu Ser Arg Gly Pro Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ala Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Ala Phe Ser Asp Glu 20 25 30 Thr Leu Asp Lys Val Pro Lys Ser Glu Gly Tyr Cys Ser Arg Ile Leu 35 40 45 Arg Val Gln Gly Thr Arg Arg Glu Gly Tyr Thr Glu Phe Ser Leu Arg 50 55 60 Val Glu Gly Asp Pro Asp Phe Tyr Lys Pro Gly Thr Ser Tyr Arg Val 65 70 75 80 Thr Leu Ser Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Phe Arg Gly Phe Thr Leu Ile 85 90 95 Ala Leu Lys Glu Asn Arg Glu Gly Asp Lys Glu Glu Asp His Ala Gly 100 105 110 Thr Phe Gln Ile Ile Asp Glu Glu Glu Thr Gln Phe Met Ser Asn Cys 115 120 125 Pro Val Ala Val Thr Glu Ser Thr Pro Arg Arg Arg Thr Arg Ile Gln 130 135 140 Val Phe Trp Ile Ala Pro Pro Ala Gly Thr Gly Cys Val Ile Leu Lys 145 150 155 160 Ala Ser Ile Val Gln Lys Arg Ile Ile Tyr Phe Gln Asp Glu Gly Ser 165 170 175 Leu Thr Lys Lys Leu Cys Glu Gln Asp Ser Thr Phe Asp Gly Val Thr 180 185 190 Asp Lys Pro Ile Leu Asp Cys Cys Ala Cys Gly Thr Ala Lys Tyr Arg 195 200 205 Leu Thr Phe Tyr Gly Asn Trp Ser Glu Lys Thr His Pro Lys Asp Tyr 210 215 220 Pro Arg Arg Ala Asn His Trp Ser Ala Ile Ile Gly Gly Ser His Ser 225 230 235 240 Lys Asn Tyr Val Leu Trp Glu Tyr Gly Gly Tyr Ala Ser Glu Gly Val 245 250 255 Lys Gln Val Ala Glu Leu Gly Ser Pro Val Lys Met Glu Glu Glu Ile 260 265 270 Arg Gln Gln Ser Asp Glu Val Leu Thr Val Ile Lys Ala Lys Ala Gln 275 280 285 Trp Pro Ala Trp Gln Pro Leu Asn Val Arg Ala Ala Pro Ser Ala Glu 290 295 300 Phe Ser Val Asp Arg Thr Arg His Leu Met Ser Phe Leu Thr Met Met 305 310 315 320 Gly Pro Ser Pro Asp Trp Asn Val Gly Leu Ser Ala Glu Asp Leu Cys 325 330 335 Thr Lys Glu Cys Gly Trp Val Gln Lys Val Val Gln Asp Leu Ile Pro 340 345 350 Trp Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Val Thr Tyr Glu Ser Pro Asn Lys 355 360 365 Pro Thr Ile Pro Gln Glu Lys Ile Arg Pro Leu Thr Ser Leu Asp His 370 375 380 Pro Gln Ser Pro Phe Tyr Asp Pro Glu Gly Gly Ser Ile Thr Gln Val 385 390 395 400 Ala Arg Val Val Ile Glu Arg Ile Ala Arg Lys Gly Glu Gln Cys Asn 405 410 415 Ile Val Pro Asp Asn Val Asp Asp Ile Val Ala Asp Leu Ala Pro Glu 420 425 430 Glu Lys Asp Glu Asp Asp Thr Pro Glu Thr Cys Ile Tyr Ser Asn Trp 435 440 445 Ser Pro Trp Ser Ala Cys Ser Ser Ser Thr Cys Asp Lys Gly Lys Arg 450 455 460 Met Arg Gln Arg Met Leu Lys Ala Gln Leu Asp Leu Ser Val Pro Cys 465 470 475 480 Pro Asp Thr Gln Asp Phe Gln Pro Cys Met Gly Pro Gly Cys Ser Asp 485 490 495 Glu Asp Gly Ser Thr Cys Thr Met Ser Glu Trp Ile Thr Trp Ser Pro 500 505 510 Cys Ser Ile Ser Cys Gly Thr Gly Thr Arg Ser Arg Glu Arg Tyr Val 515 520 525 Lys Gln Phe Pro Glu Asp Gly Ser Val Cys Thr Leu Pro Thr Glu Glu 530 535 540 Thr Glu Lys Cys Thr Val Asn Glu Glu Cys Ser Pro Ser Ser Cys Leu 545 550 555 560 Thr Thr Glu Trp Gly Glu Trp Asp Glu Cys Ser Ala Thr Cys Gly Met 565 570 575 Gly Met Lys Lys Arg His Arg Met Val Lys Met Ser Pro Ala Asp Gly 580 585 590 Ser Met Cys Lys Ala Glu Thr Ser Gln Ala Glu Lys Cys Met Met Pro 595 600 605 Glu Cys His Thr Ile Pro Cys Leu Leu Ser Leu Trp Ser Glu Trp Ser 610 615 620 Asp Cys Ser Val Thr Cys Gly Lys Gly Met Arg Thr Arg Gln Arg Met 625 630 635 640 Leu Lys Ser Leu Ala Glu Leu Gly Asp Cys Asn Glu Glu Leu Glu Gln 645 650 655 Val Glu Lys Cys Met Leu Pro Glu Cys Pro Ile Asp Cys Glu Leu Thr 660 665 670 Glu Trp Ser Gln Trp Ser Glu Cys Asn Lys Ser Cys Gly Lys Gly His 675 680 685 Met Ile Arg Thr Arg Met Ile Gln Met Glu Pro Gln Phe Gly Gly Thr 690 695 700 Pro Cys Pro Glu Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Arg Ile Arg Lys Cys 705 710 715 720 Leu Arg Asn Pro Ser Ile Gln Asn Leu Arg Trp Arg Glu Ala Arg Glu 725 730 735 Ser Arg Arg Ser Glu Gln Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly Asp Gln Phe 740 745 750 Pro Gly Cys Arg Met Arg Pro Trp Thr Ala Trp Ser Glu Cys Thr Lys 755 760 765 Leu Cys Gly Gly Gly Ile Gln Glu Arg Tyr Met Thr Val Lys Lys Arg 770 775 780 Phe Lys Ser Ser Gln Phe Thr Ser Cys Lys Asp Lys Lys Glu Ile Arg 785 790 795 800 Ala Cys Asn Val His Pro Cys 805 807

【０１１３】配列番号：4 配列の長さ：4061 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 CCAGCACCGG CTCGGAGCTC CGCTCCCGCC TGGGCTCTGC CAGGTCTCGT TTCCGCGGGG 60 ACCCCTTCGG GCAGGAGTCG TGCGGCGAGA GCAGCGGCCA GGGCACAAAG TTGGGGGCCC 120 GCGAGGATGA GGCTGTCCCC GGTGCTCCTG AGGCTGAGCC GGGGTCCAGC GCTGCTGGCC 180 CTGGCGCTGC CCCTGGCGGT GGCGCTGGCC TTCTCCGACG AGACCCTGGA CAAAGTGCCC 240 AAGTCAGAGG GCTACTGCAG CCGCATCCTG CGCGTCCAGG GCACGCGGCG TGAGGGCTAC 300 ACCGAGTTCA GCCTCCGCGT GGAGGGCGAC CCCGACTTCT ATAAGCCGGG AACCAGCTAC 360 CGCGTGACGC TTTCAGCTGC CCCTCCCTCC TATTTCAGAG GATTCACCTT AATCGCCCTC 420 AAAGAAAACA GAGAGGGTGA TAAAGAGGAA GACCATGCTG GGACCTTCCA GATCATAGAT 480 GAAGAAGAAA CACAGTTTAT GAGTAATTGC CCCGTTGCGG TCACAGAAAG CACCCCACGG 540 AGGCGGACGC GGATCCAGGT GTTCTGGATA GCGCCACCTG CAGGAACTGG CTGCGTAATT 600 CTAAAGGCTA GCATTGTACA GAAACGCATC ATTTATTTTC AAGATGAAGG CTCTCTGACC 660 AAGAAACTTT GTGAACAAGA TTCCACATTT GATGGGGTGA CTGACAAACC AATCCTAGAC 720 TGCTGCGCCT GTGGGACTGC TAAGTACAGG CTCACATTTT ATGGGAACTG GTCTGAGAAG 780 ACACACCCAA AGGATTACCC TCGTCGGGCC AATCACTGGT CTGCAATCAT CGGCGGATCC 840 CACTCCAAGA ATTACGTGCT GTGGGAGTAT GGAGGATATG CAAGCGAAGG CGTCAAACAG 900 GTTGCAGAAT TGGGCTCTCC AGTGAAAATG GAGGAGGAAA TTCGACAACA GAGCGACGAG 960 GTCCTCACCG TCATCAAAGC CAAAGCTCAG TGGCCAGCCT GGCAGCCTCT CAATGTGAGA 1020 GCAGCACCCT CGGCTGAATT TTCAGTGGAC AGGACGCGCC ACTTGATGTC CTTCCTGACC 1080 ATGATGGGCC CCAGCCCCGA CTGGAACGTG GGCCTGTCCG CAGAGGATCT GTGCACCAAA 1140 GAGTGCGGCT GGGTCCAGAA GGTGGTGCAG GACCTGATTC CCTGGGACGC GGGCACCGAC 1200 AGCGGGGTGA CCTATGAGTC ACCCAACAAG CCCACAATTC CCCAGGAGAA AATCCGACCC 1260 CTGACCAGTC TGGACCATCC TCAGAGTCCT TTTTATGATC CAGAGGGTGG ATCCATCACT 1320 CAAGTAGCCA GAGTTGTCAT CGAGAGAATC GCCCGGAAGG GGGAACAGTG CAATATTGTG 1380 CCCGACAATG TCGACGATAT TGTAGCAGAC CTGGCTCCAG AAGAGAAAGA TGAAGATGAC 1440 ACCCCTGAAA CCTGCATCTA CTCCAACTGG TCCCCGTGGT CCGCCTGCAG CTCCTCCACC 1500 TGCGACAAAG GCAAGAGGAT GCGGCAGCGC ATGCTGAAGG CACAGCTGGA CCTCAGCGTC 1560 CCCTGCCCCG ACACCCAGGA CTTCCAGCCC TGCATGGGCC CCGGCTGCAG CGACGAAGAC 1620 GGCTCCACGT GCACCATGTC CGAGTGGATC ACCTGGTCGC CCTGCAGCAT CTCCTGCGGC 1680 ACCGGCACGC GGTCCCGGGA GAGGTACGTG AAGCAGTTCC CAGAGGACGG CTCCGTGTGC 1740 ACGCTGCCCA CCGAGGAGAC AGAGAAGTGC ACGGTCAACG AAGAGTGCTC TCCCAGCAGC 1800 TGCCTGACGA CCGAGTGGGG CGAGTGGGAC GAGTGCAGCG CCACCTGCGG GATGGGCATG 1860 AAGAAGCGGC ACCGCATGGT CAAGATGAGC CCCGCGGACG GCTCCATGTG CAAGGCTGAA 1920 ACATCTCAGG CAGAGAAGTG CATGATGCCC GAGTGCCACA CCATCCCATG CTTGCTATCC 1980 CTGTGGTCTG AGTGGAGTGA CTGCAGCGTG ACCTGTGGGA AGGGCATGCG GACCCGCCAG 2040 CGGATGCTCA AGTCTCTAGC CGAACTCGGG GACTGTAATG AGGAGCTGGA GCAGGTGGAG 2100 AAGTGCATGC TGCCTGAATG CCCCATTGAC TGTGAGCTCA CGGAGTGGTC CCAGTGGTCG 2160 GAATGTAACA AGTCATGTGG GAAAGGACAC ATGATTCGAA CCCGCATGAT CCAAATGGAG 2220 CCTCAGTTTG GAGGCACACC CTGCCCAGAG ACTGTACAGC GGAAAAAGTG CCGCATCCGG 2280 AAATGCCTCC GAAATCCATC CATCCAGAAC CTGCGCTGGA GGGAGGCCCG AGAGAGCCGG 2340 AGGAGTGAAC AGCTGAGGGA GGAGTCGGAC GGGGACCAGT TTCCAGGCTG CAGGATGCGC 2400 CCTTGGACAG CCTGGTCAGA ATGCACCAAA CTGTGCGGAG GAGGGATCCA GGAACGCTAC 2460 ATGACTGTGA AGAAGAGGTT CAAAAGCTCC CAGTTTACCA GCTGCAAAGA CAAGAAGGAG 2520 ATCAGAGCGT GCAACGTCCA TCCGTGTTAA CCAGGGTACA CGTGTCCCAG GGCTGCACTC 2580 TAGACCCCCA GAGGCAATGG CTGGATCGTT TGTTTGCTTG TTTAAGGCAG TTTCAATTGT 2640 GTACACTAGT TTTCATTTCT GCAGGGGGGT CCGCCCAGTA GTCCTGTGGA TGCTACGGCC 2700 ACCCTTCTGT ACACTTCTTG GTGGGCACAG ACTGGGGGTG GGGGCATGGG GCTCCCTCAT 2760 CCTTAGCCGG CCCTCCTCCA GCACAAGTGA GTAGTGCCAG TCACCTGTGC TGAACAGAAC 2820 GTGTCCCTCT CAAGCATCCA CCTGGGCGGC AGGACAGAGA CCCTGGCTTC CCCAACATGG 2880 AGAGGCAGCT GTGCCCGCAG CTGACCCTGT GCATCGGTGC CAGGGCGCAG CAGCAGGGAG 2940 ACTTTCCTGA TTGGGTGGGA ATGAGAGCAG AGTCCCCTCA TTCTTGCCTG TGGCCTGCTT 3000 GCTCTTGCAG CAAACTACTG TTTGCTTGTC TCTTCTCATT TAGTGGAACT TTAGGGTCCC 3060 TTGTTGAGTC TCCTCAGTCA TCAACAGTTC TTGGGGAAAC AGCTGGCAAA CATGAAGAGA 3120 AGCACTGATG TTGGGTGGCT TTTCTTCTTT CACTGAGAAA TTCTGAATCC AGTATCTCAA 3180 CCCGATACTC CAAAGGAAAA AAATGATGGC TGCTTTTTTA AAAAAATATA ACCAGTTCTT 3240 ACACCTGAGG TAAAACATAC TGGGTCTAGA AATTATTATT CCCTTCTTTT GGGTTTTTTT 3300 GGATATAATT CTCTTAGGAA GCCAGCCTTA GGAACCTTGT GATCCTAGAT CCTTACTAGA 3360 ACCACAGCAG CAAAATTGGC CTCTAGAGCA GTCCCAGGCT TGAGTTTTTT TAAACCTTCC 3420 AACACAGACT TTTAAATCAG CAAACCAGTT TCTAACAAGA AAACCTTTTT TTCAGTTATG 3480 CAAACATTCT GCCGAGTTTG TCTGCAGTCC ACCAAGCCAT TCCTTCAACA AAAATACTAT 3540 CTTAGAACTT GAAAGGGTTT TTACAGTCAT AAAATTTTAT ATGTAGAGAG AAAAAGTGTT 3600 TCAGAGACCA AGACAAATCC AGGGAGAAAG GAATGTCACA GAATCAAGTT AGCAGAAAAA 3660 TCTGGTGGGA AGTCAAACGT ACATACATCA GCCCTCCACA CCAAGGGTCT GGTCCTCTGA 3720 CACCACCACA GGGAGGGTCA TGGTTTTCCG TTCCCTTCCA CACACAAGCA CACCAAATTC 3780 AGGGAGACTG ACTACCAAGG ATTAGTGTAA AAGGACGTTT TACCAACTTG AGTCCATCAG 3840 CAGTTTCTAC TCACTCATTT ACTGTTAAAA TCACTGTTCT GCTCTTGTTG CAGGCCTTCT 3900 TTATCGTGCT TAATCCAAAT ATGTACCATG GATGAGATGC ATACAATGCT TTGAATACAC 3960 TACTTTAAGA ATTTGCATTG AATACTTCAG GATATTCCAA ACACAACATT ATATATATAT 4020 ATATATATGC TACAGCCTTG AATCTGTACT GTTTTAACTA C 4061

【０１１４】配列番号：5 配列の長さ：807 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Arg Leu Ser Pro Ala Pro Leu Arg Leu Ser Arg Gly Pro Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ala Leu Pro Leu Ala Ala Ala Leu Ala Phe Ser Asp Glu 20 25 30 Thr Leu Asp Lys Val Ala Lys Ser Glu Gly Tyr Cys Ser Arg Ile Leu 35 40 45 Arg Ala Gln Gly Thr Arg Arg Glu Gly Tyr Thr Glu Phe Ser Leu Arg 50 55 60 Val Glu Gly Asp Pro Asp Phe Tyr Lys Pro Gly Ser Ser Tyr Arg Val 65 70 75 80 Thr Leu Ser Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Phe Arg Gly Phe Thr Leu Ile 85 90 95 Ala Leu Lys Glu Asn Arg Glu Gly Asp Lys Glu Glu Asp His Ala Gly 100 105 110 Thr Phe Gln Ile Ile Asp Glu Glu Glu Thr Gln Phe Met Ser Asn Cys 115 120 125 Pro Val Ala Val Thr Glu Ser Thr Pro Arg Arg Arg Thr Arg Ile Gln 130 135 140 Val Phe Trp Ile Ala Pro Pro Thr Gly Thr Gly Cys Val Ile Leu Lys 145 150 155 160 Ala Ser Ile Val Gln Lys Arg Ile Ile Tyr Phe Gln Asp Glu Gly Ser 165 170 175 Leu Thr Lys Lys Leu Cys Glu Gln Asp Pro Thr Leu Asp Gly Val Thr 180 185 190 Asp Arg Pro Ile Leu Asp Cys Cys Ala Cys Gly Thr Ala Lys Tyr Arg 195 200 205 Leu Thr Phe Tyr Gly Asn Trp Ser Glu Lys Thr His Pro Lys Asp Tyr 210 215 220 Pro Arg Arg Ala Asn His Trp Ser Ala Ile Ile Gly Gly Ser His Ser 225 230 235 240 Lys Asn Tyr Val Leu Trp Glu Tyr Gly Gly Tyr Ala Ser Glu Gly Val 245 250 255 Lys Gln Val Ala Glu Leu Gly Ser Pro Val Lys Met Glu Glu Glu Ile 260 265 270 Arg Gln Gln Ser Asp Glu Val Leu Thr Val Ile Lys Ala Lys Ala Gln 275 280 285 Trp Pro Ser Trp Gln Pro Val Asn Val Arg Ala Ala Pro Ser Ala Glu 290 295 300 Phe Ser Val Asp Arg Thr Arg His Leu Met Ser Phe Leu Thr Met Met 305 310 315 320 Gly Pro Ser Pro Asp Trp Asn Val Gly Leu Ser Ala Glu Asp Leu Cys 325 330 335 Thr Lys Glu Cys Gly Trp Val Gln Lys Val Val Gln Asp Leu Ile Pro 340 345 350 Trp Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Val Thr Tyr Glu Ser Pro Asn Lys 355 360 365 Pro Thr Ile Pro Gln Glu Lys Ile Arg Pro Leu Thr Ser Leu Asp His 370 375 380 Pro Gln Ser Pro Phe Tyr Asp Pro Glu Gly Gly Ser Ile Thr Gln Val 385 390 395 400 Ala Arg Val Val Ile Glu Arg Ile Ala Arg Lys Gly Glu Gln Cys Asn 405 410 415 Ile Val Pro Asp Asn Val Asp Asp Ile Val Ala Asp Leu Ala Pro Glu 420 425 430 Glu Lys Asp Glu Asp Asp Thr Pro Glu Thr Cys Ile Tyr Ser Asn Trp 435 440 445 Ser Pro Trp Ser Ala Cys Ser Ser Ser Thr Cys Glu Lys Gly Lys Arg 450 455 460 Met Arg Gln Arg Met Leu Lys Ala Gln Leu Asp Leu Ser Val Pro Cys 465 470 475 480 Pro Asp Thr Gln Asp Phe Gln Pro Cys Met Gly Pro Gly Cys Ser Asp 485 490 495 Glu Asp Gly Ser Thr Cys Thr Met Ser Glu Trp Ile Thr Trp Ser Pro 500 505 510 Cys Ser Val Ser Cys Gly Met Gly Met Arg Ser Arg Glu Arg Tyr Val 515 520 525 Lys Gln Phe Pro Glu Asp Gly Ser Val Cys Met Leu Pro Thr Glu Glu 530 535 540 Thr Glu Lys Cys Thr Val Asn Glu Glu Cys Ser Pro Ser Ser Cys Leu 545 550 555 560 Val Thr Glu Trp Gly Glu Trp Asp Asp Cys Ser Ala Thr Cys Gly Met 565 570 575 Gly Met Lys Lys Arg His Arg Met Val Lys Met Ser Pro Ala Asp Gly 580 585 590 Ser Met Cys Lys Ala Glu Thr Ser Gln Ala Glu Lys Cys Met Met Pro 595 600 605 Glu Cys His Thr Ile Pro Cys Leu Leu Ser Pro Trp Ser Glu Trp Ser 610 615 620 Asp Cys Ser Val Thr Cys Gly Lys Gly Met Arg Thr Arg Gln Arg Met 625 630 635 640 Leu Lys Ser Leu Ala Glu Leu Gly Asp Cys Asn Glu Asp Leu Glu Gln 645 650 655 Ala Glu Lys Cys Met Leu Pro Glu Cys Pro Ile Asp Cys Glu Leu Ser 660 665 670 Glu Trp Ser Gln Trp Ser Glu Cys Asn Lys Ser Cys Gly Lys Gly His 675 680 685 Met Ile Arg Thr Arg Thr Ile Gln Met Glu Pro Gln Phe Gly Gly Ala 690 695 700 Pro Cys Pro Glu Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Arg Ala Arg Lys Cys 705 710 715 720 Leu Arg Ser Pro Ser Ile Gln Lys Leu Arg Trp Arg Glu Ala Arg Glu 725 730 735 Ser Arg Arg Ser Glu Gln Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly Glu Gln Phe 740 745 750 Pro Gly Cys Arg Met Arg Pro Trp Thr Ala Trp Ser Glu Cys Thr Lys 755 760 765 Leu Cys Gly Gly Gly Ile Gln Glu Arg Tyr Met Thr Val Lys Lys Arg 770 775 780 Phe Lys Ser Ser Gln Phe Thr Ser Cys Lys Asp Lys Lys Glu Ile Arg 785 790 795 800 Ala Cys Asn Val His Pro Cys 805 807

【０１１５】配列番号：6 配列の長さ：4028 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 CCCTCCCTCT TCGCGCTCCT TCGCCACCGC CCGCCCCTCA GCTCCGCTGC TCGGCTCCGC 60 TCAGAGCAGC GCAGCTCCGC AGCCAAAGCG AGGCGGGCTC GGGCTCCCCA CCGCCAGTGC 120 CACCCGGGCT CCTCCAGCTT TCGCCTCTGC AGCTCCCGTC ACTTGGAGTA AAAGTGTCCT 180 GACAGGGGTC TGCAACATCA GCAGAAAGTT GGGAGGTCCT CGAGAATGAG GCTATCTCCC 240 GCGCCCCTGA GGCTTAGCCG GGGTCCGGCG CTGCTGGCCC TGGCGCTGCC CCTGGCCGCA 300 GCGCTCGCTT TCTCGGATGA GACCCTGGAC AAAGTGGCCA AGTCGGAGGG CTACTGCAGC 360 CGCATCTTGC GCGCCCAGGG CACACGGCGT GAGGGATACA CAGAGTTCAG CCTCCGCGTG 420 GAAGGCGACC CTGACTTCTA TAAGCCAGGA AGCAGCTACC GAGTGACACT CTCGGCTGCC 480 CCTCCCTCCT ACTTCAGAGG CTTCACGTTA ATTGCTCTCA AAGAGAACCG CGAAGGCGAT 540 AAGGAAGAAG ACCACGCGGG CACCTTCCAG ATCATAGATG AAGAAGAAAC CCAGTTTATG 600 AGTAACTGTC CTGTGGCAGT CACTGAAAGC ACCCCTCGGA GGAGGACACG GATCCAGGTG 660 TTTTGGATAG CGCCACCCAC AGGGACAGGC TGTGTGATTC TGAAGGCCAG CATTGTACAG 720 AAACGCATTA TCTATTTTCA AGACGAGGGC TCCCTGACCA AGAAGCTGTG TGAACAGGAT 780 CCCACACTTG ATGGAGTGAC GGACAGACCG ATCTTAGACT GCTGCGCCTG CGGAACTGCC 840 AAGTACAGAC TCACGTTTTA TGGGAACTGG TCGGAGAAGA CTCATCCAAA GGATTACCCT 900 CGTCGGGCTA ATCACTGGTC TGCCATCATT GGCGGATCCC ACTCCAAGAA CTACGTGCTG 960 TGGGAGTACG GAGGGTATGC CAGTGAAGGG GTCAAGCAAG TTGCTGAACT TGGCTCACCA 1020 GTAAAAATGG AGGAAGAAAT TCGACAACAG AGTGATGAAG TCCTCACTGT CATCAAAGCC 1080 AAAGCCCAGT GGCCATCCTG GCAGCCTGTC AATGTGAGAG CAGCACCCTC AGCCGAATTC 1140 TCAGTGGACA GGACACGCCA CTTGATGTCC TTCCTAACCA TGATGGGCCC CAGTCCTGAC 1200 TGGAACGTGG GCCTATCTGC AGAGGATCTG TGCACCAAGG AGTGTGGCTG GGTCCAGAAA 1260 GTGGTGCAGG ACCTAATTCC CTGGGATGCT GGCACGGACA GCGGGGTGAC CTACGAGTCA 1320 CCAAACAAGC CCACAATTCC TCAGGAAAAA ATCCGACCCC TGACTAGTCT GGACCATCCT 1380 CAGAGTCCTT TCTATGACCC GGAAGGTGGG TCCATCACAC AAGTGGCCAG AGTCGTCATC 1440 GAGAGAATTG CCCGGAAGGG AGAACAATGC AACATTGTAC CTGACAATGT GGATGATATT 1500 GTAGCCGACC TGGCTCCAGA AGAGAAAGAT GAAGATGACA CCCCTGAAAC CTGCATCTAC 1560 TCCAACTGGT CCCCATGGTC GGCCTGCAGC TCTTCCACTT GTGAAAAGGG TAAGAGGATG 1620 CGGCAACGCA TGCTGAAGGC ACAGCTGGAC CTCAGTGTCC CCTGTCCTGA CACCCAGGAC 1680 TTCCAGCCCT GCATGGGCCC CGGCTGCAGC GATGAAGATG GCTCCACCTG TACCATGTCG 1740 GAGTGGATCA CCTGGTCACC CTGCAGTGTC TCGTGTGGCA TGGGTATGAG GTCCCGGGAG 1800 AGGTACGTGA AGCAGTTCCC GGAAGACGGC TCGGTGTGCA TGCTGCCCAC GGAAGAGACA 1860 GAGAAGTGCA CGGTCAACGA GGAGTGCTCT CCTAGCAGCT GCCTGGTGAC TGAGTGGGGT 1920 GAGTGGGATG ACTGCAGCGC CACCTGTGGA ATGGGCATGA AGAAGCGGCA CCGCATGGTC 1980 AAGATGAGCC CCGCGGACGG CTCCATGTGC AAGGCGGAGA CTTCGCAGGC GGAGAAATGC 2040 ATGATGCCTG AGTGCCATAC CATCCCGTGC TTGCTGTCTC CTTGGTCCGA GTGGAGCGAC 2100 TGTAGCGTGA CCTGTGGGAA GGGCATGCGG ACGCGCCAGC GGATGCTCAA GTCTCTGGCA 2160 GAGCTGGGGG ACTGTAATGA GGATCTGGAG CAGGCGGAGA AGTGTATGCT GCCAGAGTGC 2220 CCCATTGACT GCGAACTCAG TGAGTGGTCC CAGTGGTCTG AATGTAACAA GTCCTGTGGG 2280 AAAGGTCACA TGATTCGAAC CCGGACAATC CAAATGGAAC CTCAGTTTGG AGGTGCACCC 2340 TGCCCAGAGA CTGTGCAACG CAAGAAGTGC CGTGCCCGGA AATGCCTTCG CAGCCCATCG 2400 ATCCAGAAGC TGCGCTGGAG GGAGGCCCGA GAGAGCAGGA GGAGTGAGCA GCTGAGGGAA 2460 GAGTCAGATG GAGAGCAGTT CCCAGGCTGT CGGATGCGCC CGTGGACAGC CTGGTCAGAG 2520 TGCACCAAAC TGTGCGGAGG TGGGATCCAA GAACGCTACA TGACTGTGAA GAAGAGGTTC 2580 AAAAGCTCCC AGTTTACCAG CTGCAAAGAC AAGAAGGAGA TCAGAGCGTG CAACGTGCAC 2640 CCTTGTTAGT AGGGGTTCAA CTCCCCAGGG CTGCATTCCA GATTCTAGTC ACCAATGGTT 2700 GGGTGGTGTA TTTGCTTGTT TAAGATGATT TAAATTGTGT CCACATGTTT TCATTTTTAC 2760 CGGTGTGGTT TGCCCAATAG TCTTATGGAG GCCGAGGGAC ATCTTGTCTG AATACTTCTT 2820 GGTGAGTACA GGCCAAGCGG GGCATCTTGT CCCCAGGCGC CATCTTCCTG CACTGAGTTG 2880 AGTAGTGTTG GTTCACCTTG GTACTAAACT GAATCGTGTC CCTCTGGAGC ATCCCCTGGT 2940 CAAGCAGGGT GGAGACTTTG GCCATCCACA AGGAGAAGCA ACCAGGATGC AGCATGCGGG 3000 AGACACAGCC ATTAATTGCA AAGGACAGAT CCTCCTCTCT CACCTTTGGC CTGCTCACTC 3060 TTACAGAAAC CTGTTTGTCC GCCTCCTTTT TTATTTAGCA CAACTCCAGG CATCTTGGTA 3120 AGTCTCCAGG GTCATGGGTT CTTCGGTGCC CTGAAGGAGA AGCCCTGAGG TGAGGTGGCA 3180 TTTGTTACAA ACCTCCCAAT ACTGCTTTAC TGGCATCACA AGGTCAGCAG GTGATGATGG 3240 CTACTTCATT TCATTGTGAG CCGTGATTTC CGTTGAGTTT TGATTGTTGG TGCCATAAAT 3300 GTCCTAGGAT GCTGGACGGA CACATCAGCC TTGTCAGCAG ATCCTTCTTT GAGCCAATGT 3360 AGACAGTAAG CTGGGCACTG GTTCCAAAGC CAACTTAAAA TCTTCCTACA CATATCCAGA 3420 CCTTTTTTTA GGTTGCCCAA ACTTCCTTAG AATAAAGCAT TTTAGCTCTG AGAACTACTT 3480 GATAAGTCTG CCAGGAAGCC CCCAAGTCAA TTCTTCAACA AAAATACTAT CTTCCCTACT 3540 TAATTTTTTT TAAGTCATGA TATTTTATAG TTAGAGGAGA GAGAGACAAT CTATTCCCAT 3600 GACTAAGACA CAAACCTACA AGAAAGGGTT ACTCAGTCAA GCCTGTGCCT GACTTCTGGA 3660 CCAGGCCCCT GATTTTCATG GATAGTCCAA AGGAAGGCCA GGGGTTCCCA CTGACTCCAA 3720 GCCATCAGCA GCACCCAAAC CCAGGAGCAA CAAATATTCA GAGAAAGAGG ATGTTTATCT 3780 CAGCTATGAG CTCATTGGCA GGTTGTACTC ATGCATCTGT TAAAAGCACC ACCACATCCT 3840 TTTGCAAGTC TGTTTATTAC CGCTTCATCC AAATACATTT TGTGGTCAAG ATCGACACAG 3900 TGCTATGAAT ACAGTACTTT AAGGTCTGCA TTAAACACAT CAGAATATTT CCTGCCACAT 3960 CTATGTACAA CCCCTGAATA TGTATTTTTC CTTAACACAA GAGAGCCTGT TCAATTAAAA 4020 AAAAAAAAA 4029

【０１１６】配列番号：７ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TAYTTYCARG AYGARGG 17

【０１１７】配列番号：８ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： AARATGGARG ARGARAT 17

【０１１８】配列番号：９ 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列： Phe Ser Gln Phe Thr Leu Xaa Lys Val Pro Lys Glu Ile Xaa Ala Ser 1 5 10 15 Asn 17

【０１１９】配列番号：10 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【０１２０】配列番号：11 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Arg Ile Ile Tyr Phe Gln Asp Glu Gly Ser Leu Thr Lys 1 5 10 13

【０１２１】配列番号：12 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Asp Tyr Pro Pro Xaa Ala Asn Xaa His Ser Ala Ile Ile Gly Gly Ser 1 5 10 15 Xaa Ser Lys 19

【０１２２】配列番号：13 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Met Glu Glu Glu Ile Arg Gln Gln Ser Asp Glu Val Leu Thr Val Ile 1 5 10 15 Lys 17

【０１２３】配列番号：14 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【０１２４】配列番号：15 配列の長さ：25 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Ile Arg Pro Leu Thr Ser Leu Asp Asp Pro Gln Gln Pro Phe Tyr Asp 1 5 10 15 Pro Glu Gly Gly Gly Ile Xaa Gln Val 20 25

【０１２５】配列番号：16 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Asp Glu Asp Asp Thr Pro Glu Thr Cys Ile Tyr Ser Asn Asn Ser Pro 1 5 10 15 Pro Ser Ala Ala Xaa Ser 20 22

【０１２６】配列番号：17 配列の長さ：30 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Ser Glu Gly Tyr Cys Ser Arg Ile Leu Arg Val Gln Gly Thr Arg Arg 1 5 10 15 Glu Gly Tyr Thr Glu Phe Ser Leu Arg Val Glu Gly Asp Pro 20 25 30

【０１２７】配列番号：18 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Ser Leu Ala Glu Leu Gly Asp Cys Asn Glu Glu Leu Glu Gln Val Glu 1 5 10 15 Lys 17

【０１２８】配列番号：19 配列の長さ：23 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Val Val Gln Asp Leu Ile Pro Trp Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Val 1 5 10 15 Thr Tyr Glu Ser Pro Asn Lys 20 23

【０１２９】配列番号：20 配列の長さ：23 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Gly Glu Gln Cys Asn Ile Val Pro Asp Asn Val Asp Asp Ile Val Ala 1 5 10 15 Asp Leu Ala Pro Glu Glu Lys 20 23

【０１３０】配列番号：21 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Ala Gln Leu Asp Leu Ser Val Pro Gln Pro Asp Thr Gln Asp Phe Gln 1 5 10 15 Pro Xaa Xaa Gly Pro Gly 20 22

【図面の簡単な説明】

【図１】 ウシVSGFのDEAEセファロースによる精製時の
各フラクションの吸光度と、血管平滑筋細胞の増殖促進
活性を示す。

【図２】 図１の各フラクションのうちの一部のSDS-PA
GEの結果を示す。

【図３】 ウシVSGFの逆相HPLCによる精製時の溶出パタ
ーンを示す。チャート中ピークの下の太線は分取した範
囲を示す。

【図４】 最終精製ウシVSGFのSDS-PAGEの結果を示す。

【図５】 組換えヒトVSGF発現用のベクターの構築を示
す。

【図６】 COS-7細胞で発現させた組換えヒトVSGFのSDS
-PAGEの結果を示す。

【図７】 組換えヒトVSGFの平滑筋細胞増殖阻害活性
を、実測細胞数の増加で示す。

【図８】 ラット角膜の組織図を示す。図8aはbFGFを10
0ng投与した場合、図8bはbFGF100ngに加え組換えヒトVS
GFを1μg投与した場合である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＷ 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＤＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 ＡＤＳ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
   むポリペプチド、または、配列番号１で表されるアミノ
   酸配列において一個以上のアミノ酸が置換、欠失もしく
   は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ血管平滑筋細胞
   増殖促進活性を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号３で表されるアミノ酸配列を含
   むポリペプチド、または、配列番号３で表されるアミノ
   酸配列において一個以上のアミノ酸が置換、欠失もしく
   は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ血管平滑筋細胞
   増殖促進活性を有するポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１記載のポリペプチドがヒト由来
   である、血管平滑筋細胞増殖促進活性を有するポリペプ
   チド。
4. 【請求項４】 請求項２記載のポリペプチドがウシ由来
   である、血管平滑筋細胞増殖促進活性を有するポリペプ
   チド。
5. 【請求項５】 請求項１あるいは３記載のポリペプチド
   をコードするＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項２あるいは４記載のポリペプチド
   をコードするＤＮＡ。
7. 【請求項７】 配列番号２で表される塩基配列を有する
   請求項５記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 配列番号４で表される塩基配列を有する
   請求項６記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 請求項５または７記載の塩基配列を有す
   るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
   し、かつ血管平滑筋細胞増殖促進活性を有するポリペプ
   チドをコードするＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 請求項６または８記載の塩基配列を有
    するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
    ズし、かつ血管平滑筋細胞増殖促進活性を有するポリペ
    プチドをコードするＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 請求項５〜１０から選ばれるＤＮＡと
    ベクターとからなる組み換えベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載の組み換えベクターを
    宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載の形質転換体を培地に
    培養し、培養物中に請求項１記載のポリペプチドを生成
    蓄積させ、該培養物からポリペプチドを採取することを
    特徴とする請求項１〜４記載のポリペプチドの製造方
    法。
14. 【請求項１４】 請求項１〜４から選ばれるポリペプチ
    ドと特異的に反応する抗体。
15. 【請求項１５】 請求項１４記載の抗体を用いた、創傷
    治癒不全、難治性皮膚潰瘍、糖尿病性網膜症、乾せん
    症、関節リウマチ、血管腫瘍、動脈硬化、固形腫瘍の免
    疫学的検出方法。
16. 【請求項１６】 請求項１〜４または配列番号５記載の
    ポリペプチドを含有してなる創傷治癒剤。
17. 【請求項１７】 請求項１〜４または配列番号５記載の
    ポリペプチドを含有してなる異常血管新生阻害剤。