【発明の詳細な説明】
ヒト前立腺腺性カリクレインに特異的な抗体
本発明は認可番号第 CA 15093-19号の下米国政府の支援によりなされた。米国
政府は本発明に一定の権利をもつ。
発明の背景
腺性カリクレインは、それらの生物学的に活性な形態への特定のポリペプチド
前駆体の翻訳後プロセシングに関連するセリン・プロテアーゼのサブグループで
ある。げっ歯類カリクレイン遺伝子ファミリーは少なくとも25の遺伝子から成る
。しかしながら、ヒト・カリクレイン遺伝子ファミリーはより小さく、３つのメ
ンバー：前立腺−特異的抗原、ヒト腺性カリクレイン（glandular kallikrein）
、および膵臓／腎臓カリクレイン、から成る。J.A.Clements，Endocr.Rev．，10
，393 (1989)及びT.M.Chu et al. （米国特許第 4,446,122号）参照。組織（腺
性）カリクレイン遺伝子ファミリーのこれらのメンバーについての一般的命名法
が最近、 T.Berg et al.，によりRecent Progress on Kinins : Biochemistry a nd Molecular Biology of the Kallikrein-Dinin System．Agents and Actions Supplements
，Vol.Ｉ，H.Fritz et al.，eds.，Birkhauser Verlag，Basel （1
992）中に、採用され、そしてそれを以下の表Ｉ上に与える。
L.J.Schedlich et al.，DNA ，6，429(1987)及びB.J.Morris，Clin.Exp.Pharm acol.Physiol．
，16，345(1989)により演鐸されたアミノ酸配列は、hK２がトリ
プシン−様セリン・プロテアーゼであることができ、一方、hK３(PSA)がキモト
リプシン−様セリン・プロテアーゼであることを示している。それ故、これらの
２つのペプチドは異なる生理学的機能をもつことができる。
hK２のためのcDNA及びゲノム配列は既に記載されているけれども、上記機能的
hK２タンパク質は前立腺組織から未だ単離及び特徴付けされていない。 hKLK2と
hKLK3(エクソン領域)の間の DNA配列の相同性は80％であり、一方、 hKLK2と hK
LK1の間の相同性は65％である。hK２の演鐸アミノ酸配列の相同性はhK３に関し
てより大きく、そしてhK１に関してより小さく；それぞれ、78％と57％である。
これらのヒト・カリクレインの遺伝子構造と演鐸アミノ酸配列の類似性は、そ
れらの進化が同一の先祖遺伝子を含むことができるということを示唆する。その
上、先に引用したMorris ; P.Chapdelaine，FEBS Lett.，236 ，205 (1988)；及
び Young，Biochemistry，31，1952 (1992).により報告されるように、hK２及び
hK３の両方がヒト前立腺内でのみ発現され、一方、hK１の発現が膵臓、顎下腺(s
ubmandibular gland)、腎臓、及び他の非前立腺組織に限定される。ヒト尿カリ
クレインに一致すると報告されたポリペプチドの推定配列はAmgen（EPA 297,913
）により開示された。
面白いことに、このhK２遺伝子は第19染色体上に頭から尾のやり方で(in head
-to-tail fashion)hK３から約12ｋ塩基対下流に位置する。P.H.Riegman et al.
，FEBS Lett.，247 ，123(1989)参照。このように、hK２とhK３遺伝子発現の間
の関係は特にそれらの進化と機能特性に関してひじょうに好奇心をそそる。
前立腺癌腫を検出し、そしてその治療をモニターするためのマー
カーとしてそれが重要な役割を演じるので、hK３(PSA)にかなりの関心が注がれ
てきた。マーカーとしてのその有用性は、前立腺癌としばしば関係付けられる循
環hK３タンパク質の上昇した血清濃度に基づく。hK３の血清濃度は、非治療患者
における癌のマスに比例することが判明しているが、良性前立腺過形成(BPH)を
もつ患者における過形成組織の容量にも比例する。hK３の血清レベルは前立腺癌
治療に従って減少するようになる。
最近、 Mayo Laboratoryは、毎年hK３レベルについて60,000を上廻る試料を検
定している。それ故、hK２とhK３の高程度の配列相同性は、両タンパク質のレベ
ルが前立腺癌の診断において有用であることができることを示唆している。例え
ば、これらの検定において現在使用されているhK３に対して顕出された抗体は理
論的にhK２を認識することもできるであろう。なぜなら、抗−hK３抗体の顕出の
ために使用される抗原性調製物中に相互汚染があり、又は上述のこれらの２つの
タンパク質の構造類似性が交差反応性抗体を産生するであろうからである。上昇
した血清hK２レベルが前立腺癌の指標でない場合、抗−hK３抗体によるhK２の検
出は、最近のhK３検定において観察されている偽陽性結果の実質的なパーセンテ
ージの原因となることができるであろう。他方において、循環hK２レベルも前立
腺癌患者におけるベースライン・レベルを上廻って上昇している場合、hK２−特
異的抗体によるhK２の検出は、前立腺癌についての他の、確実な検定を提供する
であろう。
しかしながら、その DNA配列とcDNAプローブからhK２について確かめられるこ
とができる情報にも拘らず、hK２タンパク質自体についてはひじょうに少しのこ
としか知られていない。この理由は、そのタンパク質が精製、及び特徴付けされ
ておらず、そして前立腺血漿、精液血漿又は血液血漿中のいずれにおいても、そ
のタンパク質
を計測する方法が存在しないということである。
それ故、hK３(PSA) と交差反応しないhK２(hGK-1) に対する抗体についての必
要性が存在する。hK３を検出せずに、生理学的サンプル中のhK２の存在及び／又
はレベルを測定するための検定についての、あるいは逆に、同一サンプル中のhK
２の存在により影響されない、サンプル中のhK３の存在及び／又はレベルを検出
することができる検定についての、さらなる必要性が存在する。前立腺癌の段階
を検出し、そしてその経過を追跡するための改良された及び／又は他の方法につ
いてのさらなる必要性が存在する。
発明の簡単な説明
本発明は、ヒト前立腺−特異的腺性カリクレイン（human prostate-specific
glandular kallikrein (hK2)）上のエピトープに結合(又は“交差反応”)するが
、前立腺−特異的抗原（hK３）には有意に結合しない精製抗体を提供する。本発
明に係る抗体は、それ故、hK２の精製調製物に、前立腺血漿、精液血漿、血液血
漿及び他の生理学的液体中に存在するhK２に、並びに上記エピトープを含むアミ
ノ酸配列を含んで成るhK２のサブユニットに特異的に結合するであろう。従って
、本発明は、そのポリクローナル抗体調製物がhK３と有意に交差反応しない限り
、すなわち、hK２の精製抗原性サブユニットにより哺乳類を免疫感作することに
より調製されることができるような精製抗体を含んで成るポリクローナル抗体の
単離調製物をも提供する。本発明に係る抗体は、慣用のハイブリドーマ方法論を
使用して調製されることができる抗−hK２モノクローナル抗体の均一集団から本
質的に成る単離抗体調製物であることもできる。
本発明は、哺乳類において抗体応答を作り出すために使用されることができる
hK２タンパク質の少なくとも１のペプチド・サブユニ
ットであって、その抗体がhK３と有意に交差反応しないものが存在するという我
々の発見に基づく。この発見は、hK２とhK３の間の高程度（78％）の配列相同性
、及びhK２の抗原性に関する従来技術における各データの欠如の視点において驚
ろくべきことであった。従って、本発明は以下の式（Ｉ）：
His-Cys-Leu-Lys-Lys-Asn-Ser-Gln-Val-Trp-Leu-Gly-Arg-
His-Asn-Leu （配列番号：１）
により表されるペプチドにも向けられる。
式（Ｉ）のペプチドは、L.J.Schedlish et al.，DNA ， 6，429(1987)により
報告されたような、hK２の演鐸アミノ酸配列の残基41−56を表す。特異的抗−hK
２抗体により特異的に結合されることもできる好ましくは少なくとも５ペプチジ
ル単位の上記ペプチドの免疫原性又は免疫反応性のサブユニットも本発明の範囲
内にある。もちろんこの41−56配列（配列番号：１）は、以下に討議するように
、hK２に特異的である抗原性応答を引き起こすその能力を破壊しない追加の又は
他のペプチジル残基を含んで成ることができる。
さらに、他の免疫原性hK２サブユニットであって、hK２（80−95）（配列番号
：２）、hK２（104-119）（配列番号：３）、hK２（140−157）（配列番号：４
）、及びhK２（168−174）（配列番号：５）、hK２（８−26）（配列番号：６）
、hK２（15-26）（配列番号：７）、hK２（153−167）（配列番号：８）、並び
にhK２（210−235）（配列番号：９）｛ここで括弧内の数字は図１中及び先に引
用したSchedlish et al.により開示されたhK２配列のhK２アミノ酸残基を同定す
る。｝を含むものも、hK２にユニークである抗体応答を作り出すことができるで
あろう。従って、これらのサブユニット、並びにそれらに特異的なモノクローナ
ル及びポリクローナル抗体も本発明の範囲内にある。
抗−hK２抗体の本調製物は、固体支持体、例えば紙ストリップ又は粒状固体の
表面への吸着又は化学的結合により固定化され、そしてhK２についてのさまざま
な免疫学的検定において使用されることができる。簡単な態様においては、hK２
の固定化調製物は、サンプル、例えばhK２を含むと疑われる生理学的液体の液体
サンプルと、hK２が上記抗−hK２抗体と反応して２成分（binary）複合体を形成
するように、接触される。この２成分複合体の存在は次に、例えば、そのhK２分
子上の異なる抗原性部位に対する第２抗体とその複合体を反応させて３成分(ter
nary)複合体を形成することにより検出される。この第２抗体は、検出可能な標
識、例えば放射標識、蛍光標識、化学発光標識又は酵素あるいは検出可能な標識
についての結合性部位、例えばアビジン−ビオチン結合のメンバーの中の１を含
んで成ることができる。この結合第２抗体の検出は結合hK２の量の計測量を提供
する。
あるいは、サンプル中のhK２の量は、競合的免疫検定を使用して、すなわち、
限定された量の抗−hK２抗体及びそれ自体検出可能な標識又は検出可能な標識の
ための結合性部位を含んで成る既知量のhK２を添加し、その複合体を沈殿させ、
そして遊離の、標識されたhK２の量であってその量がそのサンプル中のhK２の量
に反比例するものを計測することにより、検出されることができる。関連形式の
多くの他の免疫検定は、例えば、Ortho Pharmaceutical Corp.(PCT／US87／0057
7)；IAF(EPA 32649)；並びに米国特許第 4,629,783号；第 4,371,515号；第 4,4
87,715号；第 3,817,837号；第 3,850,752号；第 3,901,654号；第 3,935,074号
；第 3,984,533号；第 3,996,345号；第 4,034,074号；及び第 4,098,876号中に
記載されているように、本分野において利用可能である。
アミノ酸残基についての１文字及び３文字略号は、Ａ，アラニン
(Ala)；Ｒ，アルギニン(Arg)；Ｎ，アスパラギン(Asn)；Ｄ，アスパラギン酸(As
p)；Ｃ，システイン(Cys)；Ｑ，グルタミン(Gln)；Ｅ，グルタミン酸(Glu)；Ｇ
，グリシン(Gly)；Ｈ，ヒスチジン(His)；Ｉ，イソロイシン(Ile)；Ｌ，ロイシ
ン(Leu)；Ｋ，リシン(Lys)；Ｆ，フェニルアラニン(Phe)；Ｍ，メチオニン(Met)
；Ｐ，プロリン(Pro)；Ｓ，セリン(Ser)；Ｔ，トレオニン(Thr)；Ｗ，トリプト
ファン(Trp)；Ｙ，チロシン(Tyr)；Ｖ，バリン(Val)である。ペプチドの所定ア
ミノ酸配列内においては、そのペプチドのアミノ末端はそのペプチドの左手末端
にあり、そしてそのカルボキシル末端は右手にある。
図面の簡単な説明
図１は、（cDNA配列から演鐸された）hK２のアミノ酸配列（配列番号：10）と
hK３(PSA)のアミノ酸配列（配列番号：11）を表す。下線配列はモノクローナル
抗体とポリクローナル抗体の顕出のために使用される非相同領域を表す。
図２は、hK２（41−56）抗血清のドット−ブロット分析を示し、hK２（41−56
）、hK２(153−167)並びにhK３（14−27）、hK３（41−56）及びhK３(153−167)
のそれへの結合を比較している。
図３は、非−免疫ヒツジ血清（△）の結合と比較した、AE−標識hK２（41−56
）−BSA 結合体（○）へのヒツジ抗−hK２（41−56）抗血清の結合を示すタイタ
ー曲線を表す。
図４は、ヒツジhK２（41−56）抗体についての競合的置換曲線を表し、ここで
、hK２(41−56)(□)、hK３ペプチド(41−56)(△)及び精液抽出物（＊）の全てが
その抗体からAE−標識hK２（41−56）−BSA 結合体を置換することができるが、
一方、hK３はその結合体を有意に置換することができない（○）。
発明の詳細な説明hK２ペプチド合成
式（Ｉ）のポリペプチド、その抗原性アナログ及びサブユニット、又は他のhK
２サブユニット・ポリペプチドは、固相ペプチド合成（又はMerrifield）法によ
り合成されることができる。その実験手順を含む、この確立され、そして広く使
用されている方法は、以下の文献：Stewart et al.，Solid Phase Peptide Synt hesis
，W.H.Freeman Co.，San Francisco（1969） ; Merrifield，J.Am.Chem.S oc.
，85，2149（1963） ; Meienhofer in Hormonal Proteins and Peptides，Vo
l.2，C.H.Li，ed.,(Academic Press，1973)，pp.48-267；及びBarany and Merri
field in“The Peptides,”Vol.2，E.Gross and F.Meinenhofer，eds.，Academi
c Press(1980)，pp.3-285中に記載されている。この合成は、アルファ−アミノ
保護アミノ酸を使用してそのペプチドのカルボキシル末端から始められる。フル
オレニルメチルオキシ−カルボニル（Fmoc）又はｔ−ブチルオキシカルボニル(B
oc)保護基はたとえ他の保護基が好適であっても全てのアミノ酸について使用さ
れることができ、そして第一保護アミノ酸はクロロメチル化ポリスチレン樹脂支
持体にエステル化されることができる。このポリスチレン樹脂支持体は好ましく
は、ポリスチレン−ポリマーが特定の有機溶媒中に不溶性となることを引き起こ
す架橋剤としての約 0.5〜２％のジビニル・ベンゼンとスチレンとのコポリマー
である。Carpino et al.，J.Org.Chem．，37，3404(1972); Meinhofer，Int.J.P ept.Pro.Res．
，11，246 (1978)；及びMerrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149
（1963）を参照のこと。ペプチド合成のこれらの及び他の方法も米国特許第 3,8
62,925号；第 3,842,067号；第 3,972,859号；第 4,105,602号及び第 4,757,048
号により例示されている。
固定化されたペプチドは次にＮ−保護され、そして保護アミノ酸をもつ他のア
ミノ酸は段階的にその固定化ペプチドに添加される。この手順の終わりに、最後
のペプチドを上記樹脂から解裂させ、そして残りの保護基のいずれをも酸性条件
下による処理、例えば臭化水素酸とトリフルオロ酢酸との混合物又はフッ化水素
酸により除去し、又はその樹脂からの解裂は塩基性条件下、例えばトリエチルア
ミンにより行われることができ、その後その保護基が酸性条件下で除去される。
解裂されたペプチドは、本分野においてよく知られている手段、例えば凍結乾
燥その後の、多糖類ゲル媒質例えば Sephadex G-25上の排除又は分配クロマトグ
ラフィー、又は向流分配のいずれかにより、単離及び精製される。最終ペプチド
の組成は、標準的な手段によるペプチドの分解後のアミノ酸分析により確認され
ることができる。
この合成は手動技術を使用するか又は例えばApplied Biosystems 431A Peptid
e Synthesizer（Foster City，CA）又はBiosearch SAM II自動ペプチド合成装置
(Biosearch，Inc.，San Rafael，CA)を使用して、その製造者により供給される
取扱説明書中に提供される指示及び試薬に従って、完全に自動化されることがで
きる。 Cys残基間のジスルフィド結合は、米国特許第 4,757,048号中カラム20に
おいて教示されるように KCNによるその線状ペプチドの温和な酸化により導入さ
れることができる。
ペプチドのカルボキシル基の塩は、１当量以上の望ましい塩基、例えば水酸化
金属塩基、例えば水酸化ナトリウム；炭酸金属又は重炭酸金属；又はアミン塩基
、例えばトリエチルアミン、トリエタノールアミン、その他と、そのペプチドを
接触させることにより普通のやり方で調製されることができる。
ポリペプチドの酸付加塩はそのポリペプチドを、１当量以上の望ましい無機又
は有機酸、例えば塩酸と接触させることにより調製されることができる。
ポリペプチドのカルボキシルのエステルは、カルボン酸又は前駆体をエステル
に変換するための本分野において公知の普通の方法の中のいずれかにより調製さ
れることができる。本ポリペプチドのエステルの１の好ましい調製方法は、上記
のMerrifield合成技術を使用するとき、その樹脂に依存して、塩基性又は酸性条
件下のいずれかにおいて所望のアルコールの存在中でその樹脂から完全なポリペ
プチドを解裂することである。従って、樹脂から遊離されるときそのペプチドの
Ｃ−末端は上記の遊離酸の単離を伴わずに直接的にエステル化される。
本発明に係るポリペプチドのアミドも、カルボン酸又は前駆体をアミドに変換
するための本分野においてよく知られた技術により調製されることができる。そ
のＣ−末端カルボキシル基におけるアミド形成のための好ましい方法は、適当な
アミンにより固体支持体からそのポリペプチドを解裂させること、又はアルコー
ルの存在中で解裂させてエステルを作り、その後所望のアミンによるアミノリシ
スを行うこと、である。
本ポリペプチドのアミノ基のＮ−アシル誘導体は、その最後の縮合のためにＮ
−アシル保護アミノ酸を使用することにより、又は保護又は非保護ペプチドをア
シル化することにより調製されることができる。Ｏ−アシル誘導体は、例えば遊
離ヒドロキシ・ペプチド又はペプチド樹脂のアシル化により調製されることがで
きる。各アシル化は、標準的なアシル化試薬、例えばハロゲン化アシル、無水分
、アシル・イミダゾール、その他を使用して行われることができる。Ｎ−及びＯ
−アシル化の両方が適宜、一緒に行われることができ
る。
さらに、これらのペプチド配列は、Ｌ型よりもむしろＤ型を使用する置換を含
む、特定の位置について１以上の保存的アミノ酸置換を置換することにより修飾
されることができる。これらのペプチドは標準的な固相技術を使用して合成され
ることができるので、例えば、遺伝子によりコードされるアミノ酸に、上記の保
存的置換を限定することは必要でない。
本発明は、ポリペプチドの修飾形態にも向けられる。本ポリペプチドの１以上
の残基は、活性が保持される限り、変更されることができる。保存的アミノ酸置
換が好ましい。すなわち、例えば、酸性アミノ酸としてアスパラギン酸−グルタ
ミン酸；塩基性アミノ酸としてリシン／アルギニン／ヒスチジン；疎水性アミノ
酸としてロイシン／イソロイシン／トレオニン；親水性アミノ酸としてセリン／
グリシン／アラニン／トレオニンである。しかしながら、上記ペプチドは組換え
法により又はその遺伝子から調製される必要はないので、これらの置換は、非コ
ード・アミノ酸、例えばＤ−又はベータ−アミノ型を含むことができる。検定形式
本抗−hK２抗体を作るために抗原として十分に有用であるので、式(Ｉ)(41−5
6)のペプチド（配列番号：１）及びその抗原性誘導体も、抗−hK２抗体について
（又はその後、抗−PSA 抗体について）検定されるべきサンプルからの抗−hK２
抗体に結合し、そしてこれを固定化するための“捕獲抗体”として固定化され、
そして使用されることができる。ペプチドと抗−hK２抗体の２価複合体は次に、
例えばヒトの生理学的材料のサンプルの場合において、検出可能な標識又は検出
可能な標識のための結合性部位を含んで成る抗−ヒト IgG抗体とそれを反応させ
ることにより、検出される。後者のケ
ースにおいては、その結合性部位はそれ自体、それ自体検出可能な標識を含んで
成る、その結合性部位に特異的な化合物と反応する。有用な検出可能な標識は、
酵素、放射標識又は蛍光標識を含む。得られた３成分又は４成分複合体は次に、
その検出可能な標識を介して、すなわち酵素−基質色−形成反応、放射能放出、
凝集その他を介して検出及び／又は定量される。
逆に、本発明に係る抗−hK２抗体は、固体支持体の表面上に固定化され、そし
て生理学的液体中のhK２に特異的に結合することができる捕獲抗体として使用さ
れることができる。好適な支持体は、粒状支持体、例えばポリスチレン・ビーズ
、プラスチックのマイクロタイター・プレートの壁、紙又は合成繊維ストリップ
その他を含む。次に固定化された抗体は検定されるべきテスト・サンプルと、例
えば生理学的液体、例えば精液、血液血漿、前立腺組織ホモジュネート、前立腺
液その他と接触されることができる。得られた液体−hK2 ２成分複合体は次に抗
−hK２抗体により又は（hK２と抗−PSA 抗体の交差反応性による）公知の抗−PS
A （抗−hK３）抗体、例えばウサギ抗−PSA 血清により検出されることができる
。得られた３成分複合体は次に、商業的に入手可能な抗−IgG 抗体、例えばヤギ
抗−ウサギ IgGであって、結合したウサギ抗−PSA に結合し、そしてそれ自体、
検出可能な標識（例えば、放射標識、酵素又はアクリジニウム基）又は検出可能
な標識のための結合性基部位（例えば、アビジン−ビオチン複合体を形成するで
あろうもの）を含んで成るものを使用して検出される。
本発明に係る抗−hK２抗体は、その自体、検出可能な標識又は検出可能な標識
のための結合性部位に化学的に結合することができる。例えば、これらの抗体は
ディテクター酵素（例えば、アルカリ性ホスファターゼ又は西洋ワサビ・ペルオ
キシダーゼ）に直接的に結
合され又は（例えば 125Ｉにより）ラジオアイソトープにより標識されることが
でき、又は例えばビオチン化を介して、検出可能な標識のための結合性部位によ
り間接的に標識されることができる。次に、ビオチニル化抗体は、アビジン−結
合酵素に結合するその能力により検出されることができる。この第二抗体がビオ
チン化される場合、アビジンに結合されたディテクター酵素がその後に添加され
るであろう。モノクローナル抗体又はアビジンに結合した酵素を検出するための
最終段階は、その酵素にとって適当な基質を添加して反応生成物の定量的な比色
検出を許容することである。（吸光度単位において読まれた）値は、洗剤−可溶
化hK２の標準抽出物が段階的な濃度において固定化された抗−hK２モノクローナ
ル抗体に添加される対照検定において作られた標準曲線を参照してhK２のｆモル
に変換されることができる。
上記材料を使用する他の検定形式においては、抗−PSA(hK３)抗体は、上記捕
獲抗体として使用され、そして（hK３を含む）テスト・サンプルからの各結合hK
２が、標識又は検出可能な標識のための結合性部位を含んで成る抗−hK２抗体と
上記２成分複合体を反応させて３成分複合体を形成させることにより、検出され
る。
あるいは、式（Ｉ）のペプチドは、検出可能な標識により、例えば１以上の放
射標識されたペプチジル残基であって、抗−hK２抗体への結合について内因性hK
２と競合させるために、すなわち、さまざまな競合的免疫検定形式を介して、生
理学的液体のサンプル中の抗−hK２抗体に結合させるための“捕獲抗原”として
、使用されることができるものを介して使用されることができる。例えば、本固
定化抗−hK２抗体を使用するhK-2のための競合的免疫検定形式は：
（ａ）固体表面に付着された一定量の抗−hK２抗体を用意し；
（ｂ）テストされるべき生理学的液体のサンプルと、検出可能な
標識を含んで成る既知量の式（Ｉ）のポリペプチドとを混合して混合サンプルを
作り；
（ｃ）免疫学的反応がその抗体とそのhK２との間で、そしてその抗体とその標
識されたポリペプチドとの間で生じることを許容するのに十分な時間にわたり上
記固体表面上の抗体と上記混合サンプルとを接触させ；
（ｄ）上記混合サンプルから上記固体表面を分離し；
（ｅ）上記固体表面上の抗体に結合するか又は上記混合サンプル中に残存する
かのいずれかの標識されたポリペプチドの存在又は量を検出又は測定し；そして
（ｆ）段階ｅ）における結果から、上記サンプル中の上記hK２の存在又は量を
測定する、
により行われる。
競合的阻害免疫検定によりサンプル中の内因性hK２を検出することができる他
の形式においては、既知量の抗−hK２抗体が未知量の内因性hK２を含むサンプル
に添加される。この既知量は、存在することが疑われるhK２の全てと複合体を形
成するのに必要な量、例えば、前立腺癌として知られている患者から得られた生
理学的液体の同一量のサンプル中に存在するであろうもの、未満であるように選
ばれる。次に、検出可能な標識を含んで成る、既知量の式（Ｉ）のポリペプチド
又はそのサブユニットが添加される。内因性hK２がサンプル中に存在する場合、
より少ない抗体が標識されたポリペプチドに結合させるために利用されることが
できるであろうし、そしてそれは溶液中で遊離状態で残存するであろう。内因性
hK２が全く存在しない場合、添加された標識ポリペプチドはその添加された抗−
hK２抗体と複合体を形成して２成分複合体を形成するであろう。次に、この２成
分抗体−抗原複合体は、抗−哺乳類 IgG抗体（ヒツジ
、ヤギ、マウス、等）により沈殿される。その沈殿物（３成分複合体）中の放射
能又は他の標識の量はそのサンプル中に存在する内因性hK２の量に反比例し、例
えば、減少量の放射能を含むペレットは内因性hK２の存在を示す。
２以上の抗−hK２抗血清を併合する免疫計測検定の使用は、増加された検出限
界とより良好な特異性の両方を作り出すはずである。このhK２分子の２つのユニ
ーク部分に対する抗血清が“サンドイッチ”検定において使用されるとき、この
関連化合物の交差反応性はひじょうに減少される。いくつかの抗血清がhK２を免
疫抽出するために同時に使用される場合、より大きなアフィニティーが、P.H.Eh
rlich et al.，J.Immunol.，(3) ，1906（1983）により記載されるように、可能
性のある共同的協力作用のために、得られることができる。さらに、特異的免疫
抽出抗体であってhK２にユニークに結合するものが使用される場合、hK２とhK３
の両方に結合するシグナル抗体が、得られた複合体を検出するために使用される
ことができるであろう。同一支持体の特異的抗−hK２と抗−hK３捕獲抗体及び共
通シグナル抗体を使用してhK３とhK２の両方を計測するであろう検定法が開発さ
れることもできる。逆に、共通抗体が上記捕獲方法において使用される場合、hK
３とhK２の両方の同時定量が、上記特異的抗−hK３も抗−hK２抗体に付着された
２つの異なるシグナル検出システムを使用して達成されることができるであろう
。
本発明に係る抗−hK２抗体とそのhK２サブユニット・ペプチドは多くの他の検
定形式、例えば競合的免疫検定、ビーズ凝集検定及びサンドイッチ−型免疫検定
、例えば ELISAにおいて、当業者に認識されるであろうように、使用されること
ができる。
本発明に係るhK２−特異的抗体は、前立腺組織又は液体から本質的に純粋な形
態でhK２それ自体を単離するために、又は組換え発現
系、例えばアフィニティー精製技術によるhK２のその後の生産において有用でも
ある。純粋なhK２自体は、先に討議したように生来のhK２を含む液体に添加され
るとき競合的免疫検定において標識され、そして使用されることができる。従っ
て、これらの検定は、生理学的サンプル中のhK２のレベルを検出し、そして定量
することができ、そしてhK２への商業的に入手可能な抗−hK３抗体の結合が、ど
の程度、それらの抗体がhK３に結合し、そしてそれによりhK３を正確に検出し、
そして定量する能力を妨害するか、を決定するために使用されることができる。
さらに、本抗−hK２抗体は、hK２タンパク質レベルが前立腺癌を検出し又は格付
けするために有用なマーカーであるかどうかを決定するために使用されることが
できる。モノクローナル抗体
実験室及び農場動物において抗体を調製するための慣用の技術とは別に、hK２
に対するモノクローナル抗体は公知のハイブリドーマ細胞培養技術を用いて調製
されることができる。一般的に、この方法は、例えば、ミエローマ細胞の適合性
連続系統と融合された一次脾臓細胞の、抗体−産生融合細胞系を調製し、そして
その使用されたミエローマ細胞系がそれから誘導され、そして適合性である動物
種内で又は塊培養のいずれかにおいてその融合細胞を増殖させることを含む。こ
のような抗体は、動物への接種により作られたものと比較して多くの利点を提供
する。なぜなら、それは高く特異性かつ感受性であり、そして比較的免疫化学的
に“純粋”であるからである。本抗体の免疫学的に活性な断片、例えば、部分的
にヒト化されたモノクローナル抗体であるような、そのｆ（ab）断片も、本発明
の範囲内にある。
本固定化抗体、標識抗体、並びに遊離及び標識hK２サブユニット・ポリペプチ
ド、便利にはキット形態で包装される。ここでは、２
以上の各種免疫試薬が、箱、封筒等その他であることができるそのキットの外装
内に所定量で別々に包装されるであろう。この包装は好ましくは、指示手段、例
えば本検定形式の実施においてユーザを指示する、印刷挿入物、ラベル、タグ、
カセット・テープその他を含んで成る。
例えば、hK２に対する抗体を検出し又は決定するための１のこのようなキット
は、別々に包装された：（ａ）固体表面、例えば繊維状テスト・ストリップ、多
−ウェル・マイクロタイター・プレート、試験管、又はビーズであって式（Ｉ）
のペプチドがそれに結合されているもの；及び（ｂ）標識された抗−ヒト免疫グ
ロブリンを含む包装を含んで成る。hK２を検出し又は測定するための診断キット
の第２態様は、別々に包装された：（ａ）式（Ｉ）のポリペプチドに対する抗体
がそれに結合されている固体表面；並びに（ｂ）検出可能な標識、又は検出可能
な標識についての結合部位を含んで成る、既知量の（ａ）hK２に特異的な抗体又
は（ｂ）hK３にも結合するhK２に対する抗体、を含む包装を含んで成る。hKを検
出するための診断キットの第３の態様は、包装された仲間において、別々に包装
された一定量の：（ａ）hK２−特異的抗体；（ｂ）式（Ｉ）の標識ポリペプチド
；及び（ｃ）抗−哺乳類免疫グロブリン、を含んで成ることができる。
本発明を、以下の詳細な実施例を参照することによりさらに説明する。
実施例１
ポリクローナル抗血清とモノクローナル抗体の顕出と精製
hK２の公開推定アミノ酸配列から出発して、一連のアミノ酸配列は hGK-1につ
いてユニークな抗体を生じさせるための可能性のある候補として同定された（図
１参照）。これらの配列の各々に対応す
るペプチドは９−フルオレニル・メトキシ・カルボニル（FMOC）戦略により合成
され、そして逆相HPLCにより精製された。これらのペプチドをその後配列決定し
てそれらの構造を確認した。
ペプチド(41−56及び 153−167)を、keyhole limpet hemocyanin（KLH）に結
合した。ヒツジ、マウス又はヤギを、完全 Freundsアジュバント(CFA) 中 100μ
ｇの結合ペプチドにより免疫感作し（１匹のヒツジ各々に皮下で、41−56及び 1
53−167 のペプチド、１匹のヤギ各々に皮下で、８−26，15−26，43−66， 153
−167 及び 210−235 のペプチド、そして４匹のマウス各々の皮下で、８−26，
15−26，41−56，43−66， 153−167 及び 210−235 のペプチド）、そして不完
全 Freundsアジュバント(IFA) 中 100μｇのペプチドにより３週間の間隔をあけ
てブーストした。その後、５匹のヤギと24匹のBalb／ｃマウスをこれらのペプチ
ドで免疫感作した。 KLH結合ペプチド(100μｇ)、プラス遊離ペプチド(100μｇ)
の組合せをこの第２免疫感作プログラムのために使用した。
最初のこれらの免疫感作の後、これらの動物の血液を各免疫感作の６〜10日後
に抗体についてテストした。ペプチドを４℃で一夜pH 9.6の炭酸塩バッファー中
ビーズ当り（ウシ血清アルブミン(BSA)に結合された）１μｇのペプチドをイン
キュベートすることにより、0.25インチのポリスチレン・ビーズ（Clifton，Cli
fton Heights，PA）上に固定化した。次に、これらのビーズを、 0.1％ tween 2
0 を含む0.01Ｍリン酸塩バッファー生理食塩水(PBS)、pH 7.4で３回洗浄し、そ
して１％スキム・ミルク・プラス１％ BSAによりブロックした。これらのビーズ
を18時間、４℃において、 250μＬの１：100 、１：1000及び１：10,000希釈の
上記動物血清とインキュベートした。３回洗浄した後、 250μＬのウサギ抗ヒツ
ジ、抗−マウス又は抗−ヤギ抗体であって西洋ワサビ・ペルオキシダーゼに結合
されたもの（Cappel-Organon Teknica Corporation，Durham，NC）を、150rpmに
おいて水平インキュベーター上で３時間各ビーズとインキュベートした。この酵
素シグナルを基質としてオルト−フェニレン・ジアミンを使用して分光測定によ
り定量した。非−免疫血清をネガティブ・コントロールとして使用し、そして免
疫血清計測をこの対照の読み倍数として表した。
正血清力価をもつマウスの脾臓からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハ
イブリドーマ細胞を作り出した。これらの細胞のクローンにより産生された抗体
を上記のようにスクリーンした。ポジティブ・クローンを限界希釈により継代培
養し、そして再スクリーニングした。モノクローナル・ハイブリドーマを、新鮮
感作マウス（pristine primed mice）の腹腔内に注射して腹水を得た。
ポリクローナル（ヒツジ及びヤギ）及びモノクローナル抗血清の両方を免疫検
定においてそれらを使用する前に精製した。両タイプの抗血清を最初に飽和硫酸
アンモニウムによる沈殿及びウルトラゲルACA-34カラムを使用したサイズ・クロ
マトグラフィーにより、 IgG分離に供した。このポリクローナル抗血清を、Seph
arose 4Bへのこれらのペプチドの臭化シアン化物カップリングにより作られたカ
ラムを使用してさらにアフィニティー精製した。
この精製抗体を酸性PBS(pH2.45)により上記カラムから溶出した。
表IIは、免疫前レベルの少なくとも２倍のシグナルを与えた抗血清及びモノク
ローナル抗体について顕出されたデータをまとめたものである。最高開始抗血清
はhK２（41−56）ペプチドによりヒツジにおいて作られた。この抗血清は最も広
く評価された。他の抗血清の中では、hK２(210−235)に対するものが最も高い免
疫反応性をもつ。
図２は、hK２及びhK３(“PSA”)特異的ペプチドに対する抗−hK２のドット・
ブロット分析を示す。hK3 14−27とhK3 41−56と hK3 153−167 は、hK３ポリペ
プチドから誘導され、そしてhK２タンパク質の類似の領域と相同である。これら
のペプチドを H2O中に溶離し、そして図示した濃度においてニトロセルロース膜
上にブロットした。ヘモシアニンと結合されたhK2 41−56ペプチドにより注射さ
れたヒツジから得られた抗血清を、その特異性と力価についてテストした。ニト
ロセルロース膜上のペプチドと一次抗体との反応を、抗−ヒツジ IgG抗体と結合
したアルカリ性ホスファターゼにより検出した。これらのデータは、この抗−hK
２抗血清がhK３との低い交差反応性をもつことを立証する。
実施例２
競合的免疫検定
アクリジニウムＮ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル（London Diagnosti
cs，Eden Prairie，MN）を、 BSA−ペプチド結合体のリシン残基のアミノ基に付
着させた。このカップリング反応を20ｇ／Ｌのリシン１塩酸を用いてクエンチし
た。未反応AEを Sephadex G-25カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィー
その後の透析により除去した。 BSA−ペプチド結合体を等重量の EIAグレードの
BSAとペプチドを使用してEDC (Pierce，Rockford，IL)と結合した。
力価曲線を、AE−標識−BSA−ペプチド結合体と、精製ヒツジ抗−hK２（41−5
6）抗体の各希釈物を、インキュベートすることにより最初に作った。このイン
キュベーション期間は20℃において15時間であった。この結合抗体−標識複合体
をロバ抗−ヒツジ抗血清により沈殿させ、そして単離沈殿物中のシグナルを化学
発光を使用して定量した。
図３は、対照（△）として非−免疫ヒツジ血清を使用したアフィニティー精製
ヒツジhGK-1(41−56)抗体（○）の力価曲線を示す。１：7000の抗体希釈におい
て、この抗体へのAE−標識ペプチドの結合は、おおよそ最大の半分である。
検定を次に、非標識ペプチドに対する、対応のアクリジウム−エステル−（AE
）標識ペプチドへのヒツジ抗血清の競合的結合に基づいて開発した。非標識ペプ
チドによる置換に加えて、競合曲線を、精液から免疫抽出された前立腺特異的抗
原（hK３）とhK２−型物質の両方による、固定量のヒツジ抗−hK２（41−56）か
らのhK２（41−56）AE−ペプチド−BSA 結合体の置換について確立した。標識hK
２（41−56）及びその競合抗原と抗体を併合した後に形成する複合
体は沈殿し、そしてその沈殿物中の標識の量は、標識hK２（41−56）を置換する
テスト抗原の能力が増加するときに、減少する。精液抽出物は、 AminolinkTMカ
ラム（Pierce，Rockford，IL）への精製ヒツジ抗−hK２（41−56）のカップリン
グにより行われる免疫アフィニティー・カラムを使用して得られた。この免疫反
応性物質を、 0.1ＭグリシンpH 2.8を用いて上記カラムから溶出し、そして１Ｍ
Tris，pH 10で中和した。
hK２（41−56）について図４中に示すような競合的置換曲線は、上記ペプチド
の少量が上記標識を置換することができることを立証する。20％置換（80％Ｂ／
BO）に基づけば、この競合検定の最小検出限界は、約0.03ng／hK２（41−56）１
管である。この対応hK３（41−56）ペプチドの交差反応性は 0.1％未満である（
△）。
また、図４は、精液から免疫抽出された物質（＊）がヒツジ抗−hK２血清に結
合したhK２（41−56）標識を置換することができることを立証する。これは、こ
の物質が免疫反応性であることを立証する。中空丸（○）は、精製hK３(Scripps
Laboratories，San Diego，CA)による置換が最小であることを示す。この免疫
抽出物質は、非精製形態においてさえ、精製hK３（△）よりも反応性であるが、
重量基準においてはhK２ペプチド（□）と同程度に反応性ではない。しかしなが
ら、このhK２ペプチドは、たった16のアミノ酸から成り、一方、hK２とhK３は 2
37アミノ酸ポリペプチドである。それ故、重量基準においては、ある者は、その
ペプチドが約15倍高く反応性であると予想するであろう。対応のhK３サブユニッ
ト・ポリペプチド（41−56）は実質的にAE−hK２（41−56）標識（△）を置換す
ることができず（交差反応性約１％）、一方、hK２（41−56）それ自体もhK２（
41−56）標識（□）の置換において有効であった。それ故、精液からの免疫反応
性物質は、hK３とは異なり、そしてたぶ
んhK２である。
これらのデータは、抗−hK２ペプチド抗体の産生におけるhK2 cDNAから誘導さ
れた推定配列に基づく合成hK２ペプチドの使用について立証する。これらの抗体
は、hK２ペプチドに対して特異的であり、そしてhK３内の相同領域からのペプチ
ドを認識しない。ペプチド・アフィニティー・カラムを、hK３(PSA) ではなかっ
たヒト精液血漿中の成分を認識する抗体を精製するために使用した。それ故、本
発明は、ヒト血液血清及び他の液中のhK２についての検定に有用であるはずであ
るヒト精液血漿中のhK２についての検定法を提供する。
全ての刊行物、特許及び特許書類を、あたかも個々に引用により取り込むよう
に、本明細書中に引用により取り込む。本発明を、さまざまな特定の及び好まし
い実施例及び技術を参照しながら記載してきた。しかしながら、多くの変更及び
修正が本発明の本質及び範囲内に残りながら行われることができると解されるべ
きである。
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フロントページの続き
(72)発明者 ヤング，チャールズ ワイ．エフ.
アメリカ合衆国，ミネソタ 55901，ロチ
ェスター，ノースウエスト，セント メア
リー ドライブ 5100
(72)発明者 クリー，ジョージ ジー.
アメリカ合衆国，ミネソタ 55902，ロチ
ェスター，サウスウエスト，イレブンス
アベニュ 5949