JPH111477A - １，４−ベンゾジアゼピン誘導体及びその用途 - Google Patents
１，４−ベンゾジアゼピン誘導体及びその用途Info
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- JPH111477A JPH111477A JP17098397A JP17098397A JPH111477A JP H111477 A JPH111477 A JP H111477A JP 17098397 A JP17098397 A JP 17098397A JP 17098397 A JP17098397 A JP 17098397A JP H111477 A JPH111477 A JP H111477A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】トロンボポエチンレセプターに優れた親和性を
有し、血小板産生調節作用を持つ薬剤を提供する。 【解決手段】次の一般式 【化１】 （式中、Ｒはフェニル基又はインドリル基を表し、ｎは
２〜６の整数を表す。）で示される１，４−ベンゾジア
ゼピン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩は、トロ
ンボポエチンレセプターに優れた親和性を有し、血小板
産生調節作用を持つ薬剤として極めて有用である。
有し、血小板産生調節作用を持つ薬剤を提供する。 【解決手段】次の一般式 【化１】 （式中、Ｒはフェニル基又はインドリル基を表し、ｎは
２〜６の整数を表す。）で示される１，４−ベンゾジア
ゼピン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩は、トロ
ンボポエチンレセプターに優れた親和性を有し、血小板
産生調節作用を持つ薬剤として極めて有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、巨核球造血，血小
板産生に深く関わるトロンボポエチンレセプターに親和
性を有し、血小板産生調節作用を持つ新規な１, ４−ベ
ンゾジアゼピン誘導体又はその薬理学的に許容しうる
塩、及びその用途に関するものである。
板産生に深く関わるトロンボポエチンレセプターに親和
性を有し、血小板産生調節作用を持つ新規な１, ４−ベ
ンゾジアゼピン誘導体又はその薬理学的に許容しうる
塩、及びその用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】血小板は生体の止血，血栓形成において
主要な役割を果たす血液有形成分である。血小板は骨髄
幹細胞から巨核球前駆細胞より骨髄で分化，成熟して生
じた巨核球より血中に放出され、その寿命は約10日であ
り、その数は長期にわたって一定の値を保つことが知ら
れていた。この巨核球造血の過程の主要な因子であるト
ロンボポエチンの遺伝子が最近クローニングされた〔ネ
イチャー(Nature), 369巻, 533 頁（1994年）〕。トロ
ンボポエチンはc-mpl がコードしているタンパク質（ト
ロンボポエチンレセプター： MPL）のリガンドであり、
巨核球前駆細胞から巨核球細胞の増殖と分化成熟を刺激
し、さらに血小板産生を増加させることも判明した〔ネ
イチャー, 369 巻, 568 頁（1994年）〕。
主要な役割を果たす血液有形成分である。血小板は骨髄
幹細胞から巨核球前駆細胞より骨髄で分化，成熟して生
じた巨核球より血中に放出され、その寿命は約10日であ
り、その数は長期にわたって一定の値を保つことが知ら
れていた。この巨核球造血の過程の主要な因子であるト
ロンボポエチンの遺伝子が最近クローニングされた〔ネ
イチャー(Nature), 369巻, 533 頁（1994年）〕。トロ
ンボポエチンはc-mpl がコードしているタンパク質（ト
ロンボポエチンレセプター： MPL）のリガンドであり、
巨核球前駆細胞から巨核球細胞の増殖と分化成熟を刺激
し、さらに血小板産生を増加させることも判明した〔ネ
イチャー, 369 巻, 568 頁（1994年）〕。
【０００３】トロンボポエチンレセプターを介して血小
板産生を調節する生理活性物質としては、トロンボポエ
チンそのものの他、低分子ペプチドなどにもトロンボポ
エチンレセプター親和性があることが知られてきている
（ＷＯ９６／４０１８９号、ＷＯ９６／４０７５０号明
細書）。
板産生を調節する生理活性物質としては、トロンボポエ
チンそのものの他、低分子ペプチドなどにもトロンボポ
エチンレセプター親和性があることが知られてきている
（ＷＯ９６／４０１８９号、ＷＯ９６／４０７５０号明
細書）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】トロンボポエチンや上
記低分子ペプチドなどの生理活性物質は、トロンボポエ
チンレセプターを介して血小板産生を調節し、血小板数
の異常を伴う種々の血液疾患の病態に対して優れた薬剤
として期待されている。しかしながら、トロンボポエチ
ンは３３２個のアミノ酸からなるポリペプチドサイトカ
インであり、薬剤として用いる場合、消化管内で分解さ
れると予測され、注射剤としては利用できるが、経口投
与製剤としては実用的ではないと考えられる。また、ト
ロンボポエチンレセプターに親和性を有する低分子ペプ
チドも、経口投与の可能性が未知数であることなどか
ら、優れたトロンボポエチンレセプター親和性を有し経
口投与可能な、低分子非ペプチド化合物の開発が望まれ
ている。
記低分子ペプチドなどの生理活性物質は、トロンボポエ
チンレセプターを介して血小板産生を調節し、血小板数
の異常を伴う種々の血液疾患の病態に対して優れた薬剤
として期待されている。しかしながら、トロンボポエチ
ンは３３２個のアミノ酸からなるポリペプチドサイトカ
インであり、薬剤として用いる場合、消化管内で分解さ
れると予測され、注射剤としては利用できるが、経口投
与製剤としては実用的ではないと考えられる。また、ト
ロンボポエチンレセプターに親和性を有する低分子ペプ
チドも、経口投与の可能性が未知数であることなどか
ら、優れたトロンボポエチンレセプター親和性を有し経
口投与可能な、低分子非ペプチド化合物の開発が望まれ
ている。
【０００５】本発明の課題は、優れたトロンボポエチン
レセプター親和性を有し、且つ経口投与可能な低分子非
ペプチド化合物を見いだし、血小板数の異常を伴う種々
の病態に対し優れた効果が期待できる治療薬を提供する
ことにある。
レセプター親和性を有し、且つ経口投与可能な低分子非
ペプチド化合物を見いだし、血小板数の異常を伴う種々
の病態に対し優れた効果が期待できる治療薬を提供する
ことにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明に係る１,
４−ベンゾジアゼピン誘導体又はその薬理学的に許容し
うる塩が、優れたトロンボポエチンレセプター親和性を
有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明に係る１,
４−ベンゾジアゼピン誘導体又はその薬理学的に許容し
うる塩が、優れたトロンボポエチンレセプター親和性を
有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】即ち、本発明は次の一般式（Ｉ）
【化２】 （式中、Ｒはフェニル基又はインドリル基を表し、ｎは
２〜６の整数を表す。）で示される新規な１, ４−ベン
ゾジアゼピン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩、
及びその用途を提供するものである。
２〜６の整数を表す。）で示される新規な１, ４−ベン
ゾジアゼピン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩、
及びその用途を提供するものである。
【０００８】本発明の前記一般式（Ｉ）で示される化合
物と類似構造を有する１, ４−ベンゾジアゼピン誘導体
は、特開昭６１−６３６６６号, 特開昭６３−２３８０
６９号及びジャーナル・オブ・メディシナル・ケミスト
リー(Journal of MedicinalChemistry), ３０巻, １２
２９頁（１９８７年）等においては、ＣＣＫ拮抗剤とし
て開示され、またＷＯ９５／１４４７０号ではカリウム
イオン遮断による不整脈治療剤として開示されてはいる
が、これら文献には本発明に係るトロンボポエチンレセ
プター親和性については全く触れられていない。
物と類似構造を有する１, ４−ベンゾジアゼピン誘導体
は、特開昭６１−６３６６６号, 特開昭６３−２３８０
６９号及びジャーナル・オブ・メディシナル・ケミスト
リー(Journal of MedicinalChemistry), ３０巻, １２
２９頁（１９８７年）等においては、ＣＣＫ拮抗剤とし
て開示され、またＷＯ９５／１４４７０号ではカリウム
イオン遮断による不整脈治療剤として開示されてはいる
が、これら文献には本発明に係るトロンボポエチンレセ
プター親和性については全く触れられていない。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の前記一般式（Ｉ）におい
て、Ｒで示されるフェニル基又はインドリル基は、適宜
置換していてもよく、又（CH2)n で示されるアルキレン
鎖としては、例えば、エチレン，プロピレン，ブチレ
ン，ペンチレン，ヘキシレン鎖が挙げられる。また、本
発明の前記一般式（Ｉ）で示される化合物には、不斉に
基づく異性体が存在し得るが、本発明にはこれらの異性
体及びその混合物も包含される。
て、Ｒで示されるフェニル基又はインドリル基は、適宜
置換していてもよく、又（CH2)n で示されるアルキレン
鎖としては、例えば、エチレン，プロピレン，ブチレ
ン，ペンチレン，ヘキシレン鎖が挙げられる。また、本
発明の前記一般式（Ｉ）で示される化合物には、不斉に
基づく異性体が存在し得るが、本発明にはこれらの異性
体及びその混合物も包含される。
【００１０】本発明の前記一般式（Ｉ）で示される化合
物は、所望に応じて薬理学的に許容しうる塩に変換する
ことも、又は生成した塩から遊離塩基に変換することも
できる。本発明の薬理学的に許容しうる塩としては、例
えば、塩酸，臭化水素酸，ヨウ化水素酸，硫酸，硝酸，
燐酸等の鉱酸塩、あるいは、酢酸，マレイン酸，フマル
酸，クエン酸，シュウ酸，コハク酸，酒石酸，リンゴ
酸，マンデル酸，メタンスルホン酸，p-トルエンスルホ
ン酸，10- カンファースルホン酸等の有機酸塩等が挙げ
られる。
物は、所望に応じて薬理学的に許容しうる塩に変換する
ことも、又は生成した塩から遊離塩基に変換することも
できる。本発明の薬理学的に許容しうる塩としては、例
えば、塩酸，臭化水素酸，ヨウ化水素酸，硫酸，硝酸，
燐酸等の鉱酸塩、あるいは、酢酸，マレイン酸，フマル
酸，クエン酸，シュウ酸，コハク酸，酒石酸，リンゴ
酸，マンデル酸，メタンスルホン酸，p-トルエンスルホ
ン酸，10- カンファースルホン酸等の有機酸塩等が挙げ
られる。
【００１１】本発明の１，４−ベンゾジアゼピン誘導体
の好ましい態様としては、以下の化合物及びそれらの薬
理学的に許容しうる塩を挙げることができるが、本発明
はこれらの例に限定されるものではない。 (1) （±）−１−（２−アミノエチル）−１，３−ジ
ヒドロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２Ｈ
−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン (2) （±）−１−（３−アミノプロピル）−１，３−
ジヒドロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２
Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン (3) （±）−１−（４−アミノブチル）−１，３−ジ
ヒドロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２Ｈ
−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン (4) （±）−１−（５−アミノペンチル）−１，３−
ジヒドロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２
Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン (5) （±）−１−（６−アミノヘキシル）−１，３−
ジヒドロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２
Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン (6) （±）−１−（２−アミノエチル）−１，３−ジ
ヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−
５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−
オン (7) （±）−１−（３−アミノプロピル）−１，３−
ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）
−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２
−オン (8) （±）−１−（４−アミノブチル）−１，３−ジ
ヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−
５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−
オン (9) （±）−１−（５−アミノペンチル）−１，３−
ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）
−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２
−オン (10) （±）−１−（６−アミノヘキシル）−１，３−
ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）
−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２
−オン
の好ましい態様としては、以下の化合物及びそれらの薬
理学的に許容しうる塩を挙げることができるが、本発明
はこれらの例に限定されるものではない。 (1) （±）−１−（２−アミノエチル）−１，３−ジ
ヒドロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２Ｈ
−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン (2) （±）−１−（３−アミノプロピル）−１，３−
ジヒドロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２
Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン (3) （±）−１−（４−アミノブチル）−１，３−ジ
ヒドロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２Ｈ
−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン (4) （±）−１−（５−アミノペンチル）−１，３−
ジヒドロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２
Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン (5) （±）−１−（６−アミノヘキシル）−１，３−
ジヒドロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２
Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン (6) （±）−１−（２−アミノエチル）−１，３−ジ
ヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−
５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−
オン (7) （±）−１−（３−アミノプロピル）−１，３−
ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）
−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２
−オン (8) （±）−１−（４−アミノブチル）−１，３−ジ
ヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−
５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−
オン (9) （±）−１−（５−アミノペンチル）−１，３−
ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）
−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２
−オン (10) （±）−１−（６−アミノヘキシル）−１，３−
ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）
−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２
−オン
【００１２】本発明の前記一般式（Ｉ）で示される化合
物は、以下の方法により製造することができるが、当該
化合物の製造方法は、この方法に限定されるわけではな
い。
物は、以下の方法により製造することができるが、当該
化合物の製造方法は、この方法に限定されるわけではな
い。
【００１３】
【化３】 （式中、Ｒ及びｎは前述と同意義を表す。）
【００１４】即ち、工程１においては、特開昭６１−６
３６６６号, 特開昭６３−２３８０６９号及びジャーナ
ル・オブ・メディシナル・ケミストリー, ３０巻, １２
２９頁（１９８７年）等に開示されている一般式(II)の
化合物と、次の一般式(IV)
３６６６号, 特開昭６３−２３８０６９号及びジャーナ
ル・オブ・メディシナル・ケミストリー, ３０巻, １２
２９頁（１９８７年）等に開示されている一般式(II)の
化合物と、次の一般式(IV)
【化４】 （Ｚは塩素原子等のハロゲン原子又はメシルオキシ基等
の脱離基を表し、ｎは前述と同意義を表す。）で示され
る化合物とを、 N,N-ジメチルホルムアミド, テトラヒド
ロフラン等の不活性溶媒中、水素化ナトリウム，リチウ
ムジイソプロピルアミド等の塩基の存在下で、０℃から
溶媒の還流温度までの範囲で反応させることにより、一
般式(III) の化合物を得ることができる。
の脱離基を表し、ｎは前述と同意義を表す。）で示され
る化合物とを、 N,N-ジメチルホルムアミド, テトラヒド
ロフラン等の不活性溶媒中、水素化ナトリウム，リチウ
ムジイソプロピルアミド等の塩基の存在下で、０℃から
溶媒の還流温度までの範囲で反応させることにより、一
般式(III) の化合物を得ることができる。
【００１５】工程２においては、一般式(III) の化合物
をエタノール等の極性溶媒中、抱水ヒドラジン又はメチ
ルアミンと反応させることにより、本発明に係る前記一
般式（Ｉ）の化合物を得ることができる。
をエタノール等の極性溶媒中、抱水ヒドラジン又はメチ
ルアミンと反応させることにより、本発明に係る前記一
般式（Ｉ）の化合物を得ることができる。
【００１６】このようにして製造される前記一般式
（Ｉ）で示される新規な１, ４−ベンゾジアゼピン誘導
体又はその薬理学的に許容しうる塩の少なくとも１つを
有効成分として含有する医薬は、通常、カプセル剤，錠
剤，細粒剤，顆粒剤，散剤，シロップ剤などの経口投与
剤、あるいは注射剤として投与される。これらの製剤
は、薬理学的、製剤学的に許容しうる添加剤を加え、常
法により製造することができる。即ち経口剤にあって
は、賦形剤（乳糖，D-マンニトール，トウモロコシデン
プン，結晶セルロース等）、崩壊剤（カルボキシメチル
セルロース，カルボキシメチルセルロースカルシウム
等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース，ポリビニルピロリドン
等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム，タルク
等）、コーティング剤（ヒドロキシプロピルメチルセル
ロース，白糖，酸化チタン等）、可塑剤（ポリエチレン
グリコール等）等の製剤用成分が、注射剤にあっては水
性あるいは用時溶解型剤型を構成しうる溶解剤ないし溶
解補助剤（注射用蒸留水，生理食塩水，プロピレングリ
コール等）、pH調節剤（無機又は有機の酸あるいは塩
基）、 等張化剤（食塩，ブドウ糖，グリセリン等）、 安
定化剤等の製剤成分が使用される。
（Ｉ）で示される新規な１, ４−ベンゾジアゼピン誘導
体又はその薬理学的に許容しうる塩の少なくとも１つを
有効成分として含有する医薬は、通常、カプセル剤，錠
剤，細粒剤，顆粒剤，散剤，シロップ剤などの経口投与
剤、あるいは注射剤として投与される。これらの製剤
は、薬理学的、製剤学的に許容しうる添加剤を加え、常
法により製造することができる。即ち経口剤にあって
は、賦形剤（乳糖，D-マンニトール，トウモロコシデン
プン，結晶セルロース等）、崩壊剤（カルボキシメチル
セルロース，カルボキシメチルセルロースカルシウム
等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース，ポリビニルピロリドン
等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム，タルク
等）、コーティング剤（ヒドロキシプロピルメチルセル
ロース，白糖，酸化チタン等）、可塑剤（ポリエチレン
グリコール等）等の製剤用成分が、注射剤にあっては水
性あるいは用時溶解型剤型を構成しうる溶解剤ないし溶
解補助剤（注射用蒸留水，生理食塩水，プロピレングリ
コール等）、pH調節剤（無機又は有機の酸あるいは塩
基）、 等張化剤（食塩，ブドウ糖，グリセリン等）、 安
定化剤等の製剤成分が使用される。
【００１７】
【実施例】以下、本発明を例によって説明するが、本発
明はこれらの例の特定の細部に限定されるものではな
い。
明はこれらの例の特定の細部に限定されるものではな
い。
【００１８】例１ （±）−Ｎ−〔２−〔２，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕エ
チル〕フタルイミド （±）−１，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−
３−イルメチル）−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベン
ゾジアゼピン−２−オン３．００ｇ，６０％水素化ナト
リウム０．３４ｇ及びN,N-ジメチルホルムアミド６０ml
の混合物を氷冷下１．５時間攪拌後、Ｎ−（２−ブロモ
エチル）フタルイミド４．６０ｇを加え、室温で１６時
間攪拌した。反応混合物に水２００mlを加えた後、吸引
濾過しガム状固体を得た。ガム状固体を酢酸エチルに溶
かし、水，飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥
後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフ
ィー（シリカゲル，ジクロロメタン→ジクロロメタン：
メタノール＝２０：１）により精製し、微黄色結晶０．
９４ｇを得た。この結晶の一部をジクロロメタン：酢酸
エチル（３：１）の混合溶媒より再結晶して、融点２２
４．５〜２２８．５℃の微黄色結晶を得た。 元素分析値 Ｃ34Ｈ26Ｎ4 Ｏ3 理論値 Ｃ, 75.82; Ｈ, 4.87; Ｎ, 10.40 実験値 Ｃ, 75.72; Ｈ, 4.90; Ｎ, 10.36
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕エ
チル〕フタルイミド （±）−１，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−
３−イルメチル）−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベン
ゾジアゼピン−２−オン３．００ｇ，６０％水素化ナト
リウム０．３４ｇ及びN,N-ジメチルホルムアミド６０ml
の混合物を氷冷下１．５時間攪拌後、Ｎ−（２−ブロモ
エチル）フタルイミド４．６０ｇを加え、室温で１６時
間攪拌した。反応混合物に水２００mlを加えた後、吸引
濾過しガム状固体を得た。ガム状固体を酢酸エチルに溶
かし、水，飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥
後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフ
ィー（シリカゲル，ジクロロメタン→ジクロロメタン：
メタノール＝２０：１）により精製し、微黄色結晶０．
９４ｇを得た。この結晶の一部をジクロロメタン：酢酸
エチル（３：１）の混合溶媒より再結晶して、融点２２
４．５〜２２８．５℃の微黄色結晶を得た。 元素分析値 Ｃ34Ｈ26Ｎ4 Ｏ3 理論値 Ｃ, 75.82; Ｈ, 4.87; Ｎ, 10.40 実験値 Ｃ, 75.72; Ｈ, 4.90; Ｎ, 10.36
【００１９】例２ （±）−Ｎ−〔３−〔２，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕プ
ロピル〕フタルイミド （±）−１，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−
３−イルメチル）−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベン
ゾジアゼピン−２−オン３．００ｇ，６０％水素化ナト
リウム０．３４ｇ及びN,N-ジメチルホルムアミド６０ml
の混合物を氷冷下１．５時間攪拌後、Ｎ−（３−ブロモ
プロピル）フタルイミド４．５０ｇを加え、室温で１６
時間攪拌した。反応混合物に水２００mlを加えた後、吸
引濾過しガム状固体を得た。ガム状固体を酢酸エチルに
溶かし、水，飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾
燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラ
フィー（シリカゲル，ジクロロメタン：メタノール＝２
０：１）により精製し、微黄色結晶３．３６ｇを得た。
この結晶の一部をジクロロメタン：酢酸エチル（２：
１）の混合溶媒より再結晶して、融点２１３〜２１６℃
の微黄色結晶を得た。 元素分析値 Ｃ35Ｈ28Ｎ4 Ｏ3 理論値 Ｃ, 76.07; Ｈ, 5.11; Ｎ, 10.14 実験値 Ｃ, 75.85; Ｈ, 4.88; Ｎ, 10.12
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕プ
ロピル〕フタルイミド （±）−１，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−
３−イルメチル）−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベン
ゾジアゼピン−２−オン３．００ｇ，６０％水素化ナト
リウム０．３４ｇ及びN,N-ジメチルホルムアミド６０ml
の混合物を氷冷下１．５時間攪拌後、Ｎ−（３−ブロモ
プロピル）フタルイミド４．５０ｇを加え、室温で１６
時間攪拌した。反応混合物に水２００mlを加えた後、吸
引濾過しガム状固体を得た。ガム状固体を酢酸エチルに
溶かし、水，飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾
燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラ
フィー（シリカゲル，ジクロロメタン：メタノール＝２
０：１）により精製し、微黄色結晶３．３６ｇを得た。
この結晶の一部をジクロロメタン：酢酸エチル（２：
１）の混合溶媒より再結晶して、融点２１３〜２１６℃
の微黄色結晶を得た。 元素分析値 Ｃ35Ｈ28Ｎ4 Ｏ3 理論値 Ｃ, 76.07; Ｈ, 5.11; Ｎ, 10.14 実験値 Ｃ, 75.85; Ｈ, 4.88; Ｎ, 10.12
【００２０】例３ （±）−Ｎ−〔４−〔２，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕ブ
チル〕フタルイミド （±）−１，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−
３−イルメチル）−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベン
ゾジアゼピン−２−オン１．５０ｇ，６０％水素化ナト
リウム０．１７ｇ及びN,N-ジメチルホルムアミド３０ml
の混合物を氷冷下１時間攪拌後、Ｎ−（４−ブロモブチ
ル）フタルイミド２．４８ｇを加え、室温で１６時間攪
拌した。反応混合物に水１００mlを加えた後、吸引濾過
しガム状固体を得た。ガム状固体を酢酸エチルに溶か
し、水，飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥
後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフ
ィー（シリカゲル，ジクロロメタン：メタノール＝５
０：１）により精製し、黄色無晶形固体２．１３ｇを得
た。 元素分析値 Ｃ36Ｈ30Ｎ4 Ｏ3 理論値 Ｃ, 76.31; Ｈ, 5.34; Ｎ, 9.89 実験値 Ｃ, 76.18; Ｈ, 5.16; Ｎ, 9.85
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕ブ
チル〕フタルイミド （±）−１，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−インドール−
３−イルメチル）−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベン
ゾジアゼピン−２−オン１．５０ｇ，６０％水素化ナト
リウム０．１７ｇ及びN,N-ジメチルホルムアミド３０ml
の混合物を氷冷下１時間攪拌後、Ｎ−（４−ブロモブチ
ル）フタルイミド２．４８ｇを加え、室温で１６時間攪
拌した。反応混合物に水１００mlを加えた後、吸引濾過
しガム状固体を得た。ガム状固体を酢酸エチルに溶か
し、水，飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥
後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフ
ィー（シリカゲル，ジクロロメタン：メタノール＝５
０：１）により精製し、黄色無晶形固体２．１３ｇを得
た。 元素分析値 Ｃ36Ｈ30Ｎ4 Ｏ3 理論値 Ｃ, 76.31; Ｈ, 5.34; Ｎ, 9.89 実験値 Ｃ, 76.18; Ｈ, 5.16; Ｎ, 9.85
【００２１】例４ （±）−Ｎ−〔３−〔２，３−ジヒドロ−２−オキソ−
５−フェニル−３−（フェニルメチル）−１Ｈ−１，４
−ベンゾジアゼピン−１−イル〕プロピル〕フタルイミ
ド （±）−１，３−ジヒドロ−５−フェニル−３−（フェ
ニルメチル）−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−
オン３．００ｇ，６０％水素化ナトリウム０．４０ｇ及
びN,N-ジメチルホルムアミド５０mlの混合物を氷冷下１
時間攪拌後、Ｎ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド
５．００ｇを加え、室温で２時間攪拌した。反応混合物
に水２００mlを加えた後、吸引濾過しガム状固体を得
た。ガム状固体を酢酸エチルに溶かし、水，飽和食塩水
で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し
た。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ヘ
キサン：酢酸エチル＝２：１）により精製し、無色無晶
形固体４．４０ｇを得た。 元素分析値 Ｃ33Ｈ27Ｎ3 Ｏ3 理論値 Ｃ, 77.17; Ｈ, 5.30; Ｎ, 8.18 実験値 Ｃ, 76.89; Ｈ, 5.63; Ｎ, 8.05
５−フェニル−３−（フェニルメチル）−１Ｈ−１，４
−ベンゾジアゼピン−１−イル〕プロピル〕フタルイミ
ド （±）−１，３−ジヒドロ−５−フェニル−３−（フェ
ニルメチル）−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−
オン３．００ｇ，６０％水素化ナトリウム０．４０ｇ及
びN,N-ジメチルホルムアミド５０mlの混合物を氷冷下１
時間攪拌後、Ｎ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド
５．００ｇを加え、室温で２時間攪拌した。反応混合物
に水２００mlを加えた後、吸引濾過しガム状固体を得
た。ガム状固体を酢酸エチルに溶かし、水，飽和食塩水
で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し
た。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ヘ
キサン：酢酸エチル＝２：１）により精製し、無色無晶
形固体４．４０ｇを得た。 元素分析値 Ｃ33Ｈ27Ｎ3 Ｏ3 理論値 Ｃ, 77.17; Ｈ, 5.30; Ｎ, 8.18 実験値 Ｃ, 76.89; Ｈ, 5.63; Ｎ, 8.05
【００２２】例５ （±）−１−（２−アミノエチル）−１，３−ジヒドロ
−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−５−フ
ェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン （±）−Ｎ−〔２−〔２，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕エ
チル〕フタルイミド１．０２ｇ，抱水ヒドラジン０．１
０ml及びエタノールの混合物を１０時間加熱還流した。
放冷後、５％水酸化ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチ
ルで抽出した。有機層を水，飽和食塩水で洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラ
ムクロマトグラフィー（シリカゲル，ジクロロメタン：
メタノール＝９：１）により精製し、黄橙色無晶形固体
０．１５ｇを得た。 ＩＲスペクトル ν (KBr) cm -1 ： 3344 , 1676
, 1604 ＮＭＲスペクトル δ (CDCl3) ppm ： 2.49(2H,s),2.
79(1H,q,J=6.5Hz),2.89(1H,q,J=6.5Hz),3.65(1H,dd,J=1
3,6Hz),3.77-3.85(3H,m),4.39(1H,td,J=13,6.5Hz),7.03
-7.63(14H,m),8.23(1H,s) 高分解能マススペクトル：Ｃ26Ｈ24Ｎ4 Ｏ 理論値 m/z : 408.1950 実験値 m/z : 408.1946
−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−５−フ
ェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン （±）−Ｎ−〔２−〔２，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕エ
チル〕フタルイミド１．０２ｇ，抱水ヒドラジン０．１
０ml及びエタノールの混合物を１０時間加熱還流した。
放冷後、５％水酸化ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチ
ルで抽出した。有機層を水，飽和食塩水で洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラ
ムクロマトグラフィー（シリカゲル，ジクロロメタン：
メタノール＝９：１）により精製し、黄橙色無晶形固体
０．１５ｇを得た。 ＩＲスペクトル ν (KBr) cm -1 ： 3344 , 1676
, 1604 ＮＭＲスペクトル δ (CDCl3) ppm ： 2.49(2H,s),2.
79(1H,q,J=6.5Hz),2.89(1H,q,J=6.5Hz),3.65(1H,dd,J=1
3,6Hz),3.77-3.85(3H,m),4.39(1H,td,J=13,6.5Hz),7.03
-7.63(14H,m),8.23(1H,s) 高分解能マススペクトル：Ｃ26Ｈ24Ｎ4 Ｏ 理論値 m/z : 408.1950 実験値 m/z : 408.1946
【００２３】例６ （±）−１−（３−アミノプロピル）−１，３−ジヒド
ロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−５−
フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン （±）−Ｎ−〔３−〔２，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕プ
ロピル〕フタルイミド２．５３ｇ，抱水ヒドラジン０．
２４ml及びエタノール５５mlの混合物を２３時間加熱還
流した。放冷後、５％水酸化ナトリウム水溶液を加え、
酢酸エチルで抽出した。有機層を水，飽和食塩水で洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残
渣をアセトンより再結晶し、融点１６９．５〜１７１．
５℃の無色結晶１．００ｇを得た。 元素分析値 Ｃ27Ｈ26Ｎ4 Ｏ 理論値 Ｃ, 76.75; Ｈ, 6.20; Ｎ, 13.26 実験値 Ｃ, 76.43; Ｈ, 5.89; Ｎ, 13.03
ロ−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−５−
フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン （±）−Ｎ−〔３−〔２，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕プ
ロピル〕フタルイミド２．５３ｇ，抱水ヒドラジン０．
２４ml及びエタノール５５mlの混合物を２３時間加熱還
流した。放冷後、５％水酸化ナトリウム水溶液を加え、
酢酸エチルで抽出した。有機層を水，飽和食塩水で洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残
渣をアセトンより再結晶し、融点１６９．５〜１７１．
５℃の無色結晶１．００ｇを得た。 元素分析値 Ｃ27Ｈ26Ｎ4 Ｏ 理論値 Ｃ, 76.75; Ｈ, 6.20; Ｎ, 13.26 実験値 Ｃ, 76.43; Ｈ, 5.89; Ｎ, 13.03
【００２４】例７ （±）−１−（４−アミノブチル）−１，３−ジヒドロ
−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−５−フ
ェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン （±）−Ｎ−〔４−〔２，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕ブ
チル〕フタルイミド１．５０ｇ，抱水ヒドラジン０．１
４ml及びエタノール２０mlの混合物を５時間加熱還流し
た。放冷後、５％水酸化ナトリウム水溶液を加え、酢酸
エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラ
ムクロマトグラフィー（アルミナ，ジクロロメタン：メ
タノール＝２０：１→ジクロロメタン：メタノール＝
９：１）により精製し、微褐色無晶形固体０．８１ｇを
得た。 ＩＲスペクトル ν (KBr) cm -1 ： 3360 , 1672
, 1602 ＮＭＲスペクトル δ (CDCl3) ppm ： 1.22-1.57(4H,
m),2.53(2H,dd,J=13.5,6.5Hz),3.63-3.71(2H,m),3.78-
3.84(2H,m),4.44(1H,td,J=14,7Hz),7.05-7.65(14H,m),
8.01(1H,s) 高分解能マススペクトル：Ｃ28Ｈ28Ｎ4 Ｏ 理論値 m/z : 436.2263 実験値 m/z : 436.2263
−３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−５−フ
ェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン （±）−Ｎ−〔４−〔２，３−ジヒドロ−３−（１Ｈ−
インドール−３−イルメチル）−２−オキソ−５−フェ
ニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−１−イル〕ブ
チル〕フタルイミド１．５０ｇ，抱水ヒドラジン０．１
４ml及びエタノール２０mlの混合物を５時間加熱還流し
た。放冷後、５％水酸化ナトリウム水溶液を加え、酢酸
エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラ
ムクロマトグラフィー（アルミナ，ジクロロメタン：メ
タノール＝２０：１→ジクロロメタン：メタノール＝
９：１）により精製し、微褐色無晶形固体０．８１ｇを
得た。 ＩＲスペクトル ν (KBr) cm -1 ： 3360 , 1672
, 1602 ＮＭＲスペクトル δ (CDCl3) ppm ： 1.22-1.57(4H,
m),2.53(2H,dd,J=13.5,6.5Hz),3.63-3.71(2H,m),3.78-
3.84(2H,m),4.44(1H,td,J=14,7Hz),7.05-7.65(14H,m),
8.01(1H,s) 高分解能マススペクトル：Ｃ28Ｈ28Ｎ4 Ｏ 理論値 m/z : 436.2263 実験値 m/z : 436.2263
【００２５】例８ （±）−１−（３−アミノプロピル）−１，３−ジヒド
ロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２Ｈ−
１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン （±）−Ｎ−〔３−〔２，３−ジヒドロ−２−オキソ−
５−フェニル−３−（フェニルメチル）−１Ｈ−１，４
−ベンゾジアゼピン−１−イル〕プロピル〕フタルイミ
ド３．７０ｇ，抱水ヒドラジン０．３５ml及びエタノー
ル４０mlの混合物を５．５時間加熱還流した。放冷後、
５％水酸化ナトリウム水溶液２００mlを加え、酢酸エチ
ルで抽出した。有機層を水，飽和食塩水で洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラ
ムクロマトグラフィー（アルミナ，ジクロロメタン：メ
タノール＝１０：１）により精製し、淡桃色無晶形固体
０．９９ｇを得た。 ＩＲスペクトル ν (KBr) cm -1 ： 3372 , 1674
, 1604 ＮＭＲスペクトル δ (CDCl3) ppm ： 1.52-1.66(2H,
m),2.44-2.52(2H,m),3.60(2H,d,J=7Hz),3.70(1H,ddd,J=
14,7,5Hz),3.79(1H,t,J=7Hz),4.57(1H,td,J=14,7Hz),7.
15-7.54(14H,m) 高分解能マススペクトル：Ｃ25Ｈ25Ｎ3 Ｏ 理論値 m/z : 383.1998 実験値 m/z : 383.2003
ロ−５−フェニル−３−（フェニルメチル）−２Ｈ−
１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン （±）−Ｎ−〔３−〔２，３−ジヒドロ−２−オキソ−
５−フェニル−３−（フェニルメチル）−１Ｈ−１，４
−ベンゾジアゼピン−１−イル〕プロピル〕フタルイミ
ド３．７０ｇ，抱水ヒドラジン０．３５ml及びエタノー
ル４０mlの混合物を５．５時間加熱還流した。放冷後、
５％水酸化ナトリウム水溶液２００mlを加え、酢酸エチ
ルで抽出した。有機層を水，飽和食塩水で洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラ
ムクロマトグラフィー（アルミナ，ジクロロメタン：メ
タノール＝１０：１）により精製し、淡桃色無晶形固体
０．９９ｇを得た。 ＩＲスペクトル ν (KBr) cm -1 ： 3372 , 1674
, 1604 ＮＭＲスペクトル δ (CDCl3) ppm ： 1.52-1.66(2H,
m),2.44-2.52(2H,m),3.60(2H,d,J=7Hz),3.70(1H,ddd,J=
14,7,5Hz),3.79(1H,t,J=7Hz),4.57(1H,td,J=14,7Hz),7.
15-7.54(14H,m) 高分解能マススペクトル：Ｃ25Ｈ25Ｎ3 Ｏ 理論値 m/z : 383.1998 実験値 m/z : 383.2003
【００２６】以下、本発明化合物の優れたトロンボポエ
チンレセプター結合親和性を確認するため、トロンボポ
エチンと被験化合物とのトロンボポエチンレセプターに
対する競合実験を行い評価した。
チンレセプター結合親和性を確認するため、トロンボポ
エチンと被験化合物とのトロンボポエチンレセプターに
対する競合実験を行い評価した。
【００２７】試験例１ヒトトロンボポエチンレセプター（MPL)発現プラスミド
の構築 (1) まず、プラークハイブリダイゼーション法により、
MPL cDNAの全領域を保持するファージクローンを得た。
このためにPCR 法によりヒト胎児肝cDNA（CLONTECH社
製）からヒトMPL cDNAの一部を取得した。なお、MPL cD
NAの開始コドンから終止コドンはGenBank M90102に、開
始コドンの上流の配列はEMBL X73551 に登録されてい
る。PCR のためのプライマーは、MPL の開始コドンのA
から数えて331塩基から350 塩基の配列に基づいたセン
スプライマー5'-GTGCGTCTCTTCTTTCCGCT-3'と、1888から
1907塩基配列に基づいたアンチセンスプライマー5'-TCA
AGGCTGCTGCCAATAGC-3'を用いた。 PCRは、Takara EX Ta
q （宝酒造社製）により添付の反応バッファーを用い通
常の条件で行った。このPCR 産物をアガロースゲル電気
泳動後、ゲルからSUPREC-01 （宝酒造社製）を用いて添
付のプロトコールに従い回収した。回収したPCR 産物
を、Rediprime DNA labelling system（アマシャム社
製）を用いて、添付のプロトコールに従い［α- 32P ］
dCTPでラベルし、プローブとした。これを用いて、Huma
n Fetal Liver 5'-STRETCH cDNA library （CLONTECH社
製）から、添付のプロトコールに従い、MPL cDNAのコー
ディング全領域と少なくとも開始コドンより上流60塩基
以上を保持するファージクローンを単離し、常法に従っ
てファージを調製した。 (2) 次にPCR 法により、ヒトMPL 細胞外領域cDNA（1 か
ら491 番目のアミノ酸配列）をコードするDNA を取得し
た。PCR のための鋳型は上記で得られたファージを用
い、プライマーはMPL の開始コドンの28塩基上流から17
塩基の配列に基づいたセンスプライマー5'-CTAAGGCAGGC
ACACAG-3' と、486 から491 番目のアミノ酸配列に基づ
いたアンチセンスプライマー5'-GGTGACCCAGGCGGTCTCGGT
GGC-3'を用いた。この際、MPL 細胞外領域タンパク質の
C 末端領域が、ヒトIgG Fcと連結できるようにBstEIIサ
イトを入れ、さらに読み枠が一致するようにした。ま
た、ヒトIgG Fc領域cDNAは、B. D. Bennett らの文献
〔B. D. Bennett ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー (Journal of Biological Chemistry
),266 巻, 23060 〜23067 頁 , 1991 年）を参考にし
て、センスプライマー5'-CGCGGTCACCGACAAAACTCA-3' と
アンチセンスプライマー5'-GCACTCATTTACCCGGAGACAGGGA
GA-3' を用いて、ヒト脾臓のQUICK-CLONE cDNA（CLONTE
CH社製）を材料として、PCR 法により取得した。このよ
うにして得られたPCR 産物を、以下に述べる工程に従っ
てpCR3（Invitrogen社製）に組込み、MPL 発現ベクター
を構築した。 (3) PCR で得られたMPL 細胞外領域cDNAとヒトIgG Fc領
域cDNAを、EUKARYOTIC TA CLONING KIT （Invitrogen社
製）を用いて添付のプロトコールに従い、pCR3哺乳細胞
発現ベクターに挿入した後、大腸菌TOP10 に形質転換し
た。得られた形質転換体のうち、発現できる正しい方向
に挿入された株を選び、この株を常法に従い大量培養し
た。この株から、常法に従いプラスミドを調製し、MPL
(B)-pCR3 、IgG Fc(B)-pCR3と命名した。 (4) 約200 μg のMPL(B)-pCR3 を、0.64 unitsのBstEII
（東洋紡社製）と200 units のScaI（宝酒造社製）で切
断後、これをアガロース電気泳動に供した。該プラスミ
ドより、MPL cDNA領域を含む3085bpのDNA 断片を含むゲ
ル断片を切り出し、そのゲル断片から常法によりDNA を
抽出した。 (5) 約20μg のIgG Fc(B)-pCR3を、40 unitsのBstEII
（東洋紡社製）と80 unitsのScaI（宝酒造社製）で切断
後、アルカリフォスファターゼ（東洋紡社製）にて脱リ
ン酸化後、これをアガロース電気泳動に供した。該プラ
スミドより、IgG Fc領域cDNAを含む4150bpのDNA 断片を
含むゲル断片を切り出し、そのゲル断片からDNA を抽出
した。 (6) (4) で得たDNA 断片（約30ng）と(5) で得たDNA 断
片（約20ng）を、4.6 units のT4 DNAライゲース（東洋
紡社製）にて連結させた。エレクトロポレーション法に
より、大腸菌XL1-Blue株（Stratagene社製）に形質転換
した。得られた形質転換体のうち、発現できる正しい方
向に挿入された株を選び、この株を常法に従い大量培養
した。この株から、常法に従いプラスミドを調製し、MP
L-IgG Fc(B)/pCR3と命名した。
の構築 (1) まず、プラークハイブリダイゼーション法により、
MPL cDNAの全領域を保持するファージクローンを得た。
このためにPCR 法によりヒト胎児肝cDNA（CLONTECH社
製）からヒトMPL cDNAの一部を取得した。なお、MPL cD
NAの開始コドンから終止コドンはGenBank M90102に、開
始コドンの上流の配列はEMBL X73551 に登録されてい
る。PCR のためのプライマーは、MPL の開始コドンのA
から数えて331塩基から350 塩基の配列に基づいたセン
スプライマー5'-GTGCGTCTCTTCTTTCCGCT-3'と、1888から
1907塩基配列に基づいたアンチセンスプライマー5'-TCA
AGGCTGCTGCCAATAGC-3'を用いた。 PCRは、Takara EX Ta
q （宝酒造社製）により添付の反応バッファーを用い通
常の条件で行った。このPCR 産物をアガロースゲル電気
泳動後、ゲルからSUPREC-01 （宝酒造社製）を用いて添
付のプロトコールに従い回収した。回収したPCR 産物
を、Rediprime DNA labelling system（アマシャム社
製）を用いて、添付のプロトコールに従い［α- 32P ］
dCTPでラベルし、プローブとした。これを用いて、Huma
n Fetal Liver 5'-STRETCH cDNA library （CLONTECH社
製）から、添付のプロトコールに従い、MPL cDNAのコー
ディング全領域と少なくとも開始コドンより上流60塩基
以上を保持するファージクローンを単離し、常法に従っ
てファージを調製した。 (2) 次にPCR 法により、ヒトMPL 細胞外領域cDNA（1 か
ら491 番目のアミノ酸配列）をコードするDNA を取得し
た。PCR のための鋳型は上記で得られたファージを用
い、プライマーはMPL の開始コドンの28塩基上流から17
塩基の配列に基づいたセンスプライマー5'-CTAAGGCAGGC
ACACAG-3' と、486 から491 番目のアミノ酸配列に基づ
いたアンチセンスプライマー5'-GGTGACCCAGGCGGTCTCGGT
GGC-3'を用いた。この際、MPL 細胞外領域タンパク質の
C 末端領域が、ヒトIgG Fcと連結できるようにBstEIIサ
イトを入れ、さらに読み枠が一致するようにした。ま
た、ヒトIgG Fc領域cDNAは、B. D. Bennett らの文献
〔B. D. Bennett ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー (Journal of Biological Chemistry
),266 巻, 23060 〜23067 頁 , 1991 年）を参考にし
て、センスプライマー5'-CGCGGTCACCGACAAAACTCA-3' と
アンチセンスプライマー5'-GCACTCATTTACCCGGAGACAGGGA
GA-3' を用いて、ヒト脾臓のQUICK-CLONE cDNA（CLONTE
CH社製）を材料として、PCR 法により取得した。このよ
うにして得られたPCR 産物を、以下に述べる工程に従っ
てpCR3（Invitrogen社製）に組込み、MPL 発現ベクター
を構築した。 (3) PCR で得られたMPL 細胞外領域cDNAとヒトIgG Fc領
域cDNAを、EUKARYOTIC TA CLONING KIT （Invitrogen社
製）を用いて添付のプロトコールに従い、pCR3哺乳細胞
発現ベクターに挿入した後、大腸菌TOP10 に形質転換し
た。得られた形質転換体のうち、発現できる正しい方向
に挿入された株を選び、この株を常法に従い大量培養し
た。この株から、常法に従いプラスミドを調製し、MPL
(B)-pCR3 、IgG Fc(B)-pCR3と命名した。 (4) 約200 μg のMPL(B)-pCR3 を、0.64 unitsのBstEII
（東洋紡社製）と200 units のScaI（宝酒造社製）で切
断後、これをアガロース電気泳動に供した。該プラスミ
ドより、MPL cDNA領域を含む3085bpのDNA 断片を含むゲ
ル断片を切り出し、そのゲル断片から常法によりDNA を
抽出した。 (5) 約20μg のIgG Fc(B)-pCR3を、40 unitsのBstEII
（東洋紡社製）と80 unitsのScaI（宝酒造社製）で切断
後、アルカリフォスファターゼ（東洋紡社製）にて脱リ
ン酸化後、これをアガロース電気泳動に供した。該プラ
スミドより、IgG Fc領域cDNAを含む4150bpのDNA 断片を
含むゲル断片を切り出し、そのゲル断片からDNA を抽出
した。 (6) (4) で得たDNA 断片（約30ng）と(5) で得たDNA 断
片（約20ng）を、4.6 units のT4 DNAライゲース（東洋
紡社製）にて連結させた。エレクトロポレーション法に
より、大腸菌XL1-Blue株（Stratagene社製）に形質転換
した。得られた形質転換体のうち、発現できる正しい方
向に挿入された株を選び、この株を常法に従い大量培養
した。この株から、常法に従いプラスミドを調製し、MP
L-IgG Fc(B)/pCR3と命名した。
【００２８】試験例２ヒトIgG Fc領域融合ヒトMPL タンパク質（MPL-IgG)を安
定に発現するヒト胎児293 細胞の作製とMPL-IgG の精製 MPL-IgG Fc(B)/pCR3で、エレクトロポレーション法〔渡
辺良成：組織培養の技術 第三版〔応用編〕（日本組織
培養学会編）, 501 〜503 頁, 1996年〕によりヒト胎児
293 細胞を形質転換した。形質転換されたヒト胎児293
細胞を、10％FCS 含有DMEM培地で約２日間培養した後、
0.4 mg/ml ジェネティシン（LIFE TECHNOLOGIES 社製）
を含む10％FCS 含有DMEMにて約２週間培養して、形質転
換体を得た。この形質転換体を、約50％コンフルエント
になるまで培養し、1 ％ニュートリドーマ（ベーリンガ
ー・マンハイム社製）を含むDMEM培地と交換し、培養を
継続した。約１週間ごとに培地を交換しながら、３週間
から４週間培養を続けた。この培地を遠心し、培養上清
を回収した後、VacuCap TM（Gelman Sciences 社製）を
用いて濾過した。約7Lの培養上清から、HiTrap Protein
G（ファルマシア社製）を用いて、添付のプロトコール
に従いカラムクロマトグラフィーを行い、MPL-IgG を精
製した。
定に発現するヒト胎児293 細胞の作製とMPL-IgG の精製 MPL-IgG Fc(B)/pCR3で、エレクトロポレーション法〔渡
辺良成：組織培養の技術 第三版〔応用編〕（日本組織
培養学会編）, 501 〜503 頁, 1996年〕によりヒト胎児
293 細胞を形質転換した。形質転換されたヒト胎児293
細胞を、10％FCS 含有DMEM培地で約２日間培養した後、
0.4 mg/ml ジェネティシン（LIFE TECHNOLOGIES 社製）
を含む10％FCS 含有DMEMにて約２週間培養して、形質転
換体を得た。この形質転換体を、約50％コンフルエント
になるまで培養し、1 ％ニュートリドーマ（ベーリンガ
ー・マンハイム社製）を含むDMEM培地と交換し、培養を
継続した。約１週間ごとに培地を交換しながら、３週間
から４週間培養を続けた。この培地を遠心し、培養上清
を回収した後、VacuCap TM（Gelman Sciences 社製）を
用いて濾過した。約7Lの培養上清から、HiTrap Protein
G（ファルマシア社製）を用いて、添付のプロトコール
に従いカラムクロマトグラフィーを行い、MPL-IgG を精
製した。
【００２９】試験例３ELISA 法を用いたトロンボポエチンと被験化合物との競
合実験 マイクロタイター平板ウェルに、100 μl のPBS(−）で
希釈した10 ng の MPL-IgG を４℃で終夜被覆した。被
験体は被験化合物をDMSOに溶解後、PBS(−）/0.1% BSA
/ 0.05% Tween 20 を用いて、最終DMSO含有率が５％と
なるようにトロンボポエチン（R&D 社製）溶液（最終濃
度１×10-10 M ）と混ぜ合わせて作製した。ウェルより
MPL-IgG 溶液を取り除き、被験体を添加し、室温で１時
間以上被覆した。この液を取り除き、200 μl の PBS
（−）/ 0.05% Tween 20でウェル底面を洗った後、ヤギ
Anti-human TPO Neutralizing Antibody（R&D 社製）
で、室温にて１時間以上インキュベートした。200 μl
のPBS(−）/ 0.05% Tween 20でウェルを洗った後、西洋
ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヤギIgG 抗体（Chem
icon International社製）で、室温にて１時間以上イン
キュベートした。 200μl の0.05％ Tween 20 を含むPB
S(−）でウェルを洗った後、100 μl のTMB 溶液（DAKO
社製）を加え室温で５分間インキュベートした。100 μ
l の1M H2SO4（和光純薬社製）を加え反応を停止した。
光学密度を450nm にて解析し、被験化合物を加えていな
い時のトロンボポエチンの結合を100%として、被験化合
物によるトロンボポエチンの結合抑制を調べ、トロンボ
ポエチンレセプターへの親和性を評価した。結果を図１
に示す。この結果から明らかなように、本発明化合物は
トロンボポエチンレセプターへの優れた親和性を示し
た。
合実験 マイクロタイター平板ウェルに、100 μl のPBS(−）で
希釈した10 ng の MPL-IgG を４℃で終夜被覆した。被
験体は被験化合物をDMSOに溶解後、PBS(−）/0.1% BSA
/ 0.05% Tween 20 を用いて、最終DMSO含有率が５％と
なるようにトロンボポエチン（R&D 社製）溶液（最終濃
度１×10-10 M ）と混ぜ合わせて作製した。ウェルより
MPL-IgG 溶液を取り除き、被験体を添加し、室温で１時
間以上被覆した。この液を取り除き、200 μl の PBS
（−）/ 0.05% Tween 20でウェル底面を洗った後、ヤギ
Anti-human TPO Neutralizing Antibody（R&D 社製）
で、室温にて１時間以上インキュベートした。200 μl
のPBS(−）/ 0.05% Tween 20でウェルを洗った後、西洋
ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヤギIgG 抗体（Chem
icon International社製）で、室温にて１時間以上イン
キュベートした。 200μl の0.05％ Tween 20 を含むPB
S(−）でウェルを洗った後、100 μl のTMB 溶液（DAKO
社製）を加え室温で５分間インキュベートした。100 μ
l の1M H2SO4（和光純薬社製）を加え反応を停止した。
光学密度を450nm にて解析し、被験化合物を加えていな
い時のトロンボポエチンの結合を100%として、被験化合
物によるトロンボポエチンの結合抑制を調べ、トロンボ
ポエチンレセプターへの親和性を評価した。結果を図１
に示す。この結果から明らかなように、本発明化合物は
トロンボポエチンレセプターへの優れた親和性を示し
た。
【００３０】
【発明の効果】本発明の前記一般式（Ｉ）で示される
１, ４−ベンゾジアゼピン誘導体又はその薬理学的に許
容しうる塩は、トロンボポエチンレセプターへの優れた
親和性を有しており、血小板産生調節剤として極めて有
用である。
１, ４−ベンゾジアゼピン誘導体又はその薬理学的に許
容しうる塩は、トロンボポエチンレセプターへの優れた
親和性を有しており、血小板産生調節剤として極めて有
用である。
【００３１】
【図１】本発明化合物のトロンボポエチン（ＴＰＯ）の
結合抑制作用を測定し、本発明化合物のトロンボポエチ
ンレセプターへの親和性を示した図である。
結合抑制作用を測定し、本発明化合物のトロンボポエチ
ンレセプターへの親和性を示した図である。
フロントページの続き (72)発明者 岩崎 信彦 福井県勝山市猪野口37号１番地１ 北陸製 薬株式会社内 (72)発明者 池田 佳隆 福井県勝山市猪野口37号１番地１ 北陸製 薬株式会社内
Claims (2)
- 【請求項１】次の一般式 【化１】 （式中、Ｒはフェニル基又はインドリル基を表し、ｎは
２〜６の整数を表す。）で示される１, ４−ベンゾジア
ゼピン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩。 - 【請求項２】請求項１に記載の１, ４−ベンゾジアゼピ
ン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩を有効成分と
する血小板産生調節剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17098397A JPH111477A (ja) | 1997-06-12 | 1997-06-12 | １，４−ベンゾジアゼピン誘導体及びその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17098397A JPH111477A (ja) | 1997-06-12 | 1997-06-12 | １，４−ベンゾジアゼピン誘導体及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH111477A true JPH111477A (ja) | 1999-01-06 |
Family
ID=15914965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17098397A Pending JPH111477A (ja) | 1997-06-12 | 1997-06-12 | １，４−ベンゾジアゼピン誘導体及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH111477A (ja) |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6887890B2 (en) | 2000-05-30 | 2005-05-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Compounds exhibiting thrombopoietin-like activities |
| US7169931B2 (en) | 2001-01-26 | 2007-01-30 | Shionogi & Co., Ltd. | Cyclic compounds exhibiting thrombopoietin receptor agonism |
| WO2009017098A1 (ja) | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Shionogi & Co., Ltd. | トロンボポエチン受容体アゴニスト作用を有する光学活性な化合物を含有する医薬組成物およびその中間体 |
| US7582665B2 (en) | 2000-01-24 | 2009-09-01 | Shionogi & Co., Ltd. | Compounds exhibiting thrombopoietin receptor agonism |
| US7601746B2 (en) | 2003-08-12 | 2009-10-13 | Shionogi & Co., Ltd. | Compounds exhibiting thrombopoietin receptor agonism |
| US7851503B2 (en) | 2002-08-14 | 2010-12-14 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Thrombopoetin receptor activator and process for producing the same |
| US7960425B2 (en) | 2005-07-20 | 2011-06-14 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Pyrazole compounds and thrombopoietin receptor activators |
| US7968542B2 (en) | 2005-07-15 | 2011-06-28 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Thiophene compounds and thrombopoietin receptor activators |
| US8053453B2 (en) | 2002-10-09 | 2011-11-08 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Pyrazolone compounds and thrombopoietin receptor activator |
| US8093251B2 (en) | 2006-06-07 | 2012-01-10 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Nitrogen-containing heterocyclic compounds and thrombopoietin receptor activators |
| US8134013B2 (en) | 2004-12-14 | 2012-03-13 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Amide compound and thrombopoietin receptor activator |
| US8367710B2 (en) | 2008-01-10 | 2013-02-05 | Jiangsu Hengrui Medicine Co. Ltd. | Bicyclo-substituted pyrazolon azo derivatives, preparation process and pharmaceutical use thereof |
| US8552031B2 (en) | 2004-12-08 | 2013-10-08 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | 3-ethylidenehydrazino substituted heterocyclic compounds as thrombopoietin receptor activators |
| US10724028B2 (en) | 2014-10-31 | 2020-07-28 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Ligand-binding fiber and cell culture substrate using said fiber |
-
1997
- 1997-06-12 JP JP17098397A patent/JPH111477A/ja active Pending
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US8552031B2 (en) | 2004-12-08 | 2013-10-08 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | 3-ethylidenehydrazino substituted heterocyclic compounds as thrombopoietin receptor activators |
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| US7968542B2 (en) | 2005-07-15 | 2011-06-28 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Thiophene compounds and thrombopoietin receptor activators |
| US7960425B2 (en) | 2005-07-20 | 2011-06-14 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Pyrazole compounds and thrombopoietin receptor activators |
| US8093251B2 (en) | 2006-06-07 | 2012-01-10 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Nitrogen-containing heterocyclic compounds and thrombopoietin receptor activators |
| WO2009017098A1 (ja) | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Shionogi & Co., Ltd. | トロンボポエチン受容体アゴニスト作用を有する光学活性な化合物を含有する医薬組成物およびその中間体 |
| US8530668B2 (en) | 2007-07-31 | 2013-09-10 | Shionogi & Co., Ltd. | Pharmaceutical composition containing optically active compound having thrombopoietin receptor agonist activity, and intermediate therefor |
| US8889722B2 (en) | 2007-07-31 | 2014-11-18 | Shionogi & Co., Ltd. | Pharmaceutical composition containing optically active compound having thrombopoietin receptor agonist activity, and intermediate therefor |
| US8367710B2 (en) | 2008-01-10 | 2013-02-05 | Jiangsu Hengrui Medicine Co. Ltd. | Bicyclo-substituted pyrazolon azo derivatives, preparation process and pharmaceutical use thereof |
| US10724028B2 (en) | 2014-10-31 | 2020-07-28 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Ligand-binding fiber and cell culture substrate using said fiber |
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