JPH11169192A

JPH11169192A - Ｌ−ホモシステインの製造方法

Info

Publication number: JPH11169192A
Application number: JP25087098A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Kanzaki; 浩神崎; Makoto Ueda; 誠上田
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1997-10-07
Filing date: 1998-09-04
Publication date: 1999-06-29
Anticipated expiration: 2018-09-04
Also published as: JP3743172B2

Abstract

(57)【要約】【課題】工業的に有利な方法でＬ−ホモシステインを
製造する。【解決手段】ホモシステインチオラクトンに、チオエ
ステルを立体選択的に不斉加水分解する能力を有する微
生物の菌体及び／または該菌体処理物を作用させて、立
体配置がＬである光学活性体を加水分解した後、反応液
よりＬ−ホモシステインを回収する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−ホモシステイ
ンの製造方法に関し、詳細には医薬、農薬の重要な合成
中間体であるＬ−ホモシステインを、微生物反応を利用
して製造する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】Ｌ−ホ
モシステインは、医薬、農薬の分野における重要な合成
中間体である。これまでに知られているＬ−ホモシステ
インの製造方法は、Ｌ−メチオニンを原料とする化学的
な合成方法のみであった。しかしながらこの方法は、高
価なＬ−メチオニンを用いるなど、工業的には不利であ
った。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
について検討を重ねた結果、特定の微生物の作用により
ホモシステインチオラクトンを立体選択的に加水分解
し、Ｌ−ホモシステインが製造できることを見出し、本
発明を完成するにいたった。即ち、本発明はホモシステ
インチオラクトンに、チオエステルを立体選択的に不斉
加水分解する能力を有する微生物の菌体及び／または該
菌体処理物を作用させて、立体配置がＬである光学活性
体を加水分解した後、反応液よりＬ−ホモシステインを
回収することを特徴とするＬ−ホモシステインの製造方
法に存する。

【０００４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、原料としてホモシステインチオラク
トンを用い、これに微生物の菌体又は該菌体処理物を作
用させて、Ｌ−ホモシステインを製造する。本発明にお
いて使用する微生物は、ホモシステインチオラクトンを
立体選択的に加水分解する能力を有するものであればい
ずれを用いても良いが、好ましい例としては例えばフザ
リウム属を挙げることが出来る。

【０００５】また、好ましい種としては例えば、フザリ
ウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐ
ｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・パリドロセウム（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍ）またはアグ
ロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）などを挙げること
が出来る。上記の微生物の具体的な菌株としては、フザ
リウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓ
ｐｏｒｕｍ）ＩＦＯ３０７０１、フザリウム・ソラニ
（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ）ＩＦＯ９９５５、
フザリウム・パリドロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｐａ
ｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍ）ＩＦＯ３０２００の菌株また
はアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＭＣＩ３６
２４を挙げることが出来る。

【０００６】上記微生物は、野生株、変異株、あるいは
細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法に
より誘導される組換え株などのいずれの株であってもよ
い。また、上記の菌株のうちＩＦＯ３０７０１、ＩＦＯ
９９５５、ＩＦＯ３０２００は公知の菌株であり、
（財）発酵研究所（ＩＦＯ）から容易に入手することが
出来る。ＭＣＩ３６２４株は、本発明者らにより天然土
壌から分離された細菌であり、工業技術院生命工学技術
研究所にＦＥＲＭＰ−１６９３９として寄託されてい
る。ＭＣＩ３６２４株の菌学的性質は以下の通りであ
る。

【０００７】ＭＣＩ３６２４株の同定結果１．形態的性質（１）細胞の形桿状（２）細胞の多形性なし（３）運動性なし（４）胞子の有無なし

【０００８】２．培養的性質（１）肉汁寒天平板培養３０℃ １〜２日間培養
後円形、半レンズ状、うす黄、不透明、光沢のコロニ
ーを形成。コロニー表面は平滑（２）肉汁液体培養混濁が見られるが、液面
における膜の形成はない（３）肉汁ゼラチン穿刺培養ゼラチン液化なし（４）リトマス・ミルク弱いアルカリ

【０００９】３．生理学的性質（１）グラム染色陰性（２）硝酸塩の還元陽性（３）脱膣反応陽性（４）ＭＲテスト陰性（５）ＶＰテスト陰性（６）インドールの生成陰性（７）硫化水素の生成陰性（８）デンプンの加水分解陰性（１１）色素の生成なし（１２）ウレアーゼ陽性（１３）オキシダーゼ陽性（１４）カタラーゼ陽性（１６）酸素に対する態度嫌気条件下で生育せず（１７）Ｏ−Ｆテスト酸化（１８）糖類からの酸の生成Ｌ−アラビノース＋Ｄ−キシロース＋Ｄ−グルコース＋Ｄ−マンノース＋Ｄ−フラクトース＋Ｄ−ガラクトース＋マルトース＋シュークロース＋ラクトース＋トレハロース＋Ｄ−ソルビトール＋Ｄ−マンニトール＋イノシトール＋グリセリン ± デンプン − Ｄ−アラビトール＋エリスリトール − ＋：酸を生成する、−：生成しない、±：どちらともい
えない（１９）その他の諸性質アルギニンジヒドロラーゼ陽性エスクリンの分解陽性 β−ガラクトシダーゼ陽性有機酸の利用グルコン酸陽性ＤＬ−リンゴ酸陽性アジピン酸陰性ｎ−カプリン酸陰性

【００１０】４．化学分類学的性質（１）主要なイソプレノイドキノンユビキノンＱ１０（２）ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量５９．７モル％

【００１１】５．分類学的考察（１）属の同定本菌株ＭＣＩ３６２４株は１）グラム陰性桿菌、２）絶
対好気性、３）芽胞を形成しない、４）運動性なし、
５）Ｏ−Ｆテストは酸化型、６）硝酸塩還元能及び脱窒
素能を有する、７）硫化水素を生成しない、８）主要な
イソプレノイドキノンはユビキノンＱ１０を有する、
８）ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量は５９．７モル％などの特徴
を持っている。これらの特徴から、本菌株はバージェイ
ズマニュアル・システマティック・バクテリオロジー
［Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅ
ｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］第１巻、２３
４〜２５６頁（１９８４）に記載されているリゾビアシ
ーエ科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）に含まれる、アグ
ロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及び
リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に帰属することが
示唆された。

【００１２】（２）種の同定現在、１６ＳｒＲＮＡ塩基配列の解析結果から、アグ
ロバクテリウム属とリゾビウム属は属レベルでまとまっ
た菌群であることが判明している。従って本菌株の種を
決定するため、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列（１４４６
塩基）を決定した。得られた結果に基づいてデータベー
ス検索を行ったところ、本菌株はアグロバクテリウム
ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｒｉｕｍｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）に最も近縁であることが判明した。

【００１３】インターナショナルジャーナルオブ
システマティックバクテリオロジー［Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］第４３巻、６９４−７０
２頁（１９９３）によると、アグロバクテリウム属には
アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウムラディオバク
ター（Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリ
ウムリゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグ
ロバクテリウムビティス（Ａ．ｖｉｔｉｓ）及びアグ
ロバクテリウムルビ（Ａ．ｒｕｂｉ）の５種が知られて
いるが、アグロバクテリウムツメファシエンスとアグ
ロバクテリウムラディオバクターは１６ＳｒＲＮＡ
の解析から同一種として統合され、アグロバクテリウム
ラディオバクターとなっている。従って本菌株はアグ
ロバクテリウムラディオバクターと９９．６％の相同
値を示し、他種（相同値９４．５〜９７．８％）より高
い相同性を示した。さらに生理学的性質においても、
１）３７℃での生育、２）クエン酸の資化性、３）エリ
スリトール及びアラビトールの資化性、４）硝酸塩の還
元などの点で明らかに他種とは区別された。以上の結果
から、本菌株ＭＣＩ３６２４株をアグロバクテリウム
ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａ
ｄｉｏｂａｃｔｅｒ）と同定した。

【００１４】本発明の製造方法においては、上記微生物
の１種あるいは２種以上が菌体及び／または菌体処理物
として用いられる。具体的には、上記微生物を培養して
得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌
体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理し
たもの、凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的または酵
素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができ
る。また、これらの菌体または菌体処理物から、ホモシ
ステインチオラクトンに作用しこれをＬ−ホモシステイ
ンへ変換する能力を有する酵素画分を粗製物あるいは精
製物として取り出して用いることも可能である。さらに
は、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画
分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の
担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そ
こで本明細書において、「菌体及び／または該菌体処理
物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、及
びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられ
る。

【００１５】以下に、本発明の製造方法について具体的
に説明する。本発明の製造方法において微生物は、通
常、培養して用いられるが、この培養については定法通
り行うことができる。本微生物の培養の為に用いられる
培地には本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、及び無
機イオン等が含まれる。炭素源としては、グルコース等
の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、肉エキス、Ｎ
Ｚアミン、トリプトース、酵母エキス、ポリペプトン、
コーンスティープリカーその他が適宜使用される。無機
イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、
鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が
必要に応じ適宜使用される。更に、イノシトール、パン
トテン酸、ニコチン酸アミドその他のビタミン類を必要
に応じ添加することは有効である。また、チオラクトン
やラクトン類を添加することも有効である。培養は、好
気的条件下に、ｐＨ約３〜８、温度約２０〜３５℃の適
当な範囲に制御しつつ１５〜１００時間行う。

【００１６】ホモシステインチオラクトンに上記微生物
を作用させてＬ−ホモシステインを製造する方法とし
て、本微生物を培養し、得られた菌体懸濁液にホモシス
テインチオラクトンを添加し反応させＬ−ホモシステイ
ンを得る方法、培地にホモシステインチオラクトンを添
加し培養と反応を同時に行う方法、あるいは培養終了
後、ホモシステインチオラクトンを添加して更に反応を
行う方法等を用いることができる。反応温度は１５〜４
０℃が好ましく、ｐＨ４〜１０の範囲である。ホモシス
テインチオラクトン濃度は０．１〜５０％の範囲が望ま
しく、必要ならばホモシステインチオラクトンは反応の
間、追補添加される。また、必要に応じて金属イオンを
添加することにより反応が促進される場合がある。培養
及び反応で得られたＬ−ホモシステインの採取方法とし
ては晶析などの通常の分離・精製方法により行うことが
できる。

【００１７】

【実施例】いかに実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野
における通常の変更をすることができる。実施例１グルコース１０．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５．０ｇ
／Ｌ、酵母エキス５．０ｇ／Ｌ及びコーンスティープ
リカー５．０ｇ／Ｌ（ｐＨ６．０）の組成からなる液
体培地５０ｍＬに、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕ
ｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＩＦＯ３０７０１
を接種し、２７℃で７２時間好気的に培養した。培養終
了後、菌体を集め５０ｍＭ塩化カリウム水溶液で洗浄し
た。これに１０．０ｇ／Ｌのホモシステインチオラクト
ンを含む１００ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を加
え、全量を５０ｍＬとし３０℃で２４時間反応させた。
反応終了時のホモシステイン生成蓄積量は６．５ｇ／Ｌ
であり、得られたＬ−ホモシステインの光学純度は６０
％ｅ．ｅ．であった。

【００１８】実施例２第１表に示す微生物の菌体をそれぞれ、グルコース１
０．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５．０ｇ／Ｌ、酵母エキ
ス５．０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー５．０ｇ／
Ｌ（ｐＨ６．０）の組成からなる液体培地５０ｍＬに接
種し、２７℃で７２時間好気的に培養した。培養終了
後、菌体を集め５０ｍＭ塩化カリウム水溶液で洗浄し
た。これに１０．０ｇ／Ｌのホモシステインチオラクト
ンを含む１００ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を加
え、全量を５０ｍＬとし３０℃で２４時間反応させた。
得られた結果を表１に示す。

【００１９】

【表１】第１表ホモシステイン光学純度絶対配置微生物（ｇ／Ｌ）（％ｅ．ｅ．）フザリウム・ソラニＩＦＯ９９５５３．１５０Ｌフザリウム・パリドロセウムＩＦＯ３０２００３．５４５Ｌ

【００２０】実施例３ニュートリエントブロス８．０ｇ／ｌ、シュークロー
ス５．０ｇ／ｌ、酵母エキス１．０ｇ／ｌの組成か
らなる液体培地１０ｍｌに、アグロバクテリウム・ラジ
オバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏ
ｂａｃｔｅｒ）ＭＣＩ３６２４を接種し、２８度で２４
時間好気的に培養した。培養終了後、菌体を集め、０．
８５％塩化ナトリウムで懸濁し菌体懸濁液０．８ｍｌを
得た。この菌体懸濁液０．４ｍｌに２５０ｍＭのホモシ
ステインチオラクトンを０．４ｍｌ、ｐＨ７．０の１Ｍ
リン酸緩衝液０．２ｍｌを加え、３７度で２４時間反応
させた。反応終了時のホモシステインの蓄積量は５０ｍ
Ｍであり、得られたＬ−ホモシステインの光学純度は７
９．６％ｅ．ｅ．であった。

【００２１】

【発明の効果】本発明の微生物を用いたＬ−ホモシステ
インの製造方法は従来の方法に比べ安価な方法であるこ
とから、Ｌ−ホモシステインの工業的な生産を行う際に
非常に有効である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ホモシステインチオラクトンに、チオエ
ステルを立体選択的に不斉加水分解する能力を有する微
生物の菌体及び／または該菌体処理物を作用させて、立
体配置がＬである光学活性体を加水分解した後、反応液
よりＬ−ホモシステインを回収することを特徴とするＬ
−ホモシステインの製造方法。
【請求項２】微生物がフザリウム属に属する微生物で
あることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】微生物がアグロバクテリウム属に属する
微生物であることを特徴とする請求項１記載の製造方
法。