JPH11174332A - レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 対象の照明波長のみを選択的にモニタするこ
とができるレーザ顕微鏡を提供すること。 【解決手段】 調光フィルタ３、２３の後方に設けた参
照光分離ミラー４により、調光された後のレーザパワー
をモニタできるため、試料ＳＰを照明するレーザパワー
と光量モニタ用の強度検出器１７の出力との相関が取れ
ることになる。また、参照光分離ミラー４の後ろにレー
ザシャッタ５が配置されているので、レーザシャッタ５
を閉じている状態でレーザパワーをモニタし、調光フィ
ルタ３，２３で照明用のレーザ光のレーザパワーを調整
することが可能となる。複数のレーザ光源１、２１から
の複数波長のレーザパワーを同時にモニタする場合、波
長選択装置２６によって選択する参照光の波長を適当な
タイミングで順次切り替える。選択された波長は、強度
検出器１７の出力とともに制御処理装置１４でモニタさ
れている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、レーザ光で照明し
た試料像を観察するためのレーザ顕微鏡に関し、特に光
源からのレーザ光のパワーを正確にモニタすることがで
きるレーザ顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】レーザ顕微鏡として、例えばレーザ光を
試料上で走査することによって試料像を検出するレーザ
走査顕微鏡が存在する。このようなレーザ走査顕微鏡
は、一般にスポット状のレーザ光を試料に対して適宜走
査させるスキャニングユニットと、試料からの反射光や
蛍光を検出する装置と、検出した光を試料の画像として
モニタに表示する装置とを備えた構成になっている。

【０００３】このレーザ走査顕微鏡を用いて試料からの
反射光、蛍光等の測定を行う場合、測定に際しての諸条
件を一定にし、特定のパラメータのみを変化させて比較
実験を行ったり、同じ諸条件で再測定や再実験を行った
りすることが行われる。このような場合、測定の条件、
状況等を精密に制御しなければならない。かかる諸条件
の中でも特にレーザパワーの変動は、そのまま検出画像
の輝度変動につながるため、再現性ある測定を行う上
で、レーザパワーの正確な制御が重要な課題となってい
る。

【０００４】レーザパワーの制御は、レーザチューブ
自体が有するパワー制御機能を利用すること、透過率
を変える光学部材を照明光路中に挿入することなどで行
われている。なお、Ｈｅ‐Ｎｅレーザのようにレーザパ
ワーの制御機能を有しないレーザの場合、上述の手法
のみによってレーザパワーの制御が行われる。また、
の手法では、連続的にレーザパワーを制御する場合、透
過率を変える光学部材として、連続ＮＤフィルタや音響
光学素子のように連続的に透過率を変え得るものを利用
する。

【０００５】以上のような手法でレーザパワーを制御す
る場合、レーザパワーの再現性を維持するためには、試
料に入射するレーザ光をモニタする必要がある。この
際、試料を照明するレーザパワーを正確に設定するた
め、照明光路中にミラー等を適宜挿入し、一時的にレー
ザ光を照明光路外に取り出してこれをモニタすることが
行われる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のように照明用の
レーザ光を直接モニタする方式では、複数波長のレーザ
光が混合されている場合、混合されたレーザ光の総合パ
ワーをモニタしてしまうことになる。したがって、単一
波長のレーザ光についてレーザパワーを制御しようとす
る場合、他のレーザ装置の発振を停止させたり、レーザ
装置ごとのシャッタで他のレーザ装置からのレーザ光を
遮断する必要が生じる。

【０００７】しかし、前者のように他のレーザ装置の発
振を停止する方法については、レーザ装置の種類によっ
ては電源を投入してから安定するまでに相当の時間を要
するものもあり、レーザ装置の電源を落とすことは通常
望ましくないという問題がある。また、後者のように他
のレーザ装置からのレーザ光を遮断する方法について
は、各波長に対応して設けたレーザ装置の台数分だけシ
ャッタを個別に設ける必要が生じ、装置が大型化してし
まうという問題がある。

【０００８】また、Ｋｒ−Ａｒレーザのような１つのレ
ーザから複数波長のレーザ光を出射するようなマルチ波
長発振レーザでは単一波長のレーザパワーをモニタする
ことは単純にはできなかった。

【０００９】さらに、以上のように照明光を分離してモ
ニタする方法では、レーザパワーのモニタ作業を実際の
測定の前に完了していなければならず、測定中はレーザ
パワーに変化のないことを信じて行わなければならなか
った。

【００１０】そこで、本発明は、目的の波長の照明光の
みを選択的にモニタすることができるレーザ顕微鏡を提
供することを目的とする。

【００１１】また、本発明は、試料を照明するレーザ光
に影響を与えることなくレーザパワーを適当なタイミン
グでモニタすることができるレーザ顕微鏡を提供するこ
とを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明のレーザ顕微鏡は、互いに波長が異なる複数
のレーザ光を発生する光源と、前記光源からの前記複数
のレーザ光を対物レンズを介して試料に照射する照明光
学系と、前記複数のレーザ光の照射により前記試料から
発する光を取得して試料像を得る観察光学系と、前記光
源からの前記複数のレーザ光が前記試料に照射される前
に当該複数のレーザ光の一部分を参照光として分割する
分割装置と、前記分割装置で分割された前記参照光のう
ち所定波長成分の光を選択する波長選択装置と、前記波
長選択装置で選択された前記所定波長成分の光の強度を
検出する強度検出装置とを備えることを特徴とする。

【００１３】また、好ましい態様では、前記分割装置と
前記試料との間の光路上に配置されて前記試料への前記
複数のレーザ光の照射を遮断可能なシャッタ装置をさら
に備えることを特徴とする。

【００１４】また、別の態様のレーザ顕微鏡は、レーザ
光を発生する光源と、前記光源からの前記レーザ光を対
物レンズを介して試料に照射する照明光学系と、前記レ
ーザ光の照射により前記試料から発する光を取得して試
料像を得る観察光学系と、前記光源からの前記レーザ光
が前記試料に照射される前に当該レーザ光の一部分を参
照光として分割する分割装置と、前記分割装置で分割さ
れた前記参照光の強度を検出する強度検出装置と、前記
分割装置と前記試料との間の光路上に配置されて前記試
料への前記レーザ光の照射を遮断可能なシャッタ装置と
を備えることを特徴とする。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明に係るレーザ顕微鏡
の一実施形態について図面を参照しつつ説明する。

【００１６】図１は、複数波長で試料を励起するレーザ
走査顕微鏡のブロック図である。なお、同図において、
レーザ走査顕微鏡を構成する光学系のうち主要な部材だ
けを記載し、縮小及び拡大光学部材は省略している。

【００１７】図からも明らかなように、レーザ走査顕微
鏡は、光源装置として、照明用の複数波長のレーザ光を
発生する一対のレーザ光源１、２１と、各レーザ光源
１、２１から出射したレーザ光から照明に最適な波長の
レーザ光をそれぞれ選択する一対の励起フィルタ装置
２、２２と、各励起フィルタ装置２、２２を通過したレ
ーザ光のパワーをそれぞれ調節する一対の調光フィルタ
装置３、２３と、各調光フィルタ装置３、２３を通過し
た複数波長のレーザ光を混合するための反射ミラー２４
及びダイクロイックミラー２５とを備える。

【００１８】また、レーザ走査顕微鏡は、照明光監視装
置として、上記の光源装置から出射した複数波長のレー
ザ光の一部を参照光として分割する分割装置である参照
光分離ミラー４と、参照光分離ミラー４で部分的に分割
された参照光から目的とする波長の参照光のみを選択し
て透過させる波長選択装置１６と、波長選択装置１６で
選択された参照光のパワーを検出する強度検出器１７と
備える。

【００１９】また、レーザ走査顕微鏡は、走査検出装置
として、照明用のレーザ光と検出光とを分離する検出光
分離ミラー６と、検出光分離ミラー６で反射されたレー
ザ光の光路を走査のために調節する水平スキャナ７及び
垂直スキャナ８と、これらの水平スキャナ７及び垂直ス
キャナ８を通過したレーザ光をステージ１０上の試料Ｓ
Ｐの位置に集光する対物レンズ９と、このレーザ光によ
り試料ＳＰから出射し、対物レンズ９を通過し、垂直ス
キャナ８及び水平スキャナ７でデスキャニングされ、検
出光分離ミラー６を通過した検出光を選択的に通過させ
るピンホール装置１１と、ピンホール装置１１を通過し
た検出光から所望波長の光を選択する検出フィルタ装置
１２と、検出フィルタ装置１２を通過した検出光を電気
信号に変換する光電変換装置１３とを備える。

【００２０】また、レーザ走査顕微鏡は、参照光分離ミ
ラー４と検出光分離ミラー６との間に配置されて光源装
置からのレーザ光を遮断して試料ＳＰへのレーザ光の入
射を阻止することができるレーザシャッタ５を備える。

【００２１】さらに、レーザ走査顕微鏡は、レーザ走査
顕微鏡全体を統括制御するとともに、光電変換装置１３
で検出した電気信号に適当な処理を施して表示装置１５
に試料像を表示する制御処理装置１４を備える。

【００２２】この制御処理装置１４は、レーザ光源１、
２１を制御してこれらから出力されるレーザパワーを調
節し、励起フィルタ装置２、２２を制御して照明用に使
用するレーザ光の波長を選択するとともに、調光フィル
タ装置３、２３を制御して照明用に使用するレーザ光の
強度を調節する。また、制御処理装置１４は、波長選択
装置１６を制御して参照光として検出すべきレーザ光の
波長を選択するとともに、強度検出器１７の検出出力に
基づいて、選択された波長での参照光のパワーを監視す
る。さらに、制御処理装置１４は、両スキャナ７、８を
制御して励起用のレーザ光の試料ＳＰ位置における走査
スポットを監視し、ステージ１０を制御して試料ＳＰの
位置を監視し、ピンホール装置１１を制御して必要な開
口径のピンホールを検出光の光路上に配置するととも
に、検出フィルタ装置１２を制御して必要な検出波長の
みを選択して光電変換装置１３に入射させる。

【００２３】光源装置に設けた励起フィルタ装置２、２
２は、例えば複数のバンドパスフィルタを適所に固定し
たタレット板からなり、このタレット板を電動で回転さ
せていずれかのバンドパスフィルタをレーザ光の光路上
に配置することにより、各レーザ光源１、２１から所望
の波長のレーザ光のみを取り出すことができるようにな
っている。

【００２４】各調光フィルタ装置３、２３は、レーザ光
源１、２１自体に調光機能がない場合（例えばＨｅ−Ｎ
ｅレーザ）において、レーザパワーをアナログ的に微妙
に調整するためのものである。この調光フィルタ装置
３、２３として、例えば透過率が連続的に変化するよう
な連続ＮＤフィルタや、音響光学効果を利用し結晶内の
粗密波の振幅を変化させて透過率を連続的に変化するよ
うな音響光学素子等を用いることができ、制御処理装置
１４からの制御信号に基づいて、光源装置から出力され
るレーザ光のレーザパワーを簡易に調節することができ
る。

【００２５】照明光監視装置に設けた参照光分離ミラー
４は、光源装置から供給されるレーザ光の光量を直接モ
ニタするためのもので、例えば単なる板ガラスであって
もよい。このような板ガラスの表面反射によって、数パ
ーセントのレーザ光が分割され参照光として波長選択装
置１６及び強度検出器１７側に導かれる。このような板
ガラスには、波長選択性がほとんどなく、分割された参
照光には、光源装置から出射するレーザ光の波長分布に
対応する強度の複数波長のレーザ光が含まれている。

【００２６】波長選択装置２６は、参照光分離ミラー４
によって分割された参照光から目的とする波長を選択す
る。波長選択装置１６は、制御処理装置１４からの制御
信号に基づいて、選択する波長を切り替えることができ
るようになっている。波長の切り替えのためには、必要
とする切り替え速度によって各種の機構を採用すること
ができる。あまり迅速な切り替えが要求されない場合、
例えば所望のバンドパスフィルタを位置合わせ用のホル
ダに手動で挿入することで目的を達成できる。やや迅速
な切り替えが要求される場合、複数のバンドパスフィル
タを取り付けたタレット板を電動で回転させて所望のバ
ンドパスフィルタを参照光の光路上に配置することで目
的を達成できる。さらに高速性が要求される場合、音響
光学変換素子（ＡＯＴＦ）で波長を選択して必要な波長
の参照光のみを強度検出器１７に導くことも可能であ
る。

【００２７】強度検出器１７は、例えばシリコンフォト
ダイオード（ＳＰＤ）で構成されており、参照光のパワ
ーに応じて出力する電流を電圧に変換する。これによ
り、制御処理装置１４側では、試料ＳＰに供給されるレ
ーザ光のレーザパワーを電圧としてモニタできるように
なっている。

【００２８】レーザシャッタ５は、照明用のレーザ光の
光路上に移動してレーザ光が試料ＳＰに入射するのを阻
止する動作位置と、照明用のレーザ光光路外に移動して
レーザ光が試料ＳＰに入射するのを許容する退避位置と
の間で可動となっており、制御処理装置１４に制御され
て、必要なときだけ試料ＳＰにレーザ光が入射するよう
にする。

【００２９】検出光分離ミラー６は、照明用のレーザ光
と検出光とを分離するためのものであり、例えば蛍光観
察であればダイクロイックミラー、反射観察であればハ
ーフミラーまたは偏向ビームスプリッタを利用する。

【００３０】水平スキャナ７及び垂直スキャナ８は、例
えばガルバノミラーを用いることができる。

【００３１】ピンホール装置１１は、例えば複数の異な
る開口径のピンホールを適所に設けたプレートからな
り、このプレートを電動で回転させていずれかのピンホ
ールを検出光の光路上に配置することにより、必要なコ
ンフォーカル効果を得ることができるようになってい
る。

【００３２】検出フィルタ装置１２は、例えば複数のバ
ンドパスフィルタを適所に固定したタレット板からな
り、このタレット板を電動で回転させていずれかのバン
ドパスフィルタを検出光の光路上に配置することによ
り、試料ＳＰからの蛍光や反射光のうち所望の波長の光
のみを取り出すことができるようになっている。

【００３３】また、光電変換装置１３は、例えばフォト
マルチプライヤーチューブ（ＰＭＴ）で構成され、試料
が発する光の強度に応じた信号を出力する。

【００３４】以下、図１の装置の動作について説明す
る。レーザ光源１、２１から射出されたレーザ光は、励
起フィルタ２、２２によって波長が選択された後、調光
フィルタ３、２３によってパワーが調整される。調光さ
れたレーザ光は、参照光分離ミラー４を通過し、照明用
のレーザ光と検出光とを分離する検出光分離ミラー６で
反射され、水平スキャナ７、垂直スキャナ８に導かれ
る。両スキャナ７、８に入射したレーザ光は、対物レン
ズ９により点光源となり試料ＳＰを２次元走査する。一
方、このレーザ光により発生する試料ＳＰからの検出光
（蛍光観察であれば蛍光、反射観察であれば反射光）は
光路を逆行して、垂直スキャナ８、水平スキャナ７でデ
スキャニングされ、検出光分離ミラー６を透過し、照射
用のレーザ光と分離される。検出光分離ミラー６を透過
した検出光は、光電変換装置１３に入射して電気信号に
変換され、制御処理装置１４で画像に変換される。

【００３５】この際、調光フィルタ３、２３の後方に設
けた参照光分離ミラー４により、調光後のレーザ光につ
いてそのレーザパワーをモニタできるため、試料ＳＰを
照明するレーザパワーと光量モニタ用の強度検出器１７
の出力との相関が取れることになる。逆に言えば、強度
検出器１７の出力値が同じになるように調光フィルタ
３、２３を調整すれば、試料ＳＰを照明するレーザパワ
ーを同一にすることが容易に可能である。また、参照光
分離ミラー４の後ろにレーザシャッタ５が配置されてい
るので、レーザシャッタ５を閉じている状態、つまり、
試料ＳＰにレーザ光を照射していない状態でレーザパワ
ーをモニタし、調光フィルタ３、２３で照明用のレーザ
光のレーザパワーを適当に調整することが可能となる。

【００３６】複数のレーザ光源１、２１からの複数波長
のレーザパワーを同時にモニタする場合、波長選択装置
２６によって選択する参照光の波長を適当なタイミング
で順次切り替える。選択された波長は、強度検出器１７
の出力とともに制御処理装置１４でモニタされており、
各波長ごとのレーザパワーを求めることができる。この
際、参照光分離ミラー４、波長選択装置１６、ダイクロ
イックミラー２５等の透過及び反射の波長特性を予め測
定しておけば試料ＳＰ上での照明用のレーザ光の強度の
絶対値を概算することもできる。以上のような、照明光
監視装置を設けることにより、複数波長のレーザ光ごと
に格別のモニタ機構を設ける必要がなくなる。

【００３７】以上、実施形態に即してこの発明を説明し
たが、本発明は上記実施形態に限定されるものではな
い。例えば、レーザ装置１、２１は、複数波長のレーザ
光を発生する単一のレーザ装置（例えばＫｒ−Ａｒレー
ザ）とすることができる。この場合、レーザ装置自体に
も用意されていない単一波長でのパワーモニタが可能と
なる。なお、単一のレーザ装置とした場合、各励起フィ
ルタ装置や調光フィルタ装置も単一で足る。

【００３８】また、上記実施形態では、走査型のレーザ
顕微鏡について説明したが、試料ＳＰの観察領域全体を
照明する非走査型のレーザ顕微鏡であっても、照明用の
レーザ光を上記のような参照光分離ミラー４、波長選択
装置１６、強度検出器１７等を備える照明光監視装置に
よって監視するすることができる。この場合、スキャナ
７、８は使用しない。

【００３９】また、上記実施形態では、コンフォーカル
タイプのレーザ顕微鏡について説明したが、本発明はコ
ンフォーカルタイプのレーザ顕微鏡に限定されるもので
はない。この場合、ピンホール装置１１は使用しない。

【００４０】

【発明の効果】本発明のレーザ顕微鏡によれば、前記分
割装置が、前記光源からの前記複数のレーザ光が試料に
照射される前にその一部分を参照光として分割し、前記
波長選択装置が、前記分割装置で分割された前記参照光
のうち所定波長成分の光を選択し、強度検出装置が、前
記波長選択装置で選択された前記所定波長成分の光の強
度を検出するので、対象とする波長のレーザ光のみを簡
易な機構によって選択的にモニタすることができる。

【００４１】また、好ましい態様によれば、前記分割装
置と前記試料との間の光路上に配置されて前記試料への
前記複数のレーザ光の照射を遮断可能なシャッタ装置を
さらに備えるので、前記試料へのレーザ光の照射を遮断
したままで対象とする波長のレーザ光のみを選択的にモ
ニタすることができ、試料にダメージが発生することを
簡易に回避することができる。

【００４２】また、別の態様のレーザ顕微鏡によれば、
前記強度検出装置が、前記分割装置で分割された前記参
照光の強度を検出し、前記シャッタ装置が、前記分割装
置と前記試料との間の光路上に配置されて、前記試料へ
の前記レーザ光の照射を遮断可能であるので、試料での
ダメージ発生を回避しつつレーザパワーを必要なタイミ
ングで正確にモニタすることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施形態のレーザ走査顕微鏡の構造を説明する
ブロック図である。

【符号の説明】

１，２１ レーザ光源 ２，２２ 励起フィルタ装置 ３，２３ 調光フィルタ装置 ４ 参照光分離ミラー ５ レーザシャッタ ６ 検出光分離ミラー ７ 水平スキャナ ８ 垂直スキャナ ９ 対物レンズ １０ ステージ １１ ピンホール装置 １２ 検出フィルタ １３ 光電変換装置 １４ 制御処理装置 １６ 波長選択装置 １７ 強度検出装置 ２４ 全反射ミラー ２５ ダイクロイックミラー ＳＰ 試料

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 互いに波長が異なる複数のレーザ光を発
   生する光源と、 前記光源からの前記複数のレーザ光を対物レンズを介し
   て試料に照射する照明光学系と、 前記複数のレーザ光の照射により前記試料から発する光
   を取得して試料像を得る観察光学系と、 前記光源からの前記複数のレーザ光が前記試料に照射さ
   れる前に当該複数のレーザ光の一部分を参照光として分
   割する分割装置と、 前記分割装置で分割された前記参照光のうち所定波長成
   分の光を選択する波長選択装置と、 前記波長選択装置で選択された前記所定波長成分の光の
   強度を検出する強度検出装置と、を備えることを特徴と
   するレーザ顕微鏡。
2. 【請求項２】 前記分割装置と前記試料との間の光路上
   に配置されて前記試料への前記複数のレーザ光の照射を
   遮断可能なシャッタ装置をさらに備えることを特徴とす
   る請求項１記載のレーザ顕微鏡。
3. 【請求項３】 レーザ光を発生する光源と、 前記光源からの前記レーザ光を対物レンズを介して試料
   に照射する照明光学系と、 前記レーザ光の照射により前記試料から発する光を取得
   して試料像を得る観察光学系と、 前記光源からの前記レーザ光が前記試料に照射される前
   に当該レーザ光の一部分を参照光として分割する分割装
   置と、 前記分割装置で分割された前記参照光の強度を検出する
   強度検出装置と、 前記分割装置と前記試料との間の光路上に配置されて前
   記試料への前記レーザ光の照射を遮断可能なシャッタ装
   置とを備えることを特徴とするレーザ顕微鏡。