JPH11178582A - 核酸分子の増幅方法及びタンパクの合成方法 - Google Patents
核酸分子の増幅方法及びタンパクの合成方法Info
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- JPH11178582A JPH11178582A JP10081341A JP8134198A JPH11178582A JP H11178582 A JPH11178582 A JP H11178582A JP 10081341 A JP10081341 A JP 10081341A JP 8134198 A JP8134198 A JP 8134198A JP H11178582 A JPH11178582 A JP H11178582A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 単一種類の核酸分子を簡便にかつ効率良く増
幅する方法、ＰＣＲで得られたＤＮＡから、簡便に十分
な量のタンパクを合成させることのできる、無細胞タン
パク合成系を用いたタンパクの製造方法、及びタンパク
ライブラリーの簡便な構築方法を提供すること。 【解決手段】 ＰＣＲにより目的の核酸分子を増幅させ
る方法において、増幅したい核酸分子を含む核酸分子群
を単離・精製した後、ＰＣＲ反応液中におけるプライマ
ー以外の増幅可能核酸分子が、目的の核酸分子のみから
なる状態とし、かつ用いるプライマーの濃度を一種類の
プライマーにつき１００ｎＭ以下として、ＰＣＲを行
う。無細胞抽出液を含む無細胞タンパク合成系でタンパ
クを製造する方法において、プロモーターＤＮＡ配列、
リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパクをコードする
ＤＮＡ配列、及びターミネーターＤＮＡ配列又は変異タ
ーミネーターＤＮＡ配列を含み、かつ前記４種のＤＮＡ
配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上である鋳型ＤＮ
Ａを用いてタンパクを製造する方法。
幅する方法、ＰＣＲで得られたＤＮＡから、簡便に十分
な量のタンパクを合成させることのできる、無細胞タン
パク合成系を用いたタンパクの製造方法、及びタンパク
ライブラリーの簡便な構築方法を提供すること。 【解決手段】 ＰＣＲにより目的の核酸分子を増幅させ
る方法において、増幅したい核酸分子を含む核酸分子群
を単離・精製した後、ＰＣＲ反応液中におけるプライマ
ー以外の増幅可能核酸分子が、目的の核酸分子のみから
なる状態とし、かつ用いるプライマーの濃度を一種類の
プライマーにつき１００ｎＭ以下として、ＰＣＲを行
う。無細胞抽出液を含む無細胞タンパク合成系でタンパ
クを製造する方法において、プロモーターＤＮＡ配列、
リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパクをコードする
ＤＮＡ配列、及びターミネーターＤＮＡ配列又は変異タ
ーミネーターＤＮＡ配列を含み、かつ前記４種のＤＮＡ
配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上である鋳型ＤＮ
Ａを用いてタンパクを製造する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸分子の増幅方
法に関し、特に、単一種類の核酸分子を簡便にかつ効率
良く増幅する方法に関する。本発明はまた、無細胞タン
パク合成系を用いたタンパクの製造方法に関する。本発
明はさらに、上記核酸分子の増幅方法、及びタンパクの
合成方法を利用した、タンパクライブラリーを構築する
方法に関する。
法に関し、特に、単一種類の核酸分子を簡便にかつ効率
良く増幅する方法に関する。本発明はまた、無細胞タン
パク合成系を用いたタンパクの製造方法に関する。本発
明はさらに、上記核酸分子の増幅方法、及びタンパクの
合成方法を利用した、タンパクライブラリーを構築する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】多種類の核酸分子群の中から、単一種類
の核酸分子のみを増幅させる方法としては、プラスミド
と大腸菌や酵母などの宿主微生物とを組み合わせる方法
が採用されてきた。これは、プラスミドが、大腸菌や酵
母などの宿主微生物の中に１分子しか取り込まれないと
いう性質を利用したもので、塩化カルシウム法やエレク
トロポレーション法などでプラスミドを宿主微生物に導
入し、その微生物を単離・増殖させることで単一種類の
核酸分子を含む微生物の集団が得られ、その結果として
単一種類の核酸分子を増幅させる方法である。しかし、
目的の核酸分子をプラスミドに結合する操作、そのプラ
スミドを宿主微生物に導入する操作、微生物を単離・増
殖させる操作等は非常に煩雑であり、高度な技術と多大
な時間及び経費を必要とする。とりわけ、アミノ酸配列
をコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列を変化させ、その
ＤＮＡ変異体を用いてアミノ酸配列の変化した変異体タ
ンパクを作成し、産業上より有効なタンパクを創出する
分野においては、莫大な種類のＤＮＡ分子を単一種類の
分子に単離する必要があり、その作業は極めて困難であ
る。また、無細胞タンパク合成系は、生物や培養細胞等
の生きた細胞を用いる系に比べ、タンパク合成に至るま
での操作が非常に簡便であることから、近年その需要が
高まっている。一方、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリ
アクション）は大変有効かつ簡便なＤＮＡ遺伝子増幅方
法であり、この両技術を組み合わせ、プラスミドＤＮＡ
を用いずに、ＰＣＲにより得られたＤＮＡから直接その
ＤＮＡがコードするタンパクを容易かつ大量に合成でき
る技術の開発が待たれている。ＰＣＲ産物のＤＮＡを用
いて無細胞タンパク合成を行わせる系は既に知られてい
る（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, 412-417,
1997) 。しかしながら、従来、量的に十分なタンパクを
合成することは難しく、タンパクの合成量を増加させる
ことが重要な課題であった。
の核酸分子のみを増幅させる方法としては、プラスミド
と大腸菌や酵母などの宿主微生物とを組み合わせる方法
が採用されてきた。これは、プラスミドが、大腸菌や酵
母などの宿主微生物の中に１分子しか取り込まれないと
いう性質を利用したもので、塩化カルシウム法やエレク
トロポレーション法などでプラスミドを宿主微生物に導
入し、その微生物を単離・増殖させることで単一種類の
核酸分子を含む微生物の集団が得られ、その結果として
単一種類の核酸分子を増幅させる方法である。しかし、
目的の核酸分子をプラスミドに結合する操作、そのプラ
スミドを宿主微生物に導入する操作、微生物を単離・増
殖させる操作等は非常に煩雑であり、高度な技術と多大
な時間及び経費を必要とする。とりわけ、アミノ酸配列
をコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列を変化させ、その
ＤＮＡ変異体を用いてアミノ酸配列の変化した変異体タ
ンパクを作成し、産業上より有効なタンパクを創出する
分野においては、莫大な種類のＤＮＡ分子を単一種類の
分子に単離する必要があり、その作業は極めて困難であ
る。また、無細胞タンパク合成系は、生物や培養細胞等
の生きた細胞を用いる系に比べ、タンパク合成に至るま
での操作が非常に簡便であることから、近年その需要が
高まっている。一方、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリ
アクション）は大変有効かつ簡便なＤＮＡ遺伝子増幅方
法であり、この両技術を組み合わせ、プラスミドＤＮＡ
を用いずに、ＰＣＲにより得られたＤＮＡから直接その
ＤＮＡがコードするタンパクを容易かつ大量に合成でき
る技術の開発が待たれている。ＰＣＲ産物のＤＮＡを用
いて無細胞タンパク合成を行わせる系は既に知られてい
る（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, 412-417,
1997) 。しかしながら、従来、量的に十分なタンパクを
合成することは難しく、タンパクの合成量を増加させる
ことが重要な課題であった。
【０００３】
【発明が解決しようする課題】本発明の第１の目的は、
単一種類の核酸分子を簡便にかつ効率良く増幅する方法
を提供することにある。本発明の第２の目的は、簡便に
十分な量のタンパクを合成させることのできる、無細胞
タンパク合成系を用いたタンパクの製造方法を提供する
ことにある。本発明の第３の目的は、タンパクライブラ
リーを簡便にかつ効率良く構築する方法を提供すること
である。
単一種類の核酸分子を簡便にかつ効率良く増幅する方法
を提供することにある。本発明の第２の目的は、簡便に
十分な量のタンパクを合成させることのできる、無細胞
タンパク合成系を用いたタンパクの製造方法を提供する
ことにある。本発明の第３の目的は、タンパクライブラ
リーを簡便にかつ効率良く構築する方法を提供すること
である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】前記の目的を達成するた
めに本発明者らは鋭意研究を重ね、増幅したい核酸分子
を含む核酸分子群を単離・精製し、目的核酸分子のモル
濃度が極めて低い状態で、かつ充分に低い濃度のプライ
マーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクショ
ン）を行うことで、目的の単一核酸分子のみを効率良く
増幅できることを見出し、本発明を完成させるに至っ
た。
めに本発明者らは鋭意研究を重ね、増幅したい核酸分子
を含む核酸分子群を単離・精製し、目的核酸分子のモル
濃度が極めて低い状態で、かつ充分に低い濃度のプライ
マーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクショ
ン）を行うことで、目的の単一核酸分子のみを効率良く
増幅できることを見出し、本発明を完成させるに至っ
た。
【０００５】本発明は、ＰＣＲにより目的の核酸分子を
増幅させる方法において、増幅したい核酸分子を含む核
酸分子群を単離・精製した後、ＰＣＲ反応液中における
プライマー以外の増幅可能核酸分子が、目的の核酸分子
のみからなる状態とし、かつ用いるプライマーの濃度を
一種類のプライマーにつき１００ｎＭ以下として、ＰＣ
Ｒを行うことを特徴とする、核酸分子の増幅方法を提供
するものである。ここで単一種類の核酸分子とは、塩基
配列によって特定されるＤＮＡ、ＲＮＡの何れをも意味
するものとする。本発明はまた、無細胞抽出液を含む無
細胞タンパク合成系でタンパクを製造する方法におい
て、上記本発明の方法により得られた単一種類の核酸を
鋳型として使用することを特徴とする方法を提供するも
のである。ここで無細胞タンパク合成系とは、ｍＲＮＡ
の情報を読み取ってタンパクやポリペプチドを合成する
無細胞翻訳系、並びにＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成
する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む系の何れ
をも意味するものとする。本発明はさらに、上記本発明
の核酸増幅方法を、少なくとも２種の核酸分子について
別々に実施し、増幅された該少なくとも２種の核酸のそ
れぞれ１種を鋳型として用いて上記本発明のタンパク製
造方法を各核酸毎に実施し、得られた該少なくとも２種
の核酸がそれぞれコードする少なくとも２種のタンパク
からなるタンパクライブラリーを構築する方法を提供す
るものである。
増幅させる方法において、増幅したい核酸分子を含む核
酸分子群を単離・精製した後、ＰＣＲ反応液中における
プライマー以外の増幅可能核酸分子が、目的の核酸分子
のみからなる状態とし、かつ用いるプライマーの濃度を
一種類のプライマーにつき１００ｎＭ以下として、ＰＣ
Ｒを行うことを特徴とする、核酸分子の増幅方法を提供
するものである。ここで単一種類の核酸分子とは、塩基
配列によって特定されるＤＮＡ、ＲＮＡの何れをも意味
するものとする。本発明はまた、無細胞抽出液を含む無
細胞タンパク合成系でタンパクを製造する方法におい
て、上記本発明の方法により得られた単一種類の核酸を
鋳型として使用することを特徴とする方法を提供するも
のである。ここで無細胞タンパク合成系とは、ｍＲＮＡ
の情報を読み取ってタンパクやポリペプチドを合成する
無細胞翻訳系、並びにＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成
する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む系の何れ
をも意味するものとする。本発明はさらに、上記本発明
の核酸増幅方法を、少なくとも２種の核酸分子について
別々に実施し、増幅された該少なくとも２種の核酸のそ
れぞれ１種を鋳型として用いて上記本発明のタンパク製
造方法を各核酸毎に実施し、得られた該少なくとも２種
の核酸がそれぞれコードする少なくとも２種のタンパク
からなるタンパクライブラリーを構築する方法を提供す
るものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明において増幅を目的とする
核酸分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡである。以下、本発明に
おける核酸分子群の単離・精製、ＰＣＲの各段階につい
て詳細に説明する。 ｉ．目的核酸分子を含む核酸分子群の単離・精製 本発明で使用される、目的核酸分子を含む核酸分子群
は、ライゲーション反応で連結したＤＮＡ、ＲＮＡから
逆転写反応で合成したＤＮＡ等、ＰＣＲ反応の基質とな
り得るいかなる核酸分子群でもよい。核酸分子群の単離
・精製は、用いる材料に応じて異なるが、通常のいかな
る方法を用いても良い。具体的には、ＨＰＬＣ（高速液
体クロマトグラフィー）、電気泳動、ビチオン化プライ
マー・アビジン法、プライマー固定チューブ法など、通
常用いられるいかなる方法でも良い。しかし、目的核酸
分子に損傷を与えず、目的核酸分子を有効に単離・精製
できる方法を用いる必要がある。目的核酸分子群の単離
・精製を行わないと、目的核酸分子とはまったく類似性
の無い核酸分子の増幅がおこる場合が多い。従って、本
発明では、目的核酸分子群の単離・精製を行うことによ
り、試料に含まれる可能性のある目的核酸分子以外の核
酸分子を除去することが必要である。試料に含まれる目
的核酸分子以外の核酸分子としては例えば、実験器具、
手などに由来する混入ＤＮＡ、目的核酸分子をＰＣＲで
増幅して試料を作成した場合にはその際用いたプライマ
ー等が挙げられる。本発明において、増幅したい核酸分
子を含む核酸分子群を単離・精製することによりほぼ同
一の分子量を有する核酸からなる核酸分子群が得られ
る。
核酸分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡである。以下、本発明に
おける核酸分子群の単離・精製、ＰＣＲの各段階につい
て詳細に説明する。 ｉ．目的核酸分子を含む核酸分子群の単離・精製 本発明で使用される、目的核酸分子を含む核酸分子群
は、ライゲーション反応で連結したＤＮＡ、ＲＮＡから
逆転写反応で合成したＤＮＡ等、ＰＣＲ反応の基質とな
り得るいかなる核酸分子群でもよい。核酸分子群の単離
・精製は、用いる材料に応じて異なるが、通常のいかな
る方法を用いても良い。具体的には、ＨＰＬＣ（高速液
体クロマトグラフィー）、電気泳動、ビチオン化プライ
マー・アビジン法、プライマー固定チューブ法など、通
常用いられるいかなる方法でも良い。しかし、目的核酸
分子に損傷を与えず、目的核酸分子を有効に単離・精製
できる方法を用いる必要がある。目的核酸分子群の単離
・精製を行わないと、目的核酸分子とはまったく類似性
の無い核酸分子の増幅がおこる場合が多い。従って、本
発明では、目的核酸分子群の単離・精製を行うことによ
り、試料に含まれる可能性のある目的核酸分子以外の核
酸分子を除去することが必要である。試料に含まれる目
的核酸分子以外の核酸分子としては例えば、実験器具、
手などに由来する混入ＤＮＡ、目的核酸分子をＰＣＲで
増幅して試料を作成した場合にはその際用いたプライマ
ー等が挙げられる。本発明において、増幅したい核酸分
子を含む核酸分子群を単離・精製することによりほぼ同
一の分子量を有する核酸からなる核酸分子群が得られ
る。
【０００７】ii．目的核酸分子のみとする方法 本発明において、ＰＣＲ反応液中におけるプライマー以
外の増幅可能核酸分子が、目的の核酸分子のみからなる
状態にする手段としては種々の方法が挙げられるが、増
幅したい核酸分子を含む核酸分子群を単離・精製した
後、稀釈するのが最も簡便な方法である。稀釈により容
易に、ＰＣＲ反応液中におけるプライマー以外の増幅可
能核酸分子の数を一分子もしくは、二分子以上の単一種
類の分子からなる状態、すなわち、プライマー以外の増
幅可能核酸分子が目的の核酸分子のみからなる状態とす
ることができる。稀釈する際には、核酸分子のチューブ
壁面への吸着を防ぐため、ｔＲＮＡ等を添加することが
望ましい。その添加量は、０．１〜１０μg ／ml程度が
適当である。
外の増幅可能核酸分子が、目的の核酸分子のみからなる
状態にする手段としては種々の方法が挙げられるが、増
幅したい核酸分子を含む核酸分子群を単離・精製した
後、稀釈するのが最も簡便な方法である。稀釈により容
易に、ＰＣＲ反応液中におけるプライマー以外の増幅可
能核酸分子の数を一分子もしくは、二分子以上の単一種
類の分子からなる状態、すなわち、プライマー以外の増
幅可能核酸分子が目的の核酸分子のみからなる状態とす
ることができる。稀釈する際には、核酸分子のチューブ
壁面への吸着を防ぐため、ｔＲＮＡ等を添加することが
望ましい。その添加量は、０．１〜１０μg ／ml程度が
適当である。
【０００８】iii. ＰＣＲ反応液中のプライマーの濃度 本発明においては、ＰＣＲ反応液中におけるプライマー
の濃度を一種類のプライマーにつき１００ｎＭ以下とし
てＰＣＲを行うことが必要であり、好ましくは１０ｎＭ
以下としてＰＣＲを行うことが望ましい。プライマーの
濃度が、１００ｎＭを越えると、プライマー同士間で非
特異的な増幅反応が起こりやすくなり、所謂プライマー
ダイマー等、プライマー同士の増幅が起こり、目的の核
酸分子の増幅効率が低下し、収量が低下する。
の濃度を一種類のプライマーにつき１００ｎＭ以下とし
てＰＣＲを行うことが必要であり、好ましくは１０ｎＭ
以下としてＰＣＲを行うことが望ましい。プライマーの
濃度が、１００ｎＭを越えると、プライマー同士間で非
特異的な増幅反応が起こりやすくなり、所謂プライマー
ダイマー等、プライマー同士の増幅が起こり、目的の核
酸分子の増幅効率が低下し、収量が低下する。
【０００９】iv．耐熱性ポリメラーゼ 通常使用されるいかなるものでもよい。また反応の開始
はプライマーダイマーの生成を防ぐため、ホットスター
ト法が望ましい。
はプライマーダイマーの生成を防ぐため、ホットスター
ト法が望ましい。
【００１０】本発明において、単一種類の核酸分子が増
幅されたことの確認は、ＰＣＲで得られた核酸、例え
ば、ＤＮＡそのもの、もしくはそれをプラスミドにクロ
ーニングしたもののシークエンスを決定することにより
行うことができる。
幅されたことの確認は、ＰＣＲで得られた核酸、例え
ば、ＤＮＡそのもの、もしくはそれをプラスミドにクロ
ーニングしたもののシークエンスを決定することにより
行うことができる。
【００１１】次に、無細胞抽出液を含む無細胞タンパク
合成系でタンパクを製造する方法について説明する。本
発明において、鋳型として使用する核酸は、上記本発明
の増幅方法により増幅されたものであればよく、特に限
定されない。しかし、好ましくは、プロモーターＤＮＡ
配列、リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパクをコー
ドするＤＮＡ配列、及びターミネーターＤＮＡ配列又は
変異ターミネーターＤＮＡ配列を含み、かつ前記４種の
ＤＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上である鋳
型ＤＮＡである。
合成系でタンパクを製造する方法について説明する。本
発明において、鋳型として使用する核酸は、上記本発明
の増幅方法により増幅されたものであればよく、特に限
定されない。しかし、好ましくは、プロモーターＤＮＡ
配列、リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパクをコー
ドするＤＮＡ配列、及びターミネーターＤＮＡ配列又は
変異ターミネーターＤＮＡ配列を含み、かつ前記４種の
ＤＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上である鋳
型ＤＮＡである。
【００１２】プロモーターＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成
時にＲＮＡポリメラーゼが最初に結合するＤＮＡ配列で
あり、リボソーム結合ＤＮＡ配列は、タンパク合成の際
に、リボソーム（タンパク合成をつかさどる複合体）が
結合する部位のＤＮＡ配列であり、ターミネーターＤＮ
Ａ配列又は変異ターミネーターＤＮＡ配列は、ＲＮＡポ
リメラーゼによるｍＲＮＡの合成を停止させる配列（転
写終結配列）である。本発明においては、前記４種のＤ
ＮＡ配列をこの順に結合し、その合計が全ＤＮＡ配列の
５０％以上である鋳型ＤＮＡを用いることが好ましい。
前記４種のＤＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％未
満では、タンパク合成に必要なＤＮＡ部分以外に、タン
パク合成に直接関係の無いＤＮＡ配列を合成し、結合す
る必要があり、ＤＮＡの製造コストがかかり、タンパク
の合成効率も低下する。本発明に使用する無細胞抽出液
としては、小麦胚芽抽出液、大腸菌細胞抽出液、ウサギ
網状赤血球抽出液等があげられる。
時にＲＮＡポリメラーゼが最初に結合するＤＮＡ配列で
あり、リボソーム結合ＤＮＡ配列は、タンパク合成の際
に、リボソーム（タンパク合成をつかさどる複合体）が
結合する部位のＤＮＡ配列であり、ターミネーターＤＮ
Ａ配列又は変異ターミネーターＤＮＡ配列は、ＲＮＡポ
リメラーゼによるｍＲＮＡの合成を停止させる配列（転
写終結配列）である。本発明においては、前記４種のＤ
ＮＡ配列をこの順に結合し、その合計が全ＤＮＡ配列の
５０％以上である鋳型ＤＮＡを用いることが好ましい。
前記４種のＤＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％未
満では、タンパク合成に必要なＤＮＡ部分以外に、タン
パク合成に直接関係の無いＤＮＡ配列を合成し、結合す
る必要があり、ＤＮＡの製造コストがかかり、タンパク
の合成効率も低下する。本発明に使用する無細胞抽出液
としては、小麦胚芽抽出液、大腸菌細胞抽出液、ウサギ
網状赤血球抽出液等があげられる。
【００１３】以下本発明に使用する無細胞抽出液の調製
から無細胞タンパク合成系におけるタンパク合成活性の
測定までの各段階について詳細に説明する。 ｉ．無細胞抽出液の調製 無細胞抽出液の調製は、用いる材料に応じて異なるが、
通常のいかなる方法を用いても良い。 ii．無細胞タンパク合成反応 反応液には、無細胞抽出液の他、目的とするタンパクを
コードするＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、タン
パクの構成アミノ酸、緩衝剤、ＡＴＰ、ＧＴＰ等のエネ
ルギー源、クレアチンホスフェート、クレアチンホスフ
ォキナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸、ピルビン
酸キナーゼ等のＡＴＰ再生系、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）、スペルミン、スペルミジン等の安定化剤、ＲＮ
ａｓｅ阻害剤を適量加える。反応は、用いる無細胞抽出
液及び目的とするタンパクの種類等により最適の温度で
行われ、一般に２０〜４０℃が適当である。
から無細胞タンパク合成系におけるタンパク合成活性の
測定までの各段階について詳細に説明する。 ｉ．無細胞抽出液の調製 無細胞抽出液の調製は、用いる材料に応じて異なるが、
通常のいかなる方法を用いても良い。 ii．無細胞タンパク合成反応 反応液には、無細胞抽出液の他、目的とするタンパクを
コードするＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、タン
パクの構成アミノ酸、緩衝剤、ＡＴＰ、ＧＴＰ等のエネ
ルギー源、クレアチンホスフェート、クレアチンホスフ
ォキナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸、ピルビン
酸キナーゼ等のＡＴＰ再生系、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）、スペルミン、スペルミジン等の安定化剤、ＲＮ
ａｓｅ阻害剤を適量加える。反応は、用いる無細胞抽出
液及び目的とするタンパクの種類等により最適の温度で
行われ、一般に２０〜４０℃が適当である。
【００１４】タンパク合成に用いられるアミノ酸配列の
情報は、ｍＲＮＡの形でタンパク合成系にもたらされ
る。このｍＲＮＡは鋳型ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼ
による転写反応で合成される。ＲＮＡポリメラーゼは、
まずその種類に特異的なプロモーター配列をＤＮＡ上に
見出しその部分に結合し、続いてＲＮＡの合成を開始す
る。ＲＮＡの合成は、ＤＮＡ配列が無くなった部分で自
然に終了する（ｒｕｎ−ｏｆｆ）か、ＲＮＡポリメラー
ゼの種類に特異的なターミネーター配列が現れた時点で
終了する。従来主として用いられてきたプラスミドＤＮ
Ａを鋳型として用いる方法においては、ｒｕｎ−ｏｆｆ
法とターミネーター配列を用いる方法とで、タンパク合
成の効率に差が無かった。このため、より簡便なｒｕｎ
−ｏｆｆ法が主に用いられてきた。
情報は、ｍＲＮＡの形でタンパク合成系にもたらされ
る。このｍＲＮＡは鋳型ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼ
による転写反応で合成される。ＲＮＡポリメラーゼは、
まずその種類に特異的なプロモーター配列をＤＮＡ上に
見出しその部分に結合し、続いてＲＮＡの合成を開始す
る。ＲＮＡの合成は、ＤＮＡ配列が無くなった部分で自
然に終了する（ｒｕｎ−ｏｆｆ）か、ＲＮＡポリメラー
ゼの種類に特異的なターミネーター配列が現れた時点で
終了する。従来主として用いられてきたプラスミドＤＮ
Ａを鋳型として用いる方法においては、ｒｕｎ−ｏｆｆ
法とターミネーター配列を用いる方法とで、タンパク合
成の効率に差が無かった。このため、より簡便なｒｕｎ
−ｏｆｆ法が主に用いられてきた。
【００１５】しかし、ＰＣＲ産物ＤＮＡを鋳型に用いた
場合、ｒｕｎ−ｏｆｆ法を用いたタンパク合成の効率
が、プラスミドを用いた時と比較して劣るという現象が
見られた。このため、その原因を解析し、タンパク合成
の効率を上げるため研究を進めた。その結果、目的とす
るタンパクをコードする鋳型ＤＮＡの配列の後（３’末
端側）にターミネーターＤＮＡ配列又は変異ターミネー
ターＤＮＡ配列を連結するとともに、プロモーターＤＮ
Ａ配列、リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパクをコ
ードするＤＮＡ配列、及びターミネーターＤＮＡ配列又
は変異ターミネーターＤＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列
の５０％以上である鋳型ＤＮＡを用いてタンパクを製造
することにより、タンパク合成活性が顕著に高まること
が確認された。本発明においてタンパク合成量（タンパ
ク合成活性）が増加する原因はまだ明らかにされていな
いが、ＲＮＡポリメラーゼによって作られたｍＲＮＡが
安定化している、ｍＲＮＡの合成量が増加している、ｍ
ＲＮＡの高次構造がタンパク合成系で有効に機能してい
る、等の原因が推定される。
場合、ｒｕｎ−ｏｆｆ法を用いたタンパク合成の効率
が、プラスミドを用いた時と比較して劣るという現象が
見られた。このため、その原因を解析し、タンパク合成
の効率を上げるため研究を進めた。その結果、目的とす
るタンパクをコードする鋳型ＤＮＡの配列の後（３’末
端側）にターミネーターＤＮＡ配列又は変異ターミネー
ターＤＮＡ配列を連結するとともに、プロモーターＤＮ
Ａ配列、リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパクをコ
ードするＤＮＡ配列、及びターミネーターＤＮＡ配列又
は変異ターミネーターＤＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列
の５０％以上である鋳型ＤＮＡを用いてタンパクを製造
することにより、タンパク合成活性が顕著に高まること
が確認された。本発明においてタンパク合成量（タンパ
ク合成活性）が増加する原因はまだ明らかにされていな
いが、ＲＮＡポリメラーゼによって作られたｍＲＮＡが
安定化している、ｍＲＮＡの合成量が増加している、ｍ
ＲＮＡの高次構造がタンパク合成系で有効に機能してい
る、等の原因が推定される。
【００１６】本発明に使用されるＲＮＡポリメラーゼ
は、通常用いられるいかなる配列のものでも良い。しか
し、タンパク合成反応液中での活性や、ＲＮＡポリメラ
ーゼ自体の入手のし易さを考慮すると、Ｔ７、Ｔ３、Ｓ
Ｐ６等のウイルス由来のＲＮＡポリメラーゼが望まし
い。また本発明に使用されるターミネーターＤＮＡ配列
又は変異ターミネーターＤＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラ
ーゼの転写反応を停止させ、合成されたＲＮＡをＤＮＡ
から遊離させる機能を有するものであればいずれのＤＮ
Ａ配列も使用できる。通常は、転写反応に使用するＲＮ
Ａポリメラーゼに固有のターミネーターＤＮＡ配列を使
用することが望ましい。しかし、ＲＮＡポリメラーゼに
固有のターミネーターＤＮＡ配列の一部の塩基を置換、
欠失又は挿入したＤＮＡ配列であって、ＲＮＡポリメラ
ーゼの転写反応を停止させ、合成されたＲＮＡをＤＮＡ
から遊離させる機能を有するものであればいずれのＤＮ
Ａ配列も本発明に使用できることは明らかであり、この
ようなターミネーターＤＮＡ配列をこの明細書において
「変異ターミネーターＤＮＡ配列」という。
は、通常用いられるいかなる配列のものでも良い。しか
し、タンパク合成反応液中での活性や、ＲＮＡポリメラ
ーゼ自体の入手のし易さを考慮すると、Ｔ７、Ｔ３、Ｓ
Ｐ６等のウイルス由来のＲＮＡポリメラーゼが望まし
い。また本発明に使用されるターミネーターＤＮＡ配列
又は変異ターミネーターＤＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラ
ーゼの転写反応を停止させ、合成されたＲＮＡをＤＮＡ
から遊離させる機能を有するものであればいずれのＤＮ
Ａ配列も使用できる。通常は、転写反応に使用するＲＮ
Ａポリメラーゼに固有のターミネーターＤＮＡ配列を使
用することが望ましい。しかし、ＲＮＡポリメラーゼに
固有のターミネーターＤＮＡ配列の一部の塩基を置換、
欠失又は挿入したＤＮＡ配列であって、ＲＮＡポリメラ
ーゼの転写反応を停止させ、合成されたＲＮＡをＤＮＡ
から遊離させる機能を有するものであればいずれのＤＮ
Ａ配列も本発明に使用できることは明らかであり、この
ようなターミネーターＤＮＡ配列をこの明細書において
「変異ターミネーターＤＮＡ配列」という。
【００１７】本発明はさらに、上記本発明の核酸増幅方
法を、少なくとも２種の核酸分子について別々に実施
し、増幅された該少なくとも２種の核酸のそれぞれ１種
を鋳型として用いて上記本発明のタンパク製造方法を各
核酸毎に実施し、得られた該少なくとも２種の核酸がそ
れぞれコードする少なくとも２種のタンパクからなるタ
ンパクライブラリーを構築する方法を提供するものであ
る。本発明の増幅方法と、タンパクの製造方法を、複数
種類の目的核酸分子について実施することにより、所望
のタンパクを含むタンパクライブラリーを簡便かつ効率
良く構築することができる。
法を、少なくとも２種の核酸分子について別々に実施
し、増幅された該少なくとも２種の核酸のそれぞれ１種
を鋳型として用いて上記本発明のタンパク製造方法を各
核酸毎に実施し、得られた該少なくとも２種の核酸がそ
れぞれコードする少なくとも２種のタンパクからなるタ
ンパクライブラリーを構築する方法を提供するものであ
る。本発明の増幅方法と、タンパクの製造方法を、複数
種類の目的核酸分子について実施することにより、所望
のタンパクを含むタンパクライブラリーを簡便かつ効率
良く構築することができる。
【００１８】以下、比較例及び実施例によって本発明を
具体的に説明する。 実施例１（核酸の増幅）増幅を目的とする核酸分子群の作成 図１に示した、プラスミドｐＲＳＥＴ−ＧＦＰ１をＳｃ
ａＩで切断して得られるＤＮＡ断片をテンプレートとし
て、以下の条件でＰＣＲを行った。ここで用いたプライ
マーＲ２−０は、３ケ所にＮ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの混合）
を含み、分子の種類として４3 種類、即ち６４種類のＤ
ＮＡ分子を含む混合物である。
具体的に説明する。 実施例１（核酸の増幅）増幅を目的とする核酸分子群の作成 図１に示した、プラスミドｐＲＳＥＴ−ＧＦＰ１をＳｃ
ａＩで切断して得られるＤＮＡ断片をテンプレートとし
て、以下の条件でＰＣＲを行った。ここで用いたプライ
マーＲ２−０は、３ケ所にＮ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの混合）
を含み、分子の種類として４3 種類、即ち６４種類のＤ
ＮＡ分子を含む混合物である。
【００１９】
【表１】 反応液中の最終濃度 テンプレート ＤＮＡ ２ng／ml プライマーＦ２−１ 1000nM プライマーＲ２−０ 1000nM ｄＮＴＰｓ それぞれ0.2 mM Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ 40Ｕ／ml （ＴａＫａＲａ） 全量 50μｌ ｄＮＴＰｓ：デオキシヌクレオチドトリホスフェート（４種の塩基の混合物）
【００２０】９４℃、３分間プレヒートし、９６℃、１
５秒−５５℃、３０秒−７２℃、１分のサイクルを３０
サイクル行った後、７２℃、１０分更に伸長させた。反
応液をフェノール／クロロフォルム処理、エタノール沈
殿処理し、これを更に以下の条件でＨＰＬＣによって精
製した。 カラム：ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ 温度：２５℃ 溶出液 Ａ．２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH 9.0） Ｂ．２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH 9.0）＋1.0 Ｍ Ｎ
ａＣl ０分（Ｂ：０％）、10分（Ｂ：50％）、30分（Ｂ：70
％）、50分（Ｂ：100％）の条件で溶出した。流速は0.
５ml／分、検出は２６０ｎｍで行った。回収したフラク
ションをフェノール／クロロフォルム処理、エタノール
沈殿処理した後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解した。目的
核酸分子を含む核酸分子群以外の２本鎖ＤＮＡをなくす
ため、さらに以下の条件でＰＣＲを行った。
５秒−５５℃、３０秒−７２℃、１分のサイクルを３０
サイクル行った後、７２℃、１０分更に伸長させた。反
応液をフェノール／クロロフォルム処理、エタノール沈
殿処理し、これを更に以下の条件でＨＰＬＣによって精
製した。 カラム：ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ 温度：２５℃ 溶出液 Ａ．２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH 9.0） Ｂ．２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH 9.0）＋1.0 Ｍ Ｎ
ａＣl ０分（Ｂ：０％）、10分（Ｂ：50％）、30分（Ｂ：70
％）、50分（Ｂ：100％）の条件で溶出した。流速は0.
５ml／分、検出は２６０ｎｍで行った。回収したフラク
ションをフェノール／クロロフォルム処理、エタノール
沈殿処理した後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解した。目的
核酸分子を含む核酸分子群以外の２本鎖ＤＮＡをなくす
ため、さらに以下の条件でＰＣＲを行った。
【００２１】
【表２】 反応液中の最終濃度 テンプレート ＤＮＡ ５μｇ／ml プライマーＦ２−１ 1000nM プライマーＲ２−１ 1000nM ｄＮＴＰｓ それぞれ0.２mM Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ 40Ｕ／ml （ＴａＫａＲａ） 全量 50μｌ
【００２２】９４℃、３分間プレヒートし、９６℃、１
５秒−５３℃、３０秒−７２℃、１分のサイクルを５サ
イクル行った後、７２℃、１０分更に伸長させた。この
反応の生成物を先と同じくＨＰＬＣにて精製し、増幅を
目的とする核酸分子群を作成した。
５秒−５３℃、３０秒−７２℃、１分のサイクルを５サ
イクル行った後、７２℃、１０分更に伸長させた。この
反応の生成物を先と同じくＨＰＬＣにて精製し、増幅を
目的とする核酸分子群を作成した。
【００２３】目的核酸分子を含む核酸分子群の稀釈 上記ＨＰＬＣ精製ＤＮＡを稀釈した。その際チューブ等
への吸着によるＤＮＡの損失を防ぐため、１０12分子／
mlの溶液を順次、1.0 μｇ／ml ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍ
ａ）を用いて稀釈し、１０3 分子／mlの溶液を得た。こ
れより１μl を採り、ＰＣＲに用いた。
への吸着によるＤＮＡの損失を防ぐため、１０12分子／
mlの溶液を順次、1.0 μｇ／ml ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍ
ａ）を用いて稀釈し、１０3 分子／mlの溶液を得た。こ
れより１μl を採り、ＰＣＲに用いた。
【００２４】単一種類の分子の増幅 この稀釈液中の核酸分子をテンプレートとして以下の条
件でＰＣＲを行った。
件でＰＣＲを行った。
【００２５】
【表３】 反応液中の最終濃度 テンプレート ＤＮＡ 十分に稀釈し、単一種類の分子 と考えられるもの。 プライマーＦ２−１ 100 nM プライマーＲ２−１ 100 nM ｄＮＴＰｓ それぞれ0.２mM Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ 40Ｕ／ml （ＴａＫａＲａ） 全量 10μｌ
【００２６】９４℃、３分間プレヒートし、９６℃、１
５秒−５３℃、３０秒−７２℃、１分のサイクルを５０
サイクル行った後、７２℃、１０分更に伸長させた。こ
の反応液中の核酸分子をテンプレートとして以下の条件
でさらにＰＣＲを行った。
５秒−５３℃、３０秒−７２℃、１分のサイクルを５０
サイクル行った後、７２℃、１０分更に伸長させた。こ
の反応液中の核酸分子をテンプレートとして以下の条件
でさらにＰＣＲを行った。
【００２７】
【表４】 反応液中の最終濃度 上記ＰＣＲ反応液 １μｌ プライマーＦ２−２ 500 nM プライマーＲ２−２ 500 nM ｄＮＴＰｓ それぞれ0.2 mM Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ 40Ｕ／ml （ＴａＫａＲａ） 全量 11μｌ ９４℃、３分間プレヒートし、９６℃、１５秒−５８
℃、３０秒−７２℃、１分のサイクルを３０サイクル行
った後、７２℃、１０分更に伸長させた。反応産物をア
ガロース電気泳動で分析し、目的の長さのＤＮＡバンド
が生成していることを確認した。
℃、３０秒−７２℃、１分のサイクルを３０サイクル行
った後、７２℃、１０分更に伸長させた。反応産物をア
ガロース電気泳動で分析し、目的の長さのＤＮＡバンド
が生成していることを確認した。
【００２８】比較例１ 実施例１と同様の操作を行った。しかし、ＨＰＬＣによ
る精製は行わず、かつ単一種類の分子の増幅の段階での
ＰＣＲにおいて、プライマーＦ２−１及びＲ２−１の濃
度を１μＭとした。使用したプライマーの塩基配列を以
下示す。
る精製は行わず、かつ単一種類の分子の増幅の段階での
ＰＣＲにおいて、プライマーＦ２−１及びＲ２−１の濃
度を１μＭとした。使用したプライマーの塩基配列を以
下示す。
【００２９】
【表５】ＰＣＲ用プライマー 配列 Ｆ２−１ 5' GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA G 3' Ｆ２−２ 5' CGATTCATTA ATGCAGATCT CGATCCC 3' Ｒ２−０ 5' AACAGTACAC GTCGTGCCAC CAAAGCAGAG AGCTCCACTG TCTCGCCAAN NNGATCAAGC TTCGAATTCT ACGAATGCTA 3' Ｒ２−１ 5' AACAGTACAC GTCGTGCCAC C 3' Ｒ２−２ 5' AGCAGAGAGC TCCACTGTCT CGCC 3'
【００３０】実施例１で得られたクローンの NNN部分の
配列とそのクローン化数を以下の表に示す。
配列とそのクローン化数を以下の表に示す。
【００３１】
【表６】
【００３２】最終のＰＣＲ反応液から得られたＤＮＡの
配列は単一であり、予想される６４種類の配列のうち、
２４種類のクローンが得られた。これに対して、比較例
１の最終のＰＣＲ反応液から得られたＤＮＡを、アガロ
ース電気泳動で分析したが、目的の長さのＤＮＡバンド
は検出されなかった。以上のとおり、本発明では、増幅
したい核酸分子を含む核酸分子群を単離・精製した後、
ＰＣＲ反応液中におけるプライマー以外の増幅可能核酸
分子が、目的の核酸分子のみからなる状態とし、かつ用
いるプライマーの濃度を一種類のプライマーにつき１０
０ｎＭ以下としてＰＣＲを行うため、単一の核酸分子を
簡便にかつ効率よく増幅させることができる。
配列は単一であり、予想される６４種類の配列のうち、
２４種類のクローンが得られた。これに対して、比較例
１の最終のＰＣＲ反応液から得られたＤＮＡを、アガロ
ース電気泳動で分析したが、目的の長さのＤＮＡバンド
は検出されなかった。以上のとおり、本発明では、増幅
したい核酸分子を含む核酸分子群を単離・精製した後、
ＰＣＲ反応液中におけるプライマー以外の増幅可能核酸
分子が、目的の核酸分子のみからなる状態とし、かつ用
いるプライマーの濃度を一種類のプライマーにつき１０
０ｎＭ以下としてＰＣＲを行うため、単一の核酸分子を
簡便にかつ効率よく増幅させることができる。
【００３３】実施例２（タンパクの合成） 大腸菌抽出液の調製 Ellmanらの方法(Methods Enzymol. 202: 301-336 (199
1))に従って、大腸菌抽出液を調製した。まず、大腸菌A
19 を８Ｌの培養液を含むジャーファーメンターにて37
℃で培養し、450nm の吸光度が1.1 になった時点で培養
を停止した。菌体を遠心分離により集め、バッファーに
懸濁し、フレンチプレスにて8400psi で菌を破砕した。
直ちに遠心分離して30,000xgの遠心上清(S30) を得た。
得られた上清にATP 等のエネルギー源を加えたバッファ
ーを添加し、37℃、80分ゆっくり振とうした。続いてこ
の液を4 ℃、45分、３回透析し、さらに4,000xg で遠心
した上清を大腸菌抽出液として得た。
1))に従って、大腸菌抽出液を調製した。まず、大腸菌A
19 を８Ｌの培養液を含むジャーファーメンターにて37
℃で培養し、450nm の吸光度が1.1 になった時点で培養
を停止した。菌体を遠心分離により集め、バッファーに
懸濁し、フレンチプレスにて8400psi で菌を破砕した。
直ちに遠心分離して30,000xgの遠心上清(S30) を得た。
得られた上清にATP 等のエネルギー源を加えたバッファ
ーを添加し、37℃、80分ゆっくり振とうした。続いてこ
の液を4 ℃、45分、３回透析し、さらに4,000xg で遠心
した上清を大腸菌抽出液として得た。
【００３４】無細胞タンパク合成反応 遠藤斗志也らにより開発された方法（第69回日本生化学
会大会、発表番号4-P-1209) に従って、無細胞タンパク
合成を行なった。実施例２の反応液は、56.4mM Tris・
HCl buffer pH 7.4 、1.22mMＡＴＰ、それぞれ0.85mMの
ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、1.76mMＤＴＴ、40mMクレアチ
ンリン酸、0.15mg／mlクレアチンキナーゼ、320 μＭア
ミノ酸、10mM酢酸マグネシウム、150 mM酢酸カリウム、
4%ＰＥＧ、34.6μgl/ml フォリン酸、35.9mM NH4OAc 、
10μg/mlリファンピシン、0.17mg／ml大腸菌ｔＲＮＡ、
0.02mg／ml鋳型ＤＮＡ、10μg/mlＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼ、大腸菌抽出液0.2 mlの組成からなり、全量を１mlと
した。反応は37℃で２時間おこなった。
会大会、発表番号4-P-1209) に従って、無細胞タンパク
合成を行なった。実施例２の反応液は、56.4mM Tris・
HCl buffer pH 7.4 、1.22mMＡＴＰ、それぞれ0.85mMの
ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、1.76mMＤＴＴ、40mMクレアチ
ンリン酸、0.15mg／mlクレアチンキナーゼ、320 μＭア
ミノ酸、10mM酢酸マグネシウム、150 mM酢酸カリウム、
4%ＰＥＧ、34.6μgl/ml フォリン酸、35.9mM NH4OAc 、
10μg/mlリファンピシン、0.17mg／ml大腸菌ｔＲＮＡ、
0.02mg／ml鋳型ＤＮＡ、10μg/mlＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼ、大腸菌抽出液0.2 mlの組成からなり、全量を１mlと
した。反応は37℃で２時間おこなった。
【００３５】但し、実施例２で用いた鋳型ＤＮＡは、Ｔ
７プロモーター配列、ＧＦＰ（green fluorescein prot
ein:クラゲ蛍光タンパク質）遺伝子配列、Ｔ７ターミネ
ーター配列を含むプラスミド pRSET-GFP1 を鋳型とし、
Ｔ７プロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１とＴ
７ターミネーター配列の更に後ろの配列をもつアンチセ
ンスプライマーＰ３を用いてＰＣＲを行って得た。ま
た、プラスミド pRSET-GFP1 は、プラスミドpGFP(Clont
ech 社) を制限酵素BamHI とEcoRI で処理してＧＦＰ遺
伝子を切り出し、これをプラスミドpRSETB(Invitrogen
社) のBamHI とEcoRI 部位に挿入することより製造し
た。プラスミド pRSET-GFP1 のＤＮＡ配列のうちこの実
施例において鋳型として使用した部分のＤＮＡ構成を図
２に示す。ここで使用したＴ７プロモーター配列及びリ
ボソーム結合ＤＮＡ配列は以下のとおりである。 Ｔ７プロモーター配列 TAATACGACTCACTATA ATTATGCTGAGTGATAT リボソーム結合ＤＮＡ配列 AAGGAG TTCCTC
７プロモーター配列、ＧＦＰ（green fluorescein prot
ein:クラゲ蛍光タンパク質）遺伝子配列、Ｔ７ターミネ
ーター配列を含むプラスミド pRSET-GFP1 を鋳型とし、
Ｔ７プロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１とＴ
７ターミネーター配列の更に後ろの配列をもつアンチセ
ンスプライマーＰ３を用いてＰＣＲを行って得た。ま
た、プラスミド pRSET-GFP1 は、プラスミドpGFP(Clont
ech 社) を制限酵素BamHI とEcoRI で処理してＧＦＰ遺
伝子を切り出し、これをプラスミドpRSETB(Invitrogen
社) のBamHI とEcoRI 部位に挿入することより製造し
た。プラスミド pRSET-GFP1 のＤＮＡ配列のうちこの実
施例において鋳型として使用した部分のＤＮＡ構成を図
２に示す。ここで使用したＴ７プロモーター配列及びリ
ボソーム結合ＤＮＡ配列は以下のとおりである。 Ｔ７プロモーター配列 TAATACGACTCACTATA ATTATGCTGAGTGATAT リボソーム結合ＤＮＡ配列 AAGGAG TTCCTC
【００３６】実施例３（タンパクの合成） 実施例３の反応は、実施例２と同組成の反応液でおこな
った。また鋳型ＤＮＡは実施例２と同じプラスミドを鋳
型とし、Ｔ７プロモーター配列を含むセンスプライマー
Ｐ１と、Ｔ７ターミネーター配列直前のアンチセンスプ
ライマーＰ２を用いてＰＣＲを行って得た短い鋳型ＤＮ
Ａを用いた。反応１時間後に反応液の一部をとり、ＧＦ
Ｐの合成量をＧＦＰの発する蛍光、エクサイテーション
３９５ｎｍ、エミッション５０９ｎｍにて測定して求め
た。合成されたタンパクの量は、一定時間後に合成され
たＧＦＰタンパクの発する蛍光値から、反応時間０のバ
ックグラウンド蛍光値を差し引いた値で表す。
った。また鋳型ＤＮＡは実施例２と同じプラスミドを鋳
型とし、Ｔ７プロモーター配列を含むセンスプライマー
Ｐ１と、Ｔ７ターミネーター配列直前のアンチセンスプ
ライマーＰ２を用いてＰＣＲを行って得た短い鋳型ＤＮ
Ａを用いた。反応１時間後に反応液の一部をとり、ＧＦ
Ｐの合成量をＧＦＰの発する蛍光、エクサイテーション
３９５ｎｍ、エミッション５０９ｎｍにて測定して求め
た。合成されたタンパクの量は、一定時間後に合成され
たＧＦＰタンパクの発する蛍光値から、反応時間０のバ
ックグラウンド蛍光値を差し引いた値で表す。
【００３７】実施例４及び５（タンパクの合成） 実施例２で示されたターミネーター配列の有効性を確認
するため、鋳型ＤＮＡの長さをそろえ、実施例４では、
Ｔ７ターミネーター配列をもつ鋳型ＤＮＡを、実施例５
では、Ｔ７ターミネーター配列の一部（６塩基）を変化
させた鋳型ＤＮＡを用いた。 大腸菌抽出液の調製と無細胞タンパク合成反応 実施例２と同様の方法で大腸菌抽出液の調製と無細胞タ
ンパク合成反応をおこなった。但し鋳型ＤＮＡは、実施
例４は実施例２と同じプラスミドを鋳型にして、Ｔ７プ
ロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１と、Ｔ７タ
ーミネーター配列を含むアンチセンスプライマーＰ４で
ＰＣＲを行って得た。実施例５で用いた鋳型ＤＮＡは、
Ｔ７プロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１と、
Ｔ７ターミネーター配列の一部（６塩基）を変化させた
配列を含むアンチセンスプライマーＰ５でＰＣＲを行っ
て得た。ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を以下に
示す。
するため、鋳型ＤＮＡの長さをそろえ、実施例４では、
Ｔ７ターミネーター配列をもつ鋳型ＤＮＡを、実施例５
では、Ｔ７ターミネーター配列の一部（６塩基）を変化
させた鋳型ＤＮＡを用いた。 大腸菌抽出液の調製と無細胞タンパク合成反応 実施例２と同様の方法で大腸菌抽出液の調製と無細胞タ
ンパク合成反応をおこなった。但し鋳型ＤＮＡは、実施
例４は実施例２と同じプラスミドを鋳型にして、Ｔ７プ
ロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１と、Ｔ７タ
ーミネーター配列を含むアンチセンスプライマーＰ４で
ＰＣＲを行って得た。実施例５で用いた鋳型ＤＮＡは、
Ｔ７プロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１と、
Ｔ７ターミネーター配列の一部（６塩基）を変化させた
配列を含むアンチセンスプライマーＰ５でＰＣＲを行っ
て得た。ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を以下に
示す。
【００３８】
【表７】プライマー 塩基配列 Ｐ１ CCGCGAAATT AATACGACTC Ｐ２ TTATTGCTCA GCGGTGGCAG Ｐ３ GCCAGATCCG GATATAGTTC CTCC Ｐ４ AGCAAAAAAC CCCTCAAGAC C Ｐ５ AGCAAAAATC GTCTCAACAA GCGTTTAGAG GCCCCAAGGG GT 結果を以下の表８に示す。
【００３９】
【表８】 例 ＧＦＰ合成量（相対値） 実施例２（完全長のT7ターミネーターを連結） 15 実施例３（ターミネーター連結せず） 2.2 実施例４（完全長のT7ターミネーターを連結） 13 実施例５（完全長のT7ターミネーターの配列の一部変化） 4.3
【００４０】完全長のＴ７ターミネーターＤＮＡ配列を
連結した鋳型ＤＮＡを使用した実施例２のタンパク（Ｇ
ＦＰ）合成量は、Ｔ７ターミネーターＤＮＡ配列を連結
していない鋳型ＤＮＡを使用した実施例３のタンパク合
成量の6.8 倍であることがわかる。また、完全長のＴ７
ターミネーターＤＮＡ配列を連結した鋳型ＤＮＡを使用
した実施例４のタンパク（ＧＦＰ）合成量は、Ｔ７ター
ミネーターＤＮＡ配列を連結していない鋳型ＤＮＡを使
用した実施例３のタンパク合成量の5.9 倍であることが
わかる。
連結した鋳型ＤＮＡを使用した実施例２のタンパク（Ｇ
ＦＰ）合成量は、Ｔ７ターミネーターＤＮＡ配列を連結
していない鋳型ＤＮＡを使用した実施例３のタンパク合
成量の6.8 倍であることがわかる。また、完全長のＴ７
ターミネーターＤＮＡ配列を連結した鋳型ＤＮＡを使用
した実施例４のタンパク（ＧＦＰ）合成量は、Ｔ７ター
ミネーターＤＮＡ配列を連結していない鋳型ＤＮＡを使
用した実施例３のタンパク合成量の5.9 倍であることが
わかる。
【００４１】さらに、実施例４のターミネーターＤＮＡ
配列と同じ長さで、配列の一部を変化させたもの（変異
ターミネーターＤＮＡ配列）を連結した鋳型ＤＮＡを使
用した実施例５のタンパク合成量は、実施例４の場合と
比較して低いが、Ｔ７ターミネーターＤＮＡ配列を連結
していない鋳型ＤＮＡを使用した実施例３のタンパク合
成量の２倍であることがわかる。上記結果は、完全長の
ターミネーターＤＮＡ配列を連結した鋳型ＤＮＡを使用
することにより、タンパク合成量が顕著に増大するこ
と、ターミネーターＤＮＡ配列の一部の配列を変化させ
た変異ターミネーターＤＮＡ配列を使用するとターミネ
ーターＤＮＡ配列を連結することにより奏される効果が
減少することを示している。
配列と同じ長さで、配列の一部を変化させたもの（変異
ターミネーターＤＮＡ配列）を連結した鋳型ＤＮＡを使
用した実施例５のタンパク合成量は、実施例４の場合と
比較して低いが、Ｔ７ターミネーターＤＮＡ配列を連結
していない鋳型ＤＮＡを使用した実施例３のタンパク合
成量の２倍であることがわかる。上記結果は、完全長の
ターミネーターＤＮＡ配列を連結した鋳型ＤＮＡを使用
することにより、タンパク合成量が顕著に増大するこ
と、ターミネーターＤＮＡ配列の一部の配列を変化させ
た変異ターミネーターＤＮＡ配列を使用するとターミネ
ーターＤＮＡ配列を連結することにより奏される効果が
減少することを示している。
【００４２】実施例６及び７（タンパクの合成） この実施例では、図１に示したプラスミドｐＲＳＥＴ−
ＧＦＰ１をＳｃａＩで切断して得られるＤＮＡ断片をテ
ンプレートとして、実施例１と同様の条件でＰＣＲを行
った。プライマーＦ２−２及びＲ２−２を用いて最終的
に得られたＤＮＡのうち、ＮＮＮの部分の配列がＡＡＣ
のものを用いて以下の実験を行った。
ＧＦＰ１をＳｃａＩで切断して得られるＤＮＡ断片をテ
ンプレートとして、実施例１と同様の条件でＰＣＲを行
った。プライマーＦ２−２及びＲ２−２を用いて最終的
に得られたＤＮＡのうち、ＮＮＮの部分の配列がＡＡＣ
のものを用いて以下の実験を行った。
【００４３】Ｔ７ターミネーター配列の製造 プラスミドｐＲＳＥＴ−ＧＦＰ１をＳｃａＩで切断して
得られるＤＮＡ断片をテンプレートとして、実施例１と
同様の条件でＰＣＲを行い、上記配列に結合可能なＴ７
ターミネーター配列を製造した。
得られるＤＮＡ断片をテンプレートとして、実施例１と
同様の条件でＰＣＲを行い、上記配列に結合可能なＴ７
ターミネーター配列を製造した。
【００４４】
【表９】 反応液中の最終濃度 テンプレート ＤＮＡ １ｎｇ／50μl プライマーＦ−Ｔ７ＴＥＲ−１ 1000ｎＭ プライマーｐＲＳＥＴ−１３−３２ 1000ｎＭ ｄＮＴＰｓ それぞれ0.２mM Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ 40Ｕ／ml （ＴａＫａＲａ） 全量 50μｌ
【００４５】９４℃、３分間プレヒートし、９６℃、１
５秒−５５℃、３０秒−７２℃、３０秒のサイクルを３
０サイクル行った後、７２℃、１０分更に伸長させた。
得られたＤＮＡ断片を実施例と同様にＨＰＬＣによって
精製し、Ｔ７ターミネーター断片を得た。続いてこのＴ
７ターミネーター断片を、先の１分子のＰＣＲによって
得たＤＮＡ断片に付加した。
５秒−５５℃、３０秒−７２℃、３０秒のサイクルを３
０サイクル行った後、７２℃、１０分更に伸長させた。
得られたＤＮＡ断片を実施例と同様にＨＰＬＣによって
精製し、Ｔ７ターミネーター断片を得た。続いてこのＴ
７ターミネーター断片を、先の１分子のＰＣＲによって
得たＤＮＡ断片に付加した。
【００４６】
【表１０】 反応液中の最終濃度 １分子のＰＣＲによって得られたＤＮＡ、 １ｎｇ／50μl ＮＮＮ部分の配列がＡＡＣのもの Ｔ７ターミネーター断片 １ｎｇ／50μl プライマーＦ２−２ 500 nM プライマーｐＲＳＥＴ−１３−３２ 500 nM ｄＮＴＰｓ それぞれ0.2 mM Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ 40Ｕ／ml （ＴａＫａＲａ） Taq Start Antibody (Clonetech) 1.76 ng/ml 全量 10μｌ
【００４７】９４℃、３分間プレヒートし、９６℃、１
５秒−５８℃、３０秒−７２℃、１分のサイクルを３０
サイクル行った後、７２℃、１０分更に伸長させた。Ｐ
ＣＲに用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
５秒−５８℃、３０秒−７２℃、１分のサイクルを３０
サイクル行った後、７２℃、１０分更に伸長させた。Ｐ
ＣＲに用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
【００４８】
【表１１】プライマー 塩基配列 F-T7TER-1 GGCGAGACAG TGGAGCTCTC TGCCCGGCTG CTAACAAAGC C pRSET-13-32 CTGCGCAACT GTTGGGAAGG G
【００４９】次に、実施例２と同様の方法で大腸菌抽出
液の調製と無細胞タンパク合成反応をおこなった。結果
を以下の表１１に示す。
液の調製と無細胞タンパク合成反応をおこなった。結果
を以下の表１１に示す。
【００５０】
【表１２】 例 ＧＦＰ合成量（相対値） 実施例６（完全長のT7ターミネーターを連結） 3.6 実施例７（ターミネーター連結せず） 0.79
【００５１】上記結果は、完全長のターミネーターＤＮ
Ａ配列を連結した鋳型ＤＮＡを使用することにより、タ
ンパク合成量が顕著に増大することを示している。
Ａ配列を連結した鋳型ＤＮＡを使用することにより、タ
ンパク合成量が顕著に増大することを示している。
【００５２】
配列番号：１ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA G 21 配列番号：２ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 CGATTCATTA ATGCAGATCT CGATCCC 27 配列番号：３ 配列の長さ：80 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 AACAGTACAC GTCGTGCCAC CAAAGCAGAG AGCTCCACTG TCTCGCCAAN NNGATCAAGC 60 TTCGAATTCT ACGAATGCTA 80 配列番号：４ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 AACAGTACAC GTCGTGCCAC C 21 配列番号：５ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 AGCAGAGAGC TCCACTGTCT CGCC 24 配列番号：６ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 CCGCGAAATT AATACGACTC 20 配列番号：７ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 TTATTGCTCA GCGGTGGCAG 20 配列番号：８ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 GCCAGATCCG GATATAGTTC CTCC 24 配列番号：９ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 AGCAAAAAAC CCCTCAAGAC C 21 配列番号：10 配列の長さ：42 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 AGCAAAAATC GTCTCAACAA GCGTTTAGAG GCCCCAAGGG GT 42 配列番号：11 配列の長さ：41 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 GGCGAGACAG TGGAGCTCTC TGCCCGGCTG CTAACAAAGC C 41 配列番号：12 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 CTGCGCAACT GTTGGGAAGG G 21
【図１】実施例１においてテンプレートとして使用し
た、プラスミドｐＲＳＥＴ−ＧＦＰ１をＳｃａＩで切断
して得られる断片ＤＮＡ、及び各プライマーの位置を示
す図面である。
た、プラスミドｐＲＳＥＴ−ＧＦＰ１をＳｃａＩで切断
して得られる断片ＤＮＡ、及び各プライマーの位置を示
す図面である。
【図２】プラスミド pRSET-GFP1 のＤＮＡ配列のうち、
実施例２において鋳型として使用した部分のＤＮＡ配列
を示す。
実施例２において鋳型として使用した部分のＤＮＡ配列
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 奥村 れい子 愛知県名古屋市昭和区宮東町214 トキワ マンション205号 (72)発明者 関口 哲 東京都世田谷区桜丘１−２−20−110
Claims (10)
- 【請求項１】 ＰＣＲにより目的の核酸分子を増幅させ
る方法において、増幅したい核酸分子を含む核酸分子群
を単離・精製した後、ＰＣＲ反応液中におけるプライマ
ー以外の増幅可能核酸分子が、目的の核酸分子のみから
なる状態とし、かつ用いるプライマーの濃度を一種類の
プライマーにつき１００ｎＭ以下として、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする、核酸分子の増幅方法。 - 【請求項２】 増幅したい核酸分子を含む核酸分子群を
単離・精製した後、稀釈することにより、ＰＣＲ反応液
中におけるプライマー以外の増幅可能核酸分子が、目的
の核酸分子のみからなる状態とする請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 核酸分子群の単離・精製をＨＰＬＣによ
り行う請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 ＰＣＲ反応液中におけるプライマーの濃
度が、一種類のプライマーにつき１０ｎＭ以下である請
求項１記載の方法。 - 【請求項５】 ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを用いる請求項１
記載の方法。 - 【請求項６】 無細胞抽出液を含む無細胞タンパク合成
系でタンパクを製造する方法において、請求項１〜５の
いずれか１項記載の方法により得られた単一種類の核酸
を鋳型として使用することを特徴とする方法。 - 【請求項７】 鋳型として使用する核酸が、プロモータ
ーＤＮＡ配列、リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパ
クをコードするＤＮＡ配列、及びターミネーターＤＮＡ
配列又は変異ターミネーターＤＮＡ配列を含み、かつ前
記４種のＤＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上
である鋳型ＤＮＡである請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 転写に用いるＲＮＡポリメラーゼがＴ７
である、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 無細胞抽出液が大腸菌抽出液である請求
項６、７又は８記載の方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれか１項記載の方
法を、少なくとも２種の核酸分子について別々に実施
し、増幅された該少なくとも２種の核酸のそれぞれ１種
を鋳型として用いて請求項６〜９のいずれか１項記載の
方法を各核酸毎に実施し、得られた該少なくとも２種の
核酸がそれぞれコードする少なくとも２種のタンパクか
らなるタンパクライブラリーを構築する方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10081341A JPH11178582A (ja) | 1997-10-16 | 1998-03-27 | 核酸分子の増幅方法及びタンパクの合成方法 |
| US09/136,411 US6207378B1 (en) | 1997-08-19 | 1998-08-19 | Method for amplifying nucleic acid molecules and method for synthesizing proteins |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28390497 | 1997-10-16 | ||
| JP9-283904 | 1997-10-16 | ||
| JP10081341A JPH11178582A (ja) | 1997-10-16 | 1998-03-27 | 核酸分子の増幅方法及びタンパクの合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11178582A true JPH11178582A (ja) | 1999-07-06 |
Family
ID=26422366
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10081341A Pending JPH11178582A (ja) | 1997-08-19 | 1998-03-27 | 核酸分子の増幅方法及びタンパクの合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11178582A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005073609A (ja) * | 2003-09-01 | 2005-03-24 | Shimadzu Corp | 鋳型ｄｎａの増幅方法、ならびに増幅された鋳型ｄｎａを用いた無細胞系タンパク質合成方法 |
-
1998
- 1998-03-27 JP JP10081341A patent/JPH11178582A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005073609A (ja) * | 2003-09-01 | 2005-03-24 | Shimadzu Corp | 鋳型ｄｎａの増幅方法、ならびに増幅された鋳型ｄｎａを用いた無細胞系タンパク質合成方法 |
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|---|---|---|---|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080407 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080825 |