JPH02501532A - 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅二里坐丘旦 本発明は、遺伝子自体の検出のため又は遺伝子を含有する生物体の検出のために 特定の遺伝子の存在を検出する診断測定に関し、そして特に検出工程に先立って 検出されるべき遺伝子のコピー数を増加せしめる技法に向けられる０本発明はさ らに、特定のポリヌクレオチド配列の多くのコピーを必要とするあらゆる方法に 関する。

主ユ坐ｌ員 サンプル中の分析対象、例えば細菌、ウィルス又は遺伝欠陥を示すものとしての 特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列の存在の検出に頗る多数の診断測定が開発されてい る。幾つかの例においては、診断に使用できる遺伝子は、ハイブリダイゼーショ ン、特異的抗体との反応、又は他の方法のいずれかにより直接検出するのに十分 な量で存在する。しかしながら、注目の遺伝子が少量存在するか、又はサンプル 中の類憤の配列により惹起されるバックグラウンドが十分に高い場合には、標的 にされる遺伝子の確実で鋭敏な検出が困難である。不明瞭な結果は診断試験にお いて満足できるものではない。

この様な診断目的の感受性及び特異性を増加せしめるための種々の方法が開発さ れている。有効ではあるがしかし長時間を要する技法である細胞培養による標的 の増幅が長い間唯−の確実な方法であった。他の技法は、標的と結合するであろ うプローブに付加された鋭敏なレポーター基を用いて検出系の感度を上昇せしめ る。鋭敏なレポーター基の例には放射性分子及び蛍光分子が含まれるであろう、 プローブと連結された酵素、例えばパーオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファタ ーゼもまた基質発色物質に対するそれらの触媒作用を通して感受性を改良する。

増加した感受性はまた、レポーター基の増幅によっても得られる。この様な増幅 はまたアビジン−ビオチン相互作用、核酸とのネットワーク形成、又はＲＮＡレ ポーター基の直接的酸素的複製により達成されている。この後者の技法は約１２ 分間に１．０００．０００コピーまでのＲＮＡを生じさせる。他の技法は検出系 で使用されるレポーター基ではなく標的核酸配列を増幅する。

標的核酸配列の増幅のための１つの方法はポリメラーゼ連鎖反応又はＰＣＲ技法 として知られており、そして遺伝的欠陥を担当する遺伝子を検出するために開発 されている。この方法は、標的ＤＮＡの変性、プライマーアニーリング及びＤＮ Ａポリメラーゼによる延長の反復サイクルにおいて特異的オリゴヌクレオチドプ ライマーを使用する。１つのプライマーから生じた延長生成物が他のプライマー のための追加の標的配列として使用される。標的配列の増幅の程度は行われるサ イクル数により制御され、そして理論的には簡単な式２Ｉ″　（ｎはサイクル数 ）により計算される。サイクル当りの平均効率が約６５％〜８５％である場合、 標的配列の３０万〜４８０万コピーを得るのに２５サイクルが必要である。

このポリメラーゼ連鎖反応は非常に鋭敏で且つ有望な方法であるが、この技法に 内在する幾つかの限界及び欠点が存在する０例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の各 サイクルは最も良くてもわずか２倍の増幅をもたらし、そしてそれ故に実質的な 増幅を達成するために多数のサイクル（２０〜３０）が必要である。さらに、各 ＰＣＲサイクル中に生ずる高温変性が使用される酵素を不活性化し、そしてそれ 故に高価な酵素の反復添加を必要とする。

従って、遺伝子増幅の速度を上昇せしめる技法（従って、より少い酵素及びより 少いサイクル数で足りる）は、特定の標的核酸配列の検出を含むすべての診断法 及び増加した数の特異的に増幅されたポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を 必要とするあらゆる方法のために、非常に有利であろう。

回正文献 ＰＣＲ法は、５ａｉｋｉ等、“βグロビンゲノム配列の酵素的増幅及び鎌形赤血 球貧血の制限部位分析”、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０　：　１３５０− １３５４　；　５ａｉｋｉ等、“酵素的に増幅されたβ−グロビン及びＨＬＡ− ＤＱαＤＮＡの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ、Ｎａｔｕｒｅ（ １９８６）３２４　：　１６３−１６６　；並びに５ｃｈａｒｆ等、“酵素的に 増幅されたゲノム配列の直接クローニング及び配列分析”　、５ｃｉｅｎｃｅ（ １９８６）２３３　：　１０７６−１０７８、を含む多数の刊行物に記載されて いる。さらに、３件の米国特許出願、すなわち１９８５年３月２８日出願の出願 Ｎα７１６，９７５．１９８５年１０月１０日出Ｓの出願Ｎａ７９１，３０８　 、及び１９８６年２月７日出願の出Ｉｉｉ隘８２８．１４４に基く優先権を主張 する、１９８６年１２月１０日に公表されたヨーロッパ特許出１１！Ｎａ０２０ ０３６２　Ａ　２　（出願Ｎ［１８６３０２２９８−４）を参照のこと。

主恩■皿１ 本発明は、標的鋳型からコピーを作る２つの方法を交互に用いることによる標的 ポリヌクレオチド配列のコピー数を迅速に増加せしめる（酵素的サイクルにより ）方法を提供する。

第一の一連の段階において、プロモーターを含んで成る中間体二本鎖ポリヌクレ オチドが生産され、次に標的配列が生産される０次に第二工程において、この二 本鎖中間体を使用することにより、該二本鎖中間体のプロモーター顛域に結合す るＲＮＡポリメラーゼを用いて多数のＲＮＡコピーを調製する０次に、逆転写酵 素を用いて二本鎖プロモーター含有中間体の第二の（又はさらなる）集合を調製 することにより、他の増幅サイクルを開始するために各ＲＮＡコピーが標的配列 として使用され得る。従って本発明の方法は、サンプル中に存在する標的ポリヌ クレオチド配列のコピー数を、従来法より迅速にインビトロで増加せしめる方法 を提供する。この方法は、特定の具体的例において、トキソプラズマ・ボンブイ −（Ｔｏμｍ１章ＬＬ神■）についての診断測定に適用される。

皿皿企里員星説里 本発明は、図面と共に以下に記載する具体的な説明により、−３よく理解される であろう。

図は、本発明の方法の異る段階において存在するポリヌクレオチドを示す模式図 である。

貝　、な能　の１ 本発明は、標的オリゴヌクレオチド配列のコピー数を増加せしめる方法を提供し 、そしてそれ故にサンプル中に少量存在する特定のポリヌクレオチド配列を認識 することを意図する診断測定において特に有用である。これはまた、特定の配列 のポリヌクレオチドの迅速な生成により利益を受ける任意の方法において有用で ある。

標的ポリヌクレオチド配列はより大きな分子の部分であることができ、又は特定 の配列が核酸全体を構成するようにはじめから個別分子として存在することもで きる。増幅されるべき標的細胞が最初に純粋な形で存在する必要はない。これは 複雑な混合物の微小部分、例えば分析されるべき特定の生物学的サンプルのごく わずかな部分を構成する特定の微生物の核酸配列の部分であることができる。

ポリヌクレオチドを含有する出発反応混合物は所望により１種類より多くの標的 配列を含有することができる。従って、本発明の方法は、１種類の特定のポリヌ クレオチド標的配列を多量に生産するためのみではなく、同−又は異るポリヌク レオチド分子上に位置する１種類より多くの異る標的配列を同時に増幅せしめる ためにも有用である。複数の標的配列が存在する場合、本発明の必要な唯一の変 更は、所望の標的配列のそれぞれのためにプライマー（後で検討する）を提供す ることである。

本発明の方法により任意の特定のポリヌクレオチド標的配列を増幅することがで きる。後記のように２つのオリゴヌクレオチドプライマーを調製することができ るように十分に、配列の両末端における十分な数の核酸が知られることのみが必 要である。配列の両端の塩基についての知識が多くなるに従って、標的配列に対 するプライマーの特異性が高くなり、そしてそれ故にこの方法の効率が高くなる 。増幅されるべき標的の一端又は両端の配列に関する情報が幾分不明瞭である場 合は特に、本明細書において使用するプライマーなる語は複数のプライマーを意 味することができると理解されよう。

例えば、核酸配列が既知の蛋白質配列から推定される場合、遺伝コードの縮重に 基くすべての可能性あるコドンの変化を代表する配列を含有するプライマーの集 合が各鎖について使用されるであろう。この集合の１つのプライマーは標的配列 の末端と相同である。

この方法は、標的配列を含有しそしてさらに標的配列の上流に位置するプロモー ターを含有する二本鎖ポリヌクレオチド中間体を調製することにより開始する。

この二本鎖中間体は、短いオリゴヌクレオチドをプライマー配列として使用しそ して該プライマーが結合するより長いポリヌクレオチド鎖を鋳型として使用して 該プライマーを延長することにより調製される。相補的標的鎖は単鎖状態（すで にこの形で存在しなければ）で得られ、そして相補鎖中の標的領域の５′末端又 はその近傍の相補鎖中領域に相補的な結合配列から上流のプロモーター配列を含 有するオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする。このプライマー中の結合 配列は、コピーされるべき特定の標的配列への５′又は標的配列の５′末端に存 在する標的ポリヌクレオチド分子中の配列と実質的に同等である。このプライマ ーは、もとの標的鎖と同じ意味のＤＮＡ分子の、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆 転写酵素）を用いる合成を開始するために使用される。

次に、この新しく合成された鎖に第二のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズす る。この第二のオリゴヌクレオチドブラマーは標的分子の３′−末端に対応する 領域に相補的である。プライマー領域間のヌクレオチドの数は好ましくは３００ 未満、さらに好ましくは２００未満であり、しかし１０より多く、さらに好まし く１５より多い、第ニプライマーが延長される場合、標的配列のコピー及び第一 プライマーが生成する。

従って、得られる生成物は、本発明の方法の第一の部分を構成する標的配列への ５′のプロモーター領域を含有する。

次に、中間体プロモーター含有二本鎖ポリヌクレオチドは中間体中に形成された プロモーター領域に結合することができるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの鋳 型して使用される。

このポリメラーゼ酵素は標的配列をコピーし、これによってプロモーターから下 流の標的配列の多数のＲＮＡコピーを提供する。生産されるコピー数はプロモー ター、使用されるＲＮＡポリメラーゼ及び反応条件に依存し、しかし１０コピー は容易に生産され、そして強力なプロモーター、活性ＲＮＡポリメラーゼ及び適 当な反応条件を選択することにより１００コピー以上を生産することができる。

ＲＮＡコピーのそれぞれは、特定の標的の追加のコピーの生産のための鋳型とし て使用することができる。上に使用した第二オリゴヌクレオチドとの反応、相補 的配列をもたらすプライマーの延長、第一プライマーとの反応及び生ずるバイブ リドの両方向への延長（第一プライマーは標的コピーの生産のためのプライマー として働き、そして相補鎖の３′−末端はプロモーター領域のコピーが作られる ようにプライマーとして働く）が、ＲＮＡコピーを調製するための鎖型として使 用された上記の類似の二本鎖プロモーター含有中間体を生産するであろう。次に 、プロモーター依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡ−生産サイクルを反復 することができる。

サイクル当りわずか１０個のＲＮＡコピーが生産されれば、３サイクルが反応媒 体中に存在する標的配列数の一千倍の増加をもたらすであろう。鎖型当り１００ コピーのＲＮＡが生産されれば、３サイクルにより１００万コピーの標的配列が 生産されるであろう。

上記の方法は、標的鎖と該標的鎖に対する相補鎖とを含んで成る二本鎖ポリヌク レオチド標的か、又は最初の標的がＲＮＡのごとき単鎖である場合には相補的標 的鎖の存在を仮定している。標的が最初に単鎖ＲＮ　Ａ又はＤＮＡであれば、相 補鎖はオリゴヌクレオチドプライマーを用いて上記の方法と同様の方法で調製す ることができる。例えば、上記の第二オリゴヌクレオチドプライマーは標的分子 の３′−末端に対応する領域に相補的である。この第二オリゴヌクレオチドプラ イマー、又は標的配列への３′の異る領域に対して相補的な異るプライマーを用 して、方法の第一段階において使用さくその相補鎖ではなく）に対して相補的な オリゴヌクレオチドプライマーを用いて開始することである０次にプロモーター 配列含有プライマーを、第一プライマーから延長される相補鎖にハイブリダイズ せしめる。

オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅されるべき各特定の配列の異る鎖に対し て「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、プライマーがそれ らの対応する鎖とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならないこ とを意味する。従って、プラ・「マーはそれが結合する鋳型の正確な配列を反映 する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの５′−末端 に付加し、プライマー配列の残りの部分が鋳型鎖と相補的であるようにすること ができる。言うまでもなく、上記のように、１つのこのような非相補的ヌクレオ チド断片は本発明に必要なプロモーター配列であろう、しかしながら、プロモー ター配列が存在しない場合でも、他の非相補的ヌクレオチド断片を付加すること ができる０例えば、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を提供する配列を提供して 、プラスミドへの挿入が容易な増幅された標的配列の調製を可能にすることがで きる。あるいは、プライマー配列が増幅されるべき鎖（又はその相補鎖）の配列 と十分に相補的であってそれとハイブリダイズしそして延長生成物の合成のため の鋳型を形成するものであれば、プライマーの結合配列に非相補的塩基を散在せ しめることができる。

例えば、特定の制限酵素開裂部位を提供するために中程度の長さく例えば約１５ ヌクレオチド）中で１個の単一ヌクレオチドを置換することができる。

所望により、両プライマーにプロモーター配列を含めることにより完全サイクル により生産されるコピー数をさらに増加せしめることができる。

本発明の方法の操作は図及び以下の詳細な記載により容易に理解することができ る０図及び以下の検討において示される模式的単鎖及び二本鎖ポリヌクレオチド のために標準的命名法及び方向が用いられる。二本鎖ポリヌクレオチドの玉鎖の 左端は５′−末端であり、同じ鎖の左端が３′−末端である（矢じりにより示さ れる）。相補鎖は逆向きの方向を有するから上鎖はその３′−末端が左にそして その５′−末端が右に示される。困乱を回避するため、二本鎖ポリヌクレオチド の部分として示されていない場合でも上鎖はこの方向で示される０種々の配列が 文字及び符号により特定される本明細書（特許請求の範囲を含む）に記載される 配列のために同じ約束が適用される０本方法の各段階の生成物のすべてが示され るのではなく、本発明に関連するもののみが示される。

図の第１行には、後の段階でこの分子に対して行われるであろう操作において定 義される一連の領域を含む二本鎖標的ポリヌクレオチド分子が示される。前に検 討したように、もとの標的が単１ｉｔＲＮＡ（又はＤＮＡ）分子である場合最初 の段階のために二本鎖標的が作られる。ポリヌクレオチドの５′−末端において 、後の操作でコピーされないセグメントがＸｌとして特定される。これに続き、 後の段階で使用されるプライマーの配列の一部を成す配列Ｐ１のセグメントが存 在する。コピーされるべき配列である標的配列Ｔが配列Ｐ１に続く、異るプライ マーと結合する配列Ｐ２がＴの３′−末端に存在する。Ｒ２の後に追加のヌクレ オチドが存在することがあるが、しかしコピーされない。これらのヌクレオチド は図中でＸ２と命名される。ＸＩもＸ２も本発明の操作には必要ではなく、そし てそれ故に場合によっては存在し、０から数百又は数千のヌクレオチドにわたる 、アポストローブ又は「プライムｊ　（′）は反対鎖に存在する相補的配列を示 す。

この単鎖標的分子はオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で変性され、そして 次に第２行に示すようにオリゴヌクレオチドと標的とのアニールを許容するよう に条件が変えられる。

図の第２行は第一オリゴヌクレオチドプライマーＰＲ−ＰＩを示し、これは複合 構造であるがその３′−末に配列Ｐ１を有し変性された標的分子のＰＩ’セグメ ントにハイブリダイズする。このオリゴヌクレオチドプライマーの５′一部分Ｐ Ｒは、その二本鎖構造においてＲＮＡポリメラーゼのための機能的プロモーター を含んで成る配列を含有する。配列ＰＲはこの発明に不都合な影響を与えない追 加のヌクレオチドを含有することができる。ＰＲ−ＰＩプライマーは適当な酵素 （ＤＮＡ標的のためにはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはＲＮＡ及び ／又はＤＮＡ標的のためにはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）により延長され 、図の第３行に示されるように鎖ＰＲ−ＰＩ−Ｔ−Ｐ２−Ｘ２を与える。プロモ ーター領域の単鎖性は、図においてこの領域の２本の鎖間の接触の不存在により 、そして明細書により次の様に示される：ＸＩ’　−Ｐｉ’　−Ｔ’　−Ｐ２’ 　−Ｘ２’特に自動装置を用いての迅速なハイブリダイゼーション（アニーリン グ）及び循環を許容するため、本発明のこのプライマー（及び他のプライマー） は好ましくは比較的短かく、すなわち５０個以下のヌクレオチドから成る。

図の第３行に示す二本鎖ポリヌクレオチドを変性した後、第４行に示すようにア ニーリング条件下で混合物に配列Ｐ２’の第ニプライマーを添加する。配列Ｐ２ ’はすでに記載した配列Ｐ２’と同一であり、そしｒＰＩ？−ＰＩ−Ｔ−Ｒ２− Ｘ２　（７１Ｐ　２セグメントにそれ自体相補的である。

図の第５行目は示される鋳型上でプライマーを延長することにより得られる生成 物を示す。この段階でのプロモーター領域は今や二本鎖であり、そしてそれ故に ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合のために使用することができる。この明 細書において、この二本鎖中間体は次の様に示される。

ＰＲ−Ｒ１−Ｔ　−Ｒ２−Ｘ２ ＰＲ’　−ＰＩ’　−Ｔ’　−Ｐ２’ ＲＮＡポリメラーゼにより生産されるコピーが図の第６行に示される。すべてプ ロモーターＳＵＭの下流に由来するコピ−されたセグメントはＰＩ”　−Ｔ”　 −Ｐ２”　（ＲはＲＮＡコピーであることを示す）で表わされる。このＲＮＡ分 子は、Ｐｉ−Ｔ−Ｐ２と同一であるか、又はわずかに長いかもしくは短い、なぜ なら、これはＲＮＡポリメラーゼによりコピーされる最初のヌクレオチドに及び その後に配列ＰＲ−ＰＩのすべてを含有するからである。最初の標的鎖が単鎖Ｄ ＮＡ標的であれば、ＰＩ”　−Ｔ”−Ｐ２１はもとのＤＮＡ＋ＲＮＡポリメラー ゼによりコピーされるプロモーター含有セグメントＰＲの幾らかの部分又は−ポ リメラーゼによりコピーされない幾らかのヌクレオチドである。

ＲＮＡコピーが追加の増幅のために再循されるべき場合、プロモーター含有二本 鎖ＤＮＡ中間体の調製について前に検討した段階を反復する。同じプライマーセ グメントＰ１及びＰ２’又は同じプロモーターセグメントＰＲを使用する必要は ないが、ＰＲ−ＰＩ及びＰ２’はすでに入手可能であり、そして変更することな く使用することができる。他のプライマー配列が使用される場合、生ずるコピー は最初のコピーよりわずかに短いか又は長いであろうが、しかしもとのＰｉ−Ｔ −Ｐ２配列を維持すべきある特別の必要性又は要望なければ、前記のことは本発 明に不都合な影響を与えない、Ｐ２′プライマーとの最初のアニーリング、及び これに続くプライマーの延長が図の第７行目に示される生成物をもたらす、この 二本鎖中間体の変性及びプライマーＰＲ−Ｐｉとのアニーリングが第８行目に示 す生成物をもたらす、この中間体は両方向に延長され得る。なぜなら、ＰＩ配列 は鋳型として相補鎖を用いるプライマーとして機能し、そして相補鎖は鋳型とし て配列ＰＲを用いるプライマーとして機能するからである。

第１行目〜第５行目により示される段階において使用されたのと同じプライマー がこの段階で使用されれば、生成物は第５行目に示されたものと類領しており、 上値の範囲のみが異るであろう。ＲＮＡポリメラーゼにより下方鋳型鎖のみが使 用されるから、このことはその後のＲＮＡ重合になんらの影響も与えないであろ う、異るプライマー配列が使用されれば、生ずる鋳型鎖は使用されるプライマー に依存して長いか又は短いであろう。この段階で使用されるプライマーの少なく とも１つがその５′−末端においてＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを 示す配列を有するなら、生ずる材料はなお、さらなる増幅が可能であろう。従っ て、図中の第９行目のプロモーター含有二本鎖ＤＮＡ中間体をＤＮＡ依存性ＲＮ Ａポリメラーゼと共に使用して多数のＲＮＡコピーを再度生産することができる 。

最初に使用したプライマーが、標的分子を含有するＤＮＡ混合物中の意図しない 配列とハイブリダイズする場合、サイクルが反復されるときに異るプライマーを 用いることにより利点が達成し得る。例えば、ヒトの流体又は組織サンプル中の 細菌又は寄生体感染が検出されるべき場合のように、多くのポリヌクレオチド配 列を含有する粗分析対象中で特定の標的核酸が検出されるべき場合、ブライマー オリゴヌクレオチドと宿主ＤＮＡとのハイブリダイゼーションが意図しない宿主 配列の増幅をもたらし得る。増幅されたバックグラウンド材料にプロモーター配 列が存在するであろうから、標的配列の増加と共に特定のバックグラウンド配列 の量の有意な増加が見られる。この問題を回避するため、異るサイクルの間に異 るプライマー及び／又はプロモーターを用いてバンクグラウンドの増幅を防止す ることができる０例えば、もとのブロイマーの結合領域の近傍の又はそれとオー バーラツプする標的配列に属する異る結合領域（Ｐ　１”及び／又はＰ２″Ｘ） を第二サイクルで用いることができる。その増幅が望ましくない他のバックグラ ウンドポリヌクレオチド配列との結合が有在し得るが、同じバックグランド物質 が増幅されないであろう、連続する対のプライマーは標的分子の相補鎖上に接近 して一緒に存在するであろうから、この発明の具体例に従えば、逐次段階におい て使用されるプライマーはプライマーの重ねセット（ｎｅｓｔｅｄ　５ｅｔ）と して記載することができる。第二の（及び連続する）サイクルはまた、異るＲＮ Ａポリメラーゼと結合する異るプロモーター領域（例えば、ＰＲ”）を用いるこ とができる。溶液中に存留する第一のＲＮＡポリメラーゼの分解、及びそれに続 ＜ＰＲ”に結合する第二ポリメラーゼの導入はバックグラウンドコピーではなく 標的コピーを増加せしめるであろう、但し、バックグラウンドコピーの追加の群 が生ずるかも知れない、さらに、過剰に存在するかも知れない先行するサイクル からのプライマーを所望により除去することができる。プライマーを除去するた めの適当な技法はそれらを標的から区別する特徴、例えばサイズ、又は標的が二 本鎖ＤＮＡとして又はＲＮＡとして存在する場合に単鎖ＤＮＡとしてのプライマ ーの存在、に転る０例えば、ゲルクロマトグラフィーは大きな標的から小さいプ ライマーを除去し、他方、特異的ヌクレオチド又は抗体は二本鎖標的からプライ マーを除去するであろう。

異るプロモーターと共に重ね合わされたセットのプライマー又は異るプライマー を使用する例として、第−増幅サイクルにおいて所望の標的配列が５０の係数を もって増加すると仮定しよう。同時に、バックグラウンド配列へのプライマーの 結合が生じ、バックグラウンド配列もまた５０の係数をもって増加する。第二増 幅サイクルが重ねプライマーを使用し、そして再び５０倍の増幅が起これば、標 的配列は２５００倍増加し、他方、（最悪の場合でも）２つのバックグラウンド 配列がそれぞれ５０倍増加する。重ねプライマーの３サイクルの後、標的の増加 係数は１２５．０００であり、（最悪の場合でも）３つのバックグラウンド配列 が５０倍増加するであろう。

本発明の個々の段階はすべて常用のものであり、そして既知の試薬及び技法を用 いて行うことができる。特に設計された試薬はプライマーＰＲ−ＰＩ及びＰ２’ である。しかしながら、これらのセグメントは全合成により、又は天然源からの 所望の配列の単離により容易に得ることができる。配列Ｐ２（及び従ってその相 補配列Ｐ２′）並びにＰｌが標的分子中で知られている場合、全合成が最も容易 に行われる。プロモーター配列を有するＤＮＡセグメントの全合成は容易に達成 される。なぜなら、プロモーター配列自体は公表されているからである。標的分 子の配列が未知の場合、標的分子を制限エンドヌクレアーゼ又は他の方法により 断片化し、そしてセグメントを本発明のために選択することができる。ＲＮＡポ リメラーゼ及びその関連す？プロモーター配列はこれらの成分の多くの入手可能 な起源から選択することができる０例えば、Ｔ７バクテリオフアージからのＴ７ 　ＲＮＡポリメラーゼがニューイングランドバイオラプスから入手可能である。

他のＲＮＡポリメラーゼには、ニューイングランド・バイオラプスら入手可能な バクテリオファージＳＰ６からのＳＦ３、又はラプス・ケミカル社、セントルイ ス、ミズリーから入手可能なＥ、コＩＪＫ−１２株からのに−１２が含まれる。

対応するプロモーターは、ポリメラーゼが得られた生物から単離することができ 、又は配列が既知の場合には化学的に合成することができる。

本発明の方法において使用される他の生化学試薬にはプライマー配列を延長して 二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる酵素が含まれる。この様な酵素 には逆転写酵素及び他のＤＮＡポリメラーゼが含まれる。特に好ましい酵素はラ イフサイエンス社（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ、）からのＡＭＶ逆転写酵 素又はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃ ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ファルマシア（Ｐｈａｒｓ＋ａｃｉａ）　、 Ｕ、Ｓ。

バイオケミカルス（Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、又はバイオラプ ス（Ｂｔｏｌａｂｓ）からのポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏ＠）断片である。

本発明の個々の段階は容易に自動化することができる０反応は、単一容器中で逐 次試薬を添加しそして必要に応じて条件を変えることによって行うことができる 。変性条件は一般に上昇した温度、特に９５℃から１００°Ｃまでの範囲の温度 を用いる。アニーリング及びプライマー延長はさらに低い温度、典型的には３５ °Ｃ〜５０℃において起こる。示された高温においてはポリヌクレオチドと共に 多くの蛋白質が変性するため、必要に応じて追加の蛋白質を添加することができ る。存在する他の試薬は適切なｐｎ及びイオン条件において反応を維持するため の緩衝液、並びに延長反応において使用されるべき（検出可能なシグナルを提供 するために最終的にラベルされるか又は修飾される）モノヌクレオチドトリホス フェートを含むことができる。

二本鎖ポリヌクレオチドを変性するために高温が使用される場合、試薬又は溶液 を分離する必要はない、他の変性条件、例えば溶剤の使用は好ましくない。なぜ なら、アニーリング条件から変性条件に進む時及びアニーリング条件に戻るとき に付加された分離段階が必要だからである。しかしながら、多くの変性、アニー リング及び延長条件が知られており、そして所望により使用することができる。

標的配列の多数のコピーを種々の方法で使用することができる０例えば、本発明 の方法を、遺伝子操作法のプラスミド又は他の標的に挿入するための遺伝子の多 数コピーを調製するために使用することができる。標的配列についての診断測定 において使用される場合、検出段階（プローブとのハイブリダイゼーション、プ ローブ、抗体又はリガンド標的が配列Ｔ内にあり、すなわちプライマー又はプロ モーター領域の部分を含まないのであれば、抗体又は特異的リガンドとの反応） を、反応媒体から増幅された標的を単離することな（行うことができる。領域Ｐ １及びＰ２内のプローブ標的を選択することができるが、プライマー分子との結 合又はそれによる妨害を回避するために標的遺伝子コピー（ＰＩ−Ｔ−Ｐ２又は ＰＩ”　−Ｔ”　−Ｐ２”　）の分離が必要であろう、ＲＮＡが生産される段階 において、ラベルされたりボシドトリホスフエート（例えば、放射能ラベル、ビ オチン又はアビジンラベル）を使用することもできる。本発明により生じたポリ ヌクレオチド生成物の他の用途には、変異誘発、遺伝子操作及びクローニング、 遺伝分析、治療（遺伝子療法及び化学療法の両者）、蛋白質の生産（インビトロ 翻訳及び細胞への導入の両者）、並びに特定のポリヌクレオチド配列の多数コピ ーを有利に用いる他の任意の方法が含まれる０例えば、ＲＮＡ制御分子を多量に 生産することができる。

今、本発明を一般的に記載したが、本発明の限定を意図することなく例示の目的 で与えられる以下の詳細な例に言及することにより一層よく理解されよう。

例 本発明の技法が、トキソプラズマ・ボンデイー（ｎ社几且駐脛皿旦）のクローン 化された遺伝子、具体的には遺伝子Ｂ１として同定される３５倍反復抗原遺伝子 を用いて評価された。

示された遺伝子はＴ、ボンデイー（Ｔ、　脛皿旦）（ＲＨ株）からのゲノムＤＮ Ａの挿入部を含む組換ＤＮＡライブラリーから得られた。このライブラリーは発 現ベクターλｇｔｌｌ中に構成され、そして免疫感作されたラビットからの抗血 清を用いてスクリーニングされた。こうして同定された組換体がサブクローニン グされそしてさらに特徴付けられた。これらの研究において使用された標的遺伝 子は、Ｔ、ボンブイ−のゲノム中でタンデムに多数回反復する２、２キロ塩基対 （ｋｂ）の部分であることが見出された。この遺伝子の同定及び制限地図は公表 されている（Ｂｏｏ　ｔｈｒｏｙｄ等、“Ａｎｔｉｇｅｎ　ａｎｄ　Ｔｕｂｕｌ ｉｎＧｅｎｅｓ　ｏｆ　ハ脛且ｕ艶Ｇｏｎｄｉｉ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌｕｒ　Ｓｔ ｒａｔｅｇｉｅｓ　ｏｆＰａｒａｓｉｔｉｃ　Ｉｎｖａｓｉｏｎ、　Ａｙａｂｉ ａｎ”等編、［ＪＣＬＡ　Ｓｙ＋ｎｐｏｓｉａ　Ｖｏｌ。

４２、２３７−２５０．　Ａｌａｎ　Ｌｉ５ｓ、　二！−ヨーク、１９８７）　 、１個の完全反復のヌクレオチド配列が決定されている（しかし公表されていな い。）本研究に関連する配列の部分を下に再現する。

使用される番号系はゲノム中の反復を規定するＥｃｏ８１部位から数える。配列 は二本鎖分子として示され、玉鎖は左から右に５’−３’方向にある。オリゴヌ クレオチドセグメントは同じ意味の鎖、そしてそれ故に同じ配列に下線が付され ている。

０ＬＩＧＯ１００ＬＩＧＯ雲１ ＯＬＩＧＯ１２ ０ＬＩＧＯ１３ 遺伝子増殖の最終目的は診断測定における本方法の潜在的使用のためであったか ら、標的遺伝子は、それが診断のための標的遺伝子の必要な残りの基準に合うか 否かを見るために試験された。これらは、標的遺伝子が寄生体のほとんど又はす べての株に存在し、他の感染体（特に診断において床几を生じさせるもの）のゲ ノム中に存在せず、そして宿主のゲノム中に検出されないことである。予備的研 究が示すところによれば、この遺伝子は試験された寄生体のすべての株に存在し 、そしてヒト宿主のゲノムを含む試験された他の生物体のゲノムとの交差反応性 は存在しない。

多数のプライマーが本発明の方法における使用のために評価された。これらのプ ライマーは前記の配列中の下線により特定される。プライマーは２０〜４０ヌク レオチド（任意的プロモーター配列を含めて）の長さであり、効果的なアニーリ ングの標的配列との和動性を示した。グアノシン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）残基 が各プライマーの３′−末端に存在し、そこから延長が起こる効果的な塩基対合 を保証した。延長が効率的で且つ迅速であるように、反対の鎖に対して相補なプ ライマー間に１５０以下の塩基対を伴うプライマーを選択した。

他のプライマーとの又は単一のプライマー中で安定な塩基対樽造を形成する（こ れはプライマーが標的配列にアリールするのを防止するであろう）能力を欠くプ ライマーをさらに選択した。増幅段階のために本質的ではないが、「内部」増幅 されたＤＮＡについてのプローブ（すなわち、増幅された生成物に対して特異的 であるがプライマーとハイブリダイズしないであろうプローブ）のクローニング 及び作製を促進するために便利な制限部位を挟むようにプライマーを選択した。

この「内部」増幅されたＤＮＡは一般的記載及び請求の範囲中のセクションＴと 同等である。

Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む二本鎖断片の生成のために使用さ れる反応条件はすでに記載されているもの（Ｓａｉｋｉ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９ ８６）、　３２４　：　１６３−１６６　）と類似した。

反応媒体は１００Ｊｌ！容量中に１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，５）、１０ｍ ＭＭｇ（／！ｚ　、１．５０１Ｍ　ｄＮＴＰ　、１．５ｍオリゴヌクレオチドプ ライマー、及び実験に応じて種々の量の標的含有ＤＮＡ　（０，１５ｐｇ〜１． 　Ｏｔｒｇ　）を含有した。各サイクルは９０″Ｃにおける２分間の変性（変性 が１０分間起こる第一サイクルを除く）、ドライアイス上での５秒間の迅速冷却 、回転（チューブの上部での凝集を除去するため）、３５°Ｃにて２分間のプラ イマーのアニーリング、Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩのＫｌｅｎ ｏｗ断片２ユニットの添加、及び３５°Ｃにて２分間の延長から成る。

本発明の方法はまた、標的遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの１つ（上に特定し たオリゴ＃１）の５′−末端にバクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼの ためのプロモーターを含有せしめることにより行われた。Ｔ７プロモーター配列 はＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧである。これらの追加の２０ヌク レオチドを最初の段階の増幅された二本鎖ＤＮＡ生成物に導入することにより、 この配列を欠くオリゴヌクレオチドが使用された場合より２ｏｂｐ大きい生成物 を得た。例えば、オリゴ＃１及び＃２を用いて増幅されたＤＮＡは１１７ｂｐで あり、オリゴヌクレオチドに対する相同性を含む標的の９７ｂｐよりも２０ｂｐ 大である（そして同様に、＃１及び＃３を用いれば生成物は１５１ｂｐ−１３１ ｂｐ　＋２０ｂｐである）。

これらの追加された配列はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼのための効率的にプロモー ターとして機能した。インビトロエフ転写反応はＴ７　ＲＮＡ供給者の指示に従 って行われた。ＤＮＡ鋳型（プロモーター領域を含有する）は上記の反応からさ らに処理することなく直接得た。インビトロで生成したＴ７　ＲＮＡ転写物のオ ートラジオダラムは、それらがＤＮＡ鋳型よりも１７ヌクレオチド短いことを確 認した。言い換えれば、１５１塩基対の二本鎖ＤＮＡ中間対生成物は１３４ｎｔ 　ＲＮ　Ａ、すなわち標的配列からの１３１ｎｔ及びＴ７プロモーター配列から の３ｎｔ（ＧＧＧ）を与えた。ＲＮＡ転写物に（”Ｐ）−ＵＴＰを導入すること により、臭化エチジウム染色に比べて、増幅された生成物の検出感度の約３００ 倍の増加が得られた。

本発明の測定は特に、高い非活性、低いＲＮＡ収量を与えるように設計され、そ してそれ故にＴ７転写から生じた標的配列の最大モル増加を示さない。しかしな がら、高収量条件のもとでは、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鋳型分子当り ５０〜１００ＲＮＡ分子を生産することが知られている（Ｄａｖａｎｌｏｏ等、 ”Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｎｅ　ｆｏｒ　 ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ”、Ｐｒｏ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８４）８１　：　２０３５− ２０３９）　。

この方法は、図に示しそして上に記載したＴ７ＲＴ増幅の幾つかのサイクルを用 いて行われた。この方法をここでは便宜上ＴＴＲＴ法と称する。この方法は従来 技術のＰＣＲ法に比べて幾つかの利点を有する。第一に、増幅されるべき標的配 列はＲＮ　Ａ又はＤＮＡのいずれでもよく、このことは、選択された遺伝子が高 度に発現される場合に重要である。なぜなら、ＡＭＶ逆転写酵素はＲＮＡ又は単 鎖ＤＮＡを鋳型として使用することができるからである。これはまた、レトロウ ィルスの検出の場合のように標的配列がＲＮＡのみである増幅のために有意義で ある。第二に、再配列を含む各全サイクルからの増幅はＰＣＲ技法よりも高＜　 （Ｔ７ＲＴについてはサイクル当り１００までであり、これに対してＰＣＲ技法 についてはサイクル当り最大２である）、サイクル数の減少（Ｔ７ＲＴでは３サ イクルで１０ｈ倍増幅、これに対してＲＣＲについては少な（とも２０〜２５） 及び酵素のより少い量の対応する使用が可能となる。第三に、蛍白質への翻訳、 化学的不安定性のごとくＲＮＡがＤＮＡより好ましい任意の方法のために、多量 のＲＮＡが生産され得る。

Ｔ７ＲＴ法の最初の研究は前のセクションに記載したのと同じオリゴヌクレオチ ド及び標的配列を使用した。図に示すように、各サイクルのために２種類の酵素 、すなわちＡＭＶ逆転写酵素及びＴ７　ＲＮＡポリメラーゼが逐次使用される。

変性、アニーリング及び延長の反復される段階はサンプル温度の変化（変性のた めには９０〜１００″Ｃ、アニーリングのためには３７〜４１°Ｃ）、並びに増 幅されるべき核酸、適当な緩衝液（酵素の供給者により示された）、ＮＴＰ及び ｄＮＴＰ、モル過剰のオリゴヌクレオチドプライマー並びにＲＮアーゼ阻害剤を 含有するサンプルへの酵素の添加により実現される。

第一の実験において、プロモーター配列（上記のごとき）を含有するように最初 に合成された遺伝子断片を使用してＴ７ＲＴ法の実施可能性を証明した。まず、 基質ＤＮＡをＴ７　ＲＮＡポリメラーゼにより転写した。これは１３４ｎｔのＲ ＮＡ生成物を生ずると予想された０次に、この材料を、放射能標識されたｄＮＴ Ｐの存在下でＡＭＶ逆転写酵素を用いて、前記のようにそして図に示すようにし て二本鎖ＤＮＡにもどした。予想され（そして得られた）主たるＤＮＡ生成物は １３４ｎｔであり、インプット遺伝子断片の連続する存在のため１５１ｎｔの少 量の材料が存在した。Ｔ７ポリメラーゼを省略したほか、対照サンプルを同様に 処理した。この逆転写酵素段階につづき、ＡＭＶＲＴによる直接増幅の第二サイ クルを各サンプルに対して行った。これは、プライマーとしてオリゴ＃１（これ はその５′末端にＴ７プロモーターの追加の１７ヌクレオチドを有する）を用い ての１３４ｎｔ生成物の合成により１５１ｎｔ生成物の実質的な量の合成をもた らした。調節された反応の１５１ｎｔ生成物に比べて１３４ｎｔ物質は約１０倍 多かった（１回のＴ７ＲＴサイクルの後）から、Ｔ７増幅は、ＰＣＲ法のみの約 ４．５サイクルにより得られるそれに相当した。この増幅はＴＴＲＴ法を最適化 することなく達成されたから、ＰＣＲ法に対する効率及びコストの一層大きな改 良が期待される。

この明細書に記載したすべての公開及び特許出願は、この発明が属する分野にお ける当業者のレベルを示すものである。

この明細書のすべての公表及び特許出願は、各個々の公開又は特許出願が引用に より組み込まれるべき旨が示されているのと同じ程度に引用によりこの明細書に 組み込まれる。

今やこの発明は十分に記載されており、添付された請求の範囲の本質又は範囲を 逸脱することなく多くの変更を行うことができることは当業者に明らかであろう 。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．反応媒体中で標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を増加せしめる方法であ って、 （１）標的単鎖ポリヌクレオチド分子を複数のプライマー配列とハイブリダイズ せしめ、次に該プライマーを延長しそして変性せしめ、ここで前記プライマーの 内の少なくとも１つはプロモーター配列であり、こうして標的配列の上流にプロ モーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成せしめ；そして （２）前記プロモーターに結合することができるＲＮＡポリメラーゼを用いて前 記中間体から前記標的配列の多数のＲＮＡコピーを一増殖せしめる； ことを含んで成る方法。 ２．（１）前記ＲＮＡコピーをプライマー配列とハイプリダイズせしめ、延長し そして変性せしめることにより該ＲＮＡコピーから前記標的配列の上流にプロモ ーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体の第二の集合を調製し；そして（２）前 記二本鎖ＤＮＡ中間体の第二の集合から多数のＲＮＡコピーを増殖せしめる； ことをさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。 ３．前記の延長が、前記反応媒体を逆転写酵素と接触せしめることを含んで成る 、請求項１に記載の方法。 ４．二本鎖標的分子のアンチ−センス鎖を、５′にプロモーター配列を有しそし て該標的配列５′側の標的センス鎖の配列と同等の結合配列を有する第一プライ マーとハイプリダイズせしめ、前記アンチ−センス鎖を鋳型として用いて前記第 一プライマーから第一相補鎖を延長せしめ、変性せしめることによって単鎖ポリ ヌクレオチド中間体の第一の集合を形成し、該第一の集合を前記センス鎖中の前 記標的配列の３′側に結合する第二プライマーとハイプリダイズせしめ、前記第 一相補鎖を鋳型として用いて前記第二プライマーから相補鎖を延長することによ って前記二本鎖ＤＮＡ中間体を得、そして前記反応媒体を前記プロモーターと結 合することができるＲＮＡポリメラーゼと接触せしめる、ことを含んで成る請求 項１に記載の方法。 ５．（１）配列Ｘｌ−Ｐｌ−Ｔ−Ｐ２−Ｘ２の標的分子に相補的な配列Ｘ１′− Ｐ１′−Ｔ′−Ｐ２′−Ｘ２′の単鎖ポリヌクレオチド分子を配列ＰＲ−Ｐ１の 第一プライマーとハイプリダイズせしめることにより、 ▲数式、化学式、表等があります▼ Ｘ１′−Ｐ１′−Ｔ′−Ｐ２′−Ｘ２′を生成せしめ； （２）相補鎖を延長することによって、▲数式、化学式、表等があります▼ Ｘ１′−Ｐｌ′−Ｔ′−Ｐ２′−Ｘ２′を生成せしめ、次に変性を行って単鎖ポ リヌクレオチドの第一の集合を形成せしめ； （３）前記ポリヌクレオチドの第一の集合を配列Ｐ２′の第二プライマーとハイ ブリダイズせしめることにより、ＰＲ−Ｐ１−Ｔ−Ｐ２−Ｘ２ Ｐ２′ を生成せしめ； （４）相補鎖を延長することにより、 ＰＲ−Ｐ１−Ｔ−Ｐ２−Ｘ２ ＰＲ′−Ｐ１′−Ｔ′−Ｐ２′ を生成せしめ；そして （５）二本鎖プロモーター領域、 ＰＲ ＰＲ′ と結合することができるＲＮＡポリメラーゼを用いて式Ｒ１Ｒ−ＴＲ−Ｐ２Ｒを 有するＰ１−Ｔ−Ｐ２の多数のＲＮＡコピーを増殖せしめる； ことを含んで成る、 （前記式中、 Ｔは、標的配列であり； Ｔ′は、Ｔに対して相補的な配列であり；ＰＲ−Ｐ１は、第一オリゴヌクレオチ ドプライマーであって、ここでＰＲはプロモーター配列を含んで成り、そしてＰ １は該第一プライマーの結合配列であり； Ｒ１′は、Ｐ１に対して相補的な配列であり；ＰＲ′は、ＰＲに対して相補的な 配列であり；Ｐ２′は、第二オリゴヌクレオチドプライマーであり；Ｐ２は、Ｐ ２′に対して相補的な標的ポリヌクレオチド中の配列であり； Ｘ１及びＸ２は、前記標的分子のＰ１−Ｔ−Ｐ２配列の外側の配列であり、そし てそれぞれ存在し又は存在せず；Ｘ１′は、Ｘ１に対して相補的な配列であり； Ｘ２′は、Ｘ２に対して相補的な配列であり；そしてＰ１Ｒ−ＴＲ−Ｐ２Ｒは、 ＲＮＡ分子であり、ここでＰ１ＲはＰ１と同等な配列であり、ＴＲはＴと同等な 配列であり、そしてＰ２ＲはＰ２と同等な配列である）請求項１に記載の方法。 ６．（６）次Ｐ１Ｒ−ＴＲ−Ｐ２Ｒの前記多数のＲＮＡコピーを前記第二プライ マーとハイブリダイズせしめることにより、Ｐ１Ｒ−ＴＲ−Ｐ２Ｒ Ｐ２′ を生成せしめ； （７）相補鎖を延長して、 Ｐ１Ｒ−ＴＲ−Ｐ２Ｒ Ｐ１′−Ｔ′−Ｐ２′ を生成せしめ、次に変性を行って単鎖ポリヌクレオチドの第三の集合を形成せし め； （８）前記単鎖ポリヌクレオチドの第三の集合を前記第一プライマーとハイブリ ダイズせしめることにより、▲数式、化学式、表等があります▼ Ｐ１′−Ｔ′−Ｐ２′ を生成せしめ； （９）相補鎖を延長することにより、 ＰＲ−Ｐ１−Ｔ−Ｐ２ ＰＲ′−Ｐ１′−丁′−Ｐ２′ を生成せしめ； （１０）段階（５）を反復し；そして （１１）場合によっては段階（６）〜（１０）を反復する；〔ここで、段階（６ ）〜（１０）の各サイクルにおいて、各ＰＲ−Ｐ１及びＰ２′オリゴヌクレオチ ドプライマーは段階の先行するサイクルからの対応するプライマーであるか又は 対応するプライマーとは異るプライマーである〕段階をさらに含んで成る、請求 項５に記載の方法。 ７．前記標的単鎖ポリヌクレオチド分子がＲＮＡである、請求項５に記載の方法 。 ８．前記標的単鎖ポリヌクレオチド分子がＤＮＡである、請求項５に記載の方法 。 ９．前記延長が、延長されるべき前記配列を逆転写酵素と接触せしめることを含 んで成る、請求項５に記載の方法。 １０．前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである、請求項５に記 載の方法。 １１．前記プライマーが１０〜３０ヌクレオチドの長さの結合配列を含んで成る 、請求項１に記載の方法。 １２．前記複数のプライマーが２００未満の塩基対により分離されている、請求 項１に記載の方法。 １３．前記プロモーター配列がプライマーの５′一末端にある請求項１に記載の 方法。 １４．前記標的単鎖ポリヌクレオチド分子がＤＮＡであり、延長が逆転写酵素を 用いて行われ、そして前記プライマーが前記中間体中に１５０塩基対以下離れて 存在する、請求項１に記載の方法。 １５．サンプル中の標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法であって、 請求項１に従って該標的配列のコピー数を増加せしめ；そして 前記増加したコピーの存在を検出する；ことを含んで成る方法。