JPH11178593A - Ｖｅｇｆ１２１特異的モノクローナル抗体及び測定方法 - Google Patents
Ｖｅｇｆ１２１特異的モノクローナル抗体及び測定方法Info
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- JPH11178593A JPH11178593A JP9365972A JP36597297A JPH11178593A JP H11178593 A JPH11178593 A JP H11178593A JP 9365972 A JP9365972 A JP 9365972A JP 36597297 A JP36597297 A JP 36597297A JP H11178593 A JPH11178593 A JP H11178593A
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- vegf
- vegf121
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナル抗
体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及
び該モノクローナル抗体を用いたＶＥＧＦの測定方法。 【効果】 本発明により、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１
６５とを識別仕分けるようなモノクローナル抗体及び該
モノクローナル抗体を用いた免疫測定法を提供し、ＶＥ
ＧＦ１２１の作用機序の解明等に広く応用することがで
きる。
体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及
び該モノクローナル抗体を用いたＶＥＧＦの測定方法。 【効果】 本発明により、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１
６５とを識別仕分けるようなモノクローナル抗体及び該
モノクローナル抗体を用いた免疫測定法を提供し、ＶＥ
ＧＦ１２１の作用機序の解明等に広く応用することがで
きる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＶＥＧＦ１２１に
特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用
いたＶＥＧＦの測定方法に関する。
特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用
いたＶＥＧＦの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血管新生は、正常では胎児期の血管形成
や組織の構築、黄体形成や子宮内膜の増殖期に関与する
が、病的状態では炎症、創傷治癒、糖尿病性網膜症、関
節性リュウマチ、固形癌の増殖に重要な役割を果たして
いる（実験医学 15 998-1002 (1997) ）。血管新生に関
与する因子として血管内皮細胞増殖因子（vascular end
othelial cell growth factor,ＶＥＧＦ）、血管透過性
因子（vascular permeability factor, ＶＰＦ）、繊維
芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor, ＦＧ
Ｆ）、血小板由来増殖因子（platelet-derived growth
factor, ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−
α（transforming growth factor- α, ＴＧＦ−α）、
腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor, ＴＮＦ）、イ
ンターロイキン８（interleukin-8,ＩＬ−８）等が知ら
れているが、これらの中で最も中心的かつ重要な役割を
果たしているのはＶＥＧＦである。その後、ＶＥＧＦと
ＶＰＦは同一因子であることが確認されている。
や組織の構築、黄体形成や子宮内膜の増殖期に関与する
が、病的状態では炎症、創傷治癒、糖尿病性網膜症、関
節性リュウマチ、固形癌の増殖に重要な役割を果たして
いる（実験医学 15 998-1002 (1997) ）。血管新生に関
与する因子として血管内皮細胞増殖因子（vascular end
othelial cell growth factor,ＶＥＧＦ）、血管透過性
因子（vascular permeability factor, ＶＰＦ）、繊維
芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor, ＦＧ
Ｆ）、血小板由来増殖因子（platelet-derived growth
factor, ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−
α（transforming growth factor- α, ＴＧＦ−α）、
腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor, ＴＮＦ）、イ
ンターロイキン８（interleukin-8,ＩＬ−８）等が知ら
れているが、これらの中で最も中心的かつ重要な役割を
果たしているのはＶＥＧＦである。その後、ＶＥＧＦと
ＶＰＦは同一因子であることが確認されている。
【０００３】ＶＥＧＦは、腫瘍細胞の分泌する血管透過
性因子として（Science, 219, 983-985 (1983)）、ま
た、下垂体濾胞細胞培養上清中の内皮細胞増殖因子とし
て見いだされた蛋白質(Biochem. Biophys. Res. Commu
n., 161, 851-858 (1989)）であり、1989年に遺伝子が
単離された(Science, 246, 1306-1309 (1989) 、 Scien
ce, 246, 1309-1312 (1989) ）。その後の研究によりＶ
ＥＧＦはアミノ酸残基数の異なる４つのアイソマーが存
在することが明らかになった。アミノ酸残基数で１２１
個（以下、本明細書においてはＶＥＧＦ１２１と記載す
る）、１６５個（以下、本明細書においてはＶＥＧＦ１
６５と記載する）、１８９個（以下、本明細書において
はＶＥＧＦ１８９と記載する）、２０６個（以下、本明
細書においてはＶＥＧＦ２０６と記載する）の４つのア
イソマーは、遺伝子レベルの研究により、ＶＥＧＦ１２
１及びＶＥＧＦ１６５の２つが血管内皮細胞に対する作
用が強いことが示唆された（Endocrine Reviews, 13, 1
8-32 (1992) ）。しかし、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１
６５の間で、血管内皮細胞に対する作用に質的或いは量
的な違いがあるかどうかは明らかにされてはいない。
性因子として（Science, 219, 983-985 (1983)）、ま
た、下垂体濾胞細胞培養上清中の内皮細胞増殖因子とし
て見いだされた蛋白質(Biochem. Biophys. Res. Commu
n., 161, 851-858 (1989)）であり、1989年に遺伝子が
単離された(Science, 246, 1306-1309 (1989) 、 Scien
ce, 246, 1309-1312 (1989) ）。その後の研究によりＶ
ＥＧＦはアミノ酸残基数の異なる４つのアイソマーが存
在することが明らかになった。アミノ酸残基数で１２１
個（以下、本明細書においてはＶＥＧＦ１２１と記載す
る）、１６５個（以下、本明細書においてはＶＥＧＦ１
６５と記載する）、１８９個（以下、本明細書において
はＶＥＧＦ１８９と記載する）、２０６個（以下、本明
細書においてはＶＥＧＦ２０６と記載する）の４つのア
イソマーは、遺伝子レベルの研究により、ＶＥＧＦ１２
１及びＶＥＧＦ１６５の２つが血管内皮細胞に対する作
用が強いことが示唆された（Endocrine Reviews, 13, 1
8-32 (1992) ）。しかし、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１
６５の間で、血管内皮細胞に対する作用に質的或いは量
的な違いがあるかどうかは明らかにされてはいない。
【０００４】ＶＥＧＦを蛋白質として捕らえようとする
場合、抗ＶＥＧＦ特異的抗体による免疫測定法を用いる
のが簡便である。ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体
は既に取得されている（Growth Factor, 7, 53-64 (199
2)、Hybridoma, 14, 475-480(1995) 、Clinical Chemis
try, 42, 1777-1784 (1996)、特開平８−１６９８９
号、特開平８−５３４９８号、特開平７−３３０７９５
号、特開平９−１２４６９７号）が、ＶＥＧＦ１２１と
ＶＥＧＦ１６５とを識別仕分けるような抗体は存在せ
ず、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５それぞれの役割に
ついては、解明が進んでいなかった。
場合、抗ＶＥＧＦ特異的抗体による免疫測定法を用いる
のが簡便である。ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体
は既に取得されている（Growth Factor, 7, 53-64 (199
2)、Hybridoma, 14, 475-480(1995) 、Clinical Chemis
try, 42, 1777-1784 (1996)、特開平８−１６９８９
号、特開平８−５３４９８号、特開平７−３３０７９５
号、特開平９−１２４６９７号）が、ＶＥＧＦ１２１と
ＶＥＧＦ１６５とを識別仕分けるような抗体は存在せ
ず、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５それぞれの役割に
ついては、解明が進んでいなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５とを識別するよう
なモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を用い
た免疫測定法を提供することにある。
は、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５とを識別するよう
なモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を用い
た免疫測定法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来の課
題を解決すべく、ＶＥＧＦアイソマーに関する研究を重
ねた結果、ＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナル抗
体を作成し、該モノクローナル抗体を用いた免疫測定方
法によりＶＥＧＦ１２１を測定することに成功して本発
明を完成した。
題を解決すべく、ＶＥＧＦアイソマーに関する研究を重
ねた結果、ＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナル抗
体を作成し、該モノクローナル抗体を用いた免疫測定方
法によりＶＥＧＦ１２１を測定することに成功して本発
明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、ＶＥＧＦ１２１に特
異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用い
たＶＥＧＦの測定方法を提供するものである。
異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用い
たＶＥＧＦの測定方法を提供するものである。
【０００８】本発明のモノクローナル抗体を用いれば、
ＶＥＧＦ１２１のみを直接検出することができ、ＶＥＧ
Ｆ１２１の免疫測定、作用機序の解明等に広く応用する
ことができる。
ＶＥＧＦ１２１のみを直接検出することができ、ＶＥＧ
Ｆ１２１の免疫測定、作用機序の解明等に広く応用する
ことができる。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】本発明においてＶＥＧＦ１２１とは、配列
番号１に示すアミノ酸配列を有する蛋白質である。ＶＥ
ＧＦ１２１は、そのアミノ酸配列がＶＥＧＦ１６５の１
〜１１４までと同一であり、１１５番目のアスパラギン
はリジンに置換され、更にＣ末端の６アミノ酸残基はＶ
ＥＧＦ１６５のＣ末端と同一である。
番号１に示すアミノ酸配列を有する蛋白質である。ＶＥ
ＧＦ１２１は、そのアミノ酸配列がＶＥＧＦ１６５の１
〜１１４までと同一であり、１１５番目のアスパラギン
はリジンに置換され、更にＣ末端の６アミノ酸残基はＶ
ＥＧＦ１６５のＣ末端と同一である。
【００１１】本発明のＶＥＧＦ１２１に特異的なモノク
ローナル抗体を得るには、免疫原としてＶＥＧＦ１２１
を用いるよりもＶＥＧＦ１２１固有の構造部分を用いる
のが好ましく、具体的には、ＶＥＧＦ１２１固有の立体
構造、エクソン５とエクソン８の連続から生じるＣ末端
側のＶＥＧＦ１２１独特の連続したアミノ酸部分を含む
ペプチド等が挙げられる。更に好ましくは、ＶＥＧＦ１
２１の１１０〜１２１番目のアミノ酸残基を免疫原とす
るのが望ましいが、何を免疫原として用いたとしても、
モノクローナル抗体を確立する際にＶＥＧＦ１２１に特
異的なモノクローナル抗体を選別すればよく、免疫原は
これらに限定されるものではない。
ローナル抗体を得るには、免疫原としてＶＥＧＦ１２１
を用いるよりもＶＥＧＦ１２１固有の構造部分を用いる
のが好ましく、具体的には、ＶＥＧＦ１２１固有の立体
構造、エクソン５とエクソン８の連続から生じるＣ末端
側のＶＥＧＦ１２１独特の連続したアミノ酸部分を含む
ペプチド等が挙げられる。更に好ましくは、ＶＥＧＦ１
２１の１１０〜１２１番目のアミノ酸残基を免疫原とす
るのが望ましいが、何を免疫原として用いたとしても、
モノクローナル抗体を確立する際にＶＥＧＦ１２１に特
異的なモノクローナル抗体を選別すればよく、免疫原は
これらに限定されるものではない。
【００１２】上記のような免疫原を、マウス、ラット、
ハムスター等の免疫動物に免疫する。免疫は常法に従っ
て行うことができ、抗原は単独でまたはアジュバンドと
共に免疫動物に投与する。免疫後は、血清を採取して抗
体価の上昇を確認し、必要に応じて追加免疫を行うとよ
い。抗体価の上昇を確認後、脾臓細胞等のような抗体産
生細胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞とを、ポリ
エチレングリコール等のような融合剤で融合してハイブ
リドーマを作製する。次いでハイブリドーマをＨＡＴ培
地のような選択培地を用いて選択し、限界希釈法等の適
当な方法でモノクローナル化して培養する。この培養上
清を酵素免疫測定法のような適当な免疫測定法で分析
し、目的とするＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナ
ル抗体を産生しているクローンを選択する。選択の際に
は、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６
等の他のアイソマーとの反応性の有無を確認することが
好ましい。これらのモノクローナル抗体作製の手法は、
公知の方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン（Natu
re 256 495 1975 ）、シェーラー（Nature 285 446 198
0 ）等の方法により行うことができる。また上述の手法
により作製したモノクローナル抗体は、プリスタン処理
したマウスに該モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを投与して得られた腹水、あるいは該モノクロナ
ール抗体を産生するハイブリドーマの培養上清から、塩
折、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡを固
定化したアフィニティークロマトグラフィー等の分析・
精製手段により回収することができる。
ハムスター等の免疫動物に免疫する。免疫は常法に従っ
て行うことができ、抗原は単独でまたはアジュバンドと
共に免疫動物に投与する。免疫後は、血清を採取して抗
体価の上昇を確認し、必要に応じて追加免疫を行うとよ
い。抗体価の上昇を確認後、脾臓細胞等のような抗体産
生細胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞とを、ポリ
エチレングリコール等のような融合剤で融合してハイブ
リドーマを作製する。次いでハイブリドーマをＨＡＴ培
地のような選択培地を用いて選択し、限界希釈法等の適
当な方法でモノクローナル化して培養する。この培養上
清を酵素免疫測定法のような適当な免疫測定法で分析
し、目的とするＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナ
ル抗体を産生しているクローンを選択する。選択の際に
は、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６
等の他のアイソマーとの反応性の有無を確認することが
好ましい。これらのモノクローナル抗体作製の手法は、
公知の方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン（Natu
re 256 495 1975 ）、シェーラー（Nature 285 446 198
0 ）等の方法により行うことができる。また上述の手法
により作製したモノクローナル抗体は、プリスタン処理
したマウスに該モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを投与して得られた腹水、あるいは該モノクロナ
ール抗体を産生するハイブリドーマの培養上清から、塩
折、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡを固
定化したアフィニティークロマトグラフィー等の分析・
精製手段により回収することができる。
【００１３】本発明のモノクローナル抗体は、公知の免
疫測定方法に用いることができる。例えば、本発明のモ
ノクローナル抗体を固相化し、液相に標識した公知の抗
ＶＥＧＦ抗体を用いたサンドイッチ測定法や標識したＶ
ＥＧＦ１２１を用いた競合測定法によるＶＥＧＦ１２１
の免疫測定法を挙げることができる。免疫測定に用いる
標識物質としては、例えば、酵素、放射性同位元素、蛍
光物質、発光物質等が挙げられるが、本発明の免疫測定
法はこれらに限定されるものではない。
疫測定方法に用いることができる。例えば、本発明のモ
ノクローナル抗体を固相化し、液相に標識した公知の抗
ＶＥＧＦ抗体を用いたサンドイッチ測定法や標識したＶ
ＥＧＦ１２１を用いた競合測定法によるＶＥＧＦ１２１
の免疫測定法を挙げることができる。免疫測定に用いる
標識物質としては、例えば、酵素、放射性同位元素、蛍
光物質、発光物質等が挙げられるが、本発明の免疫測定
法はこれらに限定されるものではない。
【００１４】なお、測定検体には制限が無く、例えば血
清、血漿、全血、尿、リンパ液等の各種体液や細胞組織
抽出液等のＶＥＧＦ１２１の測定に適応できる。
清、血漿、全血、尿、リンパ液等の各種体液や細胞組織
抽出液等のＶＥＧＦ１２１の測定に適応できる。
【００１５】更に、本発明のモノクローナル抗体は、常
法に基づき組織免疫染色に用いることもでき、ＶＥＧＦ
１２１の作用機序の解明に有用である。
法に基づき組織免疫染色に用いることもでき、ＶＥＧＦ
１２１の作用機序の解明に有用である。
【００１６】
【実施例】本発明を以下参考例及び実施例により更に詳
細に説明する。
細に説明する。
【００１７】参考例１ 大腸菌由来の組換え体ヒトＶＥ
ＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５の調製 ヒト急性前骨髄性白血病由来の培養細胞株ＨＬ−６０の
ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法によりヒトＶＥＧＦ
１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡを単離した。
これらをｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）とｐＧＥＸ
−２Ｔ（ファルマシア社製）より作製した４．６Ｋｂの
ｐＷ６Ａベクター（特願平９−１２１８０３号）に組み
込み、ヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５を発
現するベクターとしてｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１２１及びｐ
Ｗ６Ａ−ＶＥＧＦ１６５を作製した。ｐＷ６Ａ−ＶＥＧ
Ｆ１２１及びｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１６５をそれぞれ宿主
大腸菌に導入後、１％バクトトリプトン、０．５％イー
ストエキストラクト、１％塩化ナトリウム、５０μｇ／
ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．５培地（以下、本明細書に
おいてＬＢ培地と記載する）、３７℃にて培養し、１ｍ
Ｍイソプロピルチオガラクトピラノシド（以下、本明細
書においてＩＰＴＧと記載する）を添加し３時間培養し
て発現を誘導した。ｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１２１で形質転
換した大腸菌はトリス緩衝液中で超音波破砕した後遠心
分離し、沈渣を６Ｍウレアを含むトリス緩衝液にて可溶
化した後遠心分離した。この遠心上清をＱＦＦ陰イオン
交換カラム（ファルマシア社製）を用いた陰イオン交換
クロマトグラフィー、リソースＲＰＣカラム（ファルマ
シア社製）を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製
し、純度９５％以上の大腸菌由来の組換え体ヒトＶＥＧ
Ｆ１２１（以下、本明細書中においてｒＶＥＧＦ１２１
Ｅと記載する）を得た。一方、ｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１６
５で形質転換した大腸菌も同様に上記の方法で調製した
後、更にスーパーデックス２００（ファルマシア社製）
を用いたゲル濾過により精製し、純度９５％以上の大腸
菌由来の組換え体ヒトＶＥＧＦ１６５（以下、本明細書
中においてｒＶＥＧＦ１６５Ｅと記載する）を得た。
ＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５の調製 ヒト急性前骨髄性白血病由来の培養細胞株ＨＬ−６０の
ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法によりヒトＶＥＧＦ
１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡを単離した。
これらをｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）とｐＧＥＸ
−２Ｔ（ファルマシア社製）より作製した４．６Ｋｂの
ｐＷ６Ａベクター（特願平９−１２１８０３号）に組み
込み、ヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５を発
現するベクターとしてｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１２１及びｐ
Ｗ６Ａ−ＶＥＧＦ１６５を作製した。ｐＷ６Ａ−ＶＥＧ
Ｆ１２１及びｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１６５をそれぞれ宿主
大腸菌に導入後、１％バクトトリプトン、０．５％イー
ストエキストラクト、１％塩化ナトリウム、５０μｇ／
ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．５培地（以下、本明細書に
おいてＬＢ培地と記載する）、３７℃にて培養し、１ｍ
Ｍイソプロピルチオガラクトピラノシド（以下、本明細
書においてＩＰＴＧと記載する）を添加し３時間培養し
て発現を誘導した。ｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１２１で形質転
換した大腸菌はトリス緩衝液中で超音波破砕した後遠心
分離し、沈渣を６Ｍウレアを含むトリス緩衝液にて可溶
化した後遠心分離した。この遠心上清をＱＦＦ陰イオン
交換カラム（ファルマシア社製）を用いた陰イオン交換
クロマトグラフィー、リソースＲＰＣカラム（ファルマ
シア社製）を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製
し、純度９５％以上の大腸菌由来の組換え体ヒトＶＥＧ
Ｆ１２１（以下、本明細書中においてｒＶＥＧＦ１２１
Ｅと記載する）を得た。一方、ｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１６
５で形質転換した大腸菌も同様に上記の方法で調製した
後、更にスーパーデックス２００（ファルマシア社製）
を用いたゲル濾過により精製し、純度９５％以上の大腸
菌由来の組換え体ヒトＶＥＧＦ１６５（以下、本明細書
中においてｒＶＥＧＦ１６５Ｅと記載する）を得た。
【００１８】参考例２ 抗ＶＥＧＦ１２１／ＶＥＧＦ１
６５モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製 参考例１で調製したｒＶＥＧＦ１６５Ｅを免疫原として
用いた。ｒＶＥＧＦ１６５Ｅをフロイント完全アジュバ
ントと等量混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１０
０μｌ（約４０μｇ／マウス）投与した。約２週間後、
同じくｒＶＥＧＦ１６５Ｅをフロイント不完全アジュバ
ントと等量混合し、腹腔内に投与した。抗体価の上昇を
確認した後、最終免疫としてｒＶＥＧＦ１６５Ｅ約４０
μｇを静脈内に投与し、その３日後に脾臓を摘出した。
単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞株であるＰ３−ｘ６
３−Ａｇ８−Ｕ１（大日本製薬から購入）（以下、本明
細書においてＰ３Ｕ１と記載する）とを３：１の細胞数
で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００を用
いて細胞融合を行った。細胞はＨＡＴ（１ｘ１０-4Ｍヒ
ポキサンチン、４ｘ１０-7Ｍアミノプテリン、１．６ｘ
１０-5Ｍチミジン）及び１０％ウシ胎仔血清（以下、本
明細書においてＦＣＳと記載する）添加ＲＰＭＩ１６４
０培地（以下、本明細書においてＨＡＴ培地と記載す
る）に懸濁し、９６穴のマイクロカルチャープレートに
分注して培養した。ハイブリドーマが増殖してきたウェ
ルの培養上清を以下のＥＬＩＳＡ法により調べ、ＶＥＧ
Ｆ１２１及びＶＥＧＦ１６５ に反応するモノクローナ
ル抗体を産生してしているハイブリドーマを選択した。
６５モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製 参考例１で調製したｒＶＥＧＦ１６５Ｅを免疫原として
用いた。ｒＶＥＧＦ１６５Ｅをフロイント完全アジュバ
ントと等量混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１０
０μｌ（約４０μｇ／マウス）投与した。約２週間後、
同じくｒＶＥＧＦ１６５Ｅをフロイント不完全アジュバ
ントと等量混合し、腹腔内に投与した。抗体価の上昇を
確認した後、最終免疫としてｒＶＥＧＦ１６５Ｅ約４０
μｇを静脈内に投与し、その３日後に脾臓を摘出した。
単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞株であるＰ３−ｘ６
３−Ａｇ８−Ｕ１（大日本製薬から購入）（以下、本明
細書においてＰ３Ｕ１と記載する）とを３：１の細胞数
で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００を用
いて細胞融合を行った。細胞はＨＡＴ（１ｘ１０-4Ｍヒ
ポキサンチン、４ｘ１０-7Ｍアミノプテリン、１．６ｘ
１０-5Ｍチミジン）及び１０％ウシ胎仔血清（以下、本
明細書においてＦＣＳと記載する）添加ＲＰＭＩ１６４
０培地（以下、本明細書においてＨＡＴ培地と記載す
る）に懸濁し、９６穴のマイクロカルチャープレートに
分注して培養した。ハイブリドーマが増殖してきたウェ
ルの培養上清を以下のＥＬＩＳＡ法により調べ、ＶＥＧ
Ｆ１２１及びＶＥＧＦ１６５ に反応するモノクローナ
ル抗体を産生してしているハイブリドーマを選択した。
【００１９】すなわち、参考例１で調製したｒＶＥＧＦ
１２１Ｅ及びｒＶＥＧＦ１６５Ｅをそれぞれリン酸緩衝
液（以下、本明細書においてＰＢＳと記載する）で希釈
し、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに分注し、４℃で一晩放
置して固相に結合させた。次に、０．０５％ツィーン２
０を含むＰＢＳ（以下、本明細書においてＰＢＳＴと記
載する）で洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳ
を分注し、１時間、３７℃に放置してブロッキングし
た。ＰＢＳＴで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をｒ
ＶＥＧＦ１２１Ｅ結合プレート及びｒＶＥＧＦ１６５Ｅ
結合ＥＬＩＳＡプレートそれぞれに分注し、１時間、３
７℃に放置した。続いて同様に洗浄後、ペルオキシダー
ゼ（以下、本明細書においてＰＯＤと記載する）標識抗
マウス免疫グロブリン抗体（ダコ社製）を１０００倍希
釈したものを分注し、１時間、３７℃に放置した。同様
の洗浄後、ＰＯＤ基質（ＡＢＴＳ−過酸化水素系）を加
え、室温、１０分間放置した後反応停止液を加え、４０
５ｎｍの吸収を測定した。陽性ウェルの細胞は限界希釈
法にてクローニングした。単一コロニーを含むウェルの
細胞上清の抗体活性を上記の方法で調べ、選択、培養
し、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５に反応するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマＶＧＦ３−４
を樹立した。ハイブリドーマＶＧＦ３−４は大量培養
し、マウス腹腔内に投与し、腹水を回収した。さらに、
アフィ−プレッププロテインＡマップスＩＩキット（バ
イオラド社）を用いて腹水より抗体を精製し、モノクロ
ーナル抗体を得た。この抗体をモノクローナル抗体ＶＧ
Ｆ３−４と命名した。
１２１Ｅ及びｒＶＥＧＦ１６５Ｅをそれぞれリン酸緩衝
液（以下、本明細書においてＰＢＳと記載する）で希釈
し、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに分注し、４℃で一晩放
置して固相に結合させた。次に、０．０５％ツィーン２
０を含むＰＢＳ（以下、本明細書においてＰＢＳＴと記
載する）で洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳ
を分注し、１時間、３７℃に放置してブロッキングし
た。ＰＢＳＴで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をｒ
ＶＥＧＦ１２１Ｅ結合プレート及びｒＶＥＧＦ１６５Ｅ
結合ＥＬＩＳＡプレートそれぞれに分注し、１時間、３
７℃に放置した。続いて同様に洗浄後、ペルオキシダー
ゼ（以下、本明細書においてＰＯＤと記載する）標識抗
マウス免疫グロブリン抗体（ダコ社製）を１０００倍希
釈したものを分注し、１時間、３７℃に放置した。同様
の洗浄後、ＰＯＤ基質（ＡＢＴＳ−過酸化水素系）を加
え、室温、１０分間放置した後反応停止液を加え、４０
５ｎｍの吸収を測定した。陽性ウェルの細胞は限界希釈
法にてクローニングした。単一コロニーを含むウェルの
細胞上清の抗体活性を上記の方法で調べ、選択、培養
し、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５に反応するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマＶＧＦ３−４
を樹立した。ハイブリドーマＶＧＦ３−４は大量培養
し、マウス腹腔内に投与し、腹水を回収した。さらに、
アフィ−プレッププロテインＡマップスＩＩキット（バ
イオラド社）を用いて腹水より抗体を精製し、モノクロ
ーナル抗体を得た。この抗体をモノクローナル抗体ＶＧ
Ｆ３−４と命名した。
【００２０】参考例３ バキュロウイルス−昆虫細胞由
来の組換え体ヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６
５の調製 ヒト急性前骨髄性白血病由来の培養細胞株 ＨＬ−６０
のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法により単離したヒ
トＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡを
ｐＢａｃＰＡＫ８トランスファーベクター（クローンテ
ック社製）に組み込み、ｐＢａｃ−ＶＥＧＦ１２１及び
ｐＢａｃ−ＶＥＧＦ１６５を作製した。これらをそれぞ
れＢａｃＰＡＫ６ ＤＮＡ（クローンテック社製）と共
にＳｆ２１細胞（クローンテック社製）にリポフェクチ
ン法でコトランスフェクションし、組換え型バキュロウ
イルスＡｃＶＥＧＦ１２１及びＡｃＶＥＧＦ１６５を構
築させた。組換え型バキュロウイルスはプラーク法にて
純化した後、Ｓｆ２１細胞にインフェクションして組換
え体ヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５を発現
させ、精製した。すなわち、ＳＦ９００−ＩＩ無血清培
地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）で培養したＳｆ２１細胞に
ＡｃＶＥＧＦ１２１またはＡｃＶＥＧＦ１６５を添加し
てインフェクションさせ、２７℃で３日間培養した後、
その培養上清を回収した。さらに、参考例２で調製した
モノクローナル抗体ＶＧＦ３−４をＨｉＴｒａｐ ＮＨ
Ｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（ファルマシア社製）に結合さ
せたアフィニティーカラムを用いて、培養上清からバキ
ュロウイルス−昆虫細胞由来の組換え体ヒトＶＥＧＦ１
２１（以下、本明細書中においてｒＶＥＧＦ１２１Ｂと
記載する）及びヒトＶＥＧＦ１６５（以下、本明細書中
においてｒＶＥＧＦ１６５Ｂと記載する）を精製した。
来の組換え体ヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６
５の調製 ヒト急性前骨髄性白血病由来の培養細胞株 ＨＬ−６０
のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法により単離したヒ
トＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡを
ｐＢａｃＰＡＫ８トランスファーベクター（クローンテ
ック社製）に組み込み、ｐＢａｃ−ＶＥＧＦ１２１及び
ｐＢａｃ−ＶＥＧＦ１６５を作製した。これらをそれぞ
れＢａｃＰＡＫ６ ＤＮＡ（クローンテック社製）と共
にＳｆ２１細胞（クローンテック社製）にリポフェクチ
ン法でコトランスフェクションし、組換え型バキュロウ
イルスＡｃＶＥＧＦ１２１及びＡｃＶＥＧＦ１６５を構
築させた。組換え型バキュロウイルスはプラーク法にて
純化した後、Ｓｆ２１細胞にインフェクションして組換
え体ヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５を発現
させ、精製した。すなわち、ＳＦ９００−ＩＩ無血清培
地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）で培養したＳｆ２１細胞に
ＡｃＶＥＧＦ１２１またはＡｃＶＥＧＦ１６５を添加し
てインフェクションさせ、２７℃で３日間培養した後、
その培養上清を回収した。さらに、参考例２で調製した
モノクローナル抗体ＶＧＦ３−４をＨｉＴｒａｐ ＮＨ
Ｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（ファルマシア社製）に結合さ
せたアフィニティーカラムを用いて、培養上清からバキ
ュロウイルス−昆虫細胞由来の組換え体ヒトＶＥＧＦ１
２１（以下、本明細書中においてｒＶＥＧＦ１２１Ｂと
記載する）及びヒトＶＥＧＦ１６５（以下、本明細書中
においてｒＶＥＧＦ１６５Ｂと記載する）を精製した。
【００２１】実施例１ 抗ＶＥＧＦ１２１モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマの作製 配列番号２に記載するペプチド（以下、本明細書中にお
いてＰ２と記載する）を合成し、これをＫＬＨ（Keyhol
e Limpet Hemocyanin ）に結合して複合体（以下、本明
細書においてＰ２−ＫＬＨと記載する）を作製し、免疫
原として用いた。
ル抗体産生ハイブリドーマの作製 配列番号２に記載するペプチド（以下、本明細書中にお
いてＰ２と記載する）を合成し、これをＫＬＨ（Keyhol
e Limpet Hemocyanin ）に結合して複合体（以下、本明
細書においてＰ２−ＫＬＨと記載する）を作製し、免疫
原として用いた。
【００２２】参考例２と同様の方法で免疫し、同様の方
法でハイブリドーマを作製した。
法でハイブリドーマを作製した。
【００２３】参考例３で調製したｒＶＥＧＦ１２１Ｂを
結合させたＥＬＩＳＡプレートを用い、参考例２と同様
のＥＬＩＳＡ法でＶＥＧＦ１２１に反応するモノクロー
ナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。単
一コロニーを含むウェルの培養上清は参考例３で調製し
たｒＶＥＧＦ１２１Ｂ及びｒＶＥＧＦ１６５Ｂを結合し
たＥＬＩＳＡプレートを用いて参考例２と同様の方法で
調べ、ＶＥＧＦ１２１に特異的に反応するモノクローナ
ル抗体を産生してしているハイブリドーマＶＧ２Ｐ３−
５を樹立した。参考例２と同様にしてハイブリドーマか
らモノクローナル抗体を得た。この抗体をモノクローナ
ル抗体ＶＧ２Ｐ３−５と命名した。
結合させたＥＬＩＳＡプレートを用い、参考例２と同様
のＥＬＩＳＡ法でＶＥＧＦ１２１に反応するモノクロー
ナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。単
一コロニーを含むウェルの培養上清は参考例３で調製し
たｒＶＥＧＦ１２１Ｂ及びｒＶＥＧＦ１６５Ｂを結合し
たＥＬＩＳＡプレートを用いて参考例２と同様の方法で
調べ、ＶＥＧＦ１２１に特異的に反応するモノクローナ
ル抗体を産生してしているハイブリドーマＶＧ２Ｐ３−
５を樹立した。参考例２と同様にしてハイブリドーマか
らモノクローナル抗体を得た。この抗体をモノクローナ
ル抗体ＶＧ２Ｐ３−５と命名した。
【００２４】尚、このハイブリドーマはＶＧ２Ｐ３−５
生命工学工業技術研究所に寄託され、その受託番号はＦ
ＥＲＭ Ｐ−１６５５３である。
生命工学工業技術研究所に寄託され、その受託番号はＦ
ＥＲＭ Ｐ−１６５５３である。
【００２５】実施例２ 抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体
の反応特異性 参考例３で調製したｒＶＥＧＦ１２１Ｂ及びｒＶＥＧＦ
１６５ＢをＰＢＳで０．１μｇ／ｍｌの濃度にし、参考
例２と同様の手法でｒＶＥＧＦ１２１Ｂ結合ＥＬＩＳＡ
プレート及びｒＶＥＧＦ１６５Ｂ結合ＥＬＩＳＡプレー
トを調製した。これに、それぞれ１％ウシアルブミンを
含むＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗
体ＶＧ２Ｐ３−５、モノクローナル抗体ＶＧＦ３−４を
加え、参考例２のＥＬＩＳＡ法と同様の測定を行った。
結果を表１に示す。モノクローナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５
はＶＥＧＦ１２１に特異的に、モノクローナル抗体ＶＧ
Ｆ３−４はＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５の両方に
反応した。
の反応特異性 参考例３で調製したｒＶＥＧＦ１２１Ｂ及びｒＶＥＧＦ
１６５ＢをＰＢＳで０．１μｇ／ｍｌの濃度にし、参考
例２と同様の手法でｒＶＥＧＦ１２１Ｂ結合ＥＬＩＳＡ
プレート及びｒＶＥＧＦ１６５Ｂ結合ＥＬＩＳＡプレー
トを調製した。これに、それぞれ１％ウシアルブミンを
含むＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗
体ＶＧ２Ｐ３−５、モノクローナル抗体ＶＧＦ３−４を
加え、参考例２のＥＬＩＳＡ法と同様の測定を行った。
結果を表１に示す。モノクローナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５
はＶＥＧＦ１２１に特異的に、モノクローナル抗体ＶＧ
Ｆ３−４はＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５の両方に
反応した。
【００２６】
【表１】
【００２７】実施例４ ＶＥＧＦ１２１の測定 モノクローナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５をＰＢＳで１０μｇ
／ｍｌに希釈し、参考例２と同様の方法でモノクローナ
ル抗体ＶＧ２Ｐ３−５結合ＥＬＩＳＡプレートを調製し
た。これに、それぞれｒＶＥＧＦ１２１Ｂ、ｒＶＥＧＦ
１６５Ｂ、組換え体ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄシステ
ム社製）、組換え体ヒトＰｌＧＦ（Ｒ＆Ｄシステム社
製）を加え、３７℃で１時間反応させた。続いて同様に
洗浄後、ＰＯＤ標識したモノクローナル抗体ＶＧＦ３−
４を加え、３７℃で１時間反応させた。同様の洗浄後、
ＰＯＤ基質（ＯＰＤ−過酸化水素系）を加え、室温で２
５分間放置した後反応停止液を加え、４９２ｎｍの吸収
を測定した。結果を図１に示す。固相化したモノクロー
ナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５とＰＯＤ標識モノクローナル抗
体ＶＧＦ３−４とのサンドイッチＥＬＩＳＡ法はＶＥＧ
Ｆ１２１を測定することができるが、アイソフォームＶ
ＥＧＦ１６５やアミノ酸配列で相同性のあるＰＤＧＦ−
ＢＢ、ＰｌＧＦを測定することはできず、ＶＥＧＦ１２
１特異的であることが確認された。
／ｍｌに希釈し、参考例２と同様の方法でモノクローナ
ル抗体ＶＧ２Ｐ３−５結合ＥＬＩＳＡプレートを調製し
た。これに、それぞれｒＶＥＧＦ１２１Ｂ、ｒＶＥＧＦ
１６５Ｂ、組換え体ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄシステ
ム社製）、組換え体ヒトＰｌＧＦ（Ｒ＆Ｄシステム社
製）を加え、３７℃で１時間反応させた。続いて同様に
洗浄後、ＰＯＤ標識したモノクローナル抗体ＶＧＦ３−
４を加え、３７℃で１時間反応させた。同様の洗浄後、
ＰＯＤ基質（ＯＰＤ−過酸化水素系）を加え、室温で２
５分間放置した後反応停止液を加え、４９２ｎｍの吸収
を測定した。結果を図１に示す。固相化したモノクロー
ナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５とＰＯＤ標識モノクローナル抗
体ＶＧＦ３−４とのサンドイッチＥＬＩＳＡ法はＶＥＧ
Ｆ１２１を測定することができるが、アイソフォームＶ
ＥＧＦ１６５やアミノ酸配列で相同性のあるＰＤＧＦ−
ＢＢ、ＰｌＧＦを測定することはできず、ＶＥＧＦ１２
１特異的であることが確認された。
【００２８】
【発明の効果】本発明により、ＶＥＧＦ１２１に特異的
なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いたＶ
ＥＧＦの測定方法を提供し、ＶＥＧＦ１２１を特異的に
測定することができる。
なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いたＶ
ＥＧＦの測定方法を提供し、ＶＥＧＦ１２１を特異的に
測定することができる。
【００２９】
配列番号：１ 配列の長さ：１２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg 115 120
【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg 1 5 10
【図面の簡単な説明】
【図１】 抗ＶＥＧＦ１２１モノクローナル抗体を用い
たサンドイッチＥＬＩＳＡ法の測定結果を示す図であ
る。
たサンドイッチＥＬＩＳＡ法の測定結果を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ 33/68 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 伊藤 哲 東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号 富士レビオ株式会社内
Claims (5)
- 【請求項１】 ＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項２】 モノクローナル抗体がモノクローナル抗
体ＶＧ２Ｐ３−５である請求項１に記載のモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項４】 ハイブリドーマがＶＧ２Ｐ３−５である
請求項３に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項５】 請求項１または２に記載のモノクローナ
ル抗体を用いたＶＥＧＦの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36597297A JP3591264B2 (ja) | 1997-12-24 | 1997-12-24 | Ｖｅｇｆ１２１特異的モノクローナル抗体及び測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36597297A JP3591264B2 (ja) | 1997-12-24 | 1997-12-24 | Ｖｅｇｆ１２１特異的モノクローナル抗体及び測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11178593A true JPH11178593A (ja) | 1999-07-06 |
| JP3591264B2 JP3591264B2 (ja) | 2004-11-17 |
Family
ID=18485592
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP36597297A Expired - Lifetime JP3591264B2 (ja) | 1997-12-24 | 1997-12-24 | Ｖｅｇｆ１２１特異的モノクローナル抗体及び測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3591264B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001036972A3 (en) * | 1999-11-16 | 2002-01-03 | Genentech Inc | Elisa for vegf |
| WO2002102848A3 (en) * | 2001-06-20 | 2004-03-04 | Compugen Ltd | Nucleic acid and amino acid sequences of a vegf variant |
| FR2844514A1 (fr) * | 2002-09-16 | 2004-03-19 | Neovacs | Produit immunogene stable comprenant des heterocomplexes antigeniques, compositions les contenant et procede de preparation |
| JP2010024235A (ja) * | 2001-05-25 | 2010-02-04 | Thomas Jefferson Univ | 多様な治療様式のための主成分としての選択的スプライスフォーム |
| JP2010506171A (ja) * | 2006-10-04 | 2010-02-25 | ジェネンテック インコーポレイテッド | Ｖｅｇｆのためのｅｌｉｓａ |
| JP2013534306A (ja) * | 2010-07-19 | 2013-09-02 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 抗癌治療への応答可能性の増大した患者を同定する方法 |
-
1997
- 1997-12-24 JP JP36597297A patent/JP3591264B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001036972A3 (en) * | 1999-11-16 | 2002-01-03 | Genentech Inc | Elisa for vegf |
| JP2003515136A (ja) * | 1999-11-16 | 2003-04-22 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | Ｖｅｇｆに対するエライザ |
| US6855508B2 (en) | 1999-11-16 | 2005-02-15 | Genentech, Inc. | ELISA for VEGF |
| CN100399030C (zh) * | 1999-11-16 | 2008-07-02 | 杰南技术公司 | 用于vegf的elisa |
| US7541160B2 (en) | 1999-11-16 | 2009-06-02 | David Tai Wai Fei | ELISA for VEGF |
| JP2010024235A (ja) * | 2001-05-25 | 2010-02-04 | Thomas Jefferson Univ | 多様な治療様式のための主成分としての選択的スプライスフォーム |
| WO2002102848A3 (en) * | 2001-06-20 | 2004-03-04 | Compugen Ltd | Nucleic acid and amino acid sequences of a vegf variant |
| FR2844514A1 (fr) * | 2002-09-16 | 2004-03-19 | Neovacs | Produit immunogene stable comprenant des heterocomplexes antigeniques, compositions les contenant et procede de preparation |
| WO2004024189A1 (fr) * | 2002-09-16 | 2004-03-25 | Neovacs | Produit immunogene stable comprenant des heterocomplexes antigeniques |
| EP2457929A1 (en) * | 2006-10-04 | 2012-05-30 | Genentech, Inc. | ELISA for VEGF |
| JP2010506171A (ja) * | 2006-10-04 | 2010-02-25 | ジェネンテック インコーポレイテッド | Ｖｅｇｆのためのｅｌｉｓａ |
| US8449885B2 (en) | 2006-10-04 | 2013-05-28 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
| AU2007319654B2 (en) * | 2006-10-04 | 2013-09-12 | Genentech, Inc. | ELISA for VEGF |
| EP2069798B1 (en) * | 2006-10-04 | 2014-04-16 | Genentech, Inc. | Elisa for vegf |
| KR20150038444A (ko) * | 2006-10-04 | 2015-04-08 | 제넨테크, 인크. | Ｖｅｇｆ용 ｅｌｉｓａ |
| US9146245B2 (en) | 2006-10-04 | 2015-09-29 | Genentech, Inc. | ELISA for VEGF |
| EP3103812A1 (en) * | 2006-10-04 | 2016-12-14 | Genentech, Inc. | Elisa for vegf |
| US9625462B2 (en) | 2006-10-04 | 2017-04-18 | Genetech, Inc. | Elisa for VEGF |
| JP2013534306A (ja) * | 2010-07-19 | 2013-09-02 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 抗癌治療への応答可能性の増大した患者を同定する方法 |
| JP2013534305A (ja) * | 2010-07-19 | 2013-09-02 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 抗癌治療への応答可能性の増大した患者を同定する方法 |
| JP2015180879A (ja) * | 2010-07-19 | 2015-10-15 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 抗癌治療への応答可能性の増大した患者を同定する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3591264B2 (ja) | 2004-11-17 |
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