JPH11180891A - 抗細胞死剤 - Google Patents

抗細胞死剤

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JPH11180891A
JPH11180891A JP9356757A JP35675797A JPH11180891A JP H11180891 A JPH11180891 A JP H11180891A JP 9356757 A JP9356757 A JP 9356757A JP 35675797 A JP35675797 A JP 35675797A JP H11180891 A JPH11180891 A JP H11180891A
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JP
Japan
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cell death
caspase
agent
human caspase
aspartic acid
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JP9356757A
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Atsushi Suzuki
敦 鈴木
Nobuhiko Wagai
信彦 和賀井
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Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 ヒト キャスペースまたは／およびヒト キャスペース
活性誘導因子を阻害する物質を含有する抗細胞死剤に関
する。本願発明の抗細胞死剤により、細胞死に起因する
疾病の治療が可能となる。 【課題】 細胞死に起因する、肝炎、虚血性脳疾患、ア
ルツハイマー氏病及び抗腫瘍剤投与による副作用などを
治療する抗細胞死剤を提供する。 【解決手段】 ヒト キャスペースまたは／およびヒト
キャスペース活性誘導因子を阻害すること、特に、活
性型蛋白質となる過程におけるプロセシング過程を阻害
することで、効率よくその作用効果を発揮できる、アル
デヒド化した蛋白質などを抗細胞死剤として用いる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、作用としてある種
のシステインプロテアーゼ等を阻害する機能を有する、
この阻害する物質を含有する抗細胞死剤、および抗細胞
死剤を有効成分とする細胞死に起因する疾病の治療薬に
関する。
【０００２】
【従来技術】細胞死は、細胞増殖と共に生体の恒常性に
重要な生命現象である。細胞死には２種類の過程がある
とされ、それぞれアポトーシス性細胞死（apoptotic ce
ll death）と壊死性細胞死（necrotic cell death ）と
呼ばれている。アポトーシス性細胞死は、その特異形態
として細胞質および細胞膜の分断化や染色体ＤＮＡの断
片化が見られ、発生過程や生殖器官系および免疫系など
で観察されている。また、壊死性細胞死は、熱ショック
や裂傷等物理的刺激によりおこるもので壊死として観察
される。近ごろ細胞死、中でも主にアポトーシス性細胞
死が肝炎や自己免疫疾患等の疾患に密接な関係を持つこ
とが明らかにされ、その分子機構の解明が医学分野で重
要視されている。
【０００３】線虫を使ったアポトーシス性細胞死関連因
子の探索研究から、ＣＥＤ−３と呼ばれるシステインプ
ロテアーゼが単離された。ＣＥＤ−３と高い相同性を示
す因子を動物細胞で検索したところＣＥＤ−３は、イン
ターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）と高い相同性を
示した。また、分化抗原ＣＤ４およびＩＣＥの培養細胞
への遺伝子導入試験から、両因子とも単独でアポトーシ
ス性細胞死を誘起し、ＩＣＥ／ＣＥＤ−３の活性化がア
ポトーシス性細胞死信号伝達において重要な働きをして
いることが明らかになった。既にアポトーシス性細胞死
のレセプターとして単離されていたＦａｓやタイプ１腫
瘍壊死因子レセプターも、各々のリガンドであるＦａｓ
リガンドや腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）との結合によ
りＩＣＥ／ＣＥＤ−３を活性化させる。
【０００４】現在ヒトでは、１０種類のＩＣＥ／ＣＥＤ
−３ファミリー・システインプロテアーゼが単離されて
おり、これらはさらにＩＣＥ、ＣＰＰ３２及びＩＣＨの
３種のサブファミリーに分類される。現在、ＩＣＥサブ
ファミリー・システインプロテアーゼによる活性化がＣ
ＰＰ３２サブファミリー・システインプロテアーゼを活
性化させるというＩＣＥカスケード（Enali, et al.,Na
ture Vol.380, p723-726, 1996 ）やＣＰＰ３２サブフ
ァミリー単独でのアポトーシス信号伝達系(apoptotic d
eath signaling) 誘起（Hasegawa J., et al., Cancer
Res. vol.56, p1713-1718, 1996 ）が報告されている。
【０００５】最近、ヒトのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリ
ー・システインプロテアーゼの名前を「キャスペース(C
aspese) 」ファミリーという名称で統一しようとする提
案（Emad S. Alnemri et al., Cell, Vol.87 p171,199
6）がある。この名称では、ヒト キャスペース−１
（Ｃａｓｐａｓｅ−１）がＩＣＥに対応し、ヒト キャ
スペース−３（Ｃａｓｐａｓｅ−３）がＣＰＰ３２、Ｙ
ａｍａおよびアポパイン（apopain ）に対応する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】近年、細胞死に関連
し、詳細なアポトーシス性細胞死信号伝達機構が解明さ
れつつあるが、知られている経路の他、抗腫瘍剤のよう
な薬剤によっても誘起される。ヒトにおけるＩＣＥ／Ｃ
ＥＤ−３相同体(Homolog) は、このような薬剤誘導性細
胞死にも密接に関与し、様々な報告がなされており（Ma
shima, et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun., Vol.20
9, p907-915, 1995； Suzuki and Kato, Exp.Cell Res.
Vol.227, p154-159, 1996 ）、例えば、病因、薬効お
よび薬物の副作用に関係している。発明者は、ＩＣＥ／
ＣＥＤ−３相同体の制御は疾患や副作用の抑制に大きく
貢献すると考えている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで発明者は、ヒト
キャスペース（Ｃａｓｐａｓｅ）または／およびヒトキ
ャスペース（Ｃａｓｐａｓｅ）活性誘導因子の阻害作用
を有するものについて検討を進め、この一例として抗細
胞死活性を有する治療剤の可能性を明らかにし、発明を
完成した。
【０００８】今まで知られていないアポトーシス阻害剤
として、キャスペース−３（ＣＰＰ３２サブファミリー
の１つであるＣＰＰ３２／Ｙａｍａ）のＮ末端切断部の
一部分である配列、つまり、アミノ酸配列がグルタミン
酸−セリン−メチオニン−アスパラギン酸で示される蛋
白質のアルデヒドで修飾した蛋白質（ＥＳＭＤ−ＣＨ
Ｏ）を作製した。
【０００９】キャスペース ３（ＣＰＰ３２／Ｙａｍ
ａ）は、分子量３２Kdの酵素前駆体(Zymogen) から分子
量２９Kdの活性型蛋白質への変換を司る。この２９Kdの
キャスペース−３は、それ自身でアポトーシス性細胞死
を誘導することが可能で、Ｆａｓ等の刺激によりわずか
１分で活性型となる。よって、キャスペース−３のＮ末
端切断部の一部であるアルデヒド修飾した蛋白質である
ＥＳＭＤ−ＣＨＯは、未知のキャスペース−３活性誘導
因子を阻害できると考えた。つまり、活性型蛋白質の生
成を阻害してやれば細胞死シグナルの伝達を確実に止め
ることができ、引いては細胞死に起因する疾病の治療薬
の利用が可能と考えた。
【００１０】そこで、ＥＳＭＤ−ＣＨＯの抑制能、つま
りキャスペース−３活性抑制能を測定すればその阻害活
性を調べることができる。
【００１１】ヒト キャスペース−１、ヒト キャスペ
ース−３（Ｃａｓｐａｓｅ−３）活性誘導因子などにつ
いても同様に考え、阻害効果を有する抗細胞死剤を設計
すれば良い。ここに挙げたキャスペース−１、キャスペ
ース−３やキャスペース−３誘導因子の活性型の阻害効
果は、細胞死・シグナルカスケードの上流で特異的に阻
害効果をすることになり、より効果的にシグナル伝達を
阻止し、細胞死に起因する種々の疾患を治療できる。
【００１２】
【発明の構成】本発明は、ヒト キャスペース（Ｃａｓ
ｐａｓｅ）または／およびヒト キャスペース（Ｃａｓ
ｐａｓｅ）活性誘導因子の阻害作用を有する薬品に関す
る。
【００１３】また、本発明は、ヒト キャスペース−１
（Ｃａｓｐａｓｅ−１）または／およびヒト キャスペ
ース−３（Ｃａｓｐａｓｅ−３）の阻害作用を有する薬
品に関する。前述したように、ＩＣＥ／ＣＥＤ−３の遺
伝子導入実験から、両者がアポトーシス死シグナルに重
要な意味を持っていることが明らかとなった。その後、
数多くのＩＣＥ／ＣＥＤ−３関連の遺伝子が単離され、
これらをＩＣＥ／ＣＥＤ−３相同体(Homolog) と称する
ようになっている。
【００１４】ＩＣＥ／ＣＥＤ−３相同体としては、ＩＣ
Ｅ、ＣＰＰ３２、Ｙａｍａ、アポパインなどを挙げるこ
とができる。キャスペースの名称では、前述のようにヒ
トキャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）がＩＣＥに
対応し、ヒト キャスペース−３（Ｃａｓｐａｓｅ−
３）がＣＰＰ３２、Ｙａｍａおよびアポパインに対応す
る。
【００１５】薬品とは、人体にとって有用な作用を利用
して、疾病の治療・予防が行える化学物質等の総称であ
る。上述した阻害作用を有するものならば、薬品となる
可能性がある。
【００１６】本発明は、ヒト キャスペースまたは／お
よびヒト キャススペース（Ｃａｓｐａｓｅ）活性誘導
因子を阻害する物質を含有する抗細胞死剤に関する。
【００１７】また更に、ヒト キャスペース−１（Ｃａ
ｓｐａｓｅ−１）または／およびヒト キャスペース−
３（Ｃａｓｐａｓｅ−３）を阻害する物質を含有する抗
細胞死剤に関する。
【００１８】抗細胞死剤とは、細胞死という現象を何ら
かの作用により阻止または現象出現の低減が図れるもの
を言う。効果を示すこの作用として、ヒト キャスペー
ス−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）または／およびヒト キ
ャスペース−３（Ｃａｓｐａｓｅ−３）を阻害すること
が望ましい。これらは、細胞死信号伝達機構の細胞内カ
スケードの初期の出来事に関与していると考えられ、カ
スケードの終わりあたりの出来事などの作用を阻害する
よりも、より効果的に阻害効果を示すと考えられる。こ
の効果を示すものとして、ヒト キャスペース（Ｃａｓ
ｐａｓｅ）または／およびヒト キャスペース（Ｃａｓ
ｐａｓｅ）活性誘導因子の阻害作用が、ヒト キャスペ
ースまたは／およびヒト キャスペース活性誘導因子の
活性型と成る過程における脱プロセシングによるもので
あればよい。また、ヒト キャスペース−１（Ｃａｓｐ
ａｓｅ−１）または／およびヒト キャスペース−３
（Ｃａｓｐａｓｅ−３）の阻害作用が、ヒト キャスペ
ース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）または／およびヒト
キャスペース−３（Ｃａｓｐａｓｅ−３）の活性型と成
る過程における脱プロセシングによるものであればよ
い。
【００１９】脱プロセシングは、キャスペースのプロセ
シング部位アミノ酸配列を含む蛋白質の修飾体であれ
ば、キャスペースをプロセシングし、活性化する酵素を
阻害でき、引いてはキャスペースの活性を阻害できる。
【００２０】つまり、キャスペースのプロセシング部位
アミノ酸配列を含む蛋白質の修飾体であれば抗細胞死剤
としての利用が可能である。
【００２１】更に詳しくは、 以下のアミノ酸配列の群
より選ばれる１つ以上の蛋白質のアルデヒド化された蛋
白質を含有する抗細胞死剤に関する。
【００２２】チロシン−バリン−アラニン−アスパラギ
ン酸、アスパラギン酸−グルタミン酸−バリン−アスパ
ラギン酸、およびグルタミン酸−セリン−メチオニン−
アスパラギン酸。
【００２３】この群の中で好ましくは、アミノ酸配列
が、グルタミン酸−セリン−メチオニン−アスパラギン
酸である蛋白質のアルデヒド化された蛋白質である。
【００２４】これらのアミノ酸配列は、ヒト由来のキャ
スペ−スのプロセシング部位アミノ酸配列を含んでいた
り、部位近傍の配列を含むと考えられるものである。
【００２５】この作用を有する修飾された蛋白質であれ
ば、本発明の効果は達成される。蛋白質としては、プロ
セシング酵素の基質結合部位に結合するが、その酵素作
用を受けずに結合部位に留まっていることで、阻害活性
を示すものが望ましい。このような阻害活性を有するも
のとして修飾された蛋白質が挙げられ、その修飾方法
は、蛋白質の空間形態を大きく変化させずに、修飾され
た蛋白質が安定に存在できるものであれば良く、具体的
には、アルデヒド化、アミド化、アミノ酸側鎖へ糖類の
付加及びリン酸化などが挙げられ、これらの内、好まし
くは、アルデヒド化が挙げられる。また、修飾される蛋
白質はその長さ（大きさ）が長い（大きい）必要はな
く、効果を達成できれば良く、具体的には、アミノ酸の
数にして２から１０であれば良く、好ましくは３から５
であり、特に好ましくは４である。
【００２６】さらに、上記作用を有するものは、蛋白質
の構造を有していなくてもよい。化学合成等で得られる
化合物も、作用を有するアルデヒド化蛋白質のアミノ酸
残基を考慮した空間配位を参考に設計し、合成が可能で
ある。
【００２７】本発明では、例として、ＩＣＥ／ＣＥＤ−
３相同体の蛋白質生成過程における、翻訳後の制御の段
階を阻害し、その活性出現を阻止している。更に詳しく
は、アルデヒド化されたチロシン−バリン−アラニン−
アスパラギン酸、アルデヒド化されたアスパラギン酸−
グルタミン酸−バリン−アスパラギン酸、およびアルデ
ヒド化されたグルタミン酸−セリン−メチオニン−アス
パラギン酸のアミノ酸配列は、蛋白質のプロセシングに
おけるプロセス近傍の配列の一部である。修飾されたこ
れらの配列の蛋白質をプロセシング過程に共存させるこ
とにより、プロセシング酵素の認識・結合を狂わせ、酵
素作用を減少ないし阻止し阻害効果を達成するものであ
る。
【００２８】本発明は、前述の抗細胞死剤を含有する、
細胞死に起因する疾病の治療剤にも関する。
【００２９】本発明は、細胞死に起因する疾病の中で
も、肝炎、虚血性脳疾患、アルツハイマー氏病、抗腫瘍
剤投与による副作用である骨髄毒性及び下痢から選ばれ
るものである疾病の治療剤に関する。細胞死に起因する
疾病の中でも、肝炎の治療剤に関する。
【００３０】また、本発明は、アミノ酸配列が、グルタ
ミン酸−セリン−メチオニン−アスパラギン酸である蛋
白質のアルデヒド化された蛋白質を含有する、細胞死に
起因する肝炎の治療剤に関する。
【００３１】
【発明の実施の形態】本発明の阻害剤の効果は、以下の
ようにして調べることができる。 １．Ｆａｓ抗体誘導細胞死抑効果の検討 １）急性のＦａｓ媒介アポトーシスのin vitro（試験管
内）モデル細胞であるＤ９８ＡＨ２−Ｆａｓ細胞［ヒト
子宮頸ガン細胞であるヒラ細胞(Hela cell) にインヒビ
ター・ドメインを欠損したヒトＦａｓ変異体ＦＤ−５を
遺伝子導入し作製した細胞］を用い、ＥＳＭＤ−ＣＨＯ
処理または未処理によりヒトＦａｓ抗体（Ｆａｓ Ａ
ｂ）誘導細胞死の抑制をＭＴＴアッセイ（Suzuki and K
ato, Exp.Cell Res. Vol.227, p154-159, 1996）および
ヘキスト３３３４２染色法により検討する。
【００３２】２）ＥＳＭＤ−ＣＨＯ処理または未処理の
Ｄ９８ＡＨ２−Ｆａｓ細胞をＦａｓＡｂで処理し、細胞
質中のＣＰＰ３２／Ｙａｍａ活性をＤＥＶＤ−ＭＣＡ
（Hasegawa J., et al., Cancer Res. vol.56, p1713-1
718, 1996 ）を基質とし蛍光分光光度計で測定する。
【００３３】３）上記処理の細胞から抽出した細胞質性
蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分離し、抗ヒトＣＰＰ３２抗体を用いた免疫ブロッテ
ィング法を行う。この実験によりＣＰＰ３２／Ｙａｍａ
のＦａｓ Ａｂによる分子シフトに対するＥＳＭＤ−Ｃ
ＨＯの効果を検討する。
【００３４】２．ＩＣＥ／ＣＥＤ−３関連因子阻害剤の
劇症肝炎モデルマウスへの効果検討 ＥＳＭＤ−ＣＨＯについては、上記実験法によりそのＣ
ＰＰ３２／Ｙａｍａ活性阻害能を検討した後、これに既
知のＩＣＥ／ＣＥＤ−３相同体の阻害剤であるアミノ酸
配列が、チロシン−バリン−アラニン−アスパラギン酸
で示される蛋白質のアルデヒドで修飾した蛋白質［ＹＶ
ＡＤ−ＣＨＯ（ＩＣＥサブファミリー阻害剤）］および
アミノ酸配列がアスパラギン酸−グルタミン酸−バリン
−アスパラギン酸のアルデヒドで修飾した蛋白質［ＤＥ
ＶＤ−ＣＨＯ（ＣＰＰ３２サブファミリー阻害剤）］を
加えた３種類の抗ＩＣＥ／ＣＥＤ−３相同体合成ペプチ
ドのin vitro外挿性について以下の実験により検討すれ
ばよい。
【００３５】１）抗マウスＦａｓ抗体（Ｊｏ２クロー
ン）のマウスへの尾静脈内投与は、劇症肝炎のモデルと
して確立されている（Lacronique, V., et al. Nature
Med. vol.2, p80-86,1996 ; Rodrigues, I., et al. J.
Exp.Med. vol.183, p1031-1036,1996 ）。これは、肝細
胞表面に発現しているＦａｓがＦａｓ Ａｂの刺激によ
りアポトーシス性細胞死伝達を誘起した結果起こる肝細
胞死である（Ogasawara,J., et al. Nature vol.364,p8
06-809, 1993 ）。このモデルを用い、マウスの生死、
血液生化学検査、染色体ＤＮＡ検査および組織学的検査
を指標とし、抗ＩＣＥ／ＣＥＤ−３相同体合成ペプチド
のin vitroでのアポトーシス抑制能の有無について検討
すればよい。
【００３６】３．効果の確認から治療応用へ 検討した結果から効果を確認し、更に、以下に述べる考
え方から治療方法での応用が可能となる。In vitroから
の結果がほとんどであるが、ウイルス性肝炎において以
下のような見解が示されている。
【００３７】通常肝細胞は、Ｆａｓを発現している。こ
れがウイルスの感染により細胞膜表面にウイルスの感染
を表わす抗原が発現する。細胞障害性Ｔ細胞（Cytotoxi
c Tlymphocyte；ＣＴＬ) は、この抗原を認識しウイル
ス感染肝細胞と接触する。この接触により、ＣＴＬ上の
ＦａｓリガンドとＦａｓが結合し、肝細胞をアポトーシ
ス性細胞死により除去する。この結果感染した大量の肝
細胞の死により肝炎というかたちで症状が現われるとい
うものである。
【００３８】また、抗体の投与と同様に肝障害を誘起す
るＬＰＳ（リポポリサッカリド）の投与に対し、ＩＣＥ
ノックアウト・マウスは抵抗性を示したことから、やは
りＩＣＥ／ＣＥＤ−３相同体の直接関与がうかがえる
（Li , et al. Cell Vol.80,p401-411, 1995 ）。これ
より、Ｆａｓ媒介アポトーシスにおいてはＩＣＥ／ＣＥ
Ｄ−３相同体の活性化が必須であると考えている。
【００３９】上記のウイルス性劇症肝炎モデルは、アポ
トーシス抑制効果をもつ癌遺伝子ｂｃｌ−２の遺伝子導
入(transgene)によっても抑制される。Ｂｃｌ−２はＩ
ＣＥ／ＣＥＤ−３相同体活性化の前段階を抑制すると考
えられており（Simizu, S.,et al. Oncogene vol.13, p
21-29, 1996）、この結果からアポトーシス性細胞死抑
制つまりＩＣＥ／ＣＥＤ−３相同体の活性抑制が肝炎に
対し有効であることが明らかであると考える。
【００４０】アポトーシスのメカニズムは、進化の過程
で保存されていると考えられる。特に、哺乳類では種を
越えて同じものと考えられ、上記のマウス等の実験結果
は、ヒトも同様なメカニズムでアポトーシスが起こると
考えてよい。
【００４１】現在、アポトーシス性細胞死が主要因とな
って起こる疾患として上述の各種肝炎、虚血性脳疾患、
アルツハイマー氏病等が、また薬物投与による副作用と
して抗腫瘍剤投与による骨髄毒性、下痢等が考えられ
る。これらは、本来生きているべき細胞が突然死んでし
まったために起こる現象である。発明者は、このような
不慮の死から細胞を守ることが上記疾患や副作用に対す
る治療法になりうると考えている。
【００４２】なお、上記治療薬として本願発明の化合物
の投与量は、後に述べる効果の点から、0.02から１ｇ／
ｋｇである。その投与形態は、静脈注射が望ましい。
【００４３】本願発明の化合物は、固相法による蛋白質
の製造法（Merrifield, R.B., J.Am.Chem.Soc., vol.8
5, 2149, 1963）などで所望のアミノ酸配列を有する蛋
白質を製造後、常法により、アルデヒド化などの修飾を
施せば良い。本願化合物の誘導体である、アミノ酸の側
鎖およびアルデヒドを保護した誘導体からは、強酸など
で側鎖保護基を、次いで、アルデヒド保護基のセミカル
バゾンなどをホルムアルデヒド・酢酸・メタノ−ル混液
などにて除去する。得られた脱保護体は、逆相のＨＰＬ
Ｃなどで精製を行い、本願化合物として利用できる。
【００４４】以下に、本発明を実施例にて説明を行う。
本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではな
い。
【００４５】
【実施例】（実施例１） アルデヒドで修飾された蛋白
質の細胞死阻害実験 １）Ｆａｓ抗体での細胞死誘導および阻害剤の静脈注射 雄性Slc/ddy マウス５週令（静岡実験動物）を、１群１
６匹として用いた。抗マウスＦａｓ抗体（Ｊｏ２クロー
ン）（Pharmingen社製）は、リン酸緩衝生理食塩液（Ｐ
ＢＳ）で希釈した。１０μｇのＦａｓ抗体を静脈注射
し、対照としてＰＢＳで希釈したハムスターＩｇＧを同
時に静脈注射した。
【００４６】注射後経過を観察し、各時間ごとに肺、心
臓、肝臓および甲状腺を分離し、染色体ＤＮＡ分析、組
織学的分析およびＣＰＰ３２サブファミリー活性の測定
に用いた。
【００４７】ＣＰＰ３２サブファミリーの阻害剤、ＤＥ
ＶＤ−ＣＨＯ（Peptide Lab.社製）は、ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）で溶解した。さらに、ＰＢＳ（リン
酸緩衝生理食塩液）に溶解（ＤＭＳＯの最終濃度で１
％）し、０．１〜０．５ｍｇのＤＥＶＤ−ＣＨＯを静脈
注射した。ＦＡＳ抗体の静脈注射は２時間後に行った。
【００４８】それぞれの実験は、３回繰り返した。
【００４９】２）染色体ＤＮＡの分析 Ｆａｓ抗体注入により、それぞれの組織でアポトーシス
を誘導したか否かを決めるため、染色体ＤＮＡの断片化
を公知方法（Suzuki A., et al., EMBO J. Vol.15, p21
1-215, 1996 ）で分析した。
【００５０】組織はLysis Buffer（100mM NaCl、25mM E
DTA 、100mM Tris-HCl pH8.0、0.5%SDSおよび0.3mg/ml
プロテイナーゼK ）で５０。Ｃ、１５時間消化した。試
料をフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール
（２５：２４：１）液で３回抽出し、クロロホルムで１
回抽出した。同量のイソプロパノールを水層に加え、Ｄ
ＮＡを−２０。Ｃで１時間沈殿させた。ＤＮＡを10mM T
ris-HCl pH8.0 - 10mMEDTA に溶解し、５０μｇＲＮア
ーゼで３７。Ｃ１時間処理した。
【００５１】蛋白質の分離処理を行い、ＤＮＡを前述の
ように沈殿させた。精製したＤＮＡはＡ２６０／Ａ２８
０比を分光光度計により測定し、濃度を算出した。
【００５２】約１μｇのＤＮＡを２％アガロースゲルを
用い、電気泳動用トリス−ホウ酸緩衝液中で、１００Ｖ
／時間で電気泳動を行い分離した。泳動後、ゲルを５μ
ｇ／ｍｌのエチジウムブロミドで５分間染色し、蒸留水
でリンス後、紫外線照射によりその泳動像を観察した。
【００５３】３）組織化学的分析 マウス組織は、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋
後、８μｍで連続切片を作成した。切片はデラフィード
のヘマトキシリンおよびエオジンか、ヘキスト３３３４
２で染色した。ヘキスト３３３４２染色は、常法を修飾
したものを用いた。
【００５４】切片はキシレンとエタノールで処理し、Ｐ
ＢＳで洗浄した。洗浄後、１μＭのヘキスト３３３４２
で１８時間反応させた。
【００５５】４）蛋白質の抽出およびＣＰＰ３２サブフ
ァミリー活性の測定 蛋白質の抽出と酵素アッセイは、常法（Hasegawa J., e
t al., Cancer Res. vol.56, p1713-1718, 1996 ）を用
いた。組織を分離後、ＰＢＳで洗浄後、１mM EDTA 含有
ＰＢＳ中で切り刻む。これに、最終濃度１０μＭジギト
ニン（Sigma 社製）となるように添加し、３０分３７。
Ｃでインキュベートする。さらに、１５０００ｒｐｍ、
５分の遠心分離操作で沈殿を集めアッセイ試料とした。
【００５６】試料は、ＤＣ蛋白質アッセイ・キット（Bi
o Rad 社製）を用いて測定した。
【００５７】ＣＰＰ３２サブファミリー活性は、各試料
に１０μｌの５０μＭのＤＥＶＤ−ＭＣＡ（Peptide La
b.社製）を加えインキュベートし、アミノ−４−メチル
クマリンの放出を分光光度計でモニターした。
【００５８】これらの実験の結果、Ｆａｓ抗体投与によ
って肝臓及び肺臓で、ＣＰＰ３２サブファミリーの活性
が急激に起こることが解った。
【００５９】更に、図１に示されるように、ＤＥＶＤ−
ＣＨＯは細胞死を阻害し、個体の生存率を著しく高め
た。
【００６０】
【発明の効果】本願発明の抗細胞死剤により、アポト−
シス由来の細胞死を阻害することができ、細胞死に由来
する肝炎などの治療薬となり得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＤＥＶＤ−ＣＨＯにより、細胞死が阻害でき
ることを示した、経過時間時の生存率を表す図である。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ 起源：化学合成 配列の特長 他の情報：Ｃ末端Asp がアルデヒドで修飾されている。 配列 Tyr Val Ala Asp 配列番号：２ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ 起源：化学合成 配列の特長 他の情報：Ｃ末端Asp がアルデヒドで修飾されている。 配列 Asp Glu Val Asp 配列番号：３ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ 起源：化学合成 配列の特長 他の情報：Ｃ末端Asp がアルデヒドで修飾されている。 配列 Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/55 ＡＣＳ Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＲ ＡＥＤ ＡＢＳ 45/00 ＡＣＪ Ｃ０７Ｋ 5/107 ＺＮＡ ＡＣＳ 5/113 ＡＥＤ

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト キャスペース（Ｃａｓｐａｓｅ）
    または／およびヒトキャスペース（Ｃａｓｐａｓｅ）活
    性誘導因子を阻害する物質を含有する抗細胞死剤。
  2. 【請求項２】 ヒト キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓ
    ｅ−１）、ヒト キャスペース−３（Ｃａｓｐａｓｅ−
    ３）およびヒト キャスペース−３活性誘導因子のうち
    少なくとも１つを阻害する物質を含有する抗細胞死剤。
  3. 【請求項３】 ヒト キャスペース（Ｃａｓｐａｓｅ）
    または／およびヒトキャスペース（Ｃａｓｐａｓｅ）活
    性誘導因子の阻害が、ヒト キャスペースまたは／およ
    びヒト キャスペース活性誘導因子の活性型と成る過程
    における脱プロセシングによるものである、阻害する物
    質を含有する抗細胞死剤。
  4. 【請求項４】 ヒト キャスペース−３（Ｃａｓｐａｓ
    ｅ−３）活性誘導因子の阻害が、ヒト キャスペース−
    ３（Ｃａｓｐａｓｅ−３）活性誘導因子の活性型と成る
    過程における脱プロセシングによるものである、阻害す
    る物質を含有する抗細胞死剤。
  5. 【請求項５】 キャスペースのプロセシング部位近傍の
    アミノ酸配列を含む蛋白質の修飾体を含有する抗細胞死
    剤。
  6. 【請求項６】 以下のアミノ酸配列の群より選ばれる１
    つ以上の蛋白質のアルデヒド化された蛋白質を含有する
    抗細胞死剤。チロシン−バリン−アラニン−アスパラギ
    ン酸、 アスパラギン酸−グルタミン酸−バリン−アスパラギン
    酸、およびグルタミン酸−セリン−メチオニン−アスパ
    ラギン酸。
  7. 【請求項７】 アミノ酸配列が、グルタミン酸−セリン
    −メチオニン−アスパラギン酸である蛋白質のアルデヒ
    ド化された蛋白質を含有する抗細胞死剤。
  8. 【請求項８】 請求項１から７のいずれか１項に記載の
    抗細胞死剤を有効成分とする、細胞死に起因する疾病の
    治療薬。
  9. 【請求項９】 細胞死に起因する疾病が、肝炎、虚血性
    脳疾患、アルツハイマー氏病、抗腫瘍剤投与による副作
    用である骨髄毒性および下痢からなる群から選ばれるも
    のである請求項８に記載の細胞死に起因する疾病の治療
    薬。
  10. 【請求項１０】 請求項１から７のいずれか１項に記載
    の抗細胞死剤を有効成分とする、細胞死に起因する肝炎
    の治療薬。
  11. 【請求項１１】 アミノ酸配列が、グルタミン酸−セリ
    ン−メチオニン−アスパラギン酸である蛋白質のアルデ
    ヒド化された蛋白質を含有する、細胞死に起因する肝炎
    の治療薬。
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