JPH11180893A - ｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含有する医薬組成物 - Google Patents
ｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含有する医薬組成物Info
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- JPH11180893A JPH11180893A JP10266452A JP26645298A JPH11180893A JP H11180893 A JPH11180893 A JP H11180893A JP 10266452 A JP10266452 A JP 10266452A JP 26645298 A JP26645298 A JP 26645298A JP H11180893 A JPH11180893 A JP H11180893A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシ
ス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免
疫疾患もしくは移植片対宿主病に対する治療剤を提供す
る。 【解決手段】 抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル抗
体を有効成分として含有する医薬組成物。
ス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免
疫疾患もしくは移植片対宿主病に対する治療剤を提供す
る。 【解決手段】 抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル抗
体を有効成分として含有する医薬組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫細胞を媒介す
る疾病の治療用医薬組成物に関し、詳しくは、ｇｐ３４
抗原に対して結合し、ｇｐ３４抗原、ＯＸ４０抗原膜蛋
白質間の有する生物活性を阻害する能力を有する物質を
有効成分とする医薬組成物に関するものであり、より詳
細には、ｇｐ３４を介する細胞情報伝達機構に関与しリ
ウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性
眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移
植片対宿主病に対する治療作用を有する新規な医薬組成
物に関するものである。
る疾病の治療用医薬組成物に関し、詳しくは、ｇｐ３４
抗原に対して結合し、ｇｐ３４抗原、ＯＸ４０抗原膜蛋
白質間の有する生物活性を阻害する能力を有する物質を
有効成分とする医薬組成物に関するものであり、より詳
細には、ｇｐ３４を介する細胞情報伝達機構に関与しリ
ウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性
眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移
植片対宿主病に対する治療作用を有する新規な医薬組成
物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ヒトｇｐ３４抗原は、サイトカインとし
て分類される腫瘍壊死因子（以下ＴＮＦと称する。）リ
ガンドファミリーに属し、当初ヒトＴ細胞白血病ウイル
ス（以下ＨＴＬＶ−Ｉと称する。）由来転写活性化因子
ｐ４０Ｔａｘにより誘導される３４キロダルトンのＴ細
胞膜糖蛋白質として同定され、現在ではそのアミノ酸配
列及び遺伝子のＤＮＡ塩基配列も知られている（Tanaka
ら：Int. J. Cancer 36,549(1985),Miuraら：Mol. Cel
l. Biol. 11, 1313(1991)）。一方、ＯＸ４０抗原はラ
ットの活性化Ｔ細胞抗原として同定された（Paterson
ら：Mol. Immunol.24, 1281(1987)）。その後、このｇ
ｐ３４抗原が、ＯＸ４０抗原とリガンドとリセプターの
関係にあることがヒト及びマウスにおいて明らかにな
り、マウスのｇｐ３４のアミノ酸配列及び遺伝子のＤＮ
Ａ塩基配列も知られている（Godfreyら：J. Exp. Med.
180, 757(1994)、Baumら：EMBO J. 13, 3992(1994)）。
また、本ＯＸ４０抗原が、多発性硬化症、リウマチ、サ
ルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病
を含む自己免疫疾患および移植片対宿主病に含まれる自
己免疫として働く活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞に発現してお
り、これらのＯＸ４０抗原を認識する物質に細胞毒素を
結合させてこの自己を攻撃する活性化した状態のＣＤ４
陽性Ｔ細胞を特異的に消滅させることにより治療方法と
して有効であると期待されることが、ラットを用いた実
験的自己免疫性脳脊髄炎（以下ＥＡＥと称する。）実験
によって検討され、特許出願及び報告がなされている
（CANTAB PHARM. Res. Lim.：WO95/21251、Weinberg
ら：Nature Med. 2, 183(1996)）。当該報告には、ＣＤ
４陽性活性化細胞の中の自己反応性を持つ活性化ＣＤ４
陽性Ｔ細胞の中にＯＸ４０陽性細胞群があり、それらに
対する抗ＯＸ４０免疫療法が、急性あるいは慢性のＣＤ
４陽性Ｔ細胞を媒介する自己免疫疾患に処置することに
効果があるだろうと記載されている。しかし、この報告
では、このＯＸ４０の発現はあくまでも自己免疫疾患に
関係する細胞の目印であり、標的となる活性化Ｔ細胞を
消滅させることによる治療効果を述べている。この治療
方法では、ｇｐ３４とＯＸ４０の結合のみを阻害するこ
とによって炎症状態や、自己免疫の状態が抑制できるか
どうかは明らかでなく、細胞毒素を結合しなかった抗Ｏ
Ｘ４０抗体の単独添加が、病態悪化の原因に関係する活
性化ＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞の細胞増殖を抑制しなか
ったことを報告している。また、ＥＡＥにおいて、細胞
毒素を結合させた抗マウスＯＸ４０ウサギポリクローナ
ル抗体ではその病態評価点数の上昇が阻害されたと報告
されているが、同時に検討された抗マウスＯＸ４０ウサ
ギポリクローナル抗体のみの投与群での効果は陰性対照
と同様に述べられていない。これらのことからも、ｇｐ
３４とＯＸ４０の結合のみを阻害することによって炎症
状態や、自己免疫の状態が抑制できるかどうかは明らか
でなかった。また、活性化Ｔリンパ球細胞による媒介が
考えられる疾患について、その患者の生検標本を調べる
ことによる患者の炎症症状を検出する方法についても、
特許出願がされている（CANTAB PHARM. Res. Lim.：WO9
5/21251）。
て分類される腫瘍壊死因子（以下ＴＮＦと称する。）リ
ガンドファミリーに属し、当初ヒトＴ細胞白血病ウイル
ス（以下ＨＴＬＶ−Ｉと称する。）由来転写活性化因子
ｐ４０Ｔａｘにより誘導される３４キロダルトンのＴ細
胞膜糖蛋白質として同定され、現在ではそのアミノ酸配
列及び遺伝子のＤＮＡ塩基配列も知られている（Tanaka
ら：Int. J. Cancer 36,549(1985),Miuraら：Mol. Cel
l. Biol. 11, 1313(1991)）。一方、ＯＸ４０抗原はラ
ットの活性化Ｔ細胞抗原として同定された（Paterson
ら：Mol. Immunol.24, 1281(1987)）。その後、このｇ
ｐ３４抗原が、ＯＸ４０抗原とリガンドとリセプターの
関係にあることがヒト及びマウスにおいて明らかにな
り、マウスのｇｐ３４のアミノ酸配列及び遺伝子のＤＮ
Ａ塩基配列も知られている（Godfreyら：J. Exp. Med.
180, 757(1994)、Baumら：EMBO J. 13, 3992(1994)）。
また、本ＯＸ４０抗原が、多発性硬化症、リウマチ、サ
ルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病
を含む自己免疫疾患および移植片対宿主病に含まれる自
己免疫として働く活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞に発現してお
り、これらのＯＸ４０抗原を認識する物質に細胞毒素を
結合させてこの自己を攻撃する活性化した状態のＣＤ４
陽性Ｔ細胞を特異的に消滅させることにより治療方法と
して有効であると期待されることが、ラットを用いた実
験的自己免疫性脳脊髄炎（以下ＥＡＥと称する。）実験
によって検討され、特許出願及び報告がなされている
（CANTAB PHARM. Res. Lim.：WO95/21251、Weinberg
ら：Nature Med. 2, 183(1996)）。当該報告には、ＣＤ
４陽性活性化細胞の中の自己反応性を持つ活性化ＣＤ４
陽性Ｔ細胞の中にＯＸ４０陽性細胞群があり、それらに
対する抗ＯＸ４０免疫療法が、急性あるいは慢性のＣＤ
４陽性Ｔ細胞を媒介する自己免疫疾患に処置することに
効果があるだろうと記載されている。しかし、この報告
では、このＯＸ４０の発現はあくまでも自己免疫疾患に
関係する細胞の目印であり、標的となる活性化Ｔ細胞を
消滅させることによる治療効果を述べている。この治療
方法では、ｇｐ３４とＯＸ４０の結合のみを阻害するこ
とによって炎症状態や、自己免疫の状態が抑制できるか
どうかは明らかでなく、細胞毒素を結合しなかった抗Ｏ
Ｘ４０抗体の単独添加が、病態悪化の原因に関係する活
性化ＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞の細胞増殖を抑制しなか
ったことを報告している。また、ＥＡＥにおいて、細胞
毒素を結合させた抗マウスＯＸ４０ウサギポリクローナ
ル抗体ではその病態評価点数の上昇が阻害されたと報告
されているが、同時に検討された抗マウスＯＸ４０ウサ
ギポリクローナル抗体のみの投与群での効果は陰性対照
と同様に述べられていない。これらのことからも、ｇｐ
３４とＯＸ４０の結合のみを阻害することによって炎症
状態や、自己免疫の状態が抑制できるかどうかは明らか
でなかった。また、活性化Ｔリンパ球細胞による媒介が
考えられる疾患について、その患者の生検標本を調べる
ことによる患者の炎症症状を検出する方法についても、
特許出願がされている（CANTAB PHARM. Res. Lim.：WO9
5/21251）。
【０００３】以上述べたとおり、ｇｐ３４とＯＸ４０の
機能は、一部分しか明らかになっておらず、ｇｐ３４と
ＯＸ４０の関係と種々の自己免疫疾患における役割は現
在まで全く明らかにされていない。抗ヒトｇｐ３４モノ
クローナル抗体によりこの２分子間で媒介される機能を
ｇｐ３４側において特異的に阻害することも全く予測さ
れていない。即ち、リウマチ、多発性硬化症、サルコイ
ドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む
自己免疫疾患および移植片対宿主病の治療に効果がある
かどうかと言うことは不明であった。
機能は、一部分しか明らかになっておらず、ｇｐ３４と
ＯＸ４０の関係と種々の自己免疫疾患における役割は現
在まで全く明らかにされていない。抗ヒトｇｐ３４モノ
クローナル抗体によりこの２分子間で媒介される機能を
ｇｐ３４側において特異的に阻害することも全く予測さ
れていない。即ち、リウマチ、多発性硬化症、サルコイ
ドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む
自己免疫疾患および移植片対宿主病の治療に効果がある
かどうかと言うことは不明であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、リウ
マチあるいは、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己
免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患も
しくは移植片対宿主病に対する治療剤としてヒトｇｐ３
４結合阻害物、詳しくは抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクロ
ーナル抗体を有効成分として含有する新規な医薬組成
物、及びｇｐ３４に対する結合、特にＯＸ４０に対する
結合を阻害することにより、免疫或いは自己免疫疾患を
治療する方法を提供することにある。
マチあるいは、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己
免疫性眼疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患も
しくは移植片対宿主病に対する治療剤としてヒトｇｐ３
４結合阻害物、詳しくは抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクロ
ーナル抗体を有効成分として含有する新規な医薬組成
物、及びｇｐ３４に対する結合、特にＯＸ４０に対する
結合を阻害することにより、免疫或いは自己免疫疾患を
治療する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒトｇｐ３４
に結合するヒト化モノクローナル抗体と同様の性質を有
すると考えられる抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナ
ル抗体を取得した。そして、倫理上ヒトｇｐ３４を用い
てのリウマチ患者及び多発性硬化症での実験は出来ない
ため、得られた抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル
抗体をコラーゲン関節炎惹起モデルマウス及び実験的自
己免疫性脳脊髄炎惹起モデルマウスに投与することによ
り、リウマチモデル及び多発性硬化症モデルでの病態発
症が抑制されることを確認した。本知見は、ＯＸ４０陽
性な活性化Ｔ細胞上のＯＸ４０とｇｐ３４の結合が、リ
ウマチ等の自己免疫疾患を惹起していることを初めて示
すものである。本知見は、マウスを用いた実験により得
られたものであるが、ｇｐ３４とＯＸ４０とがリガンド
とリセプタ−の関係にあることなど、マウスｇｐ３４及
びマウスＯＸ４０とヒトｇｐ３４及びヒトＯＸ４０の性
質が共通していることからして、マウスでの効果は、ヒ
トの場合にも当然あるべきものと考え得る。即ち、ヒト
ｇｐ３４に結合性を有するモノクローナル抗体は、リウ
マチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼
疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移植
片対宿主病に対する治療剤とし有効であることが、本知
見より一義的に導かれる。
を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒトｇｐ３４
に結合するヒト化モノクローナル抗体と同様の性質を有
すると考えられる抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナ
ル抗体を取得した。そして、倫理上ヒトｇｐ３４を用い
てのリウマチ患者及び多発性硬化症での実験は出来ない
ため、得られた抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル
抗体をコラーゲン関節炎惹起モデルマウス及び実験的自
己免疫性脳脊髄炎惹起モデルマウスに投与することによ
り、リウマチモデル及び多発性硬化症モデルでの病態発
症が抑制されることを確認した。本知見は、ＯＸ４０陽
性な活性化Ｔ細胞上のＯＸ４０とｇｐ３４の結合が、リ
ウマチ等の自己免疫疾患を惹起していることを初めて示
すものである。本知見は、マウスを用いた実験により得
られたものであるが、ｇｐ３４とＯＸ４０とがリガンド
とリセプタ−の関係にあることなど、マウスｇｐ３４及
びマウスＯＸ４０とヒトｇｐ３４及びヒトＯＸ４０の性
質が共通していることからして、マウスでの効果は、ヒ
トの場合にも当然あるべきものと考え得る。即ち、ヒト
ｇｐ３４に結合性を有するモノクローナル抗体は、リウ
マチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼
疾患、炎症性ボーエル病を含む自己免疫疾患および移植
片対宿主病に対する治療剤とし有効であることが、本知
見より一義的に導かれる。
【０００６】即ち、本発明は、ｇｐ３４結合阻害物を有
効成分として含有する自己免疫疾患治療用医薬組成物、
或いはｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含有する免
疫疾患治療用医薬組成物である。
効成分として含有する自己免疫疾患治療用医薬組成物、
或いはｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含有する免
疫疾患治療用医薬組成物である。
【０００７】
【発明の実施の形態】ｇｐ３４結合阻害物とは、ｇｐ３
４との結合を阻害しリガンドとリセプタ−の細胞情報伝
達を阻害するものであり特にｇｐ３４側に作用し結合を
阻害するものである。ｇｐ３４に結合するものとしては
特にＯＸ４０が代表的である。ｇｐ３４結合阻害物とは
例えばｇｐ３４に特異的な抗体、特にモノクローナル抗
体である。本発明に係るモノクローナル抗体は、例えば
ラットモノクローナル抗体を含む他種の動物由来で作製
した抗ヒトｇｐ３４モノクローナル抗体の抗原結合部位
とヒト抗体の定常部位を組み換えて各種公知の方法を用
いてキメラ抗体あるいはヒト化抗体を作製することによ
り取得できる。
４との結合を阻害しリガンドとリセプタ−の細胞情報伝
達を阻害するものであり特にｇｐ３４側に作用し結合を
阻害するものである。ｇｐ３４に結合するものとしては
特にＯＸ４０が代表的である。ｇｐ３４結合阻害物とは
例えばｇｐ３４に特異的な抗体、特にモノクローナル抗
体である。本発明に係るモノクローナル抗体は、例えば
ラットモノクローナル抗体を含む他種の動物由来で作製
した抗ヒトｇｐ３４モノクローナル抗体の抗原結合部位
とヒト抗体の定常部位を組み換えて各種公知の方法を用
いてキメラ抗体あるいはヒト化抗体を作製することによ
り取得できる。
【０００８】ヒト及びマウスのｇｐ３４はそのアミノ酸
配列、その遺伝子のＤＮＡ塩基配列を含めて公知であ
る。故に、これらに対するモノクローナル抗体を産生す
る細胞、特にハイブリドーマは通常知られている方法に
より作製することが可能であり、該細胞を用いて抗ｇｐ
３４モノクローナル抗体を生産することも可能である。
配列、その遺伝子のＤＮＡ塩基配列を含めて公知であ
る。故に、これらに対するモノクローナル抗体を産生す
る細胞、特にハイブリドーマは通常知られている方法に
より作製することが可能であり、該細胞を用いて抗ｇｐ
３４モノクローナル抗体を生産することも可能である。
【０００９】本発明に係るモノクローナル抗体の生産
は、例えば上記の抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル
抗体を産生する細胞株を各種公知の方法を用いて培養
し、得られた粗抗体を精製すればよく、細胞の増殖及び
抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル抗体の産生を阻害
しない方法であれば特に制限はない。本発明の組成物
は、ｇｐ３４モノクロ−ナル抗体等のｇｐ３４結合阻害
物を有効成分として含有するものであり、その他医薬的
に許容される添加物を含むことができる。本発明の医薬
組成物は、移植片対宿主病等の免疫疾患、リウマチ、多
発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎
症性ボーエル病等の自己免疫疾患の患者に投与される。
は、例えば上記の抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル
抗体を産生する細胞株を各種公知の方法を用いて培養
し、得られた粗抗体を精製すればよく、細胞の増殖及び
抗ヒトｇｐ３４ヒト化モノクローナル抗体の産生を阻害
しない方法であれば特に制限はない。本発明の組成物
は、ｇｐ３４モノクロ−ナル抗体等のｇｐ３４結合阻害
物を有効成分として含有するものであり、その他医薬的
に許容される添加物を含むことができる。本発明の医薬
組成物は、移植片対宿主病等の免疫疾患、リウマチ、多
発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎
症性ボーエル病等の自己免疫疾患の患者に投与される。
【００１０】
【実施例】以下実施例を示して本発明を説明するが、本
発明はこれに限られるものではない。 実施例１ 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体
の作製 ａ）マウスｇｐ３４の免疫 マウスｇｐ３４遺伝子は、ＣｏｎＡ刺激を加えたマウス
脾臓細胞から抽出したＲＮＡから逆転写酵素を用いクロ
−ニングした（Baumら：EMBO J. 13, pp.3992-4001,(19
94)）。このマウスｇｐ３４遺伝子断片をＢＣＭＧＳＮ
ｅｏプラスミド（Karasuyamaら：J. Exp. Med. 172, 96
9,(1990)）中に導入し、ＢＣＭＧＳＮｅｏ−ｍｇｐ３４
プラスミドを作製した。次に、このプラスミドをＷＫＡ
／ＨｏｃラットＴ細胞株ＴＡＲＴ−１（Tatenoら：J. E
xp. Med. 159, 1105(1984)）に、エレクトロポレ−ショ
ン法により遺伝子導入した。その後、ネオマイシン耐性
により耐性細胞株を選抜した。マウスｇｐ３４遺伝子の
発現は選抜した細胞株より抽出したＲＮＡをＲＴ−ＰＣ
Ｒ法を用いて確認しマウスｇｐ３４発現細胞株ＴＡＲＴ
−ｍｇｐ３４を得た。本マウスｇｐ３４発現細胞株ＴＡ
ＲＴ−ｍｇｐ３４を、８週齢ウィスタ−ラット（日本エ
ス・エル・シ−社製）の後肢肉丘部分に１×１０8個づ
つ２週間毎に７度植え込み免疫した。その後、最終免疫
日から３日後に、このラットから脾臓を取り出した。取
り出した脾臓細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬
製）により３度洗浄した。また、マウスミエロ−マ細胞
株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Schulmanら：Nature 276, 26
9(1978)）を対数増殖期になるように細胞増殖させＲＰ
ＭＩ−１６４０培地により３度洗浄した。マウスミエロ
−マ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４と脾臓細胞を１：３に
なるように混和し１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し
上清を除いた。沈殿した細胞に、３７℃に暖めておいた
５０％ポリエチレングリコール４０００（メルク社製）
液１ｍｌを１分間かけて撹拌しながらゆっくり加え、更
に１分間ゆっくり撹拌した。さらに３７℃に暖めておい
たＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを１分間かけゆっくり
と静かに撹拌しながら加えた。再度、３７℃に暖めてお
いたＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを１分間かけゆっく
りと静かに撹拌しながら加えた。さらに、３７℃に暖め
ておいたＲＰＭＩ−１６４０培地７ｍｌを３分間かけて
静かに撹拌しながら加えた。室温で、１０００ｒｐｍ、
５分間遠心沈降し、上清を取り除いた。細胞濃度が、５
×１０6個／ｍｌになるように３７℃に暖めておいた１
０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳと称する。）を含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地を加え、静かに撹拌し細胞を浮遊さ
せた。浮遊細胞を９６穴の培養プレ−トに、各ウェルあ
たり５０μｌずつ分注し細胞培養装置で一晩培養した。
翌日に、ＨＡＴ培地（０．１ｍＭヒポキサンチン、０．
４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン、１５％ＦＣ
Ｓを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地）を１００μｌず
つ添加した。その後、細胞の増殖状態を観察しながら、
１００μｌずつＨＡＴ培地に交換した。このような中、
増殖してくる融合細胞をハイブリドーマとして作製し
た。
発明はこれに限られるものではない。 実施例１ 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体
の作製 ａ）マウスｇｐ３４の免疫 マウスｇｐ３４遺伝子は、ＣｏｎＡ刺激を加えたマウス
脾臓細胞から抽出したＲＮＡから逆転写酵素を用いクロ
−ニングした（Baumら：EMBO J. 13, pp.3992-4001,(19
94)）。このマウスｇｐ３４遺伝子断片をＢＣＭＧＳＮ
ｅｏプラスミド（Karasuyamaら：J. Exp. Med. 172, 96
9,(1990)）中に導入し、ＢＣＭＧＳＮｅｏ−ｍｇｐ３４
プラスミドを作製した。次に、このプラスミドをＷＫＡ
／ＨｏｃラットＴ細胞株ＴＡＲＴ−１（Tatenoら：J. E
xp. Med. 159, 1105(1984)）に、エレクトロポレ−ショ
ン法により遺伝子導入した。その後、ネオマイシン耐性
により耐性細胞株を選抜した。マウスｇｐ３４遺伝子の
発現は選抜した細胞株より抽出したＲＮＡをＲＴ−ＰＣ
Ｒ法を用いて確認しマウスｇｐ３４発現細胞株ＴＡＲＴ
−ｍｇｐ３４を得た。本マウスｇｐ３４発現細胞株ＴＡ
ＲＴ−ｍｇｐ３４を、８週齢ウィスタ−ラット（日本エ
ス・エル・シ−社製）の後肢肉丘部分に１×１０8個づ
つ２週間毎に７度植え込み免疫した。その後、最終免疫
日から３日後に、このラットから脾臓を取り出した。取
り出した脾臓細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬
製）により３度洗浄した。また、マウスミエロ−マ細胞
株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Schulmanら：Nature 276, 26
9(1978)）を対数増殖期になるように細胞増殖させＲＰ
ＭＩ−１６４０培地により３度洗浄した。マウスミエロ
−マ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４と脾臓細胞を１：３に
なるように混和し１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し
上清を除いた。沈殿した細胞に、３７℃に暖めておいた
５０％ポリエチレングリコール４０００（メルク社製）
液１ｍｌを１分間かけて撹拌しながらゆっくり加え、更
に１分間ゆっくり撹拌した。さらに３７℃に暖めておい
たＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを１分間かけゆっくり
と静かに撹拌しながら加えた。再度、３７℃に暖めてお
いたＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを１分間かけゆっく
りと静かに撹拌しながら加えた。さらに、３７℃に暖め
ておいたＲＰＭＩ−１６４０培地７ｍｌを３分間かけて
静かに撹拌しながら加えた。室温で、１０００ｒｐｍ、
５分間遠心沈降し、上清を取り除いた。細胞濃度が、５
×１０6個／ｍｌになるように３７℃に暖めておいた１
０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳと称する。）を含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地を加え、静かに撹拌し細胞を浮遊さ
せた。浮遊細胞を９６穴の培養プレ−トに、各ウェルあ
たり５０μｌずつ分注し細胞培養装置で一晩培養した。
翌日に、ＨＡＴ培地（０．１ｍＭヒポキサンチン、０．
４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン、１５％ＦＣ
Ｓを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地）を１００μｌず
つ添加した。その後、細胞の増殖状態を観察しながら、
１００μｌずつＨＡＴ培地に交換した。このような中、
増殖してくる融合細胞をハイブリドーマとして作製し
た。
【００１１】ｂ）抗体産生の確認 上記ａ）で作製したハイブリド−マを培養し、培養開始
から１２日後に全ての培養上清を回収した。その上清中
の抗体活性を、マウスｇｐ３４遺伝子を導入し発現させ
たマウスＴ細胞由来細胞株ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４と
その親細胞株マウスＴ細胞由来細胞株ＢＷ５１４７（Ko
ndoら：SCIENCE 262, 1874(1993)）をそれぞれ抗原発現
細胞及びその陰性対照細胞として用いラジオイムノアッ
セイ（以下、ＲＩＡと称する。）により測定した。ＢＷ
５１４７−ｍｇｐ３４、ＢＷ５１４７を培養後、リン酸
緩衝液（ＰＢＳ（−））で洗浄し９６穴Ｕ底プレートに
それぞれ１×１０6個づつ細胞を播種した。これに、４
０μｌのハイブリドーマ培養上清を添加し混合した。こ
の９６穴Ｕ底プレートを氷上で３０分間保温し抗原とよ
く反応させた。その後、予め４℃に保温しておいた冷Ｐ
ＢＳ（−）を用いて細胞を２度洗浄した。遠心分離によ
りペレットとした細胞塊にＩ125放射性ヨード標識抗マ
ウスイムノグロブリンＧヒツジ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ
社製）を３０μｌ添加しさらに氷上で３０分間反応させ
た。その後、予め４℃に保温しておいた冷ＰＢＳ（−）
を用いて細胞を３度洗浄した。乾燥器を用い９０℃で１
０分間乾燥させて水分を蒸発させた。その後、９６穴Ｕ
底プレートを１穴づつハサミにより切り分けてガンマー
線測定器（アロカ社製、ＡＲＣ６００）により測定し
た。ガンマー線検出の値において、ＢＷ５１４７−ｍｇ
ｐ３４細胞を用いたもので１０００以上、ＢＷ５１４７
細胞を用いたもので５０前後と差の認められたハイブリ
ドーマ培養上清を陽性穴とし、再現性を確かめた。抗体
活性の確認できた細胞については、限界希釈法によるク
ローニングを行った。その結果、抗マウスｇｐ３４ラッ
トモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を取得し
た。得られた抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ株のうち代表的な株であるＴＯＬ
−１は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６５０９にて、茨城
県つくば市東１丁目１番１号の通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に、特許手続上の微生物の寄託の
国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて、平成１
０年９月１８日より寄託されている。
から１２日後に全ての培養上清を回収した。その上清中
の抗体活性を、マウスｇｐ３４遺伝子を導入し発現させ
たマウスＴ細胞由来細胞株ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４と
その親細胞株マウスＴ細胞由来細胞株ＢＷ５１４７（Ko
ndoら：SCIENCE 262, 1874(1993)）をそれぞれ抗原発現
細胞及びその陰性対照細胞として用いラジオイムノアッ
セイ（以下、ＲＩＡと称する。）により測定した。ＢＷ
５１４７−ｍｇｐ３４、ＢＷ５１４７を培養後、リン酸
緩衝液（ＰＢＳ（−））で洗浄し９６穴Ｕ底プレートに
それぞれ１×１０6個づつ細胞を播種した。これに、４
０μｌのハイブリドーマ培養上清を添加し混合した。こ
の９６穴Ｕ底プレートを氷上で３０分間保温し抗原とよ
く反応させた。その後、予め４℃に保温しておいた冷Ｐ
ＢＳ（−）を用いて細胞を２度洗浄した。遠心分離によ
りペレットとした細胞塊にＩ125放射性ヨード標識抗マ
ウスイムノグロブリンＧヒツジ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ
社製）を３０μｌ添加しさらに氷上で３０分間反応させ
た。その後、予め４℃に保温しておいた冷ＰＢＳ（−）
を用いて細胞を３度洗浄した。乾燥器を用い９０℃で１
０分間乾燥させて水分を蒸発させた。その後、９６穴Ｕ
底プレートを１穴づつハサミにより切り分けてガンマー
線測定器（アロカ社製、ＡＲＣ６００）により測定し
た。ガンマー線検出の値において、ＢＷ５１４７−ｍｇ
ｐ３４細胞を用いたもので１０００以上、ＢＷ５１４７
細胞を用いたもので５０前後と差の認められたハイブリ
ドーマ培養上清を陽性穴とし、再現性を確かめた。抗体
活性の確認できた細胞については、限界希釈法によるク
ローニングを行った。その結果、抗マウスｇｐ３４ラッ
トモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を取得し
た。得られた抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ株のうち代表的な株であるＴＯＬ
−１は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６５０９にて、茨城
県つくば市東１丁目１番１号の通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に、特許手続上の微生物の寄託の
国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて、平成１
０年９月１８日より寄託されている。
【００１２】ｃ）抗体の調製 ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウス（日本エス・エル・シ
−社製）に０．５ｍｌプリスタン（２，６，１０，１４
−テトラメチルペンタデカン）を１日目と７日目の２度
腹腔内に投与した。２度目の投与３日後に、２０％ＦＣ
Ｓを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した上記取
得のハイブリドーマ株ＴＯＬ−１を一匹当たり１０8個
腹腔内投与した。そして、２週間後に腹水を回収した。
回収した腹水には、終濃度が０．０２％になるようにア
ジ化ナトリウムを添加し室温で一晩放置した。翌日放置
した腹水を４℃、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し
上清を回収した。この培養上清を、直径０．４５μｍの
フィルターに通した後、プロテインＡカラムキット（バ
イオラッド社製）にかけイムノグロブリン画分を回収し
た。この回収溶液に対し、５０％飽和硫酸アンモニウム
（和光純薬社製）分画を行った後、生理的濃度のＰＢＳ
（−）に再溶解した。これを、ＰＢＳ（−）に対して透
析処理後、０．２μｍのフィルターにより濾過し無菌処
理した後、以降の実験に使用した。
−社製）に０．５ｍｌプリスタン（２，６，１０，１４
−テトラメチルペンタデカン）を１日目と７日目の２度
腹腔内に投与した。２度目の投与３日後に、２０％ＦＣ
Ｓを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した上記取
得のハイブリドーマ株ＴＯＬ−１を一匹当たり１０8個
腹腔内投与した。そして、２週間後に腹水を回収した。
回収した腹水には、終濃度が０．０２％になるようにア
ジ化ナトリウムを添加し室温で一晩放置した。翌日放置
した腹水を４℃、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し
上清を回収した。この培養上清を、直径０．４５μｍの
フィルターに通した後、プロテインＡカラムキット（バ
イオラッド社製）にかけイムノグロブリン画分を回収し
た。この回収溶液に対し、５０％飽和硫酸アンモニウム
（和光純薬社製）分画を行った後、生理的濃度のＰＢＳ
（−）に再溶解した。これを、ＰＢＳ（−）に対して透
析処理後、０．２μｍのフィルターにより濾過し無菌処
理した後、以降の実験に使用した。
【００１３】実施例２ フローサイトメーター解析によ
る抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のマウス
ｇｐ３４抗原結合性の確認 マウスｇｐ３４抗原に結合するヒトＯＸ４０細胞外領域
とヒトイムノグロブリンＦｃ領域の融合蛋白質（以下ｓ
ｈＯＸ４０−Ｆｃと称する。米Ｉｍｍｕｎｅｘ社より供
与）を用いてマウスｇｐ３４抗原を発現しているＢＷ５
１４７−ｍｇｐ３４細胞に対する結合性を検討した。
１．５ｍｌマイクロチューブに１×１０6個の細胞を回
収し５０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離し細胞を沈殿さ
せた。その沈殿細胞に、０．５％仔牛血清アルブミン
（以下ＢＳＡと称する。）含有ＰＢＳ（−）５００μｌ
を添加し洗浄した。再度、５０００ｒｐｍ、３０秒間遠
心分離し細胞を沈殿させた。その後、これらの細胞を３
μｌヒト血清、１６μｌ０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
（−）に懸濁して、４℃、３０分間保温した。さらに、
それらのチュ−ブの一方にｓｈＯＸ４０−Ｆｃ（２．５
μｇ／ｍｌ）２０μｌを添加・懸濁し、４℃、３０分間
保温させ、マウスｇｐ３４とヒトＯＸ４０を結合させ
た。再度、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）５００μｌ
を添加し５０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離により２度
洗浄した。それらのチューブにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（以下ＦＩＴＣと称す
る。）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＣＡＰＰＥ
Ｌ社製）（２５μｇ／ｍｌ）を２０μｌ添加・懸濁し、
４℃、２０分間保温した。そして、０．５％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ（−）５００μｌに懸濁しＦＡＣＳｃａｎ（ベク
トンデイッキンソン社製）によりフローサイトメーター
解析を行った。その結果、ｓｈＯＸ４０−Ｆｃのみがマ
ウスｇｐ３４発現細胞ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞に
結合した。このことから、ＢＷ５１４７細胞でのマウス
ｇｐ３４の発現が確認できた（図１（図１））。次に、
本マウスｇｐ３４発現細胞ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４と
ｓｈＯＸ４０−Ｆｃとの結合反応系に１０μｇ／ｍｌと
なるように実施例１で調製された抗マウスｇｐ３４ラッ
トモノクローナル抗体を添加し反応させた。そして、フ
ローサイトメーター解析を行った。その結果、ｓｈＯＸ
４０−Ｆｃと結合することにより標識されたＢＷ５１４
７−ｍｇｐ３４細胞の蛍光強度が抗マウスｇｐ３４ラッ
トモノクローナル抗体の添加により低下した。このこと
より、ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞とｓｈＯＸ４０−
Ｆｃとの結合反応が抗マウスｇｐ３４ラットモノクロー
ナル抗体により阻害されることが明らかになった（図２
（図２））。
る抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体のマウス
ｇｐ３４抗原結合性の確認 マウスｇｐ３４抗原に結合するヒトＯＸ４０細胞外領域
とヒトイムノグロブリンＦｃ領域の融合蛋白質（以下ｓ
ｈＯＸ４０−Ｆｃと称する。米Ｉｍｍｕｎｅｘ社より供
与）を用いてマウスｇｐ３４抗原を発現しているＢＷ５
１４７−ｍｇｐ３４細胞に対する結合性を検討した。
１．５ｍｌマイクロチューブに１×１０6個の細胞を回
収し５０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離し細胞を沈殿さ
せた。その沈殿細胞に、０．５％仔牛血清アルブミン
（以下ＢＳＡと称する。）含有ＰＢＳ（−）５００μｌ
を添加し洗浄した。再度、５０００ｒｐｍ、３０秒間遠
心分離し細胞を沈殿させた。その後、これらの細胞を３
μｌヒト血清、１６μｌ０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
（−）に懸濁して、４℃、３０分間保温した。さらに、
それらのチュ−ブの一方にｓｈＯＸ４０−Ｆｃ（２．５
μｇ／ｍｌ）２０μｌを添加・懸濁し、４℃、３０分間
保温させ、マウスｇｐ３４とヒトＯＸ４０を結合させ
た。再度、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）５００μｌ
を添加し５０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離により２度
洗浄した。それらのチューブにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（以下ＦＩＴＣと称す
る。）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＣＡＰＰＥ
Ｌ社製）（２５μｇ／ｍｌ）を２０μｌ添加・懸濁し、
４℃、２０分間保温した。そして、０．５％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ（−）５００μｌに懸濁しＦＡＣＳｃａｎ（ベク
トンデイッキンソン社製）によりフローサイトメーター
解析を行った。その結果、ｓｈＯＸ４０−Ｆｃのみがマ
ウスｇｐ３４発現細胞ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞に
結合した。このことから、ＢＷ５１４７細胞でのマウス
ｇｐ３４の発現が確認できた（図１（図１））。次に、
本マウスｇｐ３４発現細胞ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４と
ｓｈＯＸ４０−Ｆｃとの結合反応系に１０μｇ／ｍｌと
なるように実施例１で調製された抗マウスｇｐ３４ラッ
トモノクローナル抗体を添加し反応させた。そして、フ
ローサイトメーター解析を行った。その結果、ｓｈＯＸ
４０−Ｆｃと結合することにより標識されたＢＷ５１４
７−ｍｇｐ３４細胞の蛍光強度が抗マウスｇｐ３４ラッ
トモノクローナル抗体の添加により低下した。このこと
より、ＢＷ５１４７−ｍｇｐ３４細胞とｓｈＯＸ４０−
Ｆｃとの結合反応が抗マウスｇｐ３４ラットモノクロー
ナル抗体により阻害されることが明らかになった（図２
（図２））。
【００１４】実施例３ 抗マウスｇｐ３４ラットモノク
ローナル抗体のウシタイプ２コラーゲン誘導性関節炎モ
デルに対する有効性の検討 自己免疫疾患の一つであるヒトリウマチのモデル・ウシ
タイプ２コラーゲン誘導性関節炎に対する抗マウスｇｐ
３４ラットモノクローナル抗体の効果を検討した。７週
齢で購入した雄性ＤＢＡ／１Ｊマウス（日本エス・エル
・シ−社製）をＳＰＦ条件下で飼育し、以下に示すよう
に、コラーゲン関節炎を誘導した。ウシ関節由来Ｋ４２
タイプ２コラーゲン（コラーゲン技術研修会製）を０．
３％酢酸水溶液に溶解し４ｍｇ／ｍｌとした。等量のフ
ロイントコンプリートアジュバント（和光純薬工業社
製）を加え氷中で超音波破砕装置を用いてミセル化し
た。このコラーゲン２００μｇ当量のコラーゲン液１０
０μｌをマウス尾根部に皮内投与した。さらに、初期感
作後２１日目に再度尾根部に同量のコラーゲン液を投与
し追加感作した。抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナ
ル抗体の投与については、追加感作のコラーゲン投与開
始後、３０ｍｇ／ｋｇ重の抗体量で１週間に５回ずつ４
週間腹腔内投与した。病態発症の陽性対照投与群は、ラ
ットイムノグロブリンＧ（ｃａｐｐｅｌ社製）画分を同
量同様に投与した。試験及びコントロールをそれぞれ８
個体ずつ供試した。関節炎症状の評価は、以下のような
５段階の判定を行い、四肢合わせて最高１６点として行
った。関節炎点数をつけ経時的に行った。 ０点：症状なし １点：四肢のうち指などの小関節が１本のみ腫脹発赤 ２点：小関節２本以上、あるいは手、足首の比較的大き
な関節が腫脹発赤 ３点：１本の手、足全体が発赤腫脹 ４点：さらにその１本の手、足の腫脹発赤が最大限に達
している 但し、マウスの関節炎の症状は１本の手、足の腫脹発赤
が最大に達しその後腫脹が徐々に衰退して関節が変形剛
直化する場合が多かった。この場合その後の症状の改善
を判断できなかったので、評価点数を３とした。その結
果、図３（図３）に示すとおり、抗マウスｇｐ３４ラッ
トモノクローナル抗体の投与群では、ラットイムノグロ
ブリンＧ投与群に比べコラーゲン関節炎の病態発症が抑
制された。
ローナル抗体のウシタイプ２コラーゲン誘導性関節炎モ
デルに対する有効性の検討 自己免疫疾患の一つであるヒトリウマチのモデル・ウシ
タイプ２コラーゲン誘導性関節炎に対する抗マウスｇｐ
３４ラットモノクローナル抗体の効果を検討した。７週
齢で購入した雄性ＤＢＡ／１Ｊマウス（日本エス・エル
・シ−社製）をＳＰＦ条件下で飼育し、以下に示すよう
に、コラーゲン関節炎を誘導した。ウシ関節由来Ｋ４２
タイプ２コラーゲン（コラーゲン技術研修会製）を０．
３％酢酸水溶液に溶解し４ｍｇ／ｍｌとした。等量のフ
ロイントコンプリートアジュバント（和光純薬工業社
製）を加え氷中で超音波破砕装置を用いてミセル化し
た。このコラーゲン２００μｇ当量のコラーゲン液１０
０μｌをマウス尾根部に皮内投与した。さらに、初期感
作後２１日目に再度尾根部に同量のコラーゲン液を投与
し追加感作した。抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナ
ル抗体の投与については、追加感作のコラーゲン投与開
始後、３０ｍｇ／ｋｇ重の抗体量で１週間に５回ずつ４
週間腹腔内投与した。病態発症の陽性対照投与群は、ラ
ットイムノグロブリンＧ（ｃａｐｐｅｌ社製）画分を同
量同様に投与した。試験及びコントロールをそれぞれ８
個体ずつ供試した。関節炎症状の評価は、以下のような
５段階の判定を行い、四肢合わせて最高１６点として行
った。関節炎点数をつけ経時的に行った。 ０点：症状なし １点：四肢のうち指などの小関節が１本のみ腫脹発赤 ２点：小関節２本以上、あるいは手、足首の比較的大き
な関節が腫脹発赤 ３点：１本の手、足全体が発赤腫脹 ４点：さらにその１本の手、足の腫脹発赤が最大限に達
している 但し、マウスの関節炎の症状は１本の手、足の腫脹発赤
が最大に達しその後腫脹が徐々に衰退して関節が変形剛
直化する場合が多かった。この場合その後の症状の改善
を判断できなかったので、評価点数を３とした。その結
果、図３（図３）に示すとおり、抗マウスｇｐ３４ラッ
トモノクローナル抗体の投与群では、ラットイムノグロ
ブリンＧ投与群に比べコラーゲン関節炎の病態発症が抑
制された。
【００１５】実施例４ 抗マウスｇｐ３４ラットモノク
ローナル抗体のマウス実験的自己免疫性脳脊髄炎に対す
る有効性の検討 自己免疫疾患の一つであるヒト多発性硬化症のモデル・
実験的自己免疫性脳脊髄炎に対する抗マウスｇｐ３４ラ
ットモノクローナル抗体の効果を検討した。９〜１４週
齢で購入した雌性ＳＪＬ／Ｊマウス（ゴキタブリーディ
ングサービス社製）をＳＰＦ条件下で飼育し、以下に示
すように、実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した。１５
０μｌＰＢＳ（−）中に溶解したプロテオリピッドタン
パク質（以下ＰＬＰと称する。サワディーテクノロジー
社製）２００μｇと等量のフロイントコンプリートアジ
ュバント（ヤトロン株式会社製）を加え、連結針を用い
てミセル化しＰＬＰ乳化液を作製した。このＰＬＰ２０
０乳化液３００μｌを後２肢肉丘部分と尾根部４箇所に
試験開始日に皮下投与した。さらに、初期感作７日後に
再度同量のＰＬＰ乳化液を投与し、追加感作した。この
間、２００μｌＰＢＳ（−）中に溶解した百日咳毒素
（Bordetella pertussis toxin、Sigma社製）３００ｎ
ｇを試験開始日および試験開始２日後に腹腔内投与し
た。実施例１で調製された抗マウスｇｐ３４ラットモノ
クローナル抗体の投与については、５ｍｇ／ｋｇ体重の
用量で初回感作のＰＬＰ乳化液投与開始から２日毎に８
回１４日後まで腹腔内投与した。病態発症の陽性対照投
与群は、ラットイムノグロブリンＧ（ｃａｐｐｅｌ社
製）画分の同量を同様に投与した。試験群及びコントロ
ール群のそれぞれに４個体ずつ供試した。実験的自己免
疫性脳脊髄炎症状の評価は、以下のような６段階の判定
を行い、最高５点として行った。 ０点：症状なし １点：尾の緊張低下 ２点：軽度な後肢の不全対麻痺および運動失調 ３点：重度な後肢の不全対麻痺および運動失調 ４点：四肢麻痺 ５点：実験的自己免疫性脳脊髄炎による死亡 但し、それぞれの群において実験的自己免疫性脳脊髄炎
によって死亡した動物については、試験終了まで評価点
数を５点とした。その結果を図４（図４）に示す。各群
の評価点数を平均して示した抗マウスｇｐ３４ラットモ
ノクローナル抗体の投与群では、ラットイムノグロブリ
ンＧ投与群に比べ実験的自己免疫性脳脊髄炎の病態発症
が抑制された。
ローナル抗体のマウス実験的自己免疫性脳脊髄炎に対す
る有効性の検討 自己免疫疾患の一つであるヒト多発性硬化症のモデル・
実験的自己免疫性脳脊髄炎に対する抗マウスｇｐ３４ラ
ットモノクローナル抗体の効果を検討した。９〜１４週
齢で購入した雌性ＳＪＬ／Ｊマウス（ゴキタブリーディ
ングサービス社製）をＳＰＦ条件下で飼育し、以下に示
すように、実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した。１５
０μｌＰＢＳ（−）中に溶解したプロテオリピッドタン
パク質（以下ＰＬＰと称する。サワディーテクノロジー
社製）２００μｇと等量のフロイントコンプリートアジ
ュバント（ヤトロン株式会社製）を加え、連結針を用い
てミセル化しＰＬＰ乳化液を作製した。このＰＬＰ２０
０乳化液３００μｌを後２肢肉丘部分と尾根部４箇所に
試験開始日に皮下投与した。さらに、初期感作７日後に
再度同量のＰＬＰ乳化液を投与し、追加感作した。この
間、２００μｌＰＢＳ（−）中に溶解した百日咳毒素
（Bordetella pertussis toxin、Sigma社製）３００ｎ
ｇを試験開始日および試験開始２日後に腹腔内投与し
た。実施例１で調製された抗マウスｇｐ３４ラットモノ
クローナル抗体の投与については、５ｍｇ／ｋｇ体重の
用量で初回感作のＰＬＰ乳化液投与開始から２日毎に８
回１４日後まで腹腔内投与した。病態発症の陽性対照投
与群は、ラットイムノグロブリンＧ（ｃａｐｐｅｌ社
製）画分の同量を同様に投与した。試験群及びコントロ
ール群のそれぞれに４個体ずつ供試した。実験的自己免
疫性脳脊髄炎症状の評価は、以下のような６段階の判定
を行い、最高５点として行った。 ０点：症状なし １点：尾の緊張低下 ２点：軽度な後肢の不全対麻痺および運動失調 ３点：重度な後肢の不全対麻痺および運動失調 ４点：四肢麻痺 ５点：実験的自己免疫性脳脊髄炎による死亡 但し、それぞれの群において実験的自己免疫性脳脊髄炎
によって死亡した動物については、試験終了まで評価点
数を５点とした。その結果を図４（図４）に示す。各群
の評価点数を平均して示した抗マウスｇｐ３４ラットモ
ノクローナル抗体の投与群では、ラットイムノグロブリ
ンＧ投与群に比べ実験的自己免疫性脳脊髄炎の病態発症
が抑制された。
【００１６】
【発明の効果】本発明により、マウスｇｐ３４に対して
結合しマウスＯＸ４０との結合を阻害する抗マウスｇｐ
３４ラットモノクローナル抗体がリウマチ疾患のモデル
であるウシタイプ２コラーゲン関節炎の発症と多発性硬
化症の疾患モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎の発
症を抑制することが明らかになった。そこで、ヒト化し
た抗ヒトｇｐ３４モノクローナル抗体を用いることによ
り、少なくとも現在知られている免疫細胞を含めたｇｐ
３４とＯＸ４０の両膜結合型蛋白質を通して行う両抗原
の細胞情報伝達を阻害することにより、リウマチを含め
た多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾
患、炎症性ボーエル病等の自己免疫疾患、および移植片
対宿主病に対する予防、治療効果が期待できる。このよ
うな特性から、本発明により提供される抗ヒトｇｐ３４
モノクローナルヒト化抗体を含有する医薬組成物は、ヒ
ト自己免疫疾患に対する有用な薬剤となることが期待さ
れる。
結合しマウスＯＸ４０との結合を阻害する抗マウスｇｐ
３４ラットモノクローナル抗体がリウマチ疾患のモデル
であるウシタイプ２コラーゲン関節炎の発症と多発性硬
化症の疾患モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎の発
症を抑制することが明らかになった。そこで、ヒト化し
た抗ヒトｇｐ３４モノクローナル抗体を用いることによ
り、少なくとも現在知られている免疫細胞を含めたｇｐ
３４とＯＸ４０の両膜結合型蛋白質を通して行う両抗原
の細胞情報伝達を阻害することにより、リウマチを含め
た多発性硬化症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾
患、炎症性ボーエル病等の自己免疫疾患、および移植片
対宿主病に対する予防、治療効果が期待できる。このよ
うな特性から、本発明により提供される抗ヒトｇｐ３４
モノクローナルヒト化抗体を含有する医薬組成物は、ヒ
ト自己免疫疾患に対する有用な薬剤となることが期待さ
れる。
【図１】マウスｇｐ３４発現細胞に対するｓｈＯＸ４０
−Ｆｃの結合特異性を示す図である。
−Ｆｃの結合特異性を示す図である。
【図２】 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体
のマウスｇｐ３４とｓｈＯＸ４０−Ｆｃの結合阻害を示
す図である。白抜きの部分は、抗マウスｇｐ３４ラット
モノクローナル抗体添加前の蛍光強度を、黒塗りの部分
は、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体添加後
の蛍光強度を示す。
のマウスｇｐ３４とｓｈＯＸ４０−Ｆｃの結合阻害を示
す図である。白抜きの部分は、抗マウスｇｐ３４ラット
モノクローナル抗体添加前の蛍光強度を、黒塗りの部分
は、抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体添加後
の蛍光強度を示す。
【図３】 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体
のウシタイプ２コラーゲン関節炎発症抑制の有効性を示
す図である。コラ−ゲン関節炎誘導後の個々の検体にお
ける関節炎評価点数の経時変化である。図中、各シンボ
ルは一頭一頭の個体を示している。
のウシタイプ２コラーゲン関節炎発症抑制の有効性を示
す図である。コラ−ゲン関節炎誘導後の個々の検体にお
ける関節炎評価点数の経時変化である。図中、各シンボ
ルは一頭一頭の個体を示している。
【図４】 抗マウスｇｐ３４ラットモノクローナル抗体
の実験的自己免疫性脳脊髄炎発症抑制の有効性を示す図
である。実験的自己免疫性脳脊髄炎誘導後の各群の検体
における実験的自己免疫性脳脊髄炎評価点数の平均値の
経時変化である。図中、白抜きの部分は、抗マウスｇｐ
３４ラットモノクローナル抗体投与群を、黒塗りの部分
は、ラットイムノグロブリンＧ投与群を示す。
の実験的自己免疫性脳脊髄炎発症抑制の有効性を示す図
である。実験的自己免疫性脳脊髄炎誘導後の各群の検体
における実験的自己免疫性脳脊髄炎評価点数の平均値の
経時変化である。図中、白抜きの部分は、抗マウスｇｐ
３４ラットモノクローナル抗体投与群を、黒塗りの部分
は、ラットイムノグロブリンＧ投与群を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＧＺ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＧＺ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
Claims (8)
- 【請求項１】 ｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含
有する自己免疫疾患治療用医薬組成物。 - 【請求項２】 ｇｐ３４結合阻害物がｇｐ３４抗体であ
る請求項１に記載の自己免疫疾患治療用医薬組成物。 - 【請求項３】 自己免疫疾患が、リウマチ、多発性硬化
症、サルコイドーシス、自己免疫性眼疾患、炎症性ボー
エル病のうち少なくとも一つである請求項１に記載の自
己免疫疾患治療用医薬組成物。 - 【請求項４】 自己免疫疾患が、多発性硬化症である請
求項３に記載の自己免疫疾患治療用医薬組成物。 - 【請求項５】 自己免疫疾患が、リウマチである請求項
３に記載の自己免疫疾患治療用医薬組成物。 - 【請求項６】 ｇｐ３４結合阻害物を有効成分として含
有する免疫疾患治療用医薬組成物。 - 【請求項７】 ｇｐ３４結合阻害物がｇｐ３４抗体であ
る請求項６に記載の免疫疾患治療用医薬組成物。 - 【請求項８】 免疫疾患が、移植片対宿主病である請求
項６又は請求項７に記載の免疫疾患治療用医薬組成物。
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|---|---|---|---|
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| CA002272605A CA2272605A1 (en) | 1997-09-25 | 1998-09-24 | Pharmaceutical composition containing gp34 binding-inhibitory agent as effective ingredient |
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| JP9-260278 | 1997-09-25 | ||
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| JP3914342B2 JP3914342B2 (ja) | 2007-05-16 |
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2007530045A (ja) * | 2004-03-23 | 2007-11-01 | アムジエン・インコーポレーテツド | ヒトｏｘ４０ｌ（ｃｄ１３４ｌ）特異性モノクローナル抗体 |
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| JP2017523984A (ja) * | 2014-08-04 | 2017-08-24 | ベイラー リサーチ インスティテュートＢａｙｌｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ | 拮抗性抗ｏｘ４０ｌ抗体およびそれらの使用方法 |
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| EP3309176B1 (en) | 2009-12-14 | 2025-10-01 | Ablynx N.V. | Immunoglobulin single variable domain antibodies against ox40l, constructs and their therapeutic use |
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|---|---|---|---|---|
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| US5759546A (en) | 1994-02-04 | 1998-06-02 | Weinberg; Andrew D. | Treatment of CD4 T-cell mediated conditions |
| US6242566B1 (en) * | 1994-02-10 | 2001-06-05 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Ligand (ACT-4-L) to a receptor on the surface of activated CD4+ T-cells |
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- 1998-09-21 JP JP26645298A patent/JP3914342B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-24 US US09/308,332 patent/US6333035B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-24 EP EP98944221A patent/EP0978287A4/en not_active Withdrawn
- 1998-09-24 CA CA002272605A patent/CA2272605A1/en not_active Abandoned
- 1998-09-24 WO PCT/JP1998/004282 patent/WO1999015200A1/ja not_active Ceased
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007530045A (ja) * | 2004-03-23 | 2007-11-01 | アムジエン・インコーポレーテツド | ヒトｏｘ４０ｌ（ｃｄ１３４ｌ）特異性モノクローナル抗体 |
| JP2016514831A (ja) * | 2013-03-20 | 2016-05-23 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | マウス血清中のラット抗体の特異的検出 |
| JP2017523984A (ja) * | 2014-08-04 | 2017-08-24 | ベイラー リサーチ インスティテュートＢａｙｌｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ | 拮抗性抗ｏｘ４０ｌ抗体およびそれらの使用方法 |
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