JPH11182A - Ｇタンパク質結合レセプターの活性化を測定するための新規なレポーター遺伝子構築物 - Google Patents
Ｇタンパク質結合レセプターの活性化を測定するための新規なレポーター遺伝子構築物Info
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- JPH11182A JPH11182A JP10089176A JP8917698A JPH11182A JP H11182 A JPH11182 A JP H11182A JP 10089176 A JP10089176 A JP 10089176A JP 8917698 A JP8917698 A JP 8917698A JP H11182 A JPH11182 A JP H11182A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞表面に局在化したレセプターに関するア
ゴニストまたはアンタゴニスト活性についての化合物の
アッセイに有用な、レポーター構築物ならびにこの構築
物でトランスフェクションされた組み換え細胞を提供す
る。これらの組み換え細胞を用いるアッセイ方法も提供
する。 【解決手段】 （ａ）多重応答エレメント、（ｂ）ｃＡ
ＭＰ応答エレメント、（ｃ）血管腸ペプチドプロモータ
ー、および（ｄ）レセプター遺伝子を含むレポーター遺
伝子構築物。
ゴニストまたはアンタゴニスト活性についての化合物の
アッセイに有用な、レポーター構築物ならびにこの構築
物でトランスフェクションされた組み換え細胞を提供す
る。これらの組み換え細胞を用いるアッセイ方法も提供
する。 【解決手段】 （ａ）多重応答エレメント、（ｂ）ｃＡ
ＭＰ応答エレメント、（ｃ）血管腸ペプチドプロモータ
ー、および（ｄ）レセプター遺伝子を含むレポーター遺
伝子構築物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、レポーター構築物
およびこの構築物でトランスフェクションされた組み換
え細胞であって、細胞表面局在レセプターに関するアゴ
ニストまたはアンタゴニスト活性について化合物をアッ
セイするのに有用なものに関する。これらの組み換え細
胞を用いるアッセイ方法にも関する。
およびこの構築物でトランスフェクションされた組み換
え細胞であって、細胞表面局在レセプターに関するアゴ
ニストまたはアンタゴニスト活性について化合物をアッ
セイするのに有用なものに関する。これらの組み換え細
胞を用いるアッセイ方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの医学的に重要なプロセスは、原形
質膜レセプター（Ｇタンパク質結合レセプターまたはＧ
ＰＣＲ）とグアニンヌクレオチド交換タンパク質（Ｇタ
ンパク質）および種々の細胞エフェクター酵素との連続
的相互作用に関与するシグナルトランスダクション経路
により媒介されている。これら３種の基本的な分子成分
は、（１）ＧＰＣＲスーパーファミリーのサイズおよび
リガンド認識、（２）Ｇタンパク質のヘテロ３量体の組
み合わせの数、ならびに（３）エフェクタータンパク質
の多様性、例えばホスホリパーゼ、アデニリルシクラー
ゼ、ホスホジエステラーゼ、チャンネルおよびプロテイ
ンキナーゼによって、広範なシグナルトランスダクショ
ン経路を生じさせる。
質膜レセプター（Ｇタンパク質結合レセプターまたはＧ
ＰＣＲ）とグアニンヌクレオチド交換タンパク質（Ｇタ
ンパク質）および種々の細胞エフェクター酵素との連続
的相互作用に関与するシグナルトランスダクション経路
により媒介されている。これら３種の基本的な分子成分
は、（１）ＧＰＣＲスーパーファミリーのサイズおよび
リガンド認識、（２）Ｇタンパク質のヘテロ３量体の組
み合わせの数、ならびに（３）エフェクタータンパク質
の多様性、例えばホスホリパーゼ、アデニリルシクラー
ゼ、ホスホジエステラーゼ、チャンネルおよびプロテイ
ンキナーゼによって、広範なシグナルトランスダクショ
ン経路を生じさせる。
【０００３】ＧＰＣＲにより媒介されるシグナルトラン
スダクション経路の分子多様性は機能的アッセイの形態
を複雑なものにする。過去において、ラジオイムノアッ
セイ、放射性標識イノシトールホスフェートの生成、ま
たは細胞内Ｃａレベルの変化によって、機能的ＧＰＣＲ
アッセイによりｃＡＭＰが定量された。これらのアッセ
イは細胞内の第２のメッセンジャーの直接的測定を提供
するが、一般的には、それらは多数の細胞、ラジオアイ
ソトープの使用を必要とし、さらに液体を移す工程を多
く必要とする。それゆえ、現在フォーマットされている
ように、一般的には、これらのアッセイは自動化および
高処理量アッセイに不向きである。
スダクション経路の分子多様性は機能的アッセイの形態
を複雑なものにする。過去において、ラジオイムノアッ
セイ、放射性標識イノシトールホスフェートの生成、ま
たは細胞内Ｃａレベルの変化によって、機能的ＧＰＣＲ
アッセイによりｃＡＭＰが定量された。これらのアッセ
イは細胞内の第２のメッセンジャーの直接的測定を提供
するが、一般的には、それらは多数の細胞、ラジオアイ
ソトープの使用を必要とし、さらに液体を移す工程を多
く必要とする。それゆえ、現在フォーマットされている
ように、一般的には、これらのアッセイは自動化および
高処理量アッセイに不向きである。
【０００４】ＧＰＣＲｓについての高処理量機能的アッ
セイの開発は、薬理学的標的としてのこの重要なスーパ
ーファミリーに対する新規アゴニストおよびアンタゴニ
ストの発見の可能性を大いに増大させるであろう。高処
理量機能的ＧＰＣＲアッセイの開発のための１のアプロ
ーチは、レセプター遺伝子構築物の使用である。レセプ
ター遺伝子構築物は、適当なプロモーターおよびレポー
ター遺伝子とともに種々の細胞内の第２のメッセンジャ
ーにより調節されている転写エンハンサーと結合して、
種々のホルモンレセプターにより活性化されたシグナリ
ング経路に応答する代用シグナルトランスダクション系
を形成する（Deschamps, Science, 1985230:1174-1177;
Montminy, Proc. Natl.Aced. Sci USA, 1986 83:6682-
6686; Angel, Cell, 1987, 49:729-739; Fisch, Mol. C
ell Biol, 1989 9:1327-1331）。転写エンハンサー、プ
ロモーター、およびレポーター遺伝子を適当に選択し
て、Ｇｓ結合ＧＰＣＲ（Konig, Mol. Cell. Neuroscien
ces, 1991 2:331-337; Chen, Anal.Biochemistry, 1995
226:349-354）およびＧｑ結合ＧＰＣＲ（Weyer, Recep
tor and Channels, 1993 1:193-200; Stratowa, J.Rec.
and Signal Transduction Research, 1995, 15(1-4):6
17-630）に関する非放射測定機能的アッセイが構築さ
れ、それらは高処理量スクリーニング法に適用可能であ
る。
セイの開発は、薬理学的標的としてのこの重要なスーパ
ーファミリーに対する新規アゴニストおよびアンタゴニ
ストの発見の可能性を大いに増大させるであろう。高処
理量機能的ＧＰＣＲアッセイの開発のための１のアプロ
ーチは、レセプター遺伝子構築物の使用である。レセプ
ター遺伝子構築物は、適当なプロモーターおよびレポー
ター遺伝子とともに種々の細胞内の第２のメッセンジャ
ーにより調節されている転写エンハンサーと結合して、
種々のホルモンレセプターにより活性化されたシグナリ
ング経路に応答する代用シグナルトランスダクション系
を形成する（Deschamps, Science, 1985230:1174-1177;
Montminy, Proc. Natl.Aced. Sci USA, 1986 83:6682-
6686; Angel, Cell, 1987, 49:729-739; Fisch, Mol. C
ell Biol, 1989 9:1327-1331）。転写エンハンサー、プ
ロモーター、およびレポーター遺伝子を適当に選択し
て、Ｇｓ結合ＧＰＣＲ（Konig, Mol. Cell. Neuroscien
ces, 1991 2:331-337; Chen, Anal.Biochemistry, 1995
226:349-354）およびＧｑ結合ＧＰＣＲ（Weyer, Recep
tor and Channels, 1993 1:193-200; Stratowa, J.Rec.
and Signal Transduction Research, 1995, 15(1-4):6
17-630）に関する非放射測定機能的アッセイが構築さ
れ、それらは高処理量スクリーニング法に適用可能であ
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】概念的には簡単である
が、有用なレポーター遺伝子構築物の開発の成功は、使
用宿主細胞に合った転写エンハンサーおよび基本的なプ
ロモーターの性質に依存する。よって、特定の環状ＡＭ
Ｐ応答エレメント（ＣＲＥ）レポーター遺伝子は、ＨＥ
Ｋ２９３細胞中のアデニリルシクラーゼ活性化により誘
導されるが、試験した他の５種の細胞系においては不活
性であることがわかった（Chen, Anal. Biochemistry,
1995, 226:349-354）。同様に、特定のＣＲＥは、ＳＶ
４０プロモーターに連結されて、ＨｅＬａ、ＣＶ−１お
よびＮＩＨ３Ｔ３細胞中にトランスフェクションされた
場合にはｃＡＭＰ誘導活性を付与したが、Ｌ、ＨｅＬ
ａ、ＫＢおよびＡ４３１細胞中にトランスフェクション
された場合には不活性であった。そのうえ、同じＣＲＥ
は、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ−１プロモーターに連結された場
合には構成的転写アクチベーターとして作用し、またニ
ワトリ・β−アクチンプロモーターに連結された場合に
は、使用細胞系にもよるが、構成的に活性を有するレポ
ーター構築物または活性のないレポーター構築物のいず
れかを生成することができた（Kanei-Ishii, Nuc. Acid
s. Res.,1989 17:1521-1536）。これらの結果は、個々
のレポーター遺伝子構築物の有用性、エンハンサーおよ
びプロモーターエレメントの特定の組み合わせを、個々
の細胞宿主用に実験的に決定しなければならないことを
示す。
が、有用なレポーター遺伝子構築物の開発の成功は、使
用宿主細胞に合った転写エンハンサーおよび基本的なプ
ロモーターの性質に依存する。よって、特定の環状ＡＭ
Ｐ応答エレメント（ＣＲＥ）レポーター遺伝子は、ＨＥ
Ｋ２９３細胞中のアデニリルシクラーゼ活性化により誘
導されるが、試験した他の５種の細胞系においては不活
性であることがわかった（Chen, Anal. Biochemistry,
1995, 226:349-354）。同様に、特定のＣＲＥは、ＳＶ
４０プロモーターに連結されて、ＨｅＬａ、ＣＶ−１お
よびＮＩＨ３Ｔ３細胞中にトランスフェクションされた
場合にはｃＡＭＰ誘導活性を付与したが、Ｌ、ＨｅＬ
ａ、ＫＢおよびＡ４３１細胞中にトランスフェクション
された場合には不活性であった。そのうえ、同じＣＲＥ
は、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ−１プロモーターに連結された場
合には構成的転写アクチベーターとして作用し、またニ
ワトリ・β−アクチンプロモーターに連結された場合に
は、使用細胞系にもよるが、構成的に活性を有するレポ
ーター構築物または活性のないレポーター構築物のいず
れかを生成することができた（Kanei-Ishii, Nuc. Acid
s. Res.,1989 17:1521-1536）。これらの結果は、個々
のレポーター遺伝子構築物の有用性、エンハンサーおよ
びプロモーターエレメントの特定の組み合わせを、個々
の細胞宿主用に実験的に決定しなければならないことを
示す。
【０００６】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
１またはそれ以上の多重応答エレメント（ＭＲＥｓ）
を、血管腸ペプチド（ＶＩＰ）プロモーター、環状ＡＭ
Ｐ応答エンハンサーエレメント（ＣＲＥ）およびレポー
ター遺伝子を含むＤＮＡ構築物中に含ませることは、ア
デニリルシクラーゼの直接刺激または組み換えもしくは
内在性Ｇタンパク質結合レセプターの活性化による細胞
内ｃＡＭＰレベルの刺激後のレポーター遺伝子活性を有
意に増大させることが今回見いだされた。レポーター遺
伝子構築物は特異的にプロテインキナーゼＡ活性をモニ
ターするものであり、プロテインキナーゼＣ経路の活性
化には感受性がない。構築物は、レポーター遺伝子でト
ランスフェクションされたＨＥＫ２９３、ＣＯＳ−１、
ＣＯＳ−７およびＣＨＯ細胞系におけるｃＡＭＰにより
媒介される出来事のモニタリングに有用である。
１またはそれ以上の多重応答エレメント（ＭＲＥｓ）
を、血管腸ペプチド（ＶＩＰ）プロモーター、環状ＡＭ
Ｐ応答エンハンサーエレメント（ＣＲＥ）およびレポー
ター遺伝子を含むＤＮＡ構築物中に含ませることは、ア
デニリルシクラーゼの直接刺激または組み換えもしくは
内在性Ｇタンパク質結合レセプターの活性化による細胞
内ｃＡＭＰレベルの刺激後のレポーター遺伝子活性を有
意に増大させることが今回見いだされた。レポーター遺
伝子構築物は特異的にプロテインキナーゼＡ活性をモニ
ターするものであり、プロテインキナーゼＣ経路の活性
化には感受性がない。構築物は、レポーター遺伝子でト
ランスフェクションされたＨＥＫ２９３、ＣＯＳ−１、
ＣＯＳ−７およびＣＨＯ細胞系におけるｃＡＭＰにより
媒介される出来事のモニタリングに有用である。
【０００７】本発明の１の目的は、少なくとも１つの多
重応答エレメント、環状ＡＭＰ応答エンハンサーエレメ
ント、血管腸プロモーターおよびレポーター遺伝子を含
む新規レポーター遺伝子構築物を提供することである。
重応答エレメント、環状ＡＭＰ応答エンハンサーエレメ
ント、血管腸プロモーターおよびレポーター遺伝子を含
む新規レポーター遺伝子構築物を提供することである。
【０００８】本発明によれば、Ｇタンパク質結合レセプ
ターに関するアゴニストまたはアンタゴニスト活性につ
いて化合物をアッセイするのに有用な、この構築物でト
ランスフェクションされた新規組み換え細胞が提供され
る。
ターに関するアゴニストまたはアンタゴニスト活性につ
いて化合物をアッセイするのに有用な、この構築物でト
ランスフェクションされた新規組み換え細胞が提供され
る。
【０００９】これらの組み換え細胞を用いるアッセイ方
法も提供される。これらの方法は、Ｇタンパク質結合レ
セプターと相互作用することによりＧタンパク質結合レ
セプターの機能に影響を及ぼす化合物を同定するための
迅速かつ高感度の手段を提供する。
法も提供される。これらの方法は、Ｇタンパク質結合レ
セプターと相互作用することによりＧタンパク質結合レ
セプターの機能に影響を及ぼす化合物を同定するための
迅速かつ高感度の手段を提供する。
【００１０】本発明によれば、少なくとも１のＭＲＥお
よびＣＲＥ転写制御エレメント、ＶＩＰプロモーター、
およびレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物
が提供される。組み換えＧＰＣＲを発現するために通常
使用される細胞中へのこの構築物のトランスフェクショ
ンは、細胞内ｃＡＭＰレベルの刺激、次いで、有意なレ
ポーター遺伝子発現を生じた。
よびＣＲＥ転写制御エレメント、ＶＩＰプロモーター、
およびレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物
が提供される。組み換えＧＰＣＲを発現するために通常
使用される細胞中へのこの構築物のトランスフェクショ
ンは、細胞内ｃＡＭＰレベルの刺激、次いで、有意なレ
ポーター遺伝子発現を生じた。
【００１１】例えば、図１に示すように、レポーター遺
伝子構築物でトランスフェクションされ、刺激されなか
った細胞と比較すると、ＭＲＥII ＶＩＰII構築物のヒ
ト・胚腎臓２９３細胞中へのトランスフェクションは、
ホスホジエステラーゼ阻害剤３−イソブチル−１−メチ
ルキサンチン（ＩＢＭＸ）の存在下において、フォルス
コリンでの細胞内ｃＡＭＰレベルの刺激、次いで、約８
０倍のルシフェラーゼ活性を生じた。ＣＯＳ−１、ＣＯ
Ｓ−７およびＣＨＯ細胞系においても、このレポーター
遺伝子構築物でのトランスフェクション後の有意な刺激
が観察された。本発明構築物の広い細胞適用範囲は、他
のｃＡＭＰ応答レセプター遺伝子について報告された結
果（Chen, Anal. Biochemistry, 1985, 226:349-354）
とは異なる。
伝子構築物でトランスフェクションされ、刺激されなか
った細胞と比較すると、ＭＲＥII ＶＩＰII構築物のヒ
ト・胚腎臓２９３細胞中へのトランスフェクションは、
ホスホジエステラーゼ阻害剤３−イソブチル−１−メチ
ルキサンチン（ＩＢＭＸ）の存在下において、フォルス
コリンでの細胞内ｃＡＭＰレベルの刺激、次いで、約８
０倍のルシフェラーゼ活性を生じた。ＣＯＳ−１、ＣＯ
Ｓ−７およびＣＨＯ細胞系においても、このレポーター
遺伝子構築物でのトランスフェクション後の有意な刺激
が観察された。本発明構築物の広い細胞適用範囲は、他
のｃＡＭＰ応答レセプター遺伝子について報告された結
果（Chen, Anal. Biochemistry, 1985, 226:349-354）
とは異なる。
【００１２】３つのＭＲＥのかわりに単一のＭＲＥを含
む構築物は、１つのＣＲＥまたは１つのＭＲＥいずれか
のみを伴う構築物を含む細胞において観察されるよりも
ずっと多くの増加を示すことがわかった。１つのＶＩＰ
プロモーターおよび１つのＣＲＥもしくは１つのＭＲＥ
のいずれかを有する構築物でトランスフェクションされ
た細胞は、ｃＡＭＰによる誘導は１０倍未満であった。
しかしながら、構築物中における単一のＭＲＥおよびＣ
ＲＥの組み合わせは、誘導を４０倍まで増大させた。単
一のＣＲＥとともに複数のＭＲＥを構築物中に含ませた
場合、ｃＡＭＰ誘導をさらに８０倍で増大させた。した
がって、複数のＭＲＥはＣＲＥと相乗的に作用してより
合い活性を生じさせると考えられる。さらにＣＲＥを加
えるこにとよっては誘導のレベルは増大しなかった。
む構築物は、１つのＣＲＥまたは１つのＭＲＥいずれか
のみを伴う構築物を含む細胞において観察されるよりも
ずっと多くの増加を示すことがわかった。１つのＶＩＰ
プロモーターおよび１つのＣＲＥもしくは１つのＭＲＥ
のいずれかを有する構築物でトランスフェクションされ
た細胞は、ｃＡＭＰによる誘導は１０倍未満であった。
しかしながら、構築物中における単一のＭＲＥおよびＣ
ＲＥの組み合わせは、誘導を４０倍まで増大させた。単
一のＣＲＥとともに複数のＭＲＥを構築物中に含ませた
場合、ｃＡＭＰ誘導をさらに８０倍で増大させた。した
がって、複数のＭＲＥはＣＲＥと相乗的に作用してより
合い活性を生じさせると考えられる。さらにＣＲＥを加
えるこにとよっては誘導のレベルは増大しなかった。
【００１３】本発明レポーター遺伝子構築物のプロテイ
ンキナーゼ特異性も調べた。これらの実験において、Ｈ
ＥＫ２９３細胞をＭＲＥII ＶＩＰIIでトランスフェク
ションし、次いで、フォルスコリン（１５μＭ）または
ＴＰＡ（１００ｎＭ）で処理して、プロテインキナーゼ
ＡまたはプロテインキナーゼＣにより媒介される各シグ
ナルトランスダクション経路を活性化した。ホスホジエ
ステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸの存在下または不存在下にお
けるフォルスコリンでの刺激から６または２４時間後い
ずれかにおいてＭＲＥII ＶＩＰIIの有意な活性化が観
察された。ＴＰＡによるプロテインキナーゼＣの活性化
後には有意な刺激が観察されなかった。したがって、原
理的には、ＭＲＥII ＶＩＰIIはプロテインキナーゼＡ
シグナルトランスダクション経路をモニターするもので
ある。
ンキナーゼ特異性も調べた。これらの実験において、Ｈ
ＥＫ２９３細胞をＭＲＥII ＶＩＰIIでトランスフェク
ションし、次いで、フォルスコリン（１５μＭ）または
ＴＰＡ（１００ｎＭ）で処理して、プロテインキナーゼ
ＡまたはプロテインキナーゼＣにより媒介される各シグ
ナルトランスダクション経路を活性化した。ホスホジエ
ステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸの存在下または不存在下にお
けるフォルスコリンでの刺激から６または２４時間後い
ずれかにおいてＭＲＥII ＶＩＰIIの有意な活性化が観
察された。ＴＰＡによるプロテインキナーゼＣの活性化
後には有意な刺激が観察されなかった。したがって、原
理的には、ＭＲＥII ＶＩＰIIはプロテインキナーゼＡ
シグナルトランスダクション経路をモニターするもので
ある。
【００１４】ＭＲＥII ＶＩＰII構築物のＧＰＣＲ刺激
も調べた。これらの実験において、野生型ＨＥＫ２９３
細胞またはブタ・ＣＧＲＰレセプターを安定に発現する
ＨＥＫ２９３細胞をＭＲＥII ＶＩＰIIでトランスフェ
クションし、ＩＢＭＸ存在下において種々のＧＰＣＲア
ゴニストまたはフォルスコリンとともにインキュベーシ
ョンした。フォルスコリンまたはアゴニストにより媒介
されるＧｓ結合内在性レセプター、β−アドレナリン作
動性剤、カルシトニン、ＰＧＥ２、ＶＩＰ、またはＧｓ
結合組み換えブタ・ＣＧＲＰレセプターの刺激によるア
デニリルシクラーゼの直接活性化に基づくルシフェラー
ゼ刺激が観察された。アデノシン、エンドセリン、カル
バコール、ＡＴＰ、およびスロンビンに対するＧｉまた
はＧｑ結合内在性レセプターはＭＲＥII ＶＩＰIIから
のルシフェラーゼ誘導を刺激しなかった。したがって、
ＭＲＥII ＶＩＰIIは、Ｇｓ／プロテインキナーゼＡに
より媒介されるシグナリング経路によるｃＡＭＰレベル
の増大を特異的にモニターするものである。
も調べた。これらの実験において、野生型ＨＥＫ２９３
細胞またはブタ・ＣＧＲＰレセプターを安定に発現する
ＨＥＫ２９３細胞をＭＲＥII ＶＩＰIIでトランスフェ
クションし、ＩＢＭＸ存在下において種々のＧＰＣＲア
ゴニストまたはフォルスコリンとともにインキュベーシ
ョンした。フォルスコリンまたはアゴニストにより媒介
されるＧｓ結合内在性レセプター、β−アドレナリン作
動性剤、カルシトニン、ＰＧＥ２、ＶＩＰ、またはＧｓ
結合組み換えブタ・ＣＧＲＰレセプターの刺激によるア
デニリルシクラーゼの直接活性化に基づくルシフェラー
ゼ刺激が観察された。アデノシン、エンドセリン、カル
バコール、ＡＴＰ、およびスロンビンに対するＧｉまた
はＧｑ結合内在性レセプターはＭＲＥII ＶＩＰIIから
のルシフェラーゼ誘導を刺激しなかった。したがって、
ＭＲＥII ＶＩＰIIは、Ｇｓ／プロテインキナーゼＡに
より媒介されるシグナリング経路によるｃＡＭＰレベル
の増大を特異的にモニターするものである。
【００１５】この開示から当業者に明らかなように、Ｖ
ＩＰのほかに、本発明構築物に使用されるＣＲＥは他の
遺伝子（ソマトスタチン、プロエンケファリン、ホスホ
エノールピルベートカルボキシラーゼ、またはＮＧＦＩ
−Ａを包含するが、これらに限らない）由来のものであ
ってもよい。さらに、ルシフェラーゼ以外のレポーター
遺伝子、例えばＣＡＴ、アルカリ性ホスファターゼ、お
よびβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。
ＩＰのほかに、本発明構築物に使用されるＣＲＥは他の
遺伝子（ソマトスタチン、プロエンケファリン、ホスホ
エノールピルベートカルボキシラーゼ、またはＮＧＦＩ
−Ａを包含するが、これらに限らない）由来のものであ
ってもよい。さらに、ルシフェラーゼ以外のレポーター
遺伝子、例えばＣＡＴ、アルカリ性ホスファターゼ、お
よびβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。
【００１６】また本発明は、特定のタイプのレセプター
に関してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を確認す
るための化合物のアッセイに有用な組み換え細胞を包含
する。該レセプターは細胞表面に存在し、該細胞は、少
なくとも１つのＭＲＥ、１つのＣＲＥ、１つのＶＩＰプ
ロモーター、およびレポーター遺伝子を含むレポーター
遺伝子構築物で形質転換されている。安定な細胞系を得
るために、この構築物を含むベクターもまた、少なくと
も１つの選択可能マーカーを含む。当業者は通常的に、
安定な細胞系を調製するために適当なベクターの選択す
ることができる。好ましい具体例において、細胞を用い
て化合物をスクリーニングして、細胞表面に存在するＧ
ＰＣＲに関してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を
確認する。化合物をアッセイしてその細胞レセプターア
ゴニストまたはアンタゴニスト活性を調べる方法も提供
され、該方法は、本発明組み換え細胞を試験化合物含有
培地に接触させた場合のレポーター遺伝子の転写および
／または翻訳生成物のレベルを調べることを特徴とす
る。次いで、このレベルを、組み換え細胞を試験化合物
不含培地に接触させた場合のレポーター遺伝子の転写お
よび／または翻訳生成物のレベルと比較する。細胞レセ
プターのアゴニストは、細胞と比較した場合、レポータ
ー遺伝子の転写および／または翻訳生成物のレベルの上
昇を引き起こす化合物であると同定される。細胞レセプ
ターのアンタゴニストは、化合物に曝露されていない、
アゴニストにより活性化された細胞と比較した場合、ア
ゴニストにより活性化された細胞中のレポーター遺伝子
の転写および／または翻訳生成物のレベルの低下を引き
起こす化合物であると定義される。別法として、潜在的
アゴニストまたはアンタゴニストの存在下でのレポータ
ーの転写および／または翻訳生成物のレベルを、レセプ
ターを表面に発現する細胞およびレセプターを表面に発
現しない細胞において比較することができる。
に関してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を確認す
るための化合物のアッセイに有用な組み換え細胞を包含
する。該レセプターは細胞表面に存在し、該細胞は、少
なくとも１つのＭＲＥ、１つのＣＲＥ、１つのＶＩＰプ
ロモーター、およびレポーター遺伝子を含むレポーター
遺伝子構築物で形質転換されている。安定な細胞系を得
るために、この構築物を含むベクターもまた、少なくと
も１つの選択可能マーカーを含む。当業者は通常的に、
安定な細胞系を調製するために適当なベクターの選択す
ることができる。好ましい具体例において、細胞を用い
て化合物をスクリーニングして、細胞表面に存在するＧ
ＰＣＲに関してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を
確認する。化合物をアッセイしてその細胞レセプターア
ゴニストまたはアンタゴニスト活性を調べる方法も提供
され、該方法は、本発明組み換え細胞を試験化合物含有
培地に接触させた場合のレポーター遺伝子の転写および
／または翻訳生成物のレベルを調べることを特徴とす
る。次いで、このレベルを、組み換え細胞を試験化合物
不含培地に接触させた場合のレポーター遺伝子の転写お
よび／または翻訳生成物のレベルと比較する。細胞レセ
プターのアゴニストは、細胞と比較した場合、レポータ
ー遺伝子の転写および／または翻訳生成物のレベルの上
昇を引き起こす化合物であると同定される。細胞レセプ
ターのアンタゴニストは、化合物に曝露されていない、
アゴニストにより活性化された細胞と比較した場合、ア
ゴニストにより活性化された細胞中のレポーター遺伝子
の転写および／または翻訳生成物のレベルの低下を引き
起こす化合物であると定義される。別法として、潜在的
アゴニストまたはアンタゴニストの存在下でのレポータ
ーの転写および／または翻訳生成物のレベルを、レセプ
ターを表面に発現する細胞およびレセプターを表面に発
現しない細胞において比較することができる。
【００１７】本発明方法を用いて、Ｇｓ結合ＧＰＣＲの
既知アゴニストは、容量依存的にルシフェラーゼ発現を
刺激することが示された。これらの実験において、ブタ
・ＣＧＲＰレポーターを安定に発現するＨＥＫ２９３細
胞をＭＲＥII ＶＩＰIIでトランスフェクションし、Ｉ
ＢＭＸ存在下でＧＰＣＲアゴニストと思われる化合物と
ともにインキュベーションした。ルシフェラーゼ発現の
刺激から得られた見かけのＥＣ５０値は慣用的アッセイ
から得られた値と同様である。このことは、本発明レポ
ーターッセイが定量的であり、ＧＰＣＲアゴニストおよ
びアンタゴニストの同定および特徴づけに有用でありう
ることを示す。
既知アゴニストは、容量依存的にルシフェラーゼ発現を
刺激することが示された。これらの実験において、ブタ
・ＣＧＲＰレポーターを安定に発現するＨＥＫ２９３細
胞をＭＲＥII ＶＩＰIIでトランスフェクションし、Ｉ
ＢＭＸ存在下でＧＰＣＲアゴニストと思われる化合物と
ともにインキュベーションした。ルシフェラーゼ発現の
刺激から得られた見かけのＥＣ５０値は慣用的アッセイ
から得られた値と同様である。このことは、本発明レポ
ーターッセイが定量的であり、ＧＰＣＲアゴニストおよ
びアンタゴニストの同定および特徴づけに有用でありう
ることを示す。
【００１８】
【実施例】下記の非限定的な実施例は本発明のさらなる
例示説明である。 実施例１：ＭＲＥII ＶＩＰIIの構築 ＩＬ−６ ＭＲＥ（−１７３から−１４２まで；Ray, Mo
l Cell Biol., 1990,10:5736-5746）の３個の並列コピ
ーならび５’および３’末端にそれぞれにＭｕｌＩおよ
びＸｈｏＩ部位を有するオリゴヌクレオチドをルシフェ
ラーゼベクターｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Promega Cor
p.）中にサブクローンした。ＰＣＲを用いてＣＲＥおよ
びヒトゲノムＤＮＡ由来のＶＩＰ遺伝子の基礎的なＶＩ
Ｐプロモーター（−９４から１５２まで；Tsukuda, J.B
iol.Chem., 1987, 262:8743-8747）を増幅し、ＸｈｏＩ
およびＨｉｎｄIII部位をフラグメントのそれぞれ５’
および３’末端に入れた。ＶＩＰ ＣＲＥおよび基礎的
なプロモーターのＭＲＥ ｐＧＬ−３ｂａｓｉｃ中への
その後のサブクローニングによりプラスミドを得た。Ｍ
ＲＥII ＶＩＰIIのＭｕｌＩおよびＨｉｎｄIII間のヌク
レオチド配列を下に示す。
例示説明である。 実施例１：ＭＲＥII ＶＩＰIIの構築 ＩＬ−６ ＭＲＥ（−１７３から−１４２まで；Ray, Mo
l Cell Biol., 1990,10:5736-5746）の３個の並列コピ
ーならび５’および３’末端にそれぞれにＭｕｌＩおよ
びＸｈｏＩ部位を有するオリゴヌクレオチドをルシフェ
ラーゼベクターｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Promega Cor
p.）中にサブクローンした。ＰＣＲを用いてＣＲＥおよ
びヒトゲノムＤＮＡ由来のＶＩＰ遺伝子の基礎的なＶＩ
Ｐプロモーター（−９４から１５２まで；Tsukuda, J.B
iol.Chem., 1987, 262:8743-8747）を増幅し、ＸｈｏＩ
およびＨｉｎｄIII部位をフラグメントのそれぞれ５’
および３’末端に入れた。ＶＩＰ ＣＲＥおよび基礎的
なプロモーターのＭＲＥ ｐＧＬ−３ｂａｓｉｃ中への
その後のサブクローニングによりプラスミドを得た。Ｍ
ＲＥII ＶＩＰIIのＭｕｌＩおよびＨｉｎｄIII間のヌク
レオチド配列を下に示す。
【００１９】 ACGCGTATGCTAAAGGACGGTCACATTGCACAATCTTAAATGCTAAAGGACGTCACATTGCACAATCTTAAA TGCTAAAGGACGTCACATTGCACAATCTTAACTCGAGACTTCAAGCCCTATTCATCCCATGGCCGTCATACT GTGACGTCTTTCAGAGCACTTTGTGATTGCTCAGTCCTAAGTATAAGCCCTATAAAATGATGGGCTTTGAAA TGCTGGTCAGGGTAGAGTGAGAAGCACCAGCAGGCAGTAACAGCCAACCCTTAGCCATTGCTAAGGGCAGAG AACTGGTGGAGCCTTTCTCTTACTCCCAGGACTTCAGCACCTAAGACAGCTCCAAAACAAACCAGAACAGTC AGCTCCGGGGGAGCACGACTGGGCGAGAAGCTT
【００２０】実施例２：ＤＮＡトランスフェクションお
よびルシフェラーゼ活性 １日目：１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを
補足したEarlの最少必須培地（ＥＭＥＭ）中の細胞密度
４.５ｘ１０6個／Ｔ−７５フラスコのＨＥＫ２９３細胞
を、３７℃、５％ ＣＯ2の加湿組織培養インキュベータ
ー中で一晩インキュベーションした。 ２日目：ＭＲＥII ＶＩＰII ＤＮＡ（７.８μｇ）を７
８０μｌの無血清ＥＭＥＭと混合して溶液Ａを得た。リ
ポフェクタミン（２３.１μｌ；Gibco-BRL）を７８０μ
ｌの血清ＥＭＥＭと混合して溶液Ｂを得た。次いで、溶
液ＡおよびＢをおだやかに混合し、室温で１５ないし４
５分インキュベーションした。次いで、１５ｍｌの無血
清ＥＭＥＭで細胞をすすぎ、６.２５ｍｌの無血清ＥＭ
ＥＭを添加した。混合溶液（Ａ＋Ｂ）を重層し、フラグ
メントを組織培養インキュベーター中に５時間置いた。
培地を１５ｍｌのＥＭＥＭ／１０％血清／２ｍＭグルタ
ミンと交換し、組織培養インキュベーター中で保存し
た。 ３日目：９６ウェル組織培養プレートをMatrigel（５０
μｌ／ウェル、リン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ）で
１／５０希釈したもの；Collaborative Biochemical Pr
oducts）で１時間以上処理した。次いで、Matrigel溶液
を除去し、１００μｌの補足ＥＭＥＭ中２.６ｘ１０4個
／１００μｌの補足ＥＭＥＭ中２.６ｘ１０4個／ウェル
の細胞密度のＨＥＫ２９３細胞でプレートをトランスフ
ェクションした。細胞を撒いた後、下記のアゴニストま
たは作用剤：フォルスコリン（１５μＭ）、ＩＢＭＸ
（６０μＭ）、ＴＰＡ（１００ｎＭ）、および０.３、
１.３、１０、１００および３００ｎＭの濃度のアゴニ
ストＰＥＧ２、ＶＩＰまたはＣＧＲＰで細胞を２４時間
または４８時間処理した。次いで、細胞を組織培養イン
キュベーター中３７℃、５％ ＣＯ2で６時間インキュベ
ーションした。培地を除去し、細胞を５０μｌのＰＢＳ
で洗浄した。ＡＥＢＳＦ（０.２４ｍｇ／ｍｌ）、ペプ
スタチン、ロイペプチン、およびアプロチニン（各５μ
ｇ／ｍｌ）、ならびにＤＮＡｓｅ Ｉ（５０μｇ／ｍ
ｌ）を補足した細胞溶解溶液（５０μｌ；Promega）を
添加し、抽出物を凍結した。ルミノメーターの自動注入
器（Dynex MLX）を用いて１０マイクロリットルの融解
抽出物を５０μｌの復元されたルシフェラーゼアッセイ
試薬（Promega）とともにアッセイプレートに入れ、試
料を読んだ。ルシフェラーゼ活性は、アゴニスト、ＩＢ
ＭＸ、ＴＰＡまたはフォルスコリンで処理されなかった
細胞において発現された基礎的なルシフェラーゼ活性よ
りも２倍多く発現された。
よびルシフェラーゼ活性 １日目：１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを
補足したEarlの最少必須培地（ＥＭＥＭ）中の細胞密度
４.５ｘ１０6個／Ｔ−７５フラスコのＨＥＫ２９３細胞
を、３７℃、５％ ＣＯ2の加湿組織培養インキュベータ
ー中で一晩インキュベーションした。 ２日目：ＭＲＥII ＶＩＰII ＤＮＡ（７.８μｇ）を７
８０μｌの無血清ＥＭＥＭと混合して溶液Ａを得た。リ
ポフェクタミン（２３.１μｌ；Gibco-BRL）を７８０μ
ｌの血清ＥＭＥＭと混合して溶液Ｂを得た。次いで、溶
液ＡおよびＢをおだやかに混合し、室温で１５ないし４
５分インキュベーションした。次いで、１５ｍｌの無血
清ＥＭＥＭで細胞をすすぎ、６.２５ｍｌの無血清ＥＭ
ＥＭを添加した。混合溶液（Ａ＋Ｂ）を重層し、フラグ
メントを組織培養インキュベーター中に５時間置いた。
培地を１５ｍｌのＥＭＥＭ／１０％血清／２ｍＭグルタ
ミンと交換し、組織培養インキュベーター中で保存し
た。 ３日目：９６ウェル組織培養プレートをMatrigel（５０
μｌ／ウェル、リン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ）で
１／５０希釈したもの；Collaborative Biochemical Pr
oducts）で１時間以上処理した。次いで、Matrigel溶液
を除去し、１００μｌの補足ＥＭＥＭ中２.６ｘ１０4個
／１００μｌの補足ＥＭＥＭ中２.６ｘ１０4個／ウェル
の細胞密度のＨＥＫ２９３細胞でプレートをトランスフ
ェクションした。細胞を撒いた後、下記のアゴニストま
たは作用剤：フォルスコリン（１５μＭ）、ＩＢＭＸ
（６０μＭ）、ＴＰＡ（１００ｎＭ）、および０.３、
１.３、１０、１００および３００ｎＭの濃度のアゴニ
ストＰＥＧ２、ＶＩＰまたはＣＧＲＰで細胞を２４時間
または４８時間処理した。次いで、細胞を組織培養イン
キュベーター中３７℃、５％ ＣＯ2で６時間インキュベ
ーションした。培地を除去し、細胞を５０μｌのＰＢＳ
で洗浄した。ＡＥＢＳＦ（０.２４ｍｇ／ｍｌ）、ペプ
スタチン、ロイペプチン、およびアプロチニン（各５μ
ｇ／ｍｌ）、ならびにＤＮＡｓｅ Ｉ（５０μｇ／ｍ
ｌ）を補足した細胞溶解溶液（５０μｌ；Promega）を
添加し、抽出物を凍結した。ルミノメーターの自動注入
器（Dynex MLX）を用いて１０マイクロリットルの融解
抽出物を５０μｌの復元されたルシフェラーゼアッセイ
試薬（Promega）とともにアッセイプレートに入れ、試
料を読んだ。ルシフェラーゼ活性は、アゴニスト、ＩＢ
ＭＸ、ＴＰＡまたはフォルスコリンで処理されなかった
細胞において発現された基礎的なルシフェラーゼ活性よ
りも２倍多く発現された。
【００２１】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人：ジョナソン・エイ・リー （ｉｉ）発明の名称：Ｇタンパク質結合レセプターの活
性化を測定するための新規なレポーター遺伝子構築物 （ｉｉｉ）配列の数：１ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛て名：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番、ピ
ー・オー・ボックス１５３９ （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューターリーダブルフォーム： （Ａ）媒体タイプ：３.５インチディスケット、容量１.
４４Ｍｂ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ４８６ （Ｃ）オペレーティングシステム：WINDOWS FOR WORKGR
OUPS （Ｄ）ソフトウェア：WORDPERFECT 5.1 （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：未付与 （Ｂ）出願日：これと同日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号：６０／０３９０１１ （Ｂ）出願日：１９９７年２月２７日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ウィリアム・ティ・キング （Ｂ）登録番号：３０９５４ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０６２５ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５０１５ （Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−５０９０
性化を測定するための新規なレポーター遺伝子構築物 （ｉｉｉ）配列の数：１ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛て名：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番、ピ
ー・オー・ボックス１５３９ （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューターリーダブルフォーム： （Ａ）媒体タイプ：３.５インチディスケット、容量１.
４４Ｍｂ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ４８６ （Ｃ）オペレーティングシステム：WINDOWS FOR WORKGR
OUPS （Ｄ）ソフトウェア：WORDPERFECT 5.1 （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：未付与 （Ｂ）出願日：これと同日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号：６０／０３９０１１ （Ｂ）出願日：１９９７年２月２７日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ウィリアム・ティ・キング （Ｂ）登録番号：３０９５４ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０６２５ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５０１５ （Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−５０９０
【００２２】（２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３９３ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： ACGCGTATGC TAAAGGACGG TCACATTGCA CAATCTTAAA TGCTAAAGGA 50 CGTCACATTG CACAATCTTA AATGCTAAAG GACGTCACAT TGCACAATCT 100 TAACTCGAGA CTTCAAGCCC TATTCATCCC ATGGCCGTCA TACTGTGACG 150 TCTTTCAGAG CACTTTGTGA TTGCTCAGTC CTAAGTATAA GCCCTATAAA 200 ATGATGGGCT TTGAAATGCT GGTCAGGGTA GAGTGAGAAG CACCAGCAGG 250 CAGTAACAGC CAACCCTTAG CCATTGCTAA GGGCAGAGAA CTGGTGGAGC 300 CTTTCTCTTA CTCCCAGGAC TTCAGCACCT AAGACAGCTC CAAAACAAAC 350 CAGAACAGTC AGCTCCGGGG GAGCACGACT GGGCGAGAAG CTT 393
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＭＲＥII ＶＩＰIIレポーター遺伝子と称す
る本発明レポーター遺伝子構築物の具体例をスキーム的
に示したものである。この具体例において、３つの並列
ＩＬ−６多重応答エレメント（ＭＲＥ；Ray, Mol. Cel
l. Biol., 1989,9:5537-5547）がｃＡＭＰ応答エレメン
ト（ＣＲＥ）および血管腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子の
基礎的なプロモーターの上流にある。
る本発明レポーター遺伝子構築物の具体例をスキーム的
に示したものである。この具体例において、３つの並列
ＩＬ−６多重応答エレメント（ＭＲＥ；Ray, Mol. Cel
l. Biol., 1989,9:5537-5547）がｃＡＭＰ応答エレメン
ト（ＣＲＥ）および血管腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子の
基礎的なプロモーターの上流にある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 （ａ）多重応答エレメント、 （ｂ）ｃＡＭＰ応答エレメント、 （ｃ）血管腸ペプチドプロモーター、および （ｄ）レセプター遺伝子 を含むレポーター遺伝子構築物。
- 【請求項２】 ３つの多重応答エレメントを含む請求項
１のレポーター構築物。 - 【請求項３】 （ａ）多重応答エレメント、 （ｂ）ｃＡＭＰ応答エレメント、 （ｃ）血管腸ペプチドプロモーター、および （ｄ）レポーター遺伝子 を含むレポーター遺伝子構築物で形質転換された組み換
え細胞系。 - 【請求項４】 （ａ）請求項３の組み換え細胞系を試験
化合物と接触させること、 （ｂ）組み換え細胞系における転写または翻訳生成物の
レベルを調べること、次いで、 （ｃ）このレベルを、試験化合物を含まない対照培地と
接触させられた請求項３の組み換え細胞において生成さ
れたレポーター遺伝子の転写または翻訳生成物のレベル
と比較することを特徴とする、Ｇタンパク質結合レセプ
ターのアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3901197P | 1997-02-25 | 1997-02-25 | |
| US60/039011 | 1997-02-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11182A true JPH11182A (ja) | 1999-01-06 |
Family
ID=21903170
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10089176A Pending JPH11182A (ja) | 1997-02-25 | 1998-02-25 | Ｇタンパク質結合レセプターの活性化を測定するための新規なレポーター遺伝子構築物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0863214A3 (ja) |
| JP (1) | JPH11182A (ja) |
| CA (1) | CA2224063A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19860833C1 (de) | 1998-12-30 | 2000-09-07 | Albrecht E Sippel | Methode zur zellulären High-Throughput(Hochdurchsatz)-Detektion von Rezeptor-Liganden-Interaktionen |
| EP1616965A1 (en) * | 2004-07-16 | 2006-01-18 | AXXAM S.r.l. | Methods and assays for detecting guanylate cyclase activity |
| CN117187343B (zh) * | 2023-09-06 | 2024-11-01 | 青岛大学 | 一种磷酸二酯酶抑制剂的高通量筛选方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0668930B1 (en) * | 1991-10-01 | 2002-12-18 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | A method of identifying ligands and antagonists of ligands |
-
1998
- 1998-02-20 EP EP98301255A patent/EP0863214A3/en not_active Withdrawn
- 1998-02-23 CA CA002224063A patent/CA2224063A1/en not_active Abandoned
- 1998-02-25 JP JP10089176A patent/JPH11182A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0863214A3 (en) | 1999-05-19 |
| EP0863214A2 (en) | 1998-09-09 |
| CA2224063A1 (en) | 1998-08-25 |
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