JPH1118792A - Ｌ−リブロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 リビトールを含有した発酵液または該発酵液
処理液からリビトールを精製することなく直接Ｌ−リブ
ロースを生産し、かつＬ−リブロースの分離精製行程に
おいて負荷のかからない方法が工業的に望まれていた。 【解決手段】 リビトールをＬ−リブロースに変換する
能力を有する微生物とリビトール含有発酵液または該発
酵液処理液とを接触させることを特徴とするＬ−リブロ
ースの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−リブロースの
製造方法に関し、より詳細には微生物を用いて、リビト
ール含有発酵液または該発酵液処理液からリビトールを
精製することなくＬ−リブロースを直接製造する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、Ｌ−リブロースは生物の構成糖と
してのみならず、医薬及び農薬の中間原料として注目さ
れている。またＬ−リブロースより容易に化学合成され
るＬ−リボースにも同様の用途が近年開発されている。
従来、微生物を用いてＬ−リブロースを製造する方法と
しては精製されたリビトールを原料として酵素反応によ
り製造する方法が知られている（例えばArcus,A.C.（Bi
ochem. J. vol.64:385,1956）らによって報告されてい
る公知の反応）。しかしながら工業的に安価にＬ−リブ
ロースを生産するために、リビトールを含有した発酵液
からリビトールを精製することなく直接Ｌ−リブロース
を生産する方法は知られていなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】実際リビトールの発酵
液にはエリスリトールやグリセロールといったポリアル
コールが多く含まれ、リビトールの精製を行う場合種々
の問題が生じる。具体的には、イオン交換樹脂を用いた
精製においては、リビトールとグリセロールが分離しに
くく、精製の収率が著しく低下するといったことが挙げ
られる。このため精製したリビトールを原料とする従来
の方法では、工業的生産に於いて複雑な設備が必要で、
安価に製造することが困難であった。そこで、リビトー
ルを含有した発酵液または粗精製リビトールからリビト
ールを精製することなく直接Ｌ−リブロースを生産し、
かつＬ−リブロースの分離精製行程において負荷のかか
らない方法が工業的に望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の問
題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の微生物を用い
ることによりリビトール含有発酵液または該発酵液処理
液からＬ−リブロースを生産でき、かつＬ−リブロース
の分離精製行程においても負荷をかけることなくＬ−リ
ブロースが得られることを見いだし、本発明を完成する
に至った。

【０００５】即ち、本発明の要旨は、リビトールをＬ−
リブロースに変換する能力を有する微生物と、リビトー
ル含有発酵液または該発酵液処理液とを接触させること
を特徴とするＬ−リブロースの製造方法に存する。本発
明の好ましい実施の形態としては、微生物が、発酵液に
含まれるポリアルコールを資化する能力を有する微生物
である上記の製造方法であり、より好ましくは微生物が
グルコノバクター(Gluconobacter属）、アセトバクター
(Acetobacter) 属、アルカリゲネス（Alcaligenes ）
属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、アグロバク
テリウム(Agrobacterium) 属、アルスロバクター(Arthr
obacter)属、アエロモナス(Aeromonas) 属、オーレオバ
クテリウム(Aureobacterium)属、バチルス(Bacillus)
属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、クレブ
シエラ(Klebsiella)属、オクロバクトラム(Ochrobactru
m)属、リゾビウム(Rhizobium) 属、セラチア(Serratia)
属, ロドバクター(Rhodobacter) 属、コリネバクテリウ
ム(Corynebacterium) 属、エンテロバクター(Enterobac
ter)属、ミクロコッカス(Micrococcus) 属、パラコッカ
ス(Paracoccus)属、シュードモナス（Pseudomonas ）属
から選ばれる微生物である上記の製造方法であり、更に
好ましくは微生物がグルコノバクター（Gluconobacter
）属に属する微生物である上記の製造方法であり、特
に好ましくは微生物がグルコノバクター・フラテウリ
（Gluconobacter frateurii）またはグルコノバクター
・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）である上記
の製造方法が挙げられる。

【０００６】また、更なる好ましい実施の形態としては
リビトール含有発酵液または該発酵液処理液がリビトー
ル以外のポリアルコールを含有すること、ポリアルコー
ルがグリセロール及び／またはエリスリトールであるこ
とを特徴とする上記の製造方法が挙げられる。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用するリビトール含有発酵液としては、リビ
トールを含有したものであれば特に限定はされない。例
えば特公平６−３０５９２号公報等に記載の方法により
糖より生産された発酵液、あるいは特公昭４５−２０７
１号公報に記載のＤーリボースより生産された発酵液、
特公昭４４−１６３５０号公報に記載の炭酸ガスより生
産された発酵液等が挙げられ、リビトールの生成量の多
い発酵液がより好ましい。

【０００８】発酵液は菌体を含んでいても良いし、遠心
分離などにより菌体を除去したものでもよい。またリビ
トールの発酵に用いた微生物を蒸気滅菌などにより殺菌
したものでも良いし、殺菌を行っていない発酵液でも良
い。またこの発酵液を簡便な方法を用いて精製させたも
のでもよい。例えば発酵液を除菌後、濃縮し晶析させた
ものでも良いし、また、カラムクロマトグラフィーなど
で部分精製させたものでも良い。即ち、本発明において
は、発酵液そのものでなく、糖類、アルコール類、アミ
ノ酸、蛋白といった有機物、あるいは、塩類、色素等の
無機物よりなる、不純物を含んだままの未精製または部
分精製のリビトール発酵液処理液も対象として含まれ
る。

【０００９】発酵液に含まれるリビトールの量は０．１
〜２００ｇ／ｌの間であるがこれを適当な緩衝液、例え
ば、酢酸バッファー、リン酸バッファー、トリスバッフ
ァー等、あるいは水を用いて希釈しても良い。あるいは
濃縮させても良い。これらの発酵液に微生物を好気的条
件で作用させ、Ｌーリブロースを生成させる。

【００１０】本反応で使用する微生物としては、好気的
反応条件下、リビトールをＬ−リブロースに変換する能
力を有する微生物であれば特に限定はされないが、リビ
トールからＬ−リブロースを製造し、かつリビトール以
外の副生されたポリアルコールを資化する能力を有する
微生物が好ましく、より好ましくは、グルコノバクター
属、アセトバクター属、アルカリゲネス属、アシネトバ
クター属、アグロバクテリウム属、アルスロバクター
属、アエロモナス属、オーレオバクテリウム属、バチル
ス属、ブレビバクテリウム属、クレブシエラ属、オクロ
バクトラム属、リゾビウム属、セラチア属、ロドバクタ
ー属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、ミ
クロコッカス属、パラコッカス属およびシュードモナス
属に属する微生物である。特にグルコノバクター属に属
する微生物がポリアルコールの資化性の点からも好まし
い。グルコノバクター属に属する微生物としては、グル
コノバクター・フラテウリ、グルコノバクター・オキシ
ダンス等が挙げられる。さらに具体的な代表株としてGl
uconobacter frateurii IFO 2508 、Gluconobacteroxy
dans IFO 3293 が挙げられる。

【００１１】本発明において使用するアセトバクター属
に属する微生物は、例えば、Acetobactor acinus等が挙
げられ、具体的な菌株としては、Acetobactor acinus F
ERMP-2507が挙げられる。本発明において使用するアル
カリゲネス属に属する微生物は、例えばAlcaligenes aq
uamarinus, Alcaligenes epoxylyticus 、 Alcaligenes
margaritae 、 Alcaligenes paradoxus、 Alcaligenes
xylosoxidans subsp. xylosoxidans が挙げられる。さ
らに具体的な代表株として Alcaligenes aquamarinu FE
RM P-4299、 Alcaligenes epoxylyticus FERM P-2511
、 Alcaligenes margaritae FERM P-2512 、 Alcalige
nes xylosoxidans subsp. xylosoxidans IAM 12684 、
Alcaligenes paradoxus Biotype I DSM66、Alcaligenes
paradoxus Biotype II DSM30162 が挙げられる。

【００１２】本発明において使用するアシネトバクター
属に属する微生物は、例えばAcinetobacter tartarogen
esが挙げられる。さらに具体的にはAcinetobacter tart
arogenesIFO13644が挙げられる。本発明において使用す
るアルスロバクター属に属する微生物は、例えばArthro
bacter atrocyaneus、 Arthrobacter pascens 、 Arthr
obacter ramousus等が挙げられる。さらに具体的には A
rthrobacter pascens IFO12139、 Arthrobacteratrocya
neus JCM 1329、 Arthrobacter ramousus JCM1334等が
挙げられる。本発明において使用するアグロバクテリウ
ム属に属する微生物は、例えばAgrobacterium radiobac
ter, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium visc
osumが挙げられる。さらに具体的な代表株としてAgroba
cterium radiobacter NRRL B-11291, Agrobacterium tu
mefaciens IAM13129, Agrobacterium viscosum IFO1365
2,が挙げられる。

【００１３】本発明において使用するオーレオバクテリ
ウム(Aureobacterium)属に属する微生物は、Aureobacte
rium testaceumが挙げられる。さらに具体的な代表株と
してAureobacterium testaceum JCM1353 が挙げられ
る。本発明において使用するバチルス属に属する微生物
は、例えばBacillus alvei、 Bacillus coagulans が挙
げられる。さらに具体的な代表株としてBacillus alvei
IFO3343、 Bacillus coagulans AHU 1631が挙げられ
る。

【００１４】本発明において使用するブレビバクテリウ
ム属に属する微生物は、Brevibacterium busillum が挙
げられる。さらに具体的な代表株としてBrevibacterium
busillum IAM1489 が挙げられる。本発明において使用
するコリネバクテリウム属に属する微生物は、Coryneba
cterium flaccumfaciensが挙げられる。さらに具体的な
代表株として Corynebacterium flaccumfaciens ATCC12
813 が挙げられる。本発明において使用するエンテロバ
クター属に属する微生物は、Enterobacteraerogenesが
挙げられる。さらに具体的な代表株としてEnterobacter
aerogenesIFO13534 が挙げられる。

【００１５】本発明において使用するクレブシエラ属に
属する微生物は、例えばKlebsiellaplanticola 、 Kleb
siella oxytoca 、Klebsiella terrigenaが挙げられ
る。さらに具体的な代表株としてKlebsiella planticol
a NCIB11885 、 Klebsiella oxytoca JCM1665 、 Klebs
iella terrigena JCM1687 が挙げられる。本発明におい
て使用するミクロコッカス属に属する微生物は、例えば
Micrococcus roseusが挙げられる。さらに具体的な代表
株としてMicrococcus roseus IFO3764 が挙げられる。

【００１６】本発明において使用するオクロバクトラム
属に属する微生物は、Ochrobactrums anthropiが挙げら
れる。さらに具体的な代表株としてOchrobactrums anth
ropiIAM 13993が挙げられる。本発明において使用する
パラコッカス属に属する微生物は、例えばParacoccusde
nitrificansが挙げられる。さらに具体的な代表株とし
てParacoccus denitrificans IFO13301 が挙げられる。

【００１７】本発明において使用するシュードモナス属
に属する微生物は、例えばPseudomonas fluorecens、 P
seudomonas synxanthaが挙げられる。さらに具体的な代
表株としてPseudomonas fluorecens IFO 3903 、 Pseud
omonas fluorecens ATCC13525 、 Pseudomonas synxant
ha IAM13256 等が挙げられる。本発明において使用する
アエロモナス属に属する微生物は、例えばAeromonaspan
ctata、具体的には、Aeromonas panctata IFO13288 が
挙げられる。

【００１８】本発明において使用するリゾビウム属に属
する微生物は、例えばRhizobium validum IFO13648が挙
げられる。本発明において使用するセラチア属に属する
微生物は、例えばSerratia marcescens が挙げられ、例
えばSerratia marcescens IFO3054 、Serratia marcesc
ens ATCC13880 が挙げられる。本発明において使用する
ロドバクター属に属する微生物は、例えばRhodobacter
sphaeroides が、例えばRhodobacter sphaeroides IFO1
2003が挙げられる。

【００１９】なお、上記微生物は、ＵＶ照射、Ｎ−メチ
ル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチル
メタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アク
リジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは
遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組
換え株などのいずれの株であってもよい。上記微生物は
リビトール以外の副生されたポリアルコールを資化し、
リビトールを効率的にＬーリブロースに変換できるの
で、その後のＬーリブロースの分離・精製工程における
負荷を著しく軽減することが出来る。

【００２０】本発明の製造方法においては、上記微生物
の１種あるいは２種以上が用いられる。本発明の微生物
培養に用いる培地は微生物が生育でき、Ｌーリブロース
生産能を誘導しかつポリアルコールの資化性を誘導する
培地であれば、いずれでもよい。さらに培地は液体状で
も良いし固体培地でも良い。炭素源としては本微生物が
資化しうるグルコースなどの炭水化物、グリセロールな
どのアルコール類、有機酸などが挙げられ、適宜一種あ
るいは２種以上が選ばれる。好ましくはポリアルコール
の資化性を誘導するグリセロールなどのアルコール類が
挙げられる。窒素源としては本微生物が資化しうる窒素
源であればいずれでも良いが、好ましくは、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー、ＮＺアミン、トリプトー
ス、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚肉エキス、
その他の有機窒素源、あるいは硝酸ナトリウム、その他
の無機窒素源が適宜１種あるいは２種使用される。培地
中に含まれる炭素源及び窒素源の濃度は０．０１％〜２
０％の間で用いられる。炭素源、窒素源のほかに、無機
イオンやビタミン類を必要に応じ添加することは有効で
ある。無機イオンとしては、リン酸イオン、ナトリウム
イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオ
ン、マンガンイオン、モリブデンイオン、カルシウムイ
オン、コバルトイオン、その他金属イオン類等が適宜数
種類用いられる。ビタミン類としては、チアミン、イノ
シトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げ
られ、適宜用いられる。また、上述のグルコースその他
の炭素源、窒素源、無機イオン、ビタミン類は、必要に
応じて培養中の適当な時点で追補添加してもよい。

【００２１】培養は好気的条件下で行う。培養温度は４
度から５０度の範囲で行われるが好ましくは２０から３
５度の範囲である。通気量は0.001vvm〜2vvm好ましくは
0.5〜1.5vvmの範囲で行われる。ｐＨは２〜１０、好ま
しくは３〜９の間である。培養は１０時間から２日間行
う。培養後菌体をリビトール含有反応液に作用させる。
このとき培養液を直接用いても良いし、遠心分離などに
より菌体を培養液から分離させたものを用いても良い。
またこの菌体をカラギーナン、ポリアクリルアミドゲ
ル、イオン交換樹脂、珪藻土、活性炭等に固定化させた
ものを使用しても良い。また、菌体を超音波破砕機など
で菌体を破砕したものを用いてもよい。

【００２２】反応は好気的条件下で行う。反応温度は４
度から５０度の範囲で行われるが好ましくは２０から３
５度の範囲である。ｐＨは２〜１０、好ましくは３〜８
の間である。攪拌が十分に行われていれば特に通気の必
要は無いが、好ましくは０．０１ｖｖｍ〜１ｖｖｍの間
である。反応に用いる菌体量は湿潤菌体量換算でリビト
ール含有発酵液に対し０．０１％〜５０％（重量／体
積）の間で用いられる。リビトールの濃度は特に限定さ
れないが、好ましくは１から１５％の間である。含有さ
れるポリアルコールの濃度は特に限定されない。反応は
１時間から２日間行う。

【００２３】反応により得られたＬーリブロースは、培
養終了液から公知の方法により分離精製できる。即ち、
培養終了後まず微生物菌体を遠心分離等の既存の方法で
除去する。除菌に先立ち、培養終了液に熱を加え、殺菌
を行ってもよい。除菌された液は通常の方法、即ちクロ
マトグラフィーや晶析技術を用いることで容易に精製で
きる。工業的には、イオン交換樹脂を用いた疑似移動相
型クロマトグラフィーにより分離することも可能であ
る。分離精製の工程においては、必要に応じて脱塩、脱
色など、通常の糖の精製における操作を加えることもで
きる。

【００２４】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分
野における通常の変更をすることができる。 リビトール発酵液の製造 ａ）使用微生物 菌株 Trichosporonoides.megachillensis（ＣＢＳ５６
７．８５） ｂ）培養方法 ３０％グルコース、１．０％酵母エキスよりなる培地２
０ｍｌを入れた２００ｍｌバッフル付きフラスコ１０本
に、上記菌株を種した。フラスコは１６０ｒｐｍで回転
する振とう培養機にセットされ、３０℃で７日間培養が
行われた。

【００２５】ｃ）リビトールの生産確認 まず得られた培養終了液を１ｍｌ遠心分離し、微生物菌
体を除去した。得られた培養上清に含まれるリビトール
などの糖類含量を高速液体クロマトグラフィーにより下
記の条件で測定した。各糖質の保持時間は下記分析条件
において、それぞれグルコース１０．５７分、リビトー
ル１２．２２分、エリスリトール１３．３６分、グリセ
ロール１５．０９分である。分析の結果、残存グルコー
ス０g/l、リビトール７３．１g/l 、エリスリトール４
６．２g/l 、グリセロール２９．３g/l であった。リビ
トールおよびエリスリトール、グリセロール以外の糖質
の生産は確認されなかった。

【００２６】 高速液体クロマトグラフィー分析条件 カ ラ ム： ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０８ＥＨ ８mmI.D.×３００mm （三菱化学株式会社製） 溶 離 液： １Ｎ リン酸水溶液 流 速： ０．６ｍｌ／分 カラム温度： ５０℃ 検 出 器： ＲＩ

【００２７】実施例１ グルコノバクター・フラテウリ（Gluconobacter frateu
rii)(IFO2508) を２％グリセロール、０．５％酵母エキ
ス、０．５％ポリペプトンよりなる培地４０ｍｌを入れ
た２００ｍｌバッフル付きフラスコに接種した。１６０
ｒｐｍで回転する振とう培養機にセットし、３０℃で１
日間培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離し
て、培養上清除き、菌体を１００ｍＭのりん酸バッファ
ー（ｐＨ７．０）４ｍｌに懸濁した。方法１で製造した
リビトール発酵液を４０ｍｌ、２００ｍｌ三角フラスコ
に入れ、グルコノバクターの懸濁液を４ｍｌ入れ、３０
度にてロータリーシェーカーで振とうしながら反応し
た。反応１日後、反応液１ｍｌを遠心分離にかけて菌体
を除き、反応上清を下記の高速液体クロマトグラフィー
分析した。リビトールは完全に変換され、グリセロール
も検出されなかった。生成したリＬ−ブロースは５２．
１ｇ／Ｌであった。

【００２８】 高速液体クロマトグラフィー分析条件 カ ラ ム： ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０８Ｅ ８mmI.D.×３００mm （三菱化学株式会社製） 溶 離 液： 蒸留水 流 速： １．０ｍｌ／分 カラム温度： ６０℃ 検 出 器： ＲＩ

【００２９】実施例２ グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxyd
ans)(IFO3292) に変える以外は実施例１と同様に行っ
た。生成したＬ−リブロースは５０．３ｇ／ｌであっ
た。グリセロールは０．１ｇ／ｌであった。

【００３０】実施例３ 表１にあげた菌株を２％グリセロール、０．５％酵母エ
キス、０．５％ポリペプトンよりなる培地１０ｍｌを入
れた２１φ試験管に接種した。３０℃で１日間培養を行
った。培養終了後、培養液を遠心分離して、培養上清除
き、菌体を実施例１で製造したリビトール発酵液３ｍｌ
に懸濁した。２１φ試験管を用い３０℃にて好気的に反
応した。反応２週間後、反応液を遠心分離にかけて菌体
を除き、反応上清を下記の高速液体クロマトグラフィー
分析した。結果を表１に示す。

【００３１】

【表１】

【００３２】

【発明の効果】本発明の製造方法により、発酵されたリ
ビトールを精製することなく反応に用い、安価にＬ−リ
ブロースを製造することができ、またグリセロールなど
が同時に消費されるため、Ｌ−リブロースを効率よく精
製することができる。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リビトールをＬ−リブロースに変換する
   能力を有する微生物と、リビトール含有発酵液または該
   発酵液処理液とを接触させることを特徴とするＬ−リブ
   ロースの製造方法。
2. 【請求項２】 微生物が、リビトール含有発酵液に含ま
   れるポリアルコールを資化する能力を有する微生物であ
   ることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
3. 【請求項３】 微生物が、グルコノバクター属、アセト
   バクター属、アルカリゲネス属、アシネトバクター属、
   アグロバクテリウム属、アルスロバクター属、アエロモ
   ナス属、オーレオバクテリウム属、バチルス属、ブレビ
   バクテリウム属、クレブシエラ属、オクロバクトラム
   属、リゾビウム属、セラチア属、ロドバクター属、コリ
   ネバクテリウム属、エンテロバクター属、ミクロコッカ
   ス属、パラコッカス属およびシュードモナス属から選ば
   れることを特徴とする請求項１または２に記載の製造方
   法。
4. 【請求項４】 微生物がグルコノバクター属に属するこ
   とを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
5. 【請求項５】 微生物がグルコノバクター・フラテウリ
   またはグルコノバクター・オキシダンスであることを特
   徴とする請求項４に記載の製造方法。
6. 【請求項６】 リビトール含有発酵液または該発酵液処
   理液がリビトール以外のポリアルコールを含有すること
   を特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の製造方
   法。
7. 【請求項７】 ポリアルコールがグリセロール及び／ま
   たはエリスリトールであることを特徴とする請求項６に
   記載の製造方法。