JPH11192093A

JPH11192093A - 鳥類感染型ヘルペス属ウイルスの組み換え体、およびこれを利用した組み換えワクチン

Info

Publication number: JPH11192093A
Application number: JP10282906A
Authority: JP
Inventors: Shuji Saito; 修治斎藤; Hisashi Okuda; 尚志奥田
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-10-05
Publication date: 1999-07-21
Anticipated expiration: 2018-10-05
Also published as: EP1026246A1; US6632664B1; EP1026246B1; EP1026246A4; DE69836557D1; DE69836557T2; JP3587065B2; WO1999018215A1

Abstract

(57)【要約】【解決手段】七面鳥ヘルペスウイルス（HVT）のゲノ
ムまたはマレック病ウイルス（MDV）のゲノムの非必須
領域に異種遺伝子、とりわけ、異種抗原遺伝子を組み込
んで組み換えHVTおよびMDVを作製し、それらを利用した
ワクチンを製造する。【効果】本発明によれば、七面鳥ヘルペスウイルスゲ
ノム中の非翻訳領域である遺伝子領域に外来遺伝子が挿
入された組み換え七面鳥ヘルペスウイルスおよび当該組
み換え七面鳥ヘルペスウイルスを含有するワクチンが提
供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、七面鳥ヘルペスウ
イルス（以下、HVTということがある）のゲノムまたは
マレック病ウイルス（以下、MDVということがある）の
ゲノムの非必須領域に外来遺伝子を組み込んだ組み換え
HVTおよびMDV、及びそれを利用したワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、遺伝子組み換え手法を使ったウイ
ルスベクターワクチンは、ポックスウイルス属をベクタ
ーとしたワクチン（Ogawa R.ら、Vaccine, 8:486-490(1
990)）、アデノウイルスをベクターとしたワクチン（Hs
u, K. H.ら、Vaccine, 12:607-612 (1994)）、バキュロ
ウイルスをベクターとしたワクチンのほか、ヘルペスウ
イルス属をベクターとしたワクチン(Shin, M.-F.ら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5867-5870(1984)) が知
られている。中でもヘルペスウイルス属の遺伝子組み換
えベクターワクチンは近年盛んに研究されている。

【０００３】外来抗原遺伝子を発現させるウイルスベク
ターとして用いるウイルスは、ヒトヘルペスウイルス(H
SV)やオーエスキー病ウイルス(PRV)(Van Zijl M.,ら、
J. Virol., 65:2761-2765(1991))、七面鳥ヘルペスウイ
ルス(HVT)(Morgan R. W.ら、Avian Dis. 36:858-870(19
92))、マレック病ウイルス(MDV)などが知られている。
これらの中でもHVTウイルスおよびワクチン株MDVは接種
対象動物となる家禽での安全性が高く、ワクチン特性も
良好であることから、鳥類に対するベクターウイルスと
して注目されている。

【０００４】また、HVTおよびMDVの感染様式として、感
染細胞から他の細胞にウイルスが感染する際、ウイルス
が感染細胞から一旦血中に放出されてから他の細胞に感
染するというポックスウイルスのような感染様式をとら
ず、隣り合う細胞へ、細胞間−細胞間で感染が成立す
る。このため、血流中に存在するHVTまたはMDV特異的抗
体の影響を受けにくい。

【０００５】従来、親鳥からの移行抗体(Maternal anti
body)の存在によって、ウイルス生ワクチンの効果が減
弱され、十分な効果を発揮できないという問題があっ
た。近年、鶏へのワクチン接種法の一つとして、発生途
中の鶏卵内にワクチンを接種する方法も開発され、HVT
またはMDVのワクチンとしての有用性も認められてい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、組み換
えHVTもしくはMDVでこれまで知られている遺伝子組み換
え領域は、TK領域（Ross L.ら、16th International He
rpes virus Workshop (1991)）、US10領域（Sakaguchi
M.ら、Vaccine, 12:953-957(1994) ）、US2領域（Sonde
rmeijer, P. J.ら、Vaccine, 11:349-358(1993) ）など
のHVTの生存に非必須と考えられる遺伝子の中に外来抗
原遺伝子を組み込むという報告ばかりであった。このよ
うな非必須領域への組み込みは、外来遺伝子を、非必須
とはいえ本来HVTで発現するべき遺伝子、すなわち抗原
決定基となる遺伝子の代わりに発現させるため、HVTも
しくはMDVの抗原性を減弱させる可能性がある。それば
かりでなく、挿入部分のオープン・リーディング・フレ
ーム（ORF）の転写及び翻訳に関係した遺伝子機構（エ
ンハンサー、プロモーター、ターミネーターなど）が、
挿入遺伝子の発現に対して悪影響を及ぼす可能性を否定
できない。

【０００７】事実、多くのウイルスで、非必須と考えら
れるタンパク質をコードする遺伝子領域を欠失させた
り、その部分に外来遺伝子を組み込んだりした場合に、
ウイルスの形状が変化したり抗原性が低下したりするこ
とが報告されている。さらに、弱毒ワクチンの調整方法
としても、外来遺伝子を組込む方法が用いられているケ
ースがある。

【０００８】また、TK領域に外来遺伝子を挿入して発現
させたときに、発現遺伝子の抗原性が低下するという報
告もある（Ross L.ら、J. Gen. Virol., 74:371-377(19
93)）。さらに、特定のORF内に挿入できる抗原遺伝子の
長さが限られてしまうため、多くの抗原遺伝子を挿入で
きないなど、ワクチンとして多くの問題点がある。

【０００９】本発明者らは、かかる問題点を解決すべく
鋭意研究を進めた結果、何種類もの外来抗原遺伝子を挿
入でき、かつ安定的に抗原タンパク質を発現できるHVT
またはMDVの遺伝子挿入領域、つまりここでいうHVTまた
はMDVの非翻訳領域を見いだし、その部分に種々の外来
抗原遺伝子を挿入できること、そしてこれらの外来抗原
遺伝子が挿入された組み換えHVTまたはMDVを作製し、こ
れらの組み換えウイルスを宿主に感染させることによ
り、宿主側に十分なワクチン効果を付与する事を見いだ
し、本発明を完成するに至ったのである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の発明者らは、上
記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、鳥類感染
型ヘルペス属ウイルスに属するウイルスの非翻訳領域中
の特定の部位に外来遺伝子を挿入した組み換えウイルス
を作製し、この組み換えウイルスをワクチンとして使用
できることを見出し、本発明を完成したものである。

【００１１】すなわち、本発明は、ゲノム中の非翻訳領
域である遺伝子領域に外来遺伝子が挿入された、鳥類感
染型組み換えヘルペス属ウイルスである。ここで、上記
ウイルスは、七面鳥ヘルペスウイルス（HVT）またはマ
レック病ウイルス（MDV）であることを特徴とする。

【００１２】また、本発明は、ヒト単純ヘルペスウイル
スの各オープン・リーディング・フレームに相当する七
面鳥ヘルペスウイルスまたはマレック病ウイルスのオー
プン・リーディング・フレームの間に存在する非翻訳領
域中にあり、かつ、(1) UL44とUL45の間、(2) UL45とUL
46の間、(3) UL41とUL42の間、(4) UL40とUL41の間、
(5) gB遺伝子の下流領域、(6) UL53とUL54の間、および
(7) UL36とUL37の間からなる群から選ばれる少なくとも
１箇所の挿入部位に、少なくとも１つの外来遺伝子が挿
入されている組み換えウイルスであることを特徴とす
る。

【００１３】さらに、上記外来遺伝子は、鳥類の感染症
の病原体に由来する遺伝子であり、ウイルス、細菌、真
菌、および原虫からなる群から選ばれる病原体由来の抗
原遺伝子であることを特徴とする。さらにまた、上記外
来遺伝子は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、ガン
ボロ病ウイルス（IBDV）、伝染性喉頭気管炎ウイルス
（ILTV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、マイコプ
ラズマ（MG）、およびコクシジウムからなる群から選ば
れる病原体由来の遺伝子であることを特徴とする。本発
明はまた、上記の組み換えウイルスを有効成分とする鶏
用ワクチンである。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳述する。（本発明で使用するウイルス）本発明で使用するウイル
スは、鳥類に感染するウイルスのうち、ヘルペスウイル
ス属に属するもの（鳥類感染型ヘルペス属ウイルス）で
あることが好ましい。これは、ヘルペスウイルス属に属
するウイルスが、潜伏感染(latent infection)や持続感
染(persistent infection)の状態で感染動物の体内に永
続的に生存し続けるという性質を有するためである。

【００１５】鳥類感染型ヘルペス属ウイルスのなかで
も、特に、七面鶏ヘルペスウイルス(HVT)またはマレッ
ク病ウイルス(MDV)であることが好ましい。上記のウイ
ルスは感染期間が長いために長期にわたってワクチン効
果を感染した鳥類に付与できる可能性があり、ワクチン
としての有効性が期待されることによる。

【００１６】（HVTまたはMDV）本発明において使用する
HVTまたはMDVは、天然に得られたり、ATCCなどから有償
または無償で入手できるものなどであればよく、特に限
定されるものではない。

【００１７】HVTの好ましい例としては、ガンマヘルペ
スウイルス亜科に属し、生来非病原性であり、かつ非腫
瘍性のウイルスで家禽用のワクチンとして用いられてい
るものが挙げられる。具体的には、FC126(ATCC VR-584
B) 、PB-THV1、H-2、YT-7、WTHV-1、HPRS-26などが挙げ
られ、例えば、FC126株を好適に使用することができ
る。また、MDVとしては、具体的には、CVI988やSB1など
を挙げることができる。

【００１８】本発明の組み換えウイルスを作製するため
には、まず、上記のウイルスを適当な宿主細胞中で増殖
させ、ゲノムDNAを得る。そして、このゲノムDNA中の非
翻訳領域を確認し、その領域に、後述する外来遺伝子を
挿入する。ウイルスを増殖させるための宿主および増殖
条件は、増殖させようとするウイルスに応じて適宜選択
する。例えば、HVTを増殖させる場合には、宿主細胞と
してCEF、発育鶏卵、鶏腎細胞などを用いる。Eagle's M
EM、ライボビッツL-15／マッコイ5A（１：１混合）培地
などの中で、37℃前後にて、３〜４日間培養する。

【００１９】以上のように培養した細胞から定法に従っ
てDNAを抽出する。すなわち、単層培養した細胞をはが
し、遠心上清をとり、リシスバッファーでタンパク質を
変性除去した後に、フェノールとエタノールでDNAを抽
出する。このようにして得たウイルスDNAの非翻訳領域
を後述のように確認する。

【００２０】非翻訳領域とは、ORFを有さず、翻訳によ
って発現されるタンパク質のアミノ酸配列を規定してい
ない塩基およびORFが転写、翻訳、タンパク質発現のい
ずれにも関与していない塩基領域をいう。この領域に含
まれている塩基配列は、その領域がORFを含むこととな
らない限り、塩基の置換、欠失、付加されたものであっ
てもよい。

【００２１】（外来遺伝子挿入領域）外来遺伝子を挿入
する領域を、外来遺伝子挿入領域といい、外来遺伝子を
挿入する部位を外来遺伝子挿入部位という。外来遺伝子
挿入領域は、以下のようにして得ることができる。HVT
またはMDVの場合を例にとって説明する。

【００２２】これらのウイルスの非翻訳領域を、以下の
ようにして得る。まず、全塩基配列が解明されているヒ
ト単純ヘルペスウイルスＩ型(HSV-1)や、HVTと相同性の
高い塩基配列を持つMDV-1など相互で配列が確定されて
いる領域などから、非翻訳領域と推定される配列の前後
の配列を選択する。

【００２３】ついで、これらの配列をもとにDNAプライ
マーを合成し、HVTまたはMDVのDNAを鋳型として所定の
条件でポリメラーゼチェーンリアクション(PCR)を行
い、特定の遺伝子を増幅することによって得られる。

【００２４】この増幅された遺伝子にORFがないことをD
NA配列分析で確認し、ORFの転写および翻訳に関係した
遺伝子機構（エンハンサー、プロモーター、ターミネー
ターなどを含む機構）なども存在しない位置を確認し
て、外来遺伝子挿入領域を決定する。

【００２５】この領域がウイルスの増殖に非必須であ
り、外来遺伝子を導入できることを明らかにするため
に、この領域に、特異的な配列を付加し、もしくは欠失
させ、または置換を行い、CEF（鶏胚繊維芽細胞）に感
染させ、このような変化を生じさせた前後における感染
性および増殖性の変化を調べる。

【００２６】上記のような特定の配列の付加、欠失、置
換などは、in vitro突然変異（in vitro mutagenesi
s）、PCR、部位特異的突然変異(site-directed mutagen
esis)、および特公平6-16709号公報に記載された部位特
定変異法など、一般的な手法を用いて行うことができ
る。

【００２７】また、CEFに対しては、m.o.i.≒１で感染
させ、37℃で３〜４時間インキュベートして増殖させ、
ウイルスの増殖性、細胞の形態、プラークの形態、細胞
の不死化を観察する。

【００２８】この結果、塩基の変更前の株と細胞やプラ
ークの形態に差がなく、また、ウイルスの増殖性も５回
の繰り返し実験の平均で塩基の変異前の株との差が±20
％以内であることを確認し、同部位を外来遺伝子の挿入
が可能な領域（外来遺伝子挿入可能領域）と判断する。
この際、外来遺伝子挿入領域は、非翻訳領域を含めて外
来遺伝子挿入部位の前後10bp以上あればよく、好ましく
は100bp以上、より好ましくは500bp以上あればよい。

【００２９】外来遺伝子挿入部位は非翻訳領域内にあれ
ば特に限定されるものではないが、具体例としては、
(1) UL44とUL45との間およびUL45とUL46との間、(2) UL
41とUL42、(3) UL40とUL41との間、(4) gB遺伝子の下流
領域、(5) UL53とUL54との間、(6) UL36とUL37との間、
などが挙げられる。これらは、第16回国際ヘルペスウイ
ルスワークショップ（1991年07月７〜12日に米国カリフ
ォルニア州パシフィックグローブで開催された）の予稿
集中に、HSV-1について掲載されている。

【００３０】これらの中でも、好ましいものとして、HS
V-1だけでなく、MDVでも相同性がORFにおいて確認され
ている(1)および(4)を挙げることができ、より好ましく
はORF間の非翻訳領域が推定できる(1)を挙げることがで
きる。

【００３１】（外来遺伝子含有プラスミドの構築）外来
遺伝子をHVTもしくはMDVの非翻訳領域に挿入するには、
非翻訳領域を含んだ配列をプラスミドにクローニングし
ておく必要があるが、このプラスミドも特に限定される
ものではない。例えば、pBR322、pBR325、pBR327、pBR3
28、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8、およびpUC9などのプラ
スミド、ラムダファージ、M13ファージなどのようなフ
ァージ、pHC79などのコスミドを例示することができ
る。

【００３２】これらのプラスミドに、上記のようにして
得た非翻訳領域を常法によって組み込む。このように組
み込まれた非翻訳領域へ外来遺伝子を挿入するために
は、上記のようなプラスミドなどにクローニングした非
翻訳領域の特定の部分に変異を加えて新たな制限酵素切
断部分を作り出し、そこに外来遺伝子を挿入する。

【００３３】変異を加える方法は定法に従えばよく、in
vitro mutagenesisやPCRなど当業者において通常用い
られる方法を使用することができる。すなわち、PCR法
では、PCRプライマーに１〜２塩基の欠失、置換、付加
などの変異を生じさせ、このプライマーを使用すること
により変異を生じさせることができる。

【００３４】ここで挿入する外来遺伝子とは、本来その
領域には含まれていない自己由来の遺伝子、非自己由来
の遺伝子の双方を含み、鳥類感染型ヘルペス属ウイルス
の抗原遺伝子であることが望ましい。

【００３５】このような遺伝子としては、例えば、鳥類
の感染症の病原体に由来する遺伝子を挙げることができ
る。鳥類の感染症を引き起こす病原体としては、ウイル
ス、細菌、真菌、原虫などを挙げることができ、これら
の病原体が有する抗原遺伝子、すなわち、抗原決定基を
コードする遺伝子を好適に使用することができる。

【００３６】このような病原体としては、具体的には、
鶏の一生を通じて問題となるニューキャッスル病ウイル
ス（NDV）、ガンボロ病ウイルス(IBDV)、中雛以降で問
題となる伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、伝染性気管
支炎ウイルス(IBV)、マイコプラズマ(MG)、およびコク
シジウムなどを挙げることができる。

【００３７】特に、中和抗原遺伝子または感染防御抗原
と考えられる抗原の遺伝子が同定されている疾病では、
これらの遺伝子をHVTやMDVなどの鳥類感染型ヘルペス属
ウイルスに組み込むことによって、組み換えウイルスが
感染した鶏の体内で抗原として発現させることが可能と
なることによる。また、これによって、効果的なワクチ
ンとして使用することが可能になる。

【００３８】具体的に、HVTまたはMDVなどの鳥類感染型
ヘルペス属ウイルスに遺伝子を組み込んで組み換えウイ
ルスを作製し、これらのウイルスに感染した鳥類の体内
で発現されるタンパク質は、構造タンパク質、非構造タ
ンパク質のいずれであってもよく、DNA配列のわかって
いるタンパク質であれば特に限定されない。

【００３９】例えば、NDVでは、HNタンパク質、Ｆタン
パク質、NPタンパク質が、また、IBVでは、Ｍタンパク
質、Ｎタンパク質、スパイクタンパク質が挙げられる。
IBDVでは、VP１〜VP５の全タンパク質、ILTVはヘルペス
ウイルスであることから、HSV-1やMDV、HVTと相同性の
あるタンパク質（特にgBタンパク質やUL32相当タンパク
質など）、マイコプラズマではアドヘシンタンパク質、
HMW関連タンパク質、40Kタンパク質、66Kタンパク質、6
7Kタンパク質など（国際公開公報WO94/23019号に配列が
記載）などが挙げられる。

【００４０】したがって、これらのタンパク質をコード
している遺伝子を組み込むことが好ましい。このような
外来遺伝子を、異種抗原遺伝子という。

【００４１】また、異種抗原遺伝子をHVTまたはMDVで発
現させるためには、異種抗原遺伝子の上流域にプロモー
ター配列を組込む必要がある。使用するプロモーター
は、合成プロモーター、天然プロモーターのいずれであ
ってもよく、HVTまたはMDVが感染した細胞内で保有する
転写の系でプロモーターとして有効に機能し得るもので
あれば特に限定されない。

【００４２】このようなプロモーターとしては、HVTま
たはMDVが保有している固有のプロモーターは無論のこ
と、HVTもしくはMDV以外のウイルス由来のプロモーター
やDNA、または真核生物もしくは原核生物由来のものや
合成プロモーターであっても上記要件を満たす限り、本
発明において使用することができる。

【００４３】具体的には、ヘルペスウイルスのチミジン
キナーゼプロモーター(Ross L. J.,Gen. Virol. 74:371
-377(1993))、HVTおよびMDVのgBタンパク質プロモータ
ー（前出）、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のIEプロ
モーター(Alting-Mees M. A., Nucleic Acid Res., 17 :
9494(1989)) 、SV40プロモーター(Gunning P., Proc.Na
tl. Acad. Sci., 84:4831-4835(1987))、ヒトおよび鶏
のβアクチンプロモーター（前出、およびKost A. T.,
Nucleic Acid Res., 11 :8287-8301(1983) ）、β−グロ
ビンプロモーター(Spitzner J. R., Nucleic Acid Re
s., 18:1-11(1990))、ラウス肉腫ウイルス（RSV）のLTR
プロモーター(Fiek A.ら、Nucleic Acid Res., 20:1785
(1992)）などが挙げられる。その他、HVTまたはMDVの構
造タンパク質や必須遺伝子のプロモーターを利用するこ
とができる。

【００４４】上述した非翻訳領域に、特定のプロモータ
ーの支配下において外来抗原遺伝子が発現するような形
でこれらを組込み、プラスミドを構築する。このように
して構築されたプラスミドは、HVTおよびMDVゲノムの特
定領域と組み換えを起こして組み換えウイルスを作るこ
とができる。

【００４５】（組み換えウイルスの作製）鳥類感染型ヘ
ルペス属ウイルスのゲノムの非翻訳領域内への上記のよ
うな外来遺伝子の挿入は、定法に従って行えばよい。HV
Tの場合を例にとって説明する。

【００４６】まず、上記のようにして得たHVT非翻訳領
域内に外来抗原遺伝子が挿入されたプラスミドを、HVT
感染細胞に、エレクトポレーションや、リン酸カルシウ
ム法、リポフェクチンを用いた方法や遺伝子銃などで導
入する。導入効率の高さから、エレクトロポレーション
やリポフェクチンを用いた方法を採用することが好まし
い。導入するプラスミドの量を、0.1〜1000μgの範囲と
すると、このようなプラスミドを導入した細胞内におけ
る、HVT-DNAとプラスミドの相同領域との間での組み換
えウイルスの発生率が高くなる。

【００４７】このようにして誕生した組み換えHVTのみ
を選択するためには、プラスミドの非翻訳領域に１また
は複数の外来遺伝子を組み込み、そのうちの少なくとも
１つを特定の基質を発色させる酵素遺伝子としておくと
よい。このような酵素遺伝子の例としては、例えば、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子が挙げられる。

【００４８】β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む組み換
えHVTは、ブルオガルなどの基質の添加により特定の色
を呈するため、非組み換えウイルスと明確に区別でき
る。したがって、このような遺伝子を組み込んだウイル
スに感染させた細胞を、特定の基質を添加した培地中で
培養することにより、発色したウイルス感染細胞を選択
することができる。この操作を繰り返すことによって、
組み換えウイルスを純化することができる。

【００４９】（生ワクチン）本発明の生ワクチンの調製
方法は特に限定されないが、たとえば次の方法によって
調製することができる。

【００５０】本発明の組み換えウイルスの感染細胞を当
該ウイルスが生育できる細胞（以下、宿主細胞という）
に感染させ、増殖させた後、細胞をスクレーパーまたは
トリプシンではがし、遠心分離によって感染細胞と上清
とに分離する。

【００５１】宿主細胞としては、トリ由来の細胞が好ま
しく、CEF（ニワトリ胚繊維芽細胞）、鶏腎細胞などを
好適に使用することができる。得られた感染細胞は、10
％のジメチルスルフォキシド(DMSO)を含む培養用培地に
懸濁し、液体窒素存在下で凍結保存する。ワクチンとし
て使用するときは100倍量のリン酸緩衝液にこの凍結保
存品を溶かして使用する。

【００５２】液体窒素下で上記感染細胞を保存するため
の安定剤やその他の成分は、ウイルス感染細胞が安定的
に生存でき、かつレシピエントにとって薬理学的に問題
のない成分であれば特に限定されない。本発明の生ワク
チンの家禽への投与方法は特に限定されないが、皮下に
注射により接種する方法が一般的に用いられており、現
行のHVTワクチンと同じである。接種量も従来ワクチン
と同様でよい。

【００５３】本ワクチンはヘルペス属ウイルス感染症用
ワクチンとしてだけでなく、非翻訳領域に挿入した抗原
遺伝子によって、それらの遺伝子が由来する病原体によ
って惹起される疾病のワクチンとして使用することがで
きる。本発明のワクチンは、有用な組み換えHVT多価ワ
クチンとして使用することができる。

【００５４】

【実施例】以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定される
ものではない。

【００５５】（実施例１）HVT-DNAの調製 HVT-DNAの調製は、基本的にLeeらの方法(J. of Virol.,
7:289-294 (1971))に準じて行った。

【００５６】先ず16cm培養皿で、ライボビッツ／マッコ
イ5A（１：１）混合培地中37℃で４日間培養したHVT(FC
-126株)感染細胞（５×10⁷個）をスクレーパーで剥が
し、低速(2,000rpm、５分)で遠心分離した。遠心上清を
すて、沈殿した感染細胞の10倍量にあたるリシスバッフ
ァー(0.15M NaCl、0.1M EDTA、１％SDS、100μg/mlのPr
oteinase K)を加えた。

【００５７】37℃で一昼夜保温した後、等量のフェノー
ルを加えてタンパク質を変成させ、この操作を２回繰り
返してHVT-DNAを抽出した。抽出したDNAはエタノール沈
殿によって回収した。

【００５８】（実施例２）pNZ45/46Sfiの構築 MDV-1型のgCh(Coussensら, J. Gen. Virol., 62:2373-2
379(1981)）遺伝子とそれに隣接するBamHI-Bフラグメン
トのEcoRI-BamHI断片（特開平6-292583号公報）の情報
をもとにして、ORFの間にSfiI部位を導入できるように
合成DNA（プライマー１〜４）を設計した。ここで、上
記のCoussensらの文献ではUL44および45が記載されてお
り、特開平6-292583号公報にはUL46が記載されている。

【００５９】このプライマーを用いて以下のようにPCR
を行い、pUC18にクローニングした。HVT-FC126株感染CE
Fより、実施例１の方法でDNAを取得し、このDNA100ngを
テンプレートとして用いた。また、プライマー１（配列
番号１）とプライマー２（配列番号２）からなるプライ
マーセットＡ（それぞれ50pmol）およびプライマー３
（配列番号３）とプライマー４（配列番号４）とからな
るプライマーセットＢ（それぞれ50pmol）とを用いて、
通常の方法でPCRを行った。30サイクルで反応を停止さ
せ、それぞれ約10μgの増幅産物を得た。

【００６０】これら２つのPCR産物を混合したもの（混
合比１：１、それぞれ100ngを混合したもの）をテンプ
レートとして、プライマー１とプライマー４とを用い
て、45℃１分、60℃２分、73℃３分を１サイクルとして
30サイクルPCRを行うことにより、UL45hおよびUL46hのO
RFの間にSfiI部位を導入した。

【００６１】得られた増幅産物をEcoRIとHindIIIで切断
し、その断片をpUC18のEcoRI-HindIII部位にT4リガーゼ
（宝酒造社製）４ユニットを用いて16℃で、30分間イン
キュベートして挿入し、pNZ45/46Sfiを構築した。

【００６２】（実施例３）pNZ44/45fiの構築実施例２と同様に、HVT-FC126株感染CEFより取得したDN
A（100ng）をテンプレートとして、プライマー１および
プライマー５（配列番号５）からなるプライマーセット
Ｃ（それぞれ50pmol）およびプライマー６（配列番号
６）とプライマー４からなるプライマーセットＤ（それ
ぞれ50pmol）とを用いて、実施例２と同様にしてPCRを
行った。それぞれ約10μgの増幅産物が得られた。

【００６３】これら２つのPCR産物を混合したもの（混
合比１：１、それぞれ100ngを混合したもの）をテンプ
レートとして、プライマー１（50pmol）とプライマー４
（50pmol）とを用いて実施例２と同様にしてPCRを行う
ことにより、UL44ｈ（MDV1のHSV-1に対応するgChまたは
gA）およびUL45hのORFの間にSfiI部位を導入した。この
産物をEcoRIとHindIIIとで切断し、得られた断片をpUC1
8のEcoRI-HindIII部位に実施例２と同様にして挿入し、
pNZ44/45Sfiを構築した。

【００６４】（実施例４）pGIMCSpolyASfiの構築（１）ドナープラスミドpGTPsの構築 pUC18のHindIII-PstI部位に、合成DNA(5'-AGCTGCCCCCCC
GGCAAGCTTGCA-3'（配列番号７))を挿入し、その後DNAポ
リメラーゼでこの部分を二本鎖とした。次いで、得られ
たプラスミドのSalI-KpnI部位に合成DNA(5'-TCGACATTTT
TATGTAC-3'(配列番号８))を挿入し、同様にDNAポリメラ
ーゼで二本鎖とした。さらに、ここで得られたプラスミ
ドのSacI-EcoRI部位に、２本の合成DNA(5'-AATTCGGCCGG
GGGGGCCAGCT-3'（配列番号９))および( 5'-GGCCCCCCCGG
CCG-3'（配列番号10))をアニールさせたものを挿入し、
最後にこのプラスミドのHindIII-SacI部位にプラスミド
pNZ1729R（Yanagida et al., J. Virol., 66:1402-1408
(1992)をHindIIIとSalIとで消化して得られた約140bpの
DNA断片を挿入して、プラスミドpGTPsを構築した。

【００６５】（２） pGIMCSpolyASfiの構築 pUC18をDraIで切断し、XhoIリンカー（宝酒造社製）を
実施例２と同様にして挿入し、XhoIサイトを導入したpU
C18Xを構築した。このpUC18XをHindIIIとPstIで切断
し、合成DNA１（配列番号11）と合成DNA２（配列番号1
2）とをアニールした断片を作製した。これをT4ライゲ
ース（宝酒造社製）を用いて上記のXhoIサイトに挿入
し、pU18XGを構築した。

【００６６】このpU18XGのKpnI-EcoRI部位に、ポリＡ付
加シグナルおよびSfiIサイトを導入するために、合成DN
A３（配列番号13）と合成DNA４（配列番号14）とをアニ
ールした断片をT4ライゲースによって挿入し、pUCpolyA
Sfiを構築した。

【００６７】このpUCpolyASfiのKpnI-BamHIサイトに、
実施例４（１）に記載のpGTPsのKpnI-BamHI断片36bpを
挿入し、pMCSpolyASfiを構築した。このpMCSpolyASfiの
HindIII-PstIサイトに合成DNA５（配列番号15）を実施
例２と同様にして挿入し、pGIMCSpolyASfiを構築した。

【００６８】（実施例５）pRSVおよびpCMVの構築 pBK-RSV（STRATAGENE社製）からNsiIとNheIとを用いて
二重消化して切り出したRSVプロモーターを含む約600bp
のNsiI-NheI断片を、実施例３で得られたpGIMCSpolyASf
iのPstI-XbaI部位に実施例２と同様にして導入し、pRSV
を構築した。

【００６９】同様に、pBK-CMV（STRATAGENE社製）のCMV
プロモーターを含むNsiI-NheI断片を切出し、実施例３
で得られたpGIMCSpolyASfiのPstI-XbaI部位に実施例２
と同様にして導入して、pCMVを構築した。

【００７０】（実施例６）pCMV-HN(BglI^-) の構築（１）pCMVのCMVプロモーターからのBglI部位の欠失 pCMVのCMVプロモーター内には、BglI部位が３箇所存在
するため、BglI部位を欠失させるために、以下のように
PCRを行って変異を導入した。変異は次の方法によって
行った。

【００７１】実施例５で構築したpCMV（100ng）をテン
プレートにして、プライマー７（配列番号12）とプライ
マー８（配列番号15）からなるプライマーセットＥ、M1
3P7プライマー（東洋紡績株式会社製）とプライマー９
（配列番号13）からなるプライマーセットＦとを用い
て、実施例２と同様の条件でPCRを行った。それぞれ約1
0μgの増幅産物を得た。

【００７２】上記２つのプライマーセットを用いて得た
増幅産物100ngを混合比１：１で混合し、その混合物を
テンプレートとして、今度は、M13P7プライマーとプラ
イマー８とを用いて実施例２と同様にPCRを行い、PCR産
物(1)を約10μg得た。

【００７３】同様にpCMV（100ng）をテンプレートにし
て、プライマー10（配列番号14）とプライマー11（配列
番号17）とのセットＦ、およびプライマー12（配列番号
16）とM13P8プライマー（東洋紡績株式会社）とで、実
施例２と同様にしてPCRを行った。

【００７４】同様に、これら２つのプライマーセットの
産物それぞれ100ngを１：１で混合した混合物をテンプ
レートとして、今度は、プライマー10とM13P8プライマ
ーのプライマーでPCRを行い、PCR産物(2)を約10μg得
た。さらに、PCR産物(1)と、PCR産物(2)とを混合し、M1
3P7プライマーとM13P8プライマーとを用いて実施例２と
同じようにPCRを行うことにより、BglI部位を欠失したC
MVプロモーターを得ることができた。

【００７５】（２）pUCCMVの構築また、pUC19のPstI-XbaI部位に、pBK-CMV（STRATAGENE
社）のCMVプロモーターを含む約600bpのNsiI-NheI断片
を実施例２のようにして挿入して、pUCCMVを構築した。

【００７６】（３）pNZ87の構築（３−１）7.5Kプロモーターにβ-ガラクトシダーゼ遺
伝子が連結されたプラスミド（pNZ76）の作製 10μgのpMA001（Shirakawaら、Gene, 28:127-(1984)）
をBamHIで消化後、フェノール：クロロホルム（１：
１）で抽出し、エタノール沈殿により、β-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（約3.3kbp ）を回収した。

【００７７】一方、0.3μgのpUC19をBamHIで消化後、フ
ェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によ
り回収し、上記で調製したβ-ガラクトシダーゼ遺伝子
とライゲーションし、ハイブリッドプラスミドpNZ66を
作製した。

【００７８】40μgのpUWP-1（ワクチニアウイルスWR株
の7.5KダルトンのペプチドをコードするDNAのプロモー
ターを含むプラスミド）をHpaIIとEcoRIとで消化し、1.
5％低融点アガロース電気泳動（70V、６時間）により、
7.5Kプロモーターを含む約0.26kbpの断片を分離し、フ
ェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノー
ル沈殿によりDNAを回収した。このDNA断片の接着末端を
DNAポリメラーゼにより平滑末端とした。

【００７９】0.3μgのpNZ66をHincIIで消化し、フェノ
ール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により断
片を回収し、上記の約0.26kbpの7.5Kプロモーター遺伝
子をライゲーションし、得られたハイブリッドプラスミ
ドをpNZ76と命名した。

【００８０】（３−２）ハイブリッドファージmp10-HN1
80からプロモーターおよびその支配下にNDVのHN遺伝子D
NAを連結したハイブリッドプラスミドpNZ87の作製 pNZ76をBamHIで消化し、0.8％アガロースゲルより、β-
ガラクトシダーゼ遺伝子を含まない約2.9kbp の断片を
回収した。

【００８１】一方、ハイブリッドファージmp10-HN180を
BglIIとBamHIとで消化後、0.8％アガロースゲルより約
1.8kbp のHN遺伝子のDNA断片を回収した。両者をリガー
ゼにより連結し、得られたプラスミドでコンピテントな
大腸菌TG-1株を形質転換し、常法に従ってプラスミドを
抽出し、HN遺伝子を含むハイブリッドプラスミドを検出
し、これをpNZ-87と命名した。

【００８２】（４）pNZ87CMVの構築次に、（３）で構築したpNZ87から、NDVのHN遺伝子を含
む約1.8kbpのBamHI-SacI断片を切り出した。この断片を
pUCCMVのBamHI-SacI部位に実施例２と同様にして挿入し
て、pNZ87CMVを構築した。このpNZ87CMVのCMVプロモー
ター領域にはBglI部位が含まれるので、CMVプロモータ
ー領域を含むHindIII-BamHI断片を（２）でPCRにより構
築したBglI部位を欠失したCMVプロモーターのHindIII-B
amHI断片と実施例２に記載したようにして入れ替えて、
pCMV-HN(BglI^-）を構築した。

【００８３】（実施例７）pRSV-Fの構築（１）pUCRSV-pAの構築 pUC19のPstI-XbaI部位に、pBK-RSV（STRATAGENE社）のR
SVプロモーターを含む約600bpのNsiI-NheI断片を実施例
２に記載したようにして挿入し、pUCRSVを構築した。

【００８４】これとは別に、pBK-RSV（STRATAGENE社、1
00ng）をテンプレートとして、プライマー13（配列番号
18）とプライマー14（配列番号19）のプライマー（それ
ぞれ50pmol）とを用いて、実施例２と同様にしてPCRを
行うことによって、pBK-RSVに含まれるSV40プロモータ
ーのpA付加シグナルを持つ断片を作製した。このPCRで
増幅した断片をSacIとEcoRIとで二重消化して、pUCRSV
のSacI-EcoRI部位に実施例２に記載のようにして挿入す
ることにより、pUCRSV-pAを構築した。

【００８５】（２）pNZ98の構築 NDVのＦ遺伝子およびHN遺伝子を含むプラスミドXLIII-1
0H(Virus Research, 7:241-255(1987))を使用した。４
μｇのプラスミドXLIII-10HをXbaIで消化し、生じた付
着末端をDNAポリメラーゼで平滑末端とし、フェノール
−クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿に
より回収した。回収したDNAをBamHIで消化し、0.8％ア
ガロースゲルで電気泳動して、約2.1kbp のＦ遺伝子を
完全に含む断片を回収した。

【００８６】一方、上記のようにして作製したpNZ76をB
amHIとSmaIで二重消化し、lacZ遺伝子部分を除いた約3.
0kbpのとBamHI-SmaI断片を回収した。回収したこの断片
と、約2.1kbp のＦ遺伝子を完全に含む断片とをリガー
ゼによって連結し、コンピテントな大腸菌TG1株を形質
転換した。

【００８７】50μg/mLのアンピシリンを含むＬＢ寒天培
地上で生育してきたコロニーから、上記と同様の操作に
よってプラスミドを調製した。制限酵素（BamHIとSma
I）でこのプラスミドを切断し、目的のクローンを確認
し、pNZ98'と命名した。このpNZ98'には、Ｆ遺伝子全長
の他、HN遺伝子の5'-末端約300bpが含まれる。この部分
を除去するために、pNZ98'をSmaIとKpnIとで二重消化
し、約4,150bpのSmaI-KpnI断片を0.8％アガロースゲル
電気泳動により回収した。また、pNZ98'をSmaIとAvaII
とで同様に二重消化し、約650bpのSmaI-AvaIIを1.5％ア
ガロースゲル電気泳動により回収した。

【００８８】これら２つの断片を混合し、DNAポリメラ
ーゼによって付着末端を平滑末端とした後にコンピテン
トな大腸菌TG1を形質転換し、形質転換体を得た。50μg
/mLのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上でこの形質転
換体を生育させ、形成されたコロニーより上述のように
してプラスミドを得た。このプラスミドをSmaIで再び消
化し、切断されたものを選択してプラスミドpNZ98を得
た。

【００８９】（３）上記（２）で構築したpNZ98から、N
DVのＦ遺伝子を含む約1.8kbpのBamHI-SacI断片を切り出
し、pUCRSV-pAのBamHI-SacI部位に実施例２に記載した
ようにして挿入し、pNZ98RSV3'を構築した。また、pNZ9
8をPstIで切断したのち、BamHIにて部分消化を行い、12
5bpの断片を回収した。

【００９０】この回収した断片とpNZ98RSV3'に含まれる
PstI-BamHI断片75bpと交換して、pNZ98RSVpAを構築し
た。実施例５で構築したpRSVのMluI-SacI切断2,892bp断
片と、pNZ98RSVpAのNDVのＦ遺伝子を含むMluI-SacI切断
2,262bp断片をライゲーションすることによって、pRSV-
Fを構築した。

【００９１】（実施例８）pCMV-VP2S(Okayama)の構築（１）pCMV/MCSの構築実施例６で構築したpCMV-HN(BglI^-) のBamHI-KpnI部位
に、pBluescript SK+のBamHI-KpnI断片62bpを実施例２
に記載したように挿入し、pCMV/MCSを構築した。

【００９２】（２）pCMV/MCSpAの構築これとは別に、実施例７と同様に、pBK-RSV（STRATAGEN
E社）をテンプレートとして、プライマー15（配列番号2
0）とプライマー16（配列番号21）とを用いて、実施例
２と同様にPCRを行い、SV40のpA付加シグナルを持つ断
片を作製した。このPCRで増幅した断片をApaIとKpnIと
で二重消化して、pCMV/MCSのApaI-KpnI部位に実施例２
に記載したように挿入することにより、pCMV/MCSpAを構
築した。

【００９３】（３）pCMV-VP2Sの構築さらに、IBDV野外分離株岡山株より、常法によりRNAを
抽出し、リバーストランスクリプターゼとcDNA合成キッ
ト（宝酒造製）とを用いてcDNAを作製した。このcDNAを
テンプレートとして、VP2に相当する領域を特開昭62-50
3006号公報に記載された遺伝子配列を元にして、プライ
マー17（配列番号22）とプライマー18（配列番号23）と
を設計した。

【００９４】これら２つのプライマーを用いて実施例２
と同様にPCRを行うことによってIBDVのVP2に相当する領
域を取得した。これとは別に、pCMV/MCSpAをHindIIIで
部分消化し、ついでSalIで部分消化して3,687塩基対の
断片を得た。上記のPCRによって取得したIBDVの断片をH
indIIIとSalIとで二重消化し、これを3,687塩基対の断
片に実施例２で記載したようにして挿入し、pCMV-VP2S
(Okayama)を構築した。

【００９５】（実施例９）pUC18Xlacの構築 lacZのBamHI-SmaI断片（Yanagidaら、J. Virol., 66:14
02-1408(1992) ）を、実施例４で構築したpU18XGのBamH
I-SmaI部位に実施例２に記載したようにして挿入し、pU
C18Xlacを構築した。

【００９６】（実施例10）pNZ45/46RSVlacおよびpNZ44/
45RSVlacの構築（１）pNZ45/46RSVlacの構築実施例２で構築したpNZ45/46SfiのSfiI部位に、実施例
５で構築したRSVプロモーターを含むpRSVのBglI断片を
実施例２に記載したように挿入して、pNZ45/46RSVを構
築した。このpNZ45/46RSVのSfiI部位に、実施例９で構
築したlacZを含むpUC18XlacのBglI断片を実施例２に記
載したように挿入して、pNZ45/46RSVlacを構築した。

【００９７】（２）pNZ44/45RSVlacの構築同様に、実施例３で構築したpNZ44/45SfiのSfiI部位
に、実施例５で構築したRSVプロモーターを含むpRSVのB
glI断片を挿入して、pNZ45/46RSVを構築した。このpNZ4
4/45RSVのSfiI部位に、実施例９で構築したlacZを含むp
UC18XlacのBglI断片を実施例２に記載したように挿入し
て、pNZ44/45RSVlacを構築した。

【００９８】（実施例11）pNZ45/46VP2SおよびpNZ44/45
VP2Sの構築（１）pNZ45/46VP2S 実施例10で構築したpNZ45/46RSVlacのSfiI部位に、実施
例８で構築したIBDVのVP2遺伝子を含むpCMV-VP2S(Okaya
ma)のBglI断片を実施例２に記載したように挿入して、p
NZ45/46VP2Sを構築した。

【００９９】（２）pNZ44/45VP2S 同様に、実施例10で構築したpNZ44/45RSVlacのSfiI部位
に、実施例８で構築したIBDVのVP2遺伝子を含むpCMV-VP
2S(Okayama)のBglI断片を実施例２に記載したように挿
入して、pNZ44/45VP2Sを構築した。

【０１００】（実施例12）pNZ45/46HNFおよびpNZ44/45H
NFの構築（１）pNZ45/46HNFの構築実施例10で構築したpNZ45/46RSVlacのSfiI部位に、実施
例６で構築したNDVのHN遺伝子を含むpCMV-HN(BglI^-）の
BglI断片を実施例２に記載したようにして挿入し、pNZ4
5/46HNを構築した。さらにpNZ45/46 HNのSfiI部位に、
実施例７で構築したNDVのＦ遺伝子を含むpRSV-FのBglI
断片を挿入して、pNZ45/46HNFを構築した。

【０１０１】（２）pNZ44/45HNFの構築同様に、実施例10で構築したpNZ44/45RSVlacのSfiI部位
に、実施例６で構築したNDVのHN遺伝子を含むpCMV-HN(B
glI^-）のBglI断片を挿入して、pNZ44/45HNを構築した。
さらにpNZ44/45HNのSfiI部位に、実施例７で構築したND
VのＦ遺伝子を含むpRSV-FのBglI断片を挿入して、pNZ44
/45HNFを構築した。

【０１０２】（実施例13）pNZ45/46HNF-VP2SおよびpNZ4
4/45VP2S-HNFの構築（１）pNZ45/46HNF-VP2の構築実施例12で構築したpNZ45/46HNFのSfiI部位に、実施例
８で構築したIBDVのVP2遺伝子を含むpCMV-VP2S(Okayam
a)のBglI断片を挿入して、pNZ45/46HNF-VP2Sを構築し
た。

【０１０３】（２）pNZ44/45VP2S-HNFの構築実施例11で構築したpNZ44/45VP2SのSfiI部位に、実施例
６で構築したNDVのHN遺伝子を含むpCMV-HN(BglI^-）のBg
lI断片を挿入して、pNZ44/45VP2S-HNを構築した。さら
にpNZ44/45VP2S-HNのSfiI部位に、実施例７で構築したN
DVのＦ遺伝子を含むpRSV-FのBglI断片を挿入して、pNZ4
4/45VP2S-HNFを構築した。

【０１０４】（実施例14）組み換えHVTの純化トリプシンではがした単層のCEFを、SalineG(0.14M塩化
ナトリウム、0.5mM塩化カリウム、1.1mMリン酸一水素二
ナトリウム、1.5mMリン酸二水素一ナトリウム、0.5mM塩
化マグネシウム・６水和物、0.011%グルコース)に懸濁
し、細胞懸濁液を調製した。このた細胞懸濁液(2×10⁷
個)に、実施例11、12および13で作製した組み換え用プ
ラスミドpNZ44/45VP2S、pNZ44/45HNF、pNZ45/46 VP2S、
pNZ45/ 46HNF、pNZ44/45VP2S-HNF pNZ45/46HNF-VP2Sを
それぞれ40μｇと、実施例１で調製したHVTのDNAを100
μｇずつ混合した。

【０１０５】この溶液を室温にて10分間放置した後、室
温にてジーンパルサー（Bio-Rad 社製）を用いて、3.0K
Vcm^-1、0.4 msec、25℃の条件下でエレクトロポレーシ
ョンした。プラスミド及びHVTのDNAを導入した細胞を、
その後9cm径の培養用ディッシュ（Falcon社製）にま
き、37℃にてHVT特有のプラークが形成されるまで約4日
〜５日間培養した。

【０１０６】プラークが形成された細胞を１％トリプシ
ンではがし、同様にトリプシンではがしたＣＥＦ（２×
10⁷個)の細胞と混合し、培養用96ウェル平底マルチプレ
ート（Falcon社製）10枚に限界希釈した。これらのプレ
ートを、37℃で各ウェルにHVT特有のプラークが形成さ
れるまで、さらに、約４日〜５日間培養した。ついで、
各プレートの半数のウェルにβガラクトシダーゼの発色
基質であるブルオガル（Bluogal: Gibco社製）100μg/m
l及び0.8%寒天を含むCEF培養用培地を100 μl/wellずつ
加え、37℃において約４時間インキュベートした。

【０１０７】その後、各ウェルの青プラーク数を数え、
最も青プラーク数の多かったプレートを選択し、任意の
20ウェルに１％トリプシンを加えて組み換えHVT感染細
胞を含むCEFをそれぞれ回収し、1×10⁶個の細胞と混合
し、それぞれに培養用96ウェル平底マルチプレートに播
いた。培養用96ウェル平底マルチプレートから培養用96
ウェル平底マルチプレートに一回継代する行程を一回の
スクリーニングとしては、全ウェルが青プラークになる
まで繰り返し、ブルオガルを加えたときに全プラークが
青変するまで繰り返し、ウイルスを純化した。通常は、
ほぼ５〜10回のスクリーニングで純化できる。

【０１０８】9cm径の培養用ディッシュ上で感染細胞を
増殖させたのち、16cm径の培養用ディッシュで感染細胞
をさらに増殖させ、組み換えHVTの力価を測定したとこ
ろ、組み換えHVTの力価は１〜６×10⁵TCID₅₀であった。
各組み換え用プラスミドから作製された組み換えHVTを
以下の表１ように呼ぶこととした。

【０１０９】

【表１】

【０１１０】（実施例15）サザンハイブリダイゼーシ
ョン実施例14で調製した組み換えウイルスDNA (HF003, HF00
4)を実施例１のHVT-DNA抽出方法と同じ方法で抽出し
た。得られた組み換えウイルスDNA (HF003, HF004)、そ
の組み換え用プラスミド(pNZ45/46VP2S、pNZ44/45HN
F）、及び親株ウイルスDNAを、BamHIで消化し、これら
を0.8%アガロース電気泳動に供し、サザンブロットハイ
ブリダイゼーションとオートラジオグラフィーで分析し
た。

【０１１１】使用したプローブは、pNZ45/46VP2Sまたは
pNZ44/45HNFをEcoRIで消化した断片をマルチプライムラ
ベリングシステム（アマシャム社製）で、³²Ｐ標識した
プローブDNAである。その結果、プローブDNAと相同な配
列が組み換えHVTにも存在することが判明した。

【０１１２】（実施例16）組み換えHVT感染細胞での
外来抗原の発現確認（蛍光抗体法）組織培養用チャンバースライド上で、上記組み換えHVT
感染細胞をCEFとともに37℃でプラークが出現するまで
培養し、冷アセトンで固定した。

【０１１３】発現した抗原を検出するために、一次抗体
抗体として以下のものを用いた。β−ガラクトシダーゼ
の検出には、抗βガラクトシダーゼウサギ抗血清（ポリ
クローナル抗体:Organon Teknica N. V.社製）、NDV-HN
タンパク質及びFタンパク質の検出には、NDVワクチン免
疫鶏血清を、それぞれ500倍にPBSで希釈して用いた。IB
DV-VP2タンパク質の検出には、抗VP-2モノクローナル抗
体GK-5（YamaguchiT., et al., Avian Dis., 40:501-50
9(1996)）をPBSで100倍に希釈して用いた。

【０１１４】標識抗体としては、FITC標識抗ニワトリIg
G抗体、 FITC標識抗マウスIgG抗体、FITC標識抗ウサギI
gG抗体（いずれもハーランセララボ社製）を、それぞれ
使用時にPBSで100倍に希釈した。上記の抗体を含む各溶
液を冷アセトンで固定したチャンバースライド上の細胞
と接触させ、室温100%湿度で約一時間放置し、PBSで三
回洗浄した。この後、FITC結合抗鶏イムノグロブリンま
たは抗マウスIgGの希釈液とともに、約一時間、室温に
て反応させた。その後、PBSで三回洗浄し、蛍光励起波
長光（493.5nm）下で顕微鏡観察して反応性を調べた。

【０１１５】対照ウイルスとしてHVT親株FC-126を感染
させ、この親株ウイルスを感染させた細胞を対照細胞と
して使用した。結果を表２に示した。

【０１１６】

【表２】

【０１１７】NDV抗原遺伝子を組み込んだ組み換えHVTは
抗NDVモノクローナル抗体と反応し、IBDV-VP2遺伝子を
組み込んだ組み換えHVTは抗VP2モノクローナル抗体と反
応した。この結果から、各組み換えHVTは、挿入した遺
伝子がコードするタンパク質を発現していることが確認
された。

【０１１８】（実施例17）鶏ワクチンのNDVに対する
効果実験(SPF鶏) 実施例14で得られた組み換えHVTのワクチンの効果を判
定するためにワクチン効果実験を実施した。各群10羽の
試験用SPF鶏（Line M、日本生物科学研究所）に、表２
に示す組み換えHVTを接種した。陽性対照群にはNDVの市
販の生ワクチンを接種し、陰性対照群は未接種とした。

【０１１９】試験用SPF鶏が孵化したときに、各組み換
えHVTを、鶏の背部皮下に10⁴TCID₅₀となるように26Gの
注射針をつかって接種した。陽性対照群に使用した市販
のNDV生ワクチン（日本生物科学研究所）は、４日齢の
雛に用法通り点眼接種した。接種４週後に、各群の鶏に
強毒NDVウイルス(Sato株)を10⁴PFUとなるように右大腿
部にチャレンジした。チャレンジ後約２週間までの鶏の
生死及びNDVの発症の有無を観察し、生存率を指標とし
て効果を判定した。

【０１２０】NDVウイルスをチャレンジする前に各鶏か
ら採血を行い、各鶏の血清中のNDVに対する赤血球凝集
抑制抗体の検出を行った。測定は市販されているNDV赤
血球凝集素（日本生物科学研究所）の使用説明書に従っ
た。結果は表３に示した。

【０１２１】

【表３】

【０１２２】組み換えHVTを接種した鶏では、NDVのチャ
レンジに対して100%感染防御がなされた。HI抗体価はFC
126接種鶏群と非接種鶏群で２倍以下という低い値であ
ったのに対して、他の群では全鶏128倍から1024倍であ
った。以上の結果から、各組み換えHVTによってNDVに対
する感染防御能が接種鶏に付与されていることが明らか
となった。

【０１２３】（実施例18）鶏ワクチンのIBDVに対する
効果実験（SPF鶏）実施例14で得られた組み換えHVTのワクチン効果を判定
するために、ワクチン効果実験を実施した。各群10羽の
試験用SPF鶏（Line M、日本生物科学研究所）に、HF00
3、および親株ウイルスであるFPVをそれぞれ接種した。
陽性対照群にはIBDVの市販のワクチンを接種し、陰性対
照群は非接種とした。

【０１２４】試験用SPF鶏が孵化したときに、各組み換
えHVTを、鶏の背部皮下に10⁴TCID₅₀となるように26Gの
注射針をつかって接種した。陽性対照群に使用した市販
のNDV生ワクチン（北里研究所）は、16日齢の雛に用法
通り点眼接種した。

【０１２５】生ワクチン接種17日後に、各群の鶏に強毒
IBDVウイルス(Okayama株)を1.5x10^3.8EID₅₀となるよう
に経口でチャレンジした。チャレンジ後約３日での鶏の
生死を観察した。その後生存した鶏を屠殺し、IBDVの発
症の有無をファブリキウス嚢の病変形成状態を指標とし
て効果を判定した。ファブリキウス嚢の病変形成状態
は、出血(A)、嚢内チーズ様浸出物形成(B)、黄色病変
(C)、ゼリー様浸出物形成(D)の４点で判定した。各病変
スコアは、病変を形成した鶏羽数で表わし、スコア合計
で接種ワクチンの効果を判定した。結果を表４に示し
た。

【０１２６】

【表４】

【０１２７】組み換えHVTを接種した鶏では、IBDVのチ
ャレンジに対して市販のワクチンとほぼ同等の感染防御
能を示した。この結果から、組み換えHVTの接種によっ
てIBDVに対する感染防御能が付与されていることが示さ
れた。

【０１２８】（実施例19）鶏ワクチン効果実験（移行
抗体保有鶏）実施例14で得られた組み換えHVTが移行抗体を保有して
いる鶏に対してもワクチン効果を発揮するかどうかにつ
いて、市販鶏に接種して調べた。使用した鶏は、市販さ
れている白色レグホン(Dekalb鶏、神奈川養鶏連合会)か
ら生まれた初生雛である。HF004とHF006を実施例17と同
様に背部皮下接種した。このとき同じロットの雛20羽か
ら、心臓採血によって血液を採取し、血清を得た。移行
抗体が完全になくなる８週後に実施例17と同様にNDVに
よるチャレンジを行い、生存率の有無で感染防御能を評
価した。結果を表５に示した。

【０１２９】

【表５】

【０１３０】なお、初生齢のHI抗体価は97であった（20
羽の平均値）。この結果から明らかなように、組み換え
HVTを接種した群ではNDVのチャレンジに対してほぼ完璧
なワクチン効果が示された。また、チャレンジ時のHI抗
体価もFC126接種群（＜２）や非接種群（＜２）と比較
して明らかに高い値を示した（16および15.5）。

【０１３１】また、HF004とHF006の間ではHI抗体価に有
意な差もなく、挿入抗原の多少に関わらず、鶏に対して
有意な免疫効果を与えることが示された。これらの結果
から明らかなように、本明細書で示した組み換えHVT
は、すべて挿入抗原遺伝子が由来する疾病の効果的なワ
クチンになった。そればかりでなく、移行抗体の影響を
受けない。

【０１３２】また、挿入抗原の多少に関わらず効果を発
揮したことから、多価組み換えHVTワクチンとしての有
用性が示された。

【０１３３】

【発明の効果】本発明によれば、七面鳥ヘルペスウイル
スゲノム中の非翻訳領域である遺伝子領域に外来遺伝子
が挿入された組み換え七面鳥ヘルペスウイルスおよび当
該組み換え七面鳥ヘルペスウイルスを含有するワクチン
が提供される。

【０１３４】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> NIPPON ZEON CO., LTD. <120> Recombinant of Aves infectious Herpesviridae
virus, andrecombinant vaccine using thereof <130> P98-0561 <150> JP 97/271445 <151> 1997-10-03 <160> 23 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 1 ccccgaattc atggaagaaa tttcc 25 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 2 cgcgggcctt attggccaaa acacacctct aacggttact 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 3 gcgcggccaa taaggccaaa acacagtaac cgttagaggt 40 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 4 ccccaagctt tcaagtgata ctgcgtga 28 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 5 gcgcggccaa taaggccaac atcgggacgt acatcat 37 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 6 gcgcggcctt attggcctta aataccgcgt ttggagtaaa 40 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 7 agctgccccc ccggcaagct tgca 24 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 8 tcgacatttt tatgtac 17 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 9 aattcggccg ggggggccag ct 22 <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 10 ggcccccccg gccg 14 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 11 agcttgccaa taaggctgca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 12 atggcccgcc ggctgaccgc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 13 gcggtcagcc ggcgggccat 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 14 ggtaaactgc agacttggca gt 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 15 actgccaagt ctgcagttta cc 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 16 atggcccgcc atgcattatg cc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 17 ggcataatgc atggcgggcc at 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 18 cgggagctct aattgtttgt g 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 19 cgggaattcg cttacaattt 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 20 cgggggccct aattgtttgt g 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 21 cggggtaccg cttacaattt 20 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 22 gcaagcttgc gatgacgaac ctgc 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic
DNA <400> 23 gcgtcgactc acctccttag ggccc 25

【０１３５】

【配列表フリーテキスト】配列番号１〜２３：合成ＤＮ
Ａ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 33/569 33/569 Ｊ // Ｃ０７Ｋ 14/03 Ｃ０７Ｋ 14/03 14/055 14/055 (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲノム中の非翻訳領域である遺伝子領域
に外来遺伝子が挿入された、鳥類感染型組み換えヘルペ
ス属ウイルス。
【請求項２】前記ウイルスが、七面鳥ヘルペスウイル
スまたはマレック病ウイルスである、請求項１に記載の
組み換えウイルス。
【請求項３】ヒト単純ヘルペスウイルス各オープン・
リーディング・フレームに相当する七面鳥ヘルペスウイ
ルスまたはマレック病ウイルスのオープン・リーディン
グ・フレームの間に存在する非翻訳領域中にあり、か
つ、(1) UL44とUL45の間、(2) UL45とUL46の間、(3) UL
41とUL42の間、(4) UL40とUL41の間、(5) gB遺伝子の下
流領域、(6) UL53とUL54の間、および(7) UL36とUL37の
間からなる群から選ばれる少なくとも1箇所の挿入部位
に、少なくとも１つの外来遺伝子が挿入された請求項１
〜３のいずれかに記載の組み換えウイルス。
【請求項４】前記外来遺伝子が、鳥類の感染症の病原
体に由来する遺伝子である請求項１〜３のいずれかに記
載の組み換えウイルス。
【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載された組
み換えウイルスを有効成分とする鶏用ワクチン。