JPH11206378A

JPH11206378A - 組換えヒトマンナン結合タンパク質およびその製造方法

Info

Publication number: JPH11206378A
Application number: JP10011864A
Authority: JP
Inventors: Nobutaka Wakamiya; 伸隆若宮
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1998-01-23
Publication date: 1999-08-03
Also published as: CA2318851C; US7572890B2; CA2318851A1; WO1999037676A1; US20060040362A1

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒトマンナン結合タンパク質(hMBP)と同質の
生理活性を有する組換えヒトマンナン結合タンパク質(r
hMBP)を、均質に生産する生産系を提供する。【解決手段】天然型ヒトマンナン結合タンパク質(nat
ive hMBP)のcDNAの66bp〜812bpの部分を切り出し、発現
ベクターpNOW1に挿入して構築した発現ベクターpNOW1-h
MBPを、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損(dhfr^-)のチャイニー
ズハムスター卵巣(CHO)細胞に導入して形質転換体を得
る。この形質転換体をネオマイシンを含んだ培地で培
養したネオマイシン耐性細胞を、メトトレキセート(MT
X)を含んだ培地にて培養して、MTX耐性の細胞を取得す
る。このMTX耐性細胞からrhMBPを回収する。このrh
MBPは、ゲル濾過クロマトグラフィーで処理した際の280
nmでの吸光度が、1,000〜1,300kDaの分子量にて特異的
なピークを示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗微生物活性、特
に、抗インフルエンザウイルス活性を有する新規の組換
えヒトマンナン結合タンパク質(以下、単に「rhMBP」と
称する)とその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】マンナン結合タンパク質(以下、単に「M
BP」と称する；マンノース結合タンパク質、マンノース
結合レクチン(MBL)あるいはマンナン結合レクチン(MBL)
とも言う）、コングルチニン、サーファクタントタンパ
ク質Ａ(SP-A)、およびサーファクタントタンパク質Ｄ(S
P-D)などは、いずれもコレクチンと称するグループに属
する物質である。

【０００３】コレクチンは、図１を参照すれば、(1)カ
ルシウムイオン(Ca²⁺)要求性の糖認識領域(CRD)、(2)ネ
ック領域、(3)コラーゲン様領域、および(4)システイン
を含むＮ末端領域の４種の特徴的な領域からなる構造を
構成単位としており[Malhortra et al., ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・イムノロジー(Eur. J . Immuno
l.,)22巻、1437-1445頁、1992年〕、この構成単位３つ
（３単位）が各々のコラーゲン領域で寄り合ってトリプ
ルヘリックスを形成し、そしてサブユニットを構成する
のである。また、このサブユニットがさらに３量体、
４量体あるいは６量体などのオリゴマー構造を形成する
のである。コレクチンの内、MBPは、マンノースやN-
アセチルグルコサミンに特異的に結合し、その結合に際
してカルシウム（イオン）を要求する物質であり、例え
ば、ヒト血清由来のMBPでは、分子量約32,000のサブユ
ニットを構成単位としたホモポリマーの形態となってい
る〔藤田禎三、「補体活性化とレクチン経路」、臨床免
疫、第29巻、第３号、405-410頁、1997年〕。

【０００４】脊椎動物では、細胞を介する免疫応答およ
び特異的抗体反応によるメカニズムが、病原菌の侵入に
対する最大の生体防御システムと考えられている。し
かしながら、最近になって、これらのレクチンによる非
特異的な免疫応答が、母親の移行抗体や特異的防御シス
テムが充分に発達していない小児における、種々の微生
物やウイルスに対する中和作用や排除に重要な役割を果
たしていると考えられている〔Super et al., ランセッ
ト(Lancet)、II、1236-1239頁、1989年；若宮伸隆、鈴
木定彦、「レクチンによるウイルス感染防御」、臨床免
疫、第29巻、第４号、508-513頁、1997年]。また、宿
主の生体防御におけるこれらレクチンの役割について、
例えば、MBPの遺伝子上の変異に起因したMBPの血中濃度
の低下によって、ウイルス感染を受けやすくなるという
研究結果が報告されている〔Sumiyaet al., ランセット
(Lancet)、337巻、1569-1570頁、1991年〕。本発明者
は、以前に、コングルチニンやMBPが、H1およびH3タイ
プのインフルエンザＡウイルスの感染や赤血球凝集抑制
活性を阻害することを報告している〔Wakamiya etal.,
グリココンジュゲイト・ジャーナル (Glycoconjugate
J.) 、８巻、 235頁、1991年；Wakamiya et al., バイ
オケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケイションズ(Biochem. Bioph ys. Res. Comm.)、
187巻、1270-1278頁、1992年〕。

【０００５】殊に、ヒトMBP(以下、単に「hMBP」と称す
る）については、近年、その構造的および生理作用（活
性）的側面から各方面で熱心に研究が行われている。
例えば、 Ezekowitz(ら)は、hMBPの構造について、その
立体構造と遺伝子レベルでの解析結果を報告している
［Epstein et al., "The collectins in innate immuni
ty", Current Opinion in Immunology, ８巻、29-35
頁、1996年；特表平２−504581号］。

【０００６】一方で、hMBPの生物学的作用として、これ
までに、(i)抗微生物活性、(ii)オプソニン作用、(iii)
補体活性化などの基礎免疫を担うものと考えられている
［上村和秀、他、「生体防御に関するカルシウム依存性
動物レクチンの構造と機能の相関」、実験医学、第13
巻、第18号、1995年]。臨床現場での応用について、
血中MBPの欠損症についての解析が進んだことで、該欠
損症の原因がコラーゲン様構造内の遺伝子の変異がアミ
ノ酸変異を招き、その結果、MBP自体の安定性と血中濃
度の低下に至ることも報告されている［Sumiya et al.,
"Mannose-binding protein, genetic variants and th
e risk of infection", Q J Med., No.89, pp.723-726
(1996)；Thomas et al., "Mutation of gene for manno
se-binding protein associated with chronic hepatit
is B viral infection", The Lancet, Vol.348, pp.141
7-1419 (1996)；Ezekowitz, "Mannose-binding protein
and susceptibility to chronic hepatitis B infecti
on", The Lancet, Vol. 348, pp.1396-1397 (1996)]。
また、血中MBP濃度そのものが、Ｂ型肝炎ウイルスやH
IV感染時の病態にも関係があるとの報告が出されてい
る。

【０００７】その反面で、MBPが慢性関節リュウマチ［M
alhorta et al., "Glycosylationchanges of IgG assoc
iated with rheumatoid arthritis can activatecomple
ment via the mannnose-binding protein", Nature Med
icine, Vol.1,pp.237-243 (1995)］やIgA腎症［松田充
浩ら、「IgA腎症の発症、進展へのMannan Binding Prot
einの関与」、日本腎臓学会誌、vol.39、No.3、235頁、
1997年］の疾患において、イムノグロブリンの糖鎖異常
によって、MBPを介したレクチン経路が関与している可
能性も示唆されている。

【０００８】さらに、最近の研究によれば、hMBPがHIV
に対する感受性のみならず、AIDS(後天性免疫不全症候
群）発症までの潜伏期間に関連する旨の報告もあり、hM
BPがAIDS患者の延命効果に寄与する可能性も出てきてい
る [Garred, et al.,"Susceptibility to HIV infectio
n and progression of AIDS in relation to variant a
lleles of mannose-binding lectin", The Lancet, Vo
l. 349, pp.236-240 (1997)]。

【０００９】ところが、hMBPは、かような生理活性医薬
物質（成分）としての有用性が期待されている物質であ
りながら、ヒトやウサギなどの生体の血清にその採取源
を依存しているために、その安定供給が困難であること
に加え、自然界から採取できる量はごくわずかであるの
が実情であった。また、遺伝子組換え手法によっても
人為的に大量に得る体制は未だ確立していない。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は上述した従来技
術での問題点に鑑み、均質なhMBPの大量供給を実現すべ
く鋭意研究した末に完成されたものである。

【００１１】すなわち、本願発明によって得られるhMBP
(rhMBP)とは；ゲル濾過クロマトグラフィーで処理した
際の280nmでの吸光度が、1,000〜1,300kDa、好ましくは
1,150kDaの分子量にて特異的なピークを示す性状を備え
たrhMBP;ゲル濾過クロマトグラフィーで処理した際の28
0nmでの吸光度が、200〜400kDa、好ましくは300kDaの分
子量にて特異的なピークを示す性状を備えたrhMBP;およ
びゲル濾過クロマトグラフィーで処理した際の280nmで
の吸光度が、1,000〜1,300kDaおよび200〜400kDaの分子
量ピークを示す性状を備えたrhMBPにある。

【００１２】また、本願発明のrhMBPは、以下の工程、
すなわち、(1)天然型ヒトマンナン結合タンパク質(以
下、単に「native hMBP」と称する)のcDNAの66bp〜812b
pに対応するcDNA部分をプラスミドpNOW1に挿入して、発
現ベクターpNOW1-hMBPを構築し、(2)この発現ベクターp
NOW1-hMBPを、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損(dhfr^-)のチャ
イニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に導入して形質転換
体を得、(3)得られた形質転換体をネオマイシンを含ん
だ培養培地にて培養して、ネオマイシン耐性細胞を取得
し、(4)選択したネオマイシン耐性細胞をメトトレキセ
ート(MTX)を含んだ培養培地にて培養して、MTX耐性の細
胞を取得し、および(5)選択したMTX耐性細胞からrhMBP
を回収する、工程を含んだ製造方法によって製造された
rhMBPである。

【００１３】

【発明の実施の形態】native hMBPを構成するアミノ酸
は、すでにHermanらによって解析および報告されており
[Sastry et al., "The human mannose-binding protein
gene. Exonstructure reveals its evolutionary rela
tionship to a human pulmonary surfactant gene and
localization to chromosome 10", J. Exp. Med. 170
(4),1175-1189 (1989)]、そのcDNA由来の塩基配列を配
列番号：１に示した。

【００１４】そして、本発明者は、その塩基配列の中で
も、rhMBPのタンパク発現に関与する部分、すなわち、n
ative hMBPを構成する塩基配列の66bp〜812bpのcDNA部
分（配列番号：２）を切り出し、これを発現系に組み込
むことで、rhMBPの生産系の確立を意図したのである。

【００１５】

【実施例】以下に本願発明のrhMBPに関して実施例に沿
って詳細に説明するが、これら実施例の開示によって、
本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論であ
る。

【００１６】すなわち、プラスミドpNOW1の構築（実施
例１）、発現ベクターpNOW1-hMBPの構築（実施例２）、
ネオマイシン(G418)耐性細胞およびMTX耐性細胞からの
発現クローンの選択（実施例３）、rhMBPのPAGE分析お
よびゲル濾過クロマトグラフィーによる構造的検討（実
施例４）、rhMBPとnative hMBPの糖結合活性の検討（実
施例５）、赤血球凝集抑制(HI)試験（実施例６）、中和
活性試験（実施例７）、ウイルス増殖〔感染拡大〕阻止
試験（実施例８）、およびrhMBPの補体活性試験（実施
例９）、について以下に説明する。

【００１７】実施例１：プラスミドp NOW1の構築 (1)バックボーンベクターpBBVの調製（図２）プラスミドpUC18（宝酒造株式会社）に、新たに組み込
むマルチクローニングサイト用のリンカー(BBVリンカ
ー）として、配列番号：３に示す塩基配列を有するセン
スDNAと、配列番号：４に示す塩基配列を有するアンチ
センスDNAを合成した。このリンカーの制限酵素切断
部位の配列は、3'-Ndel-SacII-ClaI-EcoRV-SplI-EcoRI-
ApaI-5'とし、5'末端は平滑末端(Blunt End)とした。
プラスミドpUC18の１ng(0.1μl)を制限酵素NdeIおよびP
v uIIで処理することにより、lacZをコードする領域を完
全に除去した。この溶液に対して、BBVリンカーのセ
ンスDNAとアンチセンスDNAをそれぞれ100pmole加え、次
いで、DNAライゲーションキットVer.2（宝酒造株式会
社）のＩ液の2.0μlを加え、16℃で、30分間反応させ
た。

【００１８】反応液に大腸菌コンピテントセルXL1-BLUE
(STRATAGENE社）0.1mlを加え、氷上で30分間反応させた
後、42℃で、60秒間熱ショックを与えた。２分間氷上
に置いた後、SOC培地（東洋紡績株式会社）を0.9ml加
え、37℃で、１時間シェーカーで振とう培養した。 5,
000rpmで１分間遠心分離して、上清を廃棄した。遠心
管内に残った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸濁
し、１：10の割合で２枚の100μg/mlのアンピシリンを
含むアンピシリンプレートに播いた。 37℃で、１晩培
養し、生じたコロニーから得られたプラスミドの内、BB
VリンカーのDNAが挿入されているものを選択し、それら
をベクターpBBVとした。

【００１９】(2)プラスミドpCV3の調製（図３）プラスミドpUC119（宝酒造株式会社）のマルチクローニ
ングサイトを除去して、新たに組み込むマルチクローニ
ングサイト用のリンカー(CV3リンカー）として、配列番
号：５に示す塩基配列を有するセンスDNAと、配列番
号：６に示す塩基配列を有するアンチセンスDNAを合成
した。このリンカーの制限酵素切断部位の配列は、5'
-HindIII-SacII-P stI-BamHI-ClaI-3'とし、また、3'末
端はBlunt Endとした。プラスミドpUC119の１ng(0.1
μl)を、制限酵素HindIIIおよびEcoRIで処理した。得
られたプラスミドを含む溶液に対して、CV3リンカーの
センスDNAとアンチセンスDNAをそれぞれ100pmole加え、
次いで、DNAライゲーションキットVer.2（宝酒造株式会
社）のＩ液の2.0μlを加え、16℃で、30分間反応させ
た。

【００２０】反応液を大腸菌コンピテントセルXL1-BLUE
(STRATAGENE社）0.1mlに加え、氷上で30分間反応させた
後、42℃で、60秒間熱ショックを与えた。２分間氷上
に置いた後、SOC培地（東洋紡績株式会社）を0.9ml加
え、37℃で、１時間シェーカーで振とう培養した。 5,
000rpmで１分間遠心分離して、上清を廃棄した。遠心
管内に残った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸濁
し、１：10の割合で２枚の100μg/mlのアンピシリンを
含むアンピシリンプレートに播いた。 37℃で、１晩培
養し、生じたコロニーから得られたプラスミドの内、CV
3リンカーのDNAが挿入されているものを選択し、それら
を(SV40関連遺伝子クローニング用の）プラスミドpCV3
とした。

【００２１】(3)プラスミドpSVP(D)S-1の調製（図４） (3-1)プラスミドpSVP1aの調製 pBR322上にBamHIでライゲーションしたSV40ウイルスの
全DNAを有するプラスミドpSV40/BR(広島大学から入手)
から、SV40 Oriを含むSV40初期プロモーターを切り出す
ために、配列番号：７に示す塩基配列を有する5'センス
プライマー(PS1)と、配列番号：８に示す塩基配列を有
する3'アンチセンスプライマー(PS2)を合成した。 PS1
プライマーの5'側末端には、元の配列のPvuIIサイトの
代わりに、SacII-EcoRIの制限酵素サイトを付与した。
また、PS2プライマーの3'側末端には、元のHindIIIサ
イトの代わりにPstIサイトを付与した。 pSV40/BRゲノ
ム(pSV40/BR由来、広島大学から入手）１ng(0.1μl)に
対して、PS1プライマーとPS2プライマーをそれぞれ100p
mole加え、Taqポリメラーゼ（宝酒造株式会社）2.5U(0.
5μl)とPCR用緩衝液(250mM Tris-塩酸 (25℃でpH 8.
3)、375mM塩化カリウム、15mM塩化マグネシウム)20μ
l、100mM DTT 1.0μl、10mM dNTP 0.5μl(10mM dATP、d
CTP、dGTP、dTTP)、酢酸BSA(４mg/ml)0.25μlを加え、
最終容量が100μlになるように滅菌水を加えた。これ
らの混合溶液に鉱油(Sigma Chemical社）を一滴添加
し、以下の条件でPCRを行った。すなわち、95℃で４
分間の加熱処理後、95℃で１分間、55℃で１分間および
72℃で２分間の３工程を30回繰り返してから、72℃で10
分間の処理を行って反応を終了した。このPCR反応溶
液から水相を取り出し、その内の10μlに、10×H溶液２
μlを加え、次いで、制限酵素SacII 20U(１μl)およびP
stI 20U(１μl)を加え、滅菌水を７μl加えた後に、37
℃で１時間反応させた。反応液は、0.8％アガロース
ゲルを用いた50mA 30分間の電気泳動に付した。ゲル
に波長360nmの紫外線を照射して検出された約0.35kbの
バンドを切り出した。このアガロース断片を、1.5ml
容のチューブに入れ遠心分離機で、15,000rpmで、10分
間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してDNA溶
液とした。

【００２２】プラスミドpCV3を、SacIIおよびPstIで処
理した後の溶液に対して、上記のDNA溶液５μlを加え、
次いで、DNAライゲーションキットVer.2（宝酒造株式会
社）のＩ液の2.0μlを加え、16℃で、30分間反応させ
た。反応液に大腸菌コンピテントセルXL1-BLUE(STRAT
AGENE社）0.1mlを加え、氷上で30分間反応させた後、42
℃で、60秒間熱ショックを与えた。２分間氷上に置い
た後、SOC培地（東洋紡績株式会社）を0.9ml加え、37℃
で、１時間シェーカーで振とう培養した。 5,000rpmで
１分間遠心分離して、上清を廃棄した。遠心管内に残
った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸濁し、１：10
の割合で２枚の100μg/mlのアンピシリンを含むアンピ
シリンプレートに播いた。 37℃で、１晩培養し、生じ
たコロニーから得られたプラスミドの内、SV40プロモー
ターのDNAが挿入されているものを選択し、それらをpSV
Oaとした。さらに、このプラスミドについて制限酵素
S phIでセルフライゲーション(self-ligation)を行い、
エンハンサー部分を除去することにより、5'末端にSacI
I-EcoRIサイトが付いたP_SV40DEを有する、プラスミドpS
VP1aが調製された。

【００２３】(3-2)プラスミドpSVP1bの調製 5'センスプライマー(PS1)の代わりに、配列番号：９に
記載の塩基配列を有する他の5'センスプライマー(PS3)
を合成した点を除き、実施例１(3-1)に記載の調製方法
と同様にして、NEO遺伝子シストロン用SV40プロモータ
ーP_SV40DEを有するプラスミドpSVP1bを調製した。な
お、P3プライマーは、5'末端にSacIIサイトのみを付け
たものとした(EcoRIサイトは無し）。

【００２４】(3-3)SV40 p olyAの調製 SV40ウイルスゲノム由来のポリアデニレーション（以
下、「polyA」あるいは「ポリA」と称する）シグナルを
有するプラスミドpSV40pA-A(pSV40/BR由来、広島大学よ
り入手）のSV40 polyAシグナル配列の3'末端EcoRIサイ
トにSPSV40リンカーをライゲートすることで、EcoRIサ
イトをApaI-ClaIサイトに変更した。まず、SPSV40リ
ンカーとして、配列番号：10に示す塩基配列を有するセ
ンスDNAと、配列番号：11に示す塩基配列を有するアン
チセンスDNAを合成した。プラスミドpSV40pA-Aの１ng
(0.1μl)を、制限酵素EcoRIで消化した。得られた溶
液に、SPSV40リンカーのセンスDNAとアンチセンスDNAを
それぞれ100pmole加え、次いで、DNAライゲーションキ
ットVer.2（宝酒造株式会社）のＩ液の2.0μlを加え、1
6℃で、30分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテ
ントセルXL1-BLUE(STRATAGENE社）0.1mlに加え、氷上で
30分間反応させた後、42℃で、60秒間熱ショックを与え
た。２分間氷上に置いた後、SOC培地（東洋紡績株式
会社）を0.9ml加え、37℃で、１時間シェーカーで振と
う培養した。 5,000rpmで１分間遠心分離して、上清を
廃棄した。遠心管内に残った溶液で沈殿したコンピテ
ントセルを懸濁し、１：10の割合で２枚の100μg/mlの
アンピシリンを含むアンピシリンプレートに播いた。
37℃で、１晩培養し、生じたコロニーから得られたプラ
スミドの内、SV40 polyAのDNAが挿入されているものを
選択し、それらをプラスミドpSV40pA-Bとした。

【００２５】(3-4)プラスミドpSVP(D)S-1の調製プラスミドpSV40pA-Bの１ng(0.1μl)に制限酵素B amHI 2
0U(１μl)およびClaI20U(１μl)を加え、滅菌水を７μl
加えた後に、37℃で１時間反応させた。反応液は、0.
8％アガロースゲルを用いた50mA 30分間の電気泳動に付
した。ゲルに波長360nmの紫外線を照射して検出され
た約0.8kbのバンドを切り出した。このアガロース断
片を、1.5ml容のチューブに入れ遠心分離機で、15,000r
pmで、10分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離
してDNA溶液とした。一方、プラスミドpSV1aを、BamH
IおよびClaIで処理した後、得られた溶液１ng／0.1μl
に対して上記のDNA溶液５μlを加え、次いで、DNAライ
ゲーションキットVer.2（宝酒造株式会社）のＩ液の2.0
μlを加え、16℃で、30分間反応させた。反応液を大
腸菌コンピテントセルXL1-BLUE(STRATAGENE社）0.1mlに
加え、氷上で30分間反応させた後、42℃で、60秒間熱シ
ョックを与えた。２分間氷上に置いた後、SOC培地
（東洋紡績株式会社）を0.9ml加え、37℃で、１時間シ
ェーカーで振とう培養した。 5,000rpmで１分間遠心分
離して、上清を廃棄した。遠心管内に残った溶液で沈
殿したコンピテントセルを懸濁して、１：10の割合で２
枚の100μg/mlのアンピシリンを含むアンピシリンプレ
ートに播いた。 37℃で、１晩培養し、生じたコロニー
から得られたプラスミドの内、新たにSV40 polyAのDNA
が挿入されているものを選択し、それらをプラスミドpS
VP(D)S-1とした。

【００２６】(4)プラスミドpSVP(D)S-2の調製（図５）実施例１(3)に記載のプラスミドpSVP(D)S-1の調製方法
と同様にして、pSV40pA-Bから得られたSV40 polyAのDNA
とプラスミドpSVP1bを元にして、NEO遺伝子シストロン
用のSV40プロモーターとSV40 polyAを有するプラスミド
pSVP(D)S-2を得た。

【００２７】(5)プラスミドpSVP(D)S/DHFRの調製（図
６） (5-1) DHFR遺伝子のクローニングマウス繊維芽細胞株3T3を培養し、10⁷個の細胞を得た
後、グアニジンイソチオシアネート法(Meth. Enzymol.,
152, 219頁、1987年）によりmRNAを分離した。

【００２８】まずフラスコ中に細胞を浮遊させ、得られ
た細胞を滅菌処理したPBS中に再度浮遊させ、遠心分離
用チューブに移した。０℃以下の温度条件下で、450
×ｇで、10分間遠心分離を行い、上清は廃棄した。６
MのGTG-CsCl、10mMクエン酸ナトリウム、0.1ml β-メル
カプトエタノールおよび0.5％サルコシルの混合溶液
に、得られた細胞を加えて懸濁・溶解し、これを18ゲー
ジの注射針に通して、RNAを断片化した。このように
して得た溶液の2.5mlを、超遠心管中の5.7M CsCl、2.5m
lの0.1M EDTA液の上に重層した。これを超遠心機を用
いて、35,000rpmで、８時間遠心し、上清を注意深く捨
てた後に、底に沈殿したRNA画分をフェノールで抽出お
よび飽和した滅菌水に溶解した。次いで、沈殿物をエ
タノールを加えて、12,000rpmの遠心でRNAを沈殿させ
た。次いで、沈殿物をエタノールで３回洗浄した後、
風乾した。得られたRANを、３mlのRNaseフリーの水に
再懸濁した。こうして得られたmRNA試料の濃度は、260n
mの吸光度により、約0.3μg/μlであった。

【００２９】(5-2) DHFR cDNAの調製 DHFRの遺伝子を増幅するために、配列番号：12に示す塩
基配列を有する5'センスプライマー(PD1)と、配列番
号：13に示す塩基配列を有する3'アンチセンスプライマ
ー(PD2)を合成した。 5'側末端は、PstIサイトとナン
センスなピリミジン配列「TCCCTC」を人為的に結合され
た配列とし、3'側末端は、終止コドンから約85b下流に
あるBglIIサイトまで含むものとした。 cDNAを合成す
るために、２μｇの全RNAを含む10μlの溶液を用いた。
滅菌したRNaseフリーのチューブに、PCR用緩衝液(250
mM Tris-塩酸 (25℃でpH 8.3)、375mM塩化カリウム、15
mM塩化マグネシウム)20μl、100mM DTT 1.0μl、10mM d
NTP 0.5μl(10mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、酢酸BSA(４
mg/ml)0.25μl、オリゴdTプライマー2.0μｇ、PCR逆転
写酵素(200単位/μl)0.5μlに、0.5μlのRNaseフリーの
DEPC水を加えた。これらを、37℃で60分間インキュベ
ートした後、70℃で15分間加熱して、反応を停止させ
た。得られたcDNAは、用意したPCR用の反応液に直接
加えた。この溶液にPD1プライマーとPD2プライマー
を、それぞれ100pmole加え、次いで、Taqポリメラーゼ
（宝酒造株式会社）2.5U(0.5μl)とPCR用緩衝液(250mM
Tris-塩酸 (25℃でpH 8.3)、375mM塩化カリウム、15mM
塩化マグネシウム)20μl、100mM DTT 1.0μl、10mM dNT
P 0.5μl(10mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、酢酸BSA(４m
g/ml)0.25μlを加え、最終容量が100μlになるように滅
菌水を加えた。これらの混合溶液に鉱油(Sigma Chemi
cal社）を一滴添加し、以下の条件でPCRを行った。す
なわち、95℃で４分間の加熱処理後、95℃で１分間、55
℃で１分間および72℃で２分間の３工程を30回繰り返し
てから、72℃で10分間の処理を行って反応を終了した。
このPCR反応溶液から水相を取り出し、その内の10μl
に、10×H溶液２μlを加え、次いで、制限酵素PstI 20U
(１μl)およびBglII 20U(１μl)を加え、滅菌水を７μl
加えた後に、37℃で１時間反応させた。反応液は、0.
8％アガロースゲルを用いた50mA 30分間の電気泳動に付
した。ゲルに波長360nmの紫外線を照射して検出され
た約0.65kbのバンドを切り出した。このアガロース断
片を、1.5ml容のチューブに入れ遠心分離機で、15,000r
pmで、10分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離
してDNA溶液とした。

【００３０】(5-3) プラスミドpSVP(D)S/DHFRの調製プラスミドpSVP(D)S-1を制限酵素PstIおよびBamHIで部
分消化処理した（これはSV40 polyA中にもPstIサイトが
１箇所含まれることによる）。この溶液0.1μl(１ng
DNA)に対してDHFRのDNA溶液0.5μlを加え、5'末端はPst
Iで、また、3'末端はBamHIとBglIIの突出末端で結合さ
せた。この時に、DNAライゲーションキットVer.2（宝
酒造株式会社）のＩ液の2.0μlを加え、16℃で、30分間
反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルXL1-BL
UE(STRATAGENE社）0.1mlに加え、氷上で30分間反応させ
た後、42℃で、60秒間熱ショックを与えた。２分間氷
上に置いた後、SOC培地（東洋紡績株式会社）を0.9ml加
え、37℃で、１時間シェーカーで振とう培養した。 5,
000rpmで１分間遠心分離して、上清を廃棄した。

【００３１】遠心管内に残った溶液で沈殿したコンピテ
ントセルを懸濁し、１：10の割合で２枚の100μg/mlの
アンピシリンを含むアンピシリンプレートに播いた。
37℃で、１晩培養し、生じたコロニーから得られたプラ
スミドの内、DHFRのDNAとApaIの制限酵素サイトを有す
るプラスミドを選択し、それらをプラスミドpSVP(D)S/D
HFRとした。

【００３２】(6)プラスミドpSVP(D)S/NEOの調製（図
７）ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子(NEO
遺伝子)領域には、354塩基からなる5'上流のトランスポ
ゾン配列とNEO遺伝子翻訳領域がつながったものを使用
した。この配列は、Tn5由来のもので、pSV2-neo(J. M
ol. Appl. Genet., p.1327 (1982))に含まれているもの
であり、pSV2-neoから切り出して使用した。まず、配
列番号：14に示す塩基配列を有する5'センスプライマー
(PN1)と、配列番号：15に示す塩基配列を有する3'アン
チセンスプライマー(PN2)を合成した。 PN1プライマー
の5'側末端には、元の配列のHindIIIサイトの代わり
に、PstIサイトを付与した。また、PN2プライマーの
3'側末端には、元のSmaIサイトの代わりにBamHIサイト
を付与した。 pSV2-neoゲノム１ng(0.1μl)に対して、
PN1プライマーとPN2プライマーをそれぞれ100pmole加
え、次いで、Taqポリメラーゼ（宝酒造株式会社）2.5U
(0.5μl)とPCR用緩衝液(250mM Tris-塩酸 (25℃でpH 8.
3)、375mM塩化カリウム、15mM塩化マグネシウム)20μ
l、100mM DTT 1.0μl、10mM dNTP 0.5μl(10mM dATP、d
CTP、dGTP、dTTP)、酢酸BSA(４mg/ml)0.25μlを加え、
最終容量が100μlになるように滅菌水を加えた。これ
らの混合溶液に鉱油(Sigma Chemical社）を一滴添加
し、以下の条件でPCRを行った。すなわち、95℃で４
分間の加熱処理後、95℃で１分間、55℃で１分間および
72℃で２分間の３工程を30回繰り返してから、72℃で10
分間の処理を行って反応を終了した。このPCR反応溶
液から水相を取り出し、その内の10μlに、10×H溶液２
μlを加え、次いで、制限酵素PstII 20U(１μl)およびB
amHI 20U(１μl)を加え、滅菌水を７μl加えた後に、37
℃で１時間反応させた。反応液は、0.8％アガロース
ゲルを用いた50mA 30分間の電気泳動に付した。ゲル
に波長360nmの紫外線を照射して検出された約1.3kbのバ
ンドを切り出した。このアガロース断片を、1.5ml容
のチューブに入れ遠心分離機で、15,000rpmで、10分間
遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してDNA溶液
とした。

【００３３】次に、プラスミドpSVP(D)S-2を制限酵素Ps
tIおよびBamHIで部分消化処理した（これはSV40 polyA
中にもPstIサイトが１箇所含まれることによる）。こ
の溶液0.1μl(１ng DNA)に対してNEO遺伝子のDNA溶液0.
5μlを加え、PstI-BamHIサイト間にライゲートした。
この反応には、DNAライゲーションキットVer.2（宝酒造
株式会社）のＩ液の2.0μlを加え、16℃で、30分間反応
させた。反応液を大腸菌コンピテントセルXL1-BLUE(S
TRATAGENE社）0.1mlに加え、氷上で30分間反応させた
後、42℃で、60秒間熱ショックを与えた。２分間氷上
に置いた後、SOC培地（東洋紡績株式会社）を0.9ml加
え、37℃で、１時間シェーカーで振とう培養した。 5,
000rpmで１分間遠心分離して、上清を廃棄した。遠心
管内に残った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸濁
し、１：10の割合で２枚の100μg/mlのアンピシリンを
含むアンピシリンプレートに播いた。 37℃で、１晩培
養し、生じたコロニーから得られたプラスミドの内、NE
O遺伝子を含むトランスポゾン配列DNAが挿入されている
ものをG418耐性に関して選択した。

【００３４】さらに、NEO遺伝子翻訳領域開始コドン"AT
G"の直後の塩基を"A"から"C"に変更するために、配列番
号：16に示した塩基配列を有する変異導入用のアンチセ
ンスプライマーを合成した。 pSVP(D)S/NEOゲノム１ng
(１μl)に対して、このアンチセンスプライマーを100pm
ole加え、PCR in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造株式
会社）を使用して部位特異的突然変異を誘導した。 Ta
qポリメラーゼ（宝酒造株式会社）2.5U(0.5μl)とPCR用
緩衝液(250mM Tris-塩酸 (25℃でpH 8.3)、375mM塩化カ
リウム、15mM塩化マグネシウム)20μl、100mM DTT 1.0
μl、10mM dNTP0.5μl(10mM dATP、dCTP、dGTP、dTT
P)、酢酸BSA(４mg/ml)0.25μlを加え、最終容量が100μ
lになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液に
鉱油(SigmaChemical社）を一滴添加し、以下の条件でPC
Rを行った。すなわち、95℃で４分間の加熱処理後、9
5℃で１分間、55℃で１分間および72℃で２分間の３工
程を30回繰り返してから、72℃で10分間の処理を行って
反応を終了した。このようにして得られたプラスミド
ベクターを、プラスミドpSVP(D)S/NEOとした。

【００３５】(7)プラスミドpEXP-BL2の調製 (7-1) プラスミドpCV4の調製（図８）プラスミドpUC18（宝酒造株式会社）のマルチクローニ
ングサイトを除去して、新たにマルチクローニングサイ
ト(MCS)関連遺伝子を組み込むためのマルチクローニン
グサイト用のリンカー(CV4リンカー）として、配列番
号：17に示す塩基配列を有するセンスDNAと、配列番
号：18に示す塩基配列を有するアンチセンスDNAを合成
した。このリンカーの制限酵素切断部位の配列を、3'
-HindIII-EcoRV-ClaI-NotI-KpnI-XbaI-Ba lII-SplI-EcoR
I-5'とした。プラスミドpUC18の１ng(0.1μl)を制限
酵素HindIIIおよびEcoRIで処理した。得られたプラス
ミドを含む溶液に対して、CV4リンカーのセンスDNAとア
ンチセンスDNAをそれぞれ100pmole加え、次いで、DNAラ
イゲーションキットVer.2（宝酒造株式会社）のＩ液の
2.0μlを加え、16℃で、30分間反応させた。反応液を
大腸菌コンピテントセルXL1-BLUE(STRATAGENE社）0.1ml
に加え、氷上で30分間反応させた後、42℃で、60秒間熱
ショックを与えた。２分間氷上に置いた後、SOC培地
（東洋紡績株式会社）を0.9ml加え、37℃で、１時間シ
ェーカーで振とう培養した。 5,000rpmで１分間遠心分
離して、上清を廃棄した。遠心管内に残った溶液で沈
殿したコンピテントセルを懸濁して、１：10の割合で２
枚の100μg/mlのアンピシリンを含むアンピシリンプレ
ートに播いた。 37℃で、１晩培養し、生じたコロニー
から得られたプラスミドの内、CV4リンカーのDNAが挿入
されているものを選択し、それらをプラスミドpCV4とし
た。

【００３６】(7-2) P _CMVの調製（図９） hCMV MIE抗原のプロモーター／エンハンサー領域を含む
約６kbの配列をpSV2-Neoに組み込んで調製されたプラス
ミドpSV2-neo/EcoH(東海大より入手）からP_CMVを切り出
すために、配列番号：19に示す塩基配列を有する5'セン
スプライマー(PC1)と、配列番号：20に示す塩基配列を
有する3'アンチセンスプライマー(PC2)を合成した。 P
C1プライマーの5'側末端には、EcoRVサイトを、またPC2
プライマーの3'側末端には、ClaIサイトを付与した。
プラスミドpSV2-neo/EcoHゲノム１ng(１μl)に対して、
これらPC1プライマーとPC2プライマーをそれぞれ100pmo
le加え、次いで、Taqポリメラーゼ（宝酒造株式会社）
2.5U(0.5μl)とPCR用緩衝液(250mM Tris-塩酸 (25℃でp
H 8.3)、375mM塩化カリウム、15mM塩化マグネシウム)20
μl、100mM DTT 1.0μl、10mM dNTP 0.5μl(10mM dAT
P、dCTP、dGTP、dTTP)、酢酸BSA(４mg/ml)0.25μlを加
え、最終容量が100μlになるように滅菌水を加えた。
これらの混合溶液に鉱油(Sigma Chemical社）を一滴添
加し、以下の条件でPCRを行った。すなわち、95℃で
４分間の加熱処理後、95℃で１分間、55℃で１分間およ
び72℃で２分間の３工程を30回繰り返してから、72℃で
10分間の処理を行って反応を終了した。このPCR反応
溶液から水相を取り出し、その内の10μlに、10×H溶液
２μlを加え、次いで、制限酵素EcoRV 20U(１μl)およ
びClaI 20U(１μl)を、そして、滅菌水を７μl加えた後
に、37℃で１時間反応させた。

【００３７】反応液は、0.8％アガロースゲルを用いた5
0mA 30分間の電気泳動に付した。

【００３８】ゲルに波長360nmの紫外線を照射して検出
された約0.6kbのバンドを切り出した。

【００３９】このアガロース断片を、1.5ml容のチュー
ブに入れ遠心分離機で、15,000rpmで、10分間遠心し、
得られた水溶液をピペットで分離してDNA溶液とした。

【００４０】(7-3) P _CMVのプラスミドへの挿入プラスミドpCV4の１ng(１μl)を、制限酵素EcoRVおよび
ClaIで処理した後の溶液に対して、P_CMVのDNA溶液0.5μ
lを加え、EcoRV-Cl aIサイト間にライゲートした。

【００４１】この反応には、DNAライゲーションキットV
er.2（宝酒造株式会社）のＩ液の２．０μｌを加え、16
℃で、30分間反応させた。反応液に大腸菌コンピテン
トセルXL1-BLUE(STRATAGENE社）0.1mlを加え、氷上で30
分間反応させた後、42℃で、60秒間熱ショックを与え
た。２分間氷上に置いた後、SOC培地（東洋紡績株式
会社）を0.9ml加え、37℃で、１時間シェーカーで振と
う培養した。 5,000rpmで１分間遠心分離して、上清を
廃棄した。遠心管内に残った溶液で沈殿したコンピテ
ントセルを懸濁して、１：10の割合で２枚の100μg/ml
のアンピシリンを含むアンピシリンプレートに播いた。
37℃で、１晩培養し、生じたコロニーから得られたプ
ラスミドの内、P_CMVのDNAが挿入されているものを選択
し、それらをpCV4/CMVとした。

【００４２】(7-4) bGH p olyAを含むDNAの単離採取したウシ肝臓細胞組織をドライアイス上でスライス
しながら、100μg/mlになるようにプロティネースＫ溶
液を加えた緩衝液(150mM 塩化ナトリウム、10mM Tris-
塩酸(pH 8.0)、10mM EDTA、0.1％SDS)で抽出し、穏やか
に混合した。 55℃で、１時間インキュベートした後、
さらに37℃で、一晩インキュベートした。

【００４３】Trisで平衡化した中性フェノールを等量加
え、室温で20分間穏やかに混合した。

【００４４】室温で、2,000×ｇ、10分間の遠心分離を
行い、得られた上層(５ml)を回収し、新しいチューブに
移した後、再度同じ条件で遠心分離を行った。再度上
層を回収し、新しいチューブに移した後、改めて同じ条
件で遠心分離を行った。再び上層を回収し、新しいチ
ューブに移した後、２倍量の100％エタノールを重層
し、ゆっくりと攪拌しながら、緩衝液とエタノールを混
合した。得られたDNAをガラス棒で巻き取って回収し
た後、風乾し、５mlのTE溶液に入れ、４℃で、一晩おき
に溶解した。得られたDNA試料の濃度は、260nmの吸光
度によれば、約0.5μg/μlであった。

【００４５】(7-5) bGH p olyAのプラスミドへの挿入 bGH polyA配列を二重に接続するために、制限酵素サイ
トの異なる２種類のbGHpolyA配列を調製した。まず、
２組の5'センスプライマーと3'アンチセンスプライマ
ー、すなわち、配列番号：21に示す塩基配列を有する5'
センスプライマー(PB11)と、配列番号：22に示す塩基配
列を有する3'アンチセンスプライマー(PB12)の組み合わ
せと、配列番号：23に示す塩基配列を有する5'センスプ
ライマー(PB21)と、配列番号：24に示す塩基配列を有す
る3'アンチセンスプライマー(PB22)の組み合わせを合成
した。

【００４６】得られたDNA試料の内の100ngを取り、PCR
テンプレートを用いて所望の制限酵素切断配列を両端に
持つbGH polyA配列を調製した。まず、DNA試料100ng
(１μl)に対して、センスプライマーPB11とアンチセン
スプライマーPB12を、それぞれ100pmole加え、Taqポリ
メラーゼ（宝酒造株式会社）2.5U(0.5μl)とPCR用緩衝
液(250mM Tris-塩酸 (25℃でpH 8.3)、375mM塩化カリウ
ム、15mM塩化マグネシウム)20μl、100mM DTT 1.0μl、
10mM dNTP 0.5μl(10mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、酢
酸BSA(４mg/ml)0.25μlを加え、最終容量が100μlにな
るように滅菌水を加えた。これらの混合溶液に鉱油(S
igma Chemical社）を一滴添加し、以下の条件でPCRを行
った。すなわち、95℃で４分間の加熱処理後、95℃で
１分間、55℃で１分間および72℃で２分間の３工程を30
回繰り返してから、72℃で10分間の処理を行って反応を
終了した。このPCR反応溶液から水相を取り出し、そ
の内の10μlに、10×H溶液２μlを加え、次いで、制限
酵素XbaI 20U(１μl)およびBglII 20U(１μl)を加え、
滅菌水を７μl加えた後に、37℃で１時間反応させた。
反応液は、0.8％アガロースゲルを用いた50mA 30分間の
電気泳動に付した。ゲルに波長360nmの紫外線を照射し
て検出された約0.23kbのバンドを切り出した。

【００４７】このアガロース断片を、1.5ml容のチュー
ブに入れ遠心分離機で、15,000rpmで、10分間遠心し、
得られた水溶液をピペットで分離してDNA溶液とした。

【００４８】プラスミドpCV4/CMVを、XbaIおよびBglII
で処理した後の溶液0.1μl(１ng DNA)に対して、前記の
DNA溶液0.5μlを加え、次いで、DNAライゲーションキッ
トVer.2（宝酒造株式会社）のＩ液の2.0μlを加え、16
℃で、30分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテン
トセルXL1-BLUE(STRATAGENE社）0.1mlに加え、氷上で30
分間反応させた後、42℃で、60秒間熱ショックを与え
た。２分間氷上に置いた後、SOC培地（東洋紡績株式
会社）を0.9ml加え、37℃で、１時間シェーカーで振と
う培養した。 5,000rpmで１分間遠心分離して、上清を
廃棄した。遠心管内に残った溶液で沈殿したコンピテ
ントセルを懸濁して、１：10の割合で２枚の100μg/ml
のアンピシリンを含むアンピシリンプレートに播いた。
37℃で、１晩培養し、生じたコロニーから得られたプ
ラスミドの内、bGH polyA DNAが挿入されているものを
選択し、それらをプラスミドpCV4/CMV-bGH1とした。

【００４９】(7-6) ベクターpEXP-BL2の調製プライマーPB11とPB12からPCR増幅して得られたDNA試料
の内の1ngを取り、これにセンスプライマーPB21とアン
チセンスプライマーPB22を、それぞれ100pmole加え、次
いで、Taqポリメラーゼ（宝酒造株式会社）2.5U(0.5μ
l)とPCR用緩衝液(250mM Tris-塩酸 (25℃でpH 8.3)、37
5mM塩化カリウム、15mM塩化マグネシウム)20μl、100mM
DTT 1.0μl、10mM dNTP 0.5μl(10mM dATP、dCTP、dGT
P、dTTP)、酢酸BSA(４mg/ml)0.25μlを加え、最終容量
が100μlになるように滅菌水を加えた。これらの混合
溶液に鉱油(Sigma Chemical社）を一滴添加し、以下の
条件でPCRを行った。すなわち、95℃で４分間の加熱
処理後、95℃で１分間、55℃で１分間および72℃で２分
間の３工程を30回繰り返してから、72℃で10分間の処理
を行って反応を終了した。このPCR反応溶液から水相
を取り出し、その内の10μlに、10×H溶液２μlを加
え、次いで、制限酵素BamHI 20U(１μl)およびSplI 20U
(１μl)を加え、滅菌水を７μl加えた後に、37℃で１時
間反応させた。反応液は、0.8％アガロースゲルを用い
た50mA 30分間の電気泳動に付した。ゲルに波長360nmの
紫外線を照射して検出された約0.47kbのバンドを切り出
した。

【００５０】このアガロース断片を、1.5ml容のチュー
ブに入れ遠心分離機で、15,000rpmで、10分間遠心し、
得られた水溶液をピペットで分離してDNA溶液とした。

【００５１】プラスミドpCV4/CMV-bGH1を、BglIIおよび
SplIで処理した後の溶液0.1μl(１ng DNA)に対して、前
記のDNA溶液0.5μlを加え、次いで、DNAライゲーション
キットVer.2（宝酒造株式会社）のＩ液の2.0μlを加
え、16℃で、30分間反応させた。

【００５２】反応液を大腸菌コンピテントセルXL1-BLUE
(STRATAGENE社）0.1mlに加え、氷上で30分間反応させた
後、42℃で、60秒間熱ショックを与えた。２分間氷上
に置いた後、SOC培地（東洋紡績株式会社）を0.9ml加
え、37℃で、１時間シェーカーで振とう培養した。 5,
000rpmで１分間遠心分離して、上清を廃棄した。遠心
管内に残った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸濁し
て、１：10の割合で２枚の100μg/mlのアンピシリンを
含むアンピシリンプレートに播いた。 37℃で、１晩培
養し、生じたコロニーから得られたプラスミドの内、第
二のbGH polyA DNAが挿入されているもの、つまりbGH p
olyAが二重に結合して挿入されているもの((bGH polyA)
²)を選択し、それらをMCSシストロンをもつカセットベ
クターpEXP-BL2とした。

【００５３】(8)プラスミドpNOW1の調製（図10） (8-1) プラスミドpNOW-aの調製プラスミドpSVP(D)S/DHFR 100ng(１μl)に10×H溶液１
μlを加え、制限酵素EcoRI 20U(１μl)およびApaI 20U
(１μl)を加え、37℃で１時間反応させた。反応液
は、0.8％アガロースゲルを用いた50mA 30分間の電気泳
動に付した。ゲルに波長360nmの紫外線を照射して検
出された約1.75kbのバンドを切り出した。

【００５４】このアガロース断片を、1.5ml容のチュー
ブに入れ遠心分離機で、15,000rpmで、10分間遠心し、
得られた水溶液をピペットで分離してDNA溶液とした。
このDNA配列は、DHFR遺伝子シストロンを構成するも
のであり、P_SV40DE、Mu-DHFR（変異）遺伝子およびSV40
polyAからなる配列であった。

【００５５】一方、DHFR遺伝子シストロンを構成するDN
A配列が挿入されるプラスミドpBBVの１ng(１μl)を、制
限酵素EcoRIおよびApaIで処理した。得られたプラス
ミドを含む溶液に対して、DHFR遺伝子シストロンを構成
する配列のDNA溶液0.5μlを加え、EcoRI-ApaIサイト間
にライゲートした。この反応には、DNAライゲーショ
ンキットVer.2（宝酒造株式会社）のＩ液の2.0μlを加
え、16℃で、30分間反応させた。反応液を大腸菌コン
ピテントセルXL1-BLUE(STRATAGENE社）0.1mlに加え、氷
上で30分間反応させた後、42℃で、60秒間熱ショックを
与えた。２分間氷上に置いた後、SOC培地（東洋紡績
株式会社）を0.9ml加え、37℃で、１時間シェーカーで
振とう培養した。 5,000rpmで１分間遠心分離して、上
清を廃棄した。遠心管内に残った溶液で沈殿したコン
ピテントセルを懸濁して、１：10の割合で２枚の100μg
/mlのアンピシリンを含むアンピシリンプレートに播い
た。

【００５６】37℃で、１晩培養し、生じたコロニーから
得られたプラスミドの内、新たにDHFR遺伝子シストロン
を構成するDNAが挿入されているものを選択し、それら
をプラスミドpNOW-aとした。

【００５７】(8-2) プラスミドpNOW-bpの調製プラスミドpSVP(D)S/NEO 100ng(１μl)に10×H溶液１μ
lを加え、制限酵素SacII 20U(１μl)およびClaI 20U(１
μl)を加え、１時間反応させた。反応液は、0.8％ア
ガロースゲルを用いた50mA 30分間の電気泳動に付し
た。ゲルに波長360nmの紫外線を照射して検出された
約2.4kbのバンドを切り出した。このアガロース断片
を、1.5ml容のチューブに入れ、遠心分離機で、15,000r
pmで、10分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離
してDNA溶液とした。このDNA配列は、NEO遺伝子シス
トロンを構成するものであり、P_SV40DE、トランスポゾ
ン配列、Mu-NEO（変異）遺伝子およびSV40 polyAからな
る配列であった。

【００５８】一方、NEO遺伝子シストロンを構成するDNA
配列が挿入されるプラスミドpNOW-aの１ng(１μl)を、
制限酵素SacIIおよびClaIで処理した。得られたプラ
スミドを含む溶液に対して、NEO遺伝子シストロンを構
成する配列のDNA溶液0.5μlを加え、SacII-ClaIサイト
間にライゲートした。この反応には、DNAライゲーシ
ョンキットVer.2（宝酒造株式会社）のＩ液の2.0μlを
加え、16℃で、30分間反応させた。反応液を大腸菌コ
ンピテントセルXL1-BLUE(STRATAGENE社）0.1mlに加え、
氷上で30分間反応させた後、42℃で、60秒間熱ショック
を与えた。２分間氷上に置いた後、SOC培地（東洋紡
績株式会社）を0.9ml加え、37℃で、１時間シェーカー
で振とう培養した。 5,000rpmで１分間遠心分離して、
上清を廃棄した。

【００５９】遠心管内に残った溶液で沈殿したコンピテ
ントセルを懸濁して、１：10の割合で２枚の100μg/ml
のアンピシリンを含むアンピシリンプレートに播いた。
37℃で、１晩培養し、生じたコロニーから得られたプ
ラスミドの内、新たにNEO遺伝子シストロンを構成するD
NAが挿入されているものを選択し、それらをプラスミド
pNOW-bpとした。

【００６０】(8-3) プラスミドpNOW-bの調製得られたプラスミドpNOW-bpのマルチクローニングサイ
トのClaIサイトを除去するために、ApaI-ClaI-EcoRV部
分を新たに合成したApaI-EcoRVリンカーで置換すること
により、ClaIサイトを除去した。まず、このリンカー
として、5'-CGAT-3'の塩基配列を有するセンスDNAと、
3'-CGGGCTA-5'の塩基配列を有するアンチセンスDNAを合
成した。プラスミドpNOW-bpの１ng(0.1μl)を、制限
酵素ApaIおよびEcoRVでダイジェスト処理した。得ら
れたプラスミドを含む溶液に対して、ApaI-EcoRVリンカ
ーセンスDNAとアンチセンスDNAをそれぞれ100pmole加
え、次いで、DNAライゲーションキットVer.2（宝酒造株
式会社）のＩ液の2.0μlを加え、16℃で、30分間反応さ
せた。反応液を大腸菌コンピテントセルXL1-BLUE(STR
ATAGENE社）0.1mlに加え、氷上で30分間反応させた後、
42℃で、60秒間熱ショックを与えた。２分間氷上に置
いた後、SOC培地（東洋紡績株式会社）を0.9ml加え、37
℃で、１時間シェーカーで振とう培養した。 5,000rpm
で１分間遠心分離して、上清を廃棄した。遠心管内に
残った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸濁して、
１：10の割合で２枚の100μg/mlのアンピシリンを含む
アンピシリンプレートに播いた。 37℃で、１晩培養
し、生じたコロニーから得られたプラスミドの内、新た
にNEO遺伝子シストロンを構成するDNAが挿入されている
ものを選択し、それらをプラスミドpNOW-bとした。

【００６１】(8-4) プラスミドpNOW1の調製プラスミドpEXP-BL2 100ng(１μl)に10×H溶液１μlを
加え、制限酵素EcoRV 20U(１μl)およびSpl1 20U(１μ
l)を加え、１時間反応させた。反応液は、0.8％アガ
ロースゲルを用いた、50mA 30分間の電気泳動に付し
た。ゲルに波長360nmの紫外線を照射して検出された
約1.1kbのバンドを切り出した。このアガロース断片
を、1.5ml容のチューブに入れ、遠心分離機で、15,000r
pmで、10分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離
してDNA溶液とした。このDNA配列は、MCSシストロン
を構成するものであり、P_CMV、MCS-B、および(bGH poly
A)²からなる配列であった。

【００６２】一方、MCSシストロンを構成するDNA配列が
挿入されるプラスミドpNOW-bの１ng(１μl)を制限酵素E
coRVおよびSplIで処理した。得られたプラスミドを含
む溶液に対して、MCSシストロンを構成する配列のDNA溶
液0.5μlを加え、EcoRV-SplIサイト間にライゲートし
た。この反応には、DNAライゲーションキットVer.2
（宝酒造株式会社）のＩ液の2.0μlを加え、16℃で、30
分間反応させた。反応液に大腸菌コンピテントセルXL
1-BLUE(STRATAGENE社）0.1mlを加え、氷上で30分間反応
させた後、42℃で、60秒間熱ショックを与えた。２分
間氷上に置いた後、SOC培地（東洋紡績株式会社）を0.9
ml加え、37℃で、１時間シェーカーで振とう培養した。
5,000rpmで１分間遠心分離して、上清を廃棄した。
遠心管内に残った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸
濁して、１：10の割合で２枚の100μg/mlのアンピシリ
ンを含むアンピシリンプレートに播いた。 37℃で、１
晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドの
内、MCSシストロンを構成するDNAが挿入されているもの
を選択し、それらをpNOW1とした。

【００６３】なお、プラスミドpNOW1の構造を図11に示
した。さらに、プラスミドpNOW1の全塩基配列を、配
列番号：25に示した。

【００６４】実施例２：発現ベクターpNOW1-hMBPの構築まず、ヒト肝臓cDNAライブラリー（クローンラック社
製）から、hMBPの開始コドンからストップコドンまで
を、AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGTCCCTGTTTCCATCACTCの塩基
配列（配列番号：26)からなるプライマーとGCTCTAGATCA
GATAGGGAACTCACAGACの塩基配列（配列番号：27)からな
るプライマーを用いて、ザイモリアクター（アトー社
製）で増幅させた。

【００６５】得られたhMBPのcDNAを制限酵素NotIとXbaI
で消化して、hMBPのcDNAの66〜812bpに対応するcDNA部
分（配列番号：２）を得、これを挿入体とした。

【００６６】次に、実施例１にて調製した発現ベクター
pNOW1を、制限酵素NotIとXbaIで消化して、サイトメガ
ロウイルスプロモーター(pCMV)の下流、すなわち、pCMV
とBGPポリA(図11での(bGHpA)²に相当する）の間に、前
述の挿入体をDNAライゲーションキット（宝酒造製）を
用いて挿入した。このようにして得られた発現ベクタ
ーをプラスミドpNOW1-hMBPと命名し、その構造の模式図
を図12に示した。

【００６７】実施例３：発現クローンの選択 (1)ジヒドロ葉酸還元酵素欠損(dhfr^-)のチャイニーズハ
ムスター卵巣(CHO)細胞への発現ベクターpNOW1-hMBPの導入ウシ胎児血清(FCS, GIBCO社)を10％添加した(ヒポキサ
ンチン、チミジンを含まない)Iscove's Modified Dulbe
cco's Medium (IMDM;GIBCO社)を調製し、これにDHFR遺
伝子が欠損した(dhfr^-)DG44 CHO細胞株を、１×10⁵細胞
／mlになるように混合し、これを直径60mmのディッシュ
に播種し、37℃で、５％炭酸ガス(CO2)の条件下で、24
時間培養した。培養上清を廃棄し、その代わりに別途
予め、５μgのDNA（発現ベクターpNOW1-hMBP）をリポフ
ェクチン溶液(DOTAP Liposomal Transfection Reagent;
ベーリンガーマンハイム社製）に混合して得た溶液100
μlを含む10％FCS添加IMDMを加えて６mlとし、さらにヒ
ポキサンチン(終濃度10nM)(GIBCO社製)とチミジン(終濃
度100nM)(GIBCO社製)を加え、16時間培養し、dhfr^-の宿
主CHO細胞への発現ベクターpNOW1-hMBPの導入を行っ
た。その後、培養上清を廃棄し、10％FCS、ヒポキサ
ンチン、チミジン添加IMDMの６mlを加え、さらに24時間
培養を行った。

【００６８】(2)ネオマイシン(G418)耐性CHO細胞の取得発現ベクターpNOW1-hMBPが導入された細胞を24時間培養
した後、これをトリプシン処理して、ディッシュより回
収し、細胞数を計測した後、１×10⁵細胞/mlになるよう
に400μg/mlの濃度のネオマイシン(G418)を含む10％FCS
添加IMDMで細胞を懸濁したものを、0.1ml/ウェルの量で
96ウェルのマイクロプレート10枚に播種（分注）した。
37℃で、５％炭酸ガス(CO2)の条件下で、２週間培養
したところ、960ウェル中の84個のウェルにおいて生存
細胞があり、G418耐性の細胞（クローン）が認められ
た。

【００６９】これらG418耐性クローンのhMBPの産生性を
確認したところ、殆どのG418耐性クローンにおいて高水
準の産生レベルが確認された。 hMBPの産生が確認され
たクローンの中からいくつかを選択し、各クローンを、
25cm²のカルチャーフラスコに播種した。細胞が密集
するまで培養を行い、細胞数を測定したところ、３×10
⁶細胞/25cm²カルチャーフラスコであった。それぞれ
のカルチャーフラスコの培養上清を廃棄し、前出のもの
と同じ組成の10％FCS添加IMDMを２ml加え、４日間培養
し、その培養上清を回収した。回収した培養上清中の
hMBP(rhMBP)の産生量を測定したところ、いくつかのカ
ルチャーフラスコで５μg/mlを超える産生量が確認され
た。なお、hMBPの産生量は、対照としてのnative MB
P、コレクチンの糖認識領域(CRD)とネック領域に対する
（大腸菌で発現させた）抗ウサギポリクローナル抗体お
よびhMBP（定量対象）を用いて、鈴木らの方法(Y. Suzu
ki, et al., "Characterization of Recombinant Bovin
e Conglutinin Expressedin a Mammalian Cell", Bioch
em. Biophys. Re s. Commun., 238, pp.856-863 (1997))
に準じて定量した。そして、産生量が大きかった４つ
のクローンについての結果を、図13のグラフに示した。
産生効率の最も高いクローンでのhMBPの産生量は、2
3.3μg/mlであった。

【００７０】(3)MTX耐性のCHO細胞の取得 hMBP産生クローンをさらに継代培養して安定化させた
後、低濃度のMTXを培地に加えて遺伝子増幅を行った。

【００７１】まず、５nM MTX、400μg/mlのG418を加え
た10％透析済FCS(JRHバイオサイエンス社製)添加IMDM
に、選択した２つの各細胞クローンを混合し、0.1ml/ウ
ェルの量を96ウェルのマイクロプレート10枚に播種（分
注）した。 37℃で、５％炭酸ガス(CO₂)の条件下で、
２週間培養を行ったところ、960ウェル中のほとんどの
ウェルで生存細胞、すなわち、５nM MTX耐性の細胞（ク
ローン）が認められた。

【００７２】これら５nM MTX耐性のクローンのhMBP産生
性を確認したところ、殆どの５nM MTX耐性クローンにお
いて高水準の産生レベルが確認された。これらクロー
ンの中から５つのクローンを任意に選択し、それぞれを
25cm²のカルチャーフラスコに播種し、細胞が密集する
まで２週間培養した。

【００７３】培養上清を廃棄し、前出のものと同じ組成
の10％FCS添加IMDM(５nM MTX、400μg/ml G418を加えた
もの）を２ml加え、４日間培養し、その培養上清を回収
し、hMBPの産生レベルを確認した。なお、hMBPの産生
量の定量は、実施例３(1)と同様の定量方法によって定
量した。その結果を、図14のグラフに示す。産生効
率の最も高いクローンでのhMBPの産生量は、54.1μg/ml
であった。

【００７４】実施例４：PAGE分析およびゲル濾過クロマ
トグラフィーによるrhMBPの構造的検討 (1) rhMBPの精製得られたクローンの中で最も産生効率の高いクローン
を、225cm²のカルチャーフラスコに播種し、細胞が密集
するまで培養した。そして、培養上清を廃棄し、5nM
MTX、400μg/mlのG418を含むCHO-S-SFM II培地(ビタミ
ンＣを添加する場合は終濃度100mMになるようにビタミ
ンＣを添加)を50ml加え、４日間培養した。その培養上
清を回収し、TBS(TBS powder(宝酒造社製)より調製）に
対して透析を行い、その後、TBSC（5mM CaCl₂、TBS）に
対して透析を行った。

【００７５】次いで、マンナン−アガロース(mannan-ag
arose:SIGMA社製)により精製を行った。すなわち、マ
ンナン−アガロースをカラム（Column PD-10、 Empty、
ファルマシア社製）に詰め、そこに透析済の培養液を通
し、TBSCで洗浄後、TBSE(10mM EDTA、TBS)で溶出した。
溶出後、1M CaCl₂を終濃度が15mMになるように加え、
さらに、もう一度、マンナン−アガロースに適用し、TB
SCで洗浄後、100mMのマンノースを含むTBSで溶出し、再
度、TBSCに対して透析を行いrhMBPの精製品とした。

【００７６】(2) 精製rhMBPのPAGE分析実施例４(1)で得たhMBPを、PAGEにより解析した。 SDS
-PAGEには、非還元条件下では４〜20％の濃度勾配のポ
リアクリルアミドゲル(第一化学薬品社製）を、還元条
件下では10〜20％の濃度勾配のポリアクリルアミドゲル
(第一化学薬品社製）を、また、native PAGEには４〜20
％の濃度勾配のポリアクリルアミドゲル(第一化学薬品
社製）を用いた。ポリペプチドの染色は、１％のクマ
シーブルー(CBB)で行った。その結果を、図15に示し
た。図15において、レーンＭは分子量マーカー（プレ
ステインドプロテインマーカーブロードレンジ (NEW EN
GLAND BIO Labs社製)）、レーン１はnative hMBP、レー
ン２はrhMBP（ビタミンＣ添加培養）、およびレーン３
はrhMBP（ビタミンＣ無添加培養）を示す。

【００７７】図15の結果から、還元条件下でのSDS-PAGE
ではnative hMBPと同じ分子量の位置にバンドを形成し
たが、非還元条件下でのSDS-PAGEとnative PAGEではnat
ivehMBPと異なるパターンのバンドが形成されていた。

【００７８】(3) 精製rhMBPのゲル濾過クロマトグラフ
ィー分析精製したrhMBPを、20mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.15 NaC
l、5mM EDTAを用い、流速0.5ml／分で、スーパーロース
６ HR10/30（φ10mm×長さ300mm；ファルマシア社製）
によりゲル濾過を行った。 40μgのrhMBPをこのカラム
に流し、280nmの吸光度で測定した。

【００７９】カラムの検量には、バイオラッド社製ゲル
濾過スタンダード（チログロブリン(670kDa)、ウシγグ
ロブリン(158kDa)、チキン卵白アルブミン(44kDa)、ウ
シミオグロブリン(17kDa))を用いた。図16に示すよう
に、rhMBPでは300kDa、一方、native hMBPでは1,300kDa
の付近に主要なピークを確認した。

【００８０】実施例５：rhMBPとnative hMBPの糖結合活
性と糖特異性マイクロタイタープレートを、マンナン(10μg/ml:SIGM
A社製）を含む 100μlのコーティング緩衝液（炭酸ナト
リウム15mM、炭酸水素ナトリウム35mM、0.05％アジ化ナ
トリウム、pH9.6)中にて、４℃で、１晩表面処理した。
各段階後にプレートをTBSNTC液(TBS、0.05％アジ化ナ
トリウム、0.05％ツィーン20（登録商標）、５mM塩化カ
ルシウム）で３回洗浄した。コーティングが完了した
後、プレートを、BlockAce(大日本製薬社製）で、室温
で１時間処理し、ブロッキングを行った。

【００８１】洗浄液、native hMBP、rhMBP（ビタミンＣ
添加培養）、rhMBP（ビタミンＣ無添加培養）を、200、
100、50、25、12.5、6.25ng/mlの濃度に段階希釈したも
の、および各hMBPの200ng/mlの濃度のものにEDTAを10mM
となるように添加したもの、さらに50ng/mlの濃度のも
のにマンノースを100mMとなるように添加したものを準
備し、各ウェルに100μlずつ加え、37℃で１時間インキ
ュベートした。洗浄後、TBSNTCで 1,000倍に希釈した
ビオチン化抗ウサギ抗hMBP抗体（ビオチン化はEZ-Link
(登録商標)Sulfo-NHS-LC-Biotin(PIACE社製）により行
った）を加え、37℃で１時間インキュベートした後、洗
浄を行った。次に、VECTASTAIN ABC-APSTANDARDKIT
(VECTOR社製）により、アビジンとビオチン化アルカリ
フォスファターゼの複合体を、37℃で30分間かけて形成
させ、これを洗浄した。最後に、TMB基質液(KPL社製T
MB マイクロウェル・ペルオキシダーゼ基質システム)10
0μlを各ウェルに加えた。室温で30分間インキュベー
トした後、１Ｍリン酸100μlを添加し、450nmでの吸光
度を測定した（Model 450 Microplate Reader；バイオ
ラッド社製）。そして、糖抑制試験はこのELISA 系を
用いて、Lu et al.,の方法（バイオケミカル・ジャーナ
ル (Biochem. J.)、 284巻、795-802頁、1992年）に従
って実施した。

【００８２】マイクロタイター・プレートを、マンナン
（１μg/100μlウェル) でコートした後、100、50、2
5、12.5、6.3、3.1、1.6mMの終濃度の糖類と共存させた
nativehMBPおよびrhMBP(ビタミンＣ添加培養あるいはビ
タミンＣ無添加培養のもの）を反応させた。抑制曲線
と比較して、結合を50％抑制する糖濃度をＩ₅₀として算
出した。このようにして得られた結果を、以下の表１
に示した。

【００８３】

【表１】

【００８４】表１の結果から明らかなように、rhMBPの
糖特異性は、native hMBPとほぼ一致していた。ま
た、図17に示すように、rhMBPは、native hMBPと同様の
糖結合活性を有していた。

【００８５】実施例６：赤血球凝集抑制(HI)試験 (1) ウイルスインフルエンザＡウイルスのＡ/Ibaraki/1/90 (H3N2:イ
ンフルエンザウイルスＡ香港型)を、赤血球凝集抑制(H
I)試験に用いた。ウイルスは標準的な方法で、発育鶏
卵のCAM(卵しょうのう膜）を用いて40代継代培養したも
ので、使用時まで−70℃で保存した。ウイルス増殖用
培地としては、３％組織培養用ビタミン、 0.2％アルブ
ミン、 0.1％グルコース、および0.2ng/mlのアセチレー
トトリプシンを含有するイーグルMEM培地（日水製薬社
製）を用いた。

【００８６】(2) rhMBPの赤血球凝集抑制(HI)活性 Okuno et al.,の方法（ジャーナル・オブ・クリニカル
・ミクロバイオロジー(J. Clin. Microbiol.)、28巻、1
308-1313頁、1990年）に従って赤血球凝集抑制(HI)活性
を測定した。すなわち、naitive hMBPおよびrhMBP(ビ
タミンＣ添加培養あるいはビタミンＣ無添加培養のも
の)(５μg/ml）を、25μlのTBSCで96穴マイクロプレー
ト上で２倍階段希釈した。 16HAU（赤血球凝集単位）
のウイルス液25μlを各MBP段階希釈液に加えて、37℃で
60分間反応さた後、0.5％ニワトリ赤血球溶液50μlを加
えた。４℃で60分間インキュベートした後、ウイルス
介在性のヒヨコ赤血球凝集に対するrhMBPの効果を観察
した。その結果を、以下の表２および図18に示す。

【００８７】

【表２】

【００８８】表２と図18の結果から、rhMBPの赤血球凝
集抑制(HI)活性は、native hMBPと比較して遜色のない
活性（値）を示していた。

【００８９】実施例７：中和活性試験 (1) ウイルス実施例６と同じく、インフルエンザＡウイルスＡ/Ibara
ki/1/90を用いた。

【００９０】(2) 中和活性試験 Okuno et al.,の方法（ジャーナル・オブ・クリニカル
・ミクロバイオロジー(J. Clin. Microbiol.)、28巻、1
308-1313頁、1990年）に従って中和活性試験を行った。
naitive hMBPおよびrhMBP（ビタミンＣ添加培養ある
いはビタミンＣ無添加培養したもの）をTBSCで２倍階段
希釈し、50 Focus Forming Unit (FFU)/25μlのウイル
ス液を等量加えて混合し、37℃で、60分間反応させた。
この反応液50μlを10％ウシ胎児血清(GIBCO社製）を
含むイーグルMEM培地で培養されたMadin-Darby Canine
Kidney (MDCK)細胞を単層培養した96穴マイクロプレー
ト上に、各MBP希釈濃度について３ウェル接種した。 3
5℃で60分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、0.5
％トリガカントガム（和光純薬社製）を含むインフルエ
ンザウイルス増殖用培地を加えて、CO₂インキュベータ
ー中で24時間培養した。培養後、細胞を洗浄し、そし
て、エタノールで固定した。風乾した後、抗インフル
エンザ高度免疫ウサギ血清、抗ウサギIgGヤギ血清（ICN
ファー真シューティカル社製）、ペルオキシダーゼ抗ペ
ルオキシダーゼ(ウサギ)複合体（ICNファー真シューテ
ィカル社製）を、各々37 ℃で、30分間反応させた。 P
BSで洗浄した後、DAB溶液(SIGMA社製）を加えて、ウイ
ルス感染フォーカスが赤褐色に染色されるまで反応させ
た。そして、水道水で洗浄し、風乾した後にウイルス
感染フォーカスを計数した。

【００９１】図19に、native hMBP、rhMBP画分（ビタミ
ンＣ添加培地で培養）、rhMBP画分（ビタミンＣ無添加
培地で培養）、およびこれらに100mMのマンノースを添
加した試験区での、インフルエンザＡウイルスへの中和
活性の比較結果を示した。また、中和価は、MBPを含ま
ず、これに代えてTBSCのみをウイルス液と混合した場合
を100％とし、FFUの減少率で示した。その結果、rhMB
P（ビタミンＣ添加培養あるいはビタミンＣ無添加培養
のもの）は、native hMBPとほぼ同様にインフルエンザ
ウイルスに対して、中和活性を示し、マンノースの添加
により抑制されたことが確認された。

【００９２】(3)HIV-1、HBVおよびインフルエンザＡウ
イルスへの結合活性 rhMBPのHIV-1、HBVおよびインフルエンザＡウイルスへ
の結合活性を、以下に示すウイルス構成タンパク質を電
気泳動した後、メンブレンに移し、そこにrhMBPを結合
させ、標識した抗体で検出して決定した。

【００９３】用いたウイルス構成タンパク質の電気泳動
に要した量は、HIV-gp120 (HIV_IIIB-gp120)(ADVANCED B
IOTECHNOLOGIES INCORPORATED (ABI)社製) 0.25μg、HI
V-gp160 (HIV_IIIB-gp160)(ABI社製) 0.25μg、HBS (Hep
atitis B Surface Antigen (HBsAg)(ABI社製)、サブタ
イプad）10μg、インフルエンザＡウイルス（IAV；財団
法人阪大微生物病研究所より供与を受けた）、 H1N1 Ya
magata ビリオン５μg、H3N2 Beijin ビリオン５μgで
あった。

【００９４】SDS-PAGEは、４〜20％の濃度勾配のポリア
クリルアミドゲルを用い、HIV-1、HBSは、還元条件下で
電気泳動を行った。電気泳動を行った後、Immobilon-
P^SQトランスファーメンブラン（ミリポア社製）にセミ
ドライエレクトロブロットバッファーキット（Owl Scie
ntific社製）を用い、Nova Blot(ファルマシア社製）で
トランスファーを行った。トランスファーを行った
後、BlockAce(大日本製薬社製）で、室温で、１時間ブ
ロッキングを行った。 TBSTC(0.05％ツイーン20(登録
商標）、5mM塩化カルシウム、TBS)またはTBSTE(0.05％
ツイーン20(登録商標）、5mM EDTA、TBS)(rhMBPの糖認
識領域へのカルシウムイオン(Ca²⁺)依存的な結合を阻害
するコントロール）で洗浄を、10分間、３回行い、rhMB
PをTBSTCまたはTBSTEで、1.0μg/mlに希釈した溶液を、
室温で、１時間反応させた。改めて前記同様に、TBST
CまたはTBSTEで洗浄を行った後に、TBSTCで1000倍希釈
した抗ヒトMBPポリクローナル抗体を加え、室温で、１
時間反応させた。 TBSTCで洗浄した後、TBSTCで5,000
倍に希釈した抗ウサギIgGアルカリホスファターゼ標識
（ケミコンインターナショナル社製）を加え、室温で、
30分間反応させた。 TBSTCで洗浄した後、NBT/BCIP(GI
BCO社製）を用いて発色を行った。その結果を、図20
に示した。図20の結果から明らかな通り、本発明のrh
MBPは、HIV-1、HBVおよびインフルエンザＡウイルスへ
のいずれに対しても結合性を有することが明らかとなっ
た。

【００９５】実施例８：ウイルス増殖（感染拡大）阻止
試験 (1) ウイルス実施例６と同じく、インフルエンザＡウイルスＡ/Ibara
ki/1/90を用いた。

【００９６】(2) ウイルス増殖（感染拡大）阻止試験 24穴マイクロタイタープレート上で、10％ウシ胎児血清
を含むイーグルMEM 培地でMDCK細胞を単層培養し、１ウ
ェル当たり30FFUとなるように、インフルエンザウイル
スを接種した。 35℃で60分間インキュベートした後、
細胞を洗浄し、１ウェル当たり１mlの0.5％トリガカン
トガムを含むインフルエンザウイルス増殖用培地を加え
た。さらに、native hMBP、rhMBP（ビタミンＣ添加培
養）、rhMBP（ビタミンＣ無添加培養）、ウシ血清アル
ブミンを１ウェル当たり0.5および１μg/mlとなるよう
に添加し、３日間培養した。細胞を洗浄した後、実施
例７(2)の中和活性試験と同様にて操作し、PAP染色法に
てウイルス感染フォーカスの総面積を求めた。その結
果を、図21に示す。なお、対照として、100mMマンノ
ース共存下で培養したものを用いた（図21の右欄）。
図21の結果から明らかなように、rhMBPは、濃度依存的
にインフルエンザウイルスの感染フォーカスの面積を減
少させ、ウイルス増殖阻止効果を呈した。

【００９７】実施例９：rhMBPによる補体活性化試験 (1) ウイルス実施例６と同じく、インフルエンザＡウイルスは、A/Ib
araki/1/90(H3N2)を用いた。

【００９８】(2) 感作ヒツジ赤血球の調製ヒツジ赤血球（日本バイオテスト研究所製）をゼラチン
-ベロナール緩衝液(１×ベロナール(145mM塩化ナトリウ
ム、15.6mM 5,5-ジエチルバルビタール酸、9.09mM 5,5-
ジエチルバルビタール酸ナトリウム）、１％ゼラチン、
0.25mM CaCl₂、0.82mM MgCl₂）で洗浄後、１×10⁹ 細胞
/mlの濃度になるようにゼラチン-ベロナール緩衝液で希
釈した。ヒツジ赤血球（１×10⁹ 細胞/ml）10ml、塩
化クロム(0.5mg/ml）5ml、マンナン(60μg/ml）5mlを混
合し、室温で、５分間インキュベートした後、ゼラチン
-ベロナール緩衝液で数回洗浄し、再び１×10⁹ 細胞/ml
の濃度になるようにゼラチン-ベロナール緩衝液に懸濁
したものを、感作ヒツジ赤血球とした。

【００９９】(3) 補体活性化試験 native hMBPおよびrhMBP(ビタミンＣ添加培養あるいは
ビタミンＣ無添加培養したもの）各400μlと感作ヒツジ
赤血球100μlを混合し、室温で、15分間インキュベート
した（各レクチン濃度は、終濃度1、10、100および1000
ng/試験管とした）。

【０１００】遠心後、沈査を1.1mlベロナール緩衝液に
懸濁した。モルモット補体（ICNファーマシューティ
カル社製：マンナンカラム処理により内在性MBPを除
き、ゼラチン−ベロナール緩衝液で20倍希釈したもの）
400μlを加え、37℃で、60分間インキュベートした後、
遠心上清の541nmでの吸光度を測定した。対照には、
感作ヒツジ赤血球100μlに蒸留水1400μlを加えて完全
溶血させたものを用いた。マンノースによる阻害実験
は、感作ヒツジ赤血球とhMBPを反応させるときに同時に
加えた。

【０１０１】その結果を、図22に示す。図22の結果か
ら、rhMBP(ビタミンＣ添加培養あるいはビタミンＣ無添
加培養したもの）は、native hMBPとほぼ同様に濃度依
存的に感作ヒツジ赤血球を溶血させた。このことか
ら、rhMBPが感作ヒツジ赤血球表面のマンナンに結合
し、それに続く補体の活性化を引き起こすことが推測さ
れた。この活性は、マンノースの添加により抑制されて
いた。

【０１０２】

【発明の効果】このように、本発明によって、従来、生
体から極めて低収率でしか取得できなかったMBPと同等
の生理活性を呈する均質なrhMBPを、大量に生産する手
段が実現されたのである。また、本発明のrhMBPが、n
ative hMBPと同質の生理活性を維持していることから、
医薬品への利用についてもおおいに期待できるなど、多
様な効果を奏するのである。

【０１０３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：3605 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状鎖の数：二本鎖配列の種類：cDNA 起源生物名：ホモ＝サピエンス (Homo sapiens) 個体クローン名： taxon:9606 組織の種類：肝臓細胞の種類：ヒートサイトス(heatocytes) セルライン： Hep62 直接の起源ライブラリー：λ gt10 クローン： 48-11 染色体名： 10q11.2-q21. 配列の特徴特徴を表す記号： sig peptide 存在位置： 66...125 特徴を表す記号： CDS 存在位置： 66...812 配列： GGTAAATATG TGTTCATTAA CTGAGATTAA CCTTCCCTGA GTTTTCTCAC ACCAAGGTGA 60 GGACCA TGT CCC TGT TTC CAT CAC TCC CTC TCC TTC TCC TGA GTA TGG TGG 111 Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val -20 -15 -10 CAG CGT CTT ACT CAG AAA CTG TGA CCT GTG AGG ATG CCC AAA AGA CCT GCC 162 Ala Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys -5 1 5 10 CTG CAG TGA TTG CCT GTA GCT CTC CAG GCA TCA ACG GCT TCC CAG GCA AAG 213 Pro Ala Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys 15 20 25 ATG GGC GTG ATG GCA CCA AGG GAG AAA AGG GGG AAC CAG GCC AAG GGC TCA 264 Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG GCT TAC AGG GCC CCC CTG GAA AGT TGG GGC CTC CAG GAA ATC CAG GGC 315 Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly 50 55 60 CTT CTG GGT CAC CAG GAC CAA AGG GCC AAA AAG GAG ACC CTG GAA AAA GTC 366 Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys Ser 65 70 75 80 CGG ATG GTG ATA GTA GCC TGG CTG CCT CAG AAA GAA AAG CTC TGC AAA CAG 417 Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln Thr 85 90 95 AAA TGG CAC GTA TCA AAA AGT GGC TGA CCT TCT CTC TGG GCA AAC AAG TTG 468 Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val 100 105 110 GGA ACA AGT TCT TCC TGA CCA ATG GTG AAA TAA TGA CCT TTG AAA AAG TGA 519 Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys Val 115 120 125 130 AGG CCT TGT GTG TCA AGT TCC AGG CCT CTG TGG CCA CCC CCA GGA ATG CTG 570 Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala 135 140 145 CAG AGA ATG GAG CCA TTC AGA ATC TCA TCA AGG AGG AAG CCT TCC TGG GCA 621 Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly 150 155 160 165 TCA CTG ATG AGA AGA CAG AAG GGC AGT TTG TGG ATC TGA CAG GAA ATA GAC 672 Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg 170 175 180 TGA CCT ACA CAA ACT GGA ACG AGG GTG AAC CCA ACA ATG CTG GTT CTG ATG 723 Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp 185 190 195 AAG ATT GTG TAT TGC TAC TGA AAA ATG GCC AGT GGA ATG ACG TCC CCT GCT 774 Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys 200 205 210 215 CCA CCT CCC ATC TGG CCG TCT GTG AGT TCC CTA TCT GAAGGGTCAT 820 Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile 220 225 ATCACTCAGG CCCTCCTTGT CTTTTTACTG CAACCCACAG GCCCACAGTA TGCTTGAAAA 880 GATAAATTAT ATCAATTTCC TCATATCCAG TATTGTTCCT TTTGTGGGCA ATCACTAAAA 940 ATGATCACTA ACAGCACCAA CAAAGCAATA ATAGTAGTAG TAGTAGTTAG CAGCAGCAGT 1000 AGTAGTCATG CTAATTATAT AATATTTTTA ATATATACTA TGAGGCCCTA TCTTTTGCAT 1060 CCTACATTAA TTATCTAGTT TAATTAATCT GTAATGCTTT CGATAGTGTT AACTTGCTGC 1120 AGTATGAAAA TAAGACGGAT TTATTTTTCC ATTTACAACA AACACCTGTG CTCTGTTGAG 1180 CCTTCCTTTC TGTTTGGGTA GAGGGCTCCC CTAATGACAT CACCACAGTT TAATACCACA 1240 GCTTTTTACC AAGTTTCAGG TATTAAGAAA ATCTATTTTG TAACTTTCTC TATGAACTCT 1300 GTTTTCTTTC TAATGAGATA TTAAACCATG TAAAGAACAT AAATAACAAA TCTCAAGCAA 1360 ACAGCTTCAC AAATTCTCAC ACACATACAT ACCTATATAC TCACTTTCTA GATTAAGATA 1420 TGGGACATTT TTGACTCCCT AGAAGCCCCG TTATAACTCC TCCTAGTACT AACTCCTAGG 1480 AAAATACTAT TCTGACCTCC ATGACTGCAC AGTAATTTCG TCTGTTTATA AACATTGTAT 1540 AGTTGGAATC ATATTGTGTG TAATGTTGTA TGTCTTGCTT ACTCAGAATT AAGTCTGTGA 1600 GATTCATTCA TGTCATGTGT ACAAAAGTTT CATCCTTTTC ATTGCCATGT AGGGTTCCCT 1660 TATATTAATA TTCCTCAGTT CATCCATTCT ATTGTTAATA GGCACTTAAG TGGCTTCCAA 1720 TTTTTGGCCA TGAGGAAGAG AACCCACGAA CATTCCTGGA CTTGTCTTTT GGTGGACATG 1780 GTGCACTAAT TTCACTACCT ATCCAGGAGT GGAACTGGTA GAGGATGAGG AAAGCATGTA 1840 TTCAGCTTTA GTAGATATTA CCAGTTTTCC TAAGTGATTG TATGAATTTA TGCTCCTACC 1900 GGCAATGTGT GGCAGTCCTA GATGCTCTAT GTGCTTGTAA AAAGTCAATG TTTTCAGTTC 1960 TCTTGATTTT CATTATTCCT GTGGATGTAA AGTGATATTT CCCCATGGTT TTAATCTGTA 2020 TTTCCCCAAC ATGTAATAAG GTTGAACACT TTTTTATATG CTTATTGGGC ACTTGGGTAT 2080 CTTCTTCTGT GAAGTACCCG TTCACATTTT TGTATTTTGT TTAAATTAGT TAGCCAATAT 2140 TTTTCTTACT GATTTTTAAG TTATTTTTAC ATTCTGAATA TGTCCTTTTT AATGTGTATT 2200 ACAAATATTT TGCTAGTTTT TGACTTGCTC CTAATGTTGA ATTTTGATGA ACAAAATTTC 2260 CTAATTTTGA GAAAGTCTTA TTTATTCATA TTTTCTTTCA AAATTAGTGC TTTTTGTGTC 2320 ATGTTTAAGA AATTTTTGCC CATCCCAAAA TCATAAGATA TTTTTCATGA TTTTGAAACC 2380 ATGAAGAGAT TTTTCATGAT TTTGAAATCA TGAAGATATT TTTCCATTTT TTTCTAATAG 2440 TTTTATTAAT AAACATTCTA TCTATTCCTG GTAGAATAGA TATCCACTTG AGACAGCACT 2500 ATGTAGGAAA GACCATTTTT CCTCCACTGA ACTAGGGTGG TGCATTTTTG TAAGTTAGGT 2560 AACTGTATGT GTGTGTGTCT GTTTCTGGGC TGTCTATTCT AGTCTATTTG TTGATGCTTG 2620 TGTCAAACAG TACACTATCT TAATTATTGT ACATTTATAG TTGTAACTGT AGTCCAGCTT 2680 TGTTCTTCTT CAAGTCAAGA TTTCCATATA AATATTAGAA ACAGTTTCTC AATTTCTACA 2740 AAATCCTGAT GAGGTTTCTA CTGGGACCAC ATTGAGTCTA TCAATCAACT TATGCAGAAC 2800 TGGCAACTTA CTACTGAATC TCTAATCAAT GTTCATCATG TATCGCTTCA TTTAACTAGG 2860 ATTTCTCTAA CTTAATTGCT ATGTTTTGAG ATTTTTAGTT TAAAAACCTT GTATATCTTG 2920 TTTTGGTGGT TTTAGTGATT TTAATAATAT ATTTTAAATA TTTTTTCTTT TCTATTGTTG 2980 TACACAGAAA TACAGTTAAG TTTTGTGTGT AGTCTTACGA TGTTTAGTAA CCTCAATAAG 3040 TTTATTTCTT AAATCTAGTA ATTTGTAGAT TCCTCTGGAT TTTGTATATG CATAGTCATG 3100 TAAGCTGAAA ATATGGCAAT ACTTGCTTCT TCCCAATTGC TTTACCTTTT TTCTTACCTT 3160 ATTGCACTGG TTAGCAACCC CAATACAGAG ACCACCAGAG CAGGTATAGA CTCCTGAAAG 3220 ACAATATAAT GAAGTGCTCC AGTCAGGCCT ATCTAAACTG GATTCACAGC TCTGTCACTT 3280 AATTGCTACA TGATCTAGAG CCAGTTACTT TGTGTTTCAG CCATGTATTT GCAGCTGAGA 3340 GAAAATAATC ATTCTTATTT CATGAAAATT GTGGGGATGA TGAAATAAGT TAACACCTTT 3400 AAAGTGTGTA GTAAAGTATC AGGATACTAT ATTTTAGGTC TTAATACACA CAGTTATGCC 3460 GCTAGATACA TGCTTTTTAA TGAGATAATG TGATATTATA CATAACACAT ATCGATTTTT 3520 AAAAATTAAA TCAACCTTGC TTTGATGGAA TAAACTCCAT TTAGTCACAA AAAAAAAAAA 3580 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 3605 配列番号：2 配列の長さ：747 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列： ATGTCCCTGT TTCCATCACT CCCTCTCCTT CTCCTGAGTA TGGTGGCAGC GTCTTACTCA 60 GAAACTGTGA CCTGTGAGGA TGCCCAAAAG ACCTGCCCTG CAGTGATTGC CTGTAGCTCT 120 CCAGGCATCA ACGGCTTCCC AGGCAAAGAT GGGCGTGATG GCACCAAGGG AGAAAAGGGG 180 GAACCAGGCC AAGGGCTCAG AGGCTTACAG GGCCCCCCTG GAAAGTTGGG GCCTCCAGGA 240 AATCCAGGGC CTTCTGGGTC ACCAGGACCA AAGGGCCAAA AAGGAGACCC TGGAAAAAGT 300 CCGGATGGTG ATAGTAGCCT GGCTGCCTCA GAAAGAAAAG CTCTGCAAAC AGAAATGGCA 360 CGTATCAAAA AGTGGCTGAC CTTCTCTCTG GGCAAACAAG TTGGGAACAA GTTCTTCCTG 420 ACCAATGGTG AAATAATGAC CTTTGAAAAA GTGAAGGCCT TGTGTGTCAA GTTCCAGGCC 480 TCTGTGGCCA CCCCCAGGAA TGCTGCAGAG AATGGAGCCA TTCAGAATCT CATCAAGGAG 540 GAAGCCTTCC TGGGCATCAC TGATGAGAAG ACAGAAGGGC AGTTTGTGGA TCTGACAGGA 600 AATAGACTGA CCTACACAAA CTGGAACGAG GGTGAACCCA ACAATGCTGG TTCTGATGAA 660 GATTGTGTAT TGCTACTGAA AAATGGCCAG TGGAATGACG TCCCCTGCTC CACCTCCCAT 720 CTGGCCGTCT GTGAGTTCCC TATCTGA 747 配列番号：３配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： NO 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 0..1 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 8..9 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 13..14 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 20..21 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 24..25 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 30..31 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 40..41 配列： TATGCCGCGG AATCGATGAT TACCGTACGG AATTCGGGCC C 41 配列番号：4 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNAアンチセンス : YES 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 0..1 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 4..5 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 8..9 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 13..14 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 18..19 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 26..27 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 32..33 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 34..35 配列： ACGGCGCCTT AGCTACTAAT GGCATGCCTT AAGCCCGGG 39 配列番号：5 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： NO 配列の特徴特徴を表す記号：Ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ存在位置：０．．１特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 9..10 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 16..17 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 18..19 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 25..26 配列： AGCTTCCGCG GCTGCAGGGA TCCATCGAT 29 配列番号：6 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： YES 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 0..1 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 3..4 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 8..9 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 18..19 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置：２３．．２４配列：ＡＧＧＣＧＣＣＧＡＣＧＴＣＣＣＴＡＧＧＴＡＧＣＴＡＴＴＡＡ
２９配列番号：7 配列の長さ：37 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： NO 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 6..7 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 9..10 配列： CCCCGCGGGA ATTCTGTGGA ATGTGTGTCA GTTAGGG 37 配列番号：8 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： YES 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 7..8 配列： CCCTGCAGCT TTTTGCAAAA GCCTAGGCCT CC 32 配列番号：９配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： NO 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 6..7 配列： CCCCGCGGTG TGGAATGTGT GTCAGTTAGG G 31 配列番号：10 配列の長さ：16 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： NO 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 9..10 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 12..13 配列： AATTGGGCCC ATCGAT 16 配列番号：11 配列の長さ：16 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： YES 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 1..2 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 8..9 配列： CCCGGGTAGC TATTAA 16 配列番号：12 配列の長さ：41 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： NO 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 7..8 配列： GGCTGCAGTC CCTCATGCTT CGACCATTGA ACTGCATCGT C 41 配列番号：13 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： YES 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 3..4 配列： ATAGATCTAA AGCCAGCAAA AGTCCCATGG TC 32 配列番号：14 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： NO 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 7..8 配列： GGCTGCAGCT TCACGCTGCC GCAAGCAC 28 配列番号：15 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： YES 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置：１．．２配列の特徴特徴を表す記号：Ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ存在位置： 3..4 配列： GGGGATCCGG GGTGGGCGAA GAACTCCAG 28 配列番号：16 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： YES 配列： ATCTTGTTCA AGCATGCGAA ACGATCCT 28 配列番号：17 配列の長さ：50 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： NO 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 0..1 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 8..9 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 13..14 特徴を表す記号：Ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ存在位置：１９．．２０特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 30..31 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 32..33 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 38..39 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 44..45 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 50..51 配列： AGCTTGATAT CATCGATGCG GCCGCGGTAC CAGATCTCGT ACGTCTAGAG 50 配列番号：18 配列の長さ：50 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： YES 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 0..1 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 4..5 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 11..12 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置：１９．．２０特徴を表す記号：Ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ存在位置： 22..23 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 32..33 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 38..39 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 44..45 特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 50..51 配列： ACTATAGTAG CTACGCCGGC GCCATGGTCT AGAGCATGCA GATCTCTTAA 50 配列番号：19 配列の長さ：47 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： NO 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 5..6 配列： CCGATTACTT ACCGCCATGT TGACATTGAT TATTGACTAG TTATTAA 47 配列番号：20 配列の長さ：45 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： YES 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 4..5 配列： CCATCGATCG GTTCACTAAA CGAGCTCTGC TTATATAGAC CTCCC 45 配列番号：21 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： NO 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 2..3 配列： CCTCTAGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC AT 32 配列番号：22 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： YES 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置：３．．４配列：ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣ
３２配列番号：23 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： NO 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 3..4 配列： TTGGATCCCT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC AT 32 配列番号：24 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA アンチセンス： YES 配列の特徴特徴を表す記号： Cleavage-site 存在位置： 3..4 配列： TTCGTACGGA TCCCATAGAG CCCACCGCAT CC 32 配列番号：25 配列の長さ：7635 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：環状配列の種類：他の核酸プラスミド pNOW-1 配列： GCGCGTTTCG GTGATGACGG TGAAAACCTC TGACACATGC AGCTCCCGGA GACGGTCACA 60 GCTTGTCTGT AAGCGGATGC CGGGAGCAGA CAAGCCCGTC AGGGCGCGTC AGCGGGTGTT 120 GGCGGGTGTC GGGGCTGGCT TAACTATGCG GCATCAGAGC AGATTGTACT GAGAGTGCAC 180 CATATGCCGC GGTGTGGAAT GTGTGTCAGT TAGGGTGTGG AAAGTCCCCA GGCTCCCCAG 240 CAGGCAGAAG TATGCAAAGC ATGCATCTCA ATTAGTCAGC AACCATAGTC CCGCCCCTAA 300 CTCCGCCCAT CCCGCCCCTA ACTCCGCCCA GTTCCGCCCA TTCTCCGCCC CATGGCTGAC 360 TAATTTTTTT TATTTATGCA GAGGCCGAGG CGCCTCTGAG CTATTCCAGA AGTAGTGAGG 420 AGGCTTTTTT GGAGGCCTAG GCTTTTGCAA AAAAGCTGCA GTGGGCTTAC ATGGCGATAG 480 CTAGACTGGG CGGTTTTATG GACAGCAAGC GAACCGGAAT TGCCAGCTGG GGCGCCCTCT 540 GGTAAGGTTG GGAAGCCCTG CAAAGTAAAC TGGATGGCTT TCTTGCCGCC AAGGATCTGA 600 TGGCGCAGGG GATCAAGATC TGATCAAGAG ACAGGATGAG GATCGTTTCG CATGATTGAA 660 CAAGATGGAT TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT CGGCTATGAC 720 TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG 780 CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC TGAATGAACT GCAGGACGAG 840 GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT 900 GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG 960 TCATCTCACC TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG 1020 CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG CATCGAGCGA 1080 GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG ATCTGGACGA AGAGCATCAG 1140 GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC GCATGCCCGA CGGCGAGGAT 1200 CTCGTCGTGA CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT 1260 TCTGGATTCA TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG 1320 GCTACCCGTG ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG CTGACCGCTT CCTCGTGCTT 1380 TACGGTATCG CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT ATCGCCTTCT TGACGAGTTC 1440 TTCTGAGCGG GACTCTGGGG TTCGAAATGA CCGACCAAGC GACGCCCAAC CTGCCATCAC 1500 GAGATTTCGA TTCCACCGCC GCCTTCTATG AAAGGTTGGG CTTCGGAATC GTTTTCCGGG 1560 ACGCCGGCTG GATGATCCTC CAGCGCGGGA TCACATGCTG GATTCTTCGC CCACCCCCTC 1620 GATCCCCTCG CGAGTTGGTT CAGCTGCTGC CTGAGGCTGG ACGACCTCGC GGAGTTCTAC 1680 CGGCAGTGCA AATCCGTCGG CATCCAGGAA ACCAGCAGCG GCTATCCGCG CATCCATGCC 1740 CCCGAACTGC AGGAGTGGGG AGGCACGATG GCCGCTTTGG TCGACCCGGA CGGGACGCTC 1800 CTGCGCCTGA TACAGAACGA ATTGCTTGCA GGCATCTCAT GAGTGTGTCT TCCCGTTTTC 1860 CGCCTGAGGT CACTGCGTGG ATGGGATCCG TGACATAATT GGACAAACTA CCTACAGAGA 1920 TTTAAAGCTC TAAGGTAAAT ATAAAATTTT TAAGTGTATA ATGTGTTAAA CTACTGATTC 1980 TAATTGTTTG TGTATTTTAG ATTCCAACCT ATGGAACTGA TGAATGGGAG CAGTGGTGGA 2040 ATGCCTTTAA TGAGGAAAAC CTGTTTTGCT CAGAAGAAAT GCCATCTAGT GATGATGAGG 2100 CTACTGCTGA CTCTCAACAT TCTACTCCTC CAAAAAAGAA GAGAAAGGTA GAAGACCCCA 2160 AGGACTTTCC TTCAGAATTG CTAAGTTTTT TGAGTCATGC TGTGTTTAGT AATAGAACTC 2220 TTGCTTGCTT TGCTATTTAC ACCACAAAGG AAAAAGCTGC ACTGCTATAC CAGAAATTAT 2280 GAAATATTCT GTAACCTTTA TAAGTAGGCA TAACAGTTAT AATCATAACA TACTGTTTTT 2340 TCTTACTCCA CACAGGCATA GAGTGTCTGC TATTAATAAC TATGCTCAAA AATTGTGTAC 2400 CTTTAGCTTT TTAATTTGTA AAGGGGTTAA TAAGGAATAT TTGATGTATA GTGCCTTGAC 2460 TAGAGATCAT AATCAGCCAT ACCACATTTG TAGAGGTTTT ACTTGCTTTA AAAAACCTCC 2520 CACACCTCCC CCTGAACCTG AAACATAAAA TGAATGCAAT TGTTGTTGTT AACTTGTTTA 2580 TTGCAGCTTA TAATGGTTAC AAATAAAGCA ATAGCATCAC AAATTTCACA AATAAAGCAT 2640 TTTTTTCACT GCATTCTAGT TGTGGTTTGT CCAAACTCAT CAATGTATCT TATCATGTCT 2700 GGGCCCGATA TCCGATGTAC GGGCCAGATA TACGCGTTGA CATTGATTAT TGACTAGTTA 2760 TTAATAGTAA TCAATTACGG GGTCATTAGT TCATAGCCCA TATATGGAGT TCCGCGTTAC 2820 ATAACTTACG GTAAATGGCC CGCCTGGCTG ACCGCCCAAC GACCCCCGCC CATTGACGTC 2880 AATAATGACG TATGTTCCCA TAGTAACGCC AATAGGGACT TTCCATTGAC GTCAATGGGT 2940 GGACTATTTA CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA GTGTATCATA TGCCAAGTAC 3000 GCCCCCTATT GACGTCAATG ACGGTAAATG GCCCGCCTGG CATTATGCCC AGTACATGAC 3060 CTTATGGGAA CTTTCCTACT TGGCAGTACA TCTACGTATT AGTCATCGCT ATTACCATGG 3120 TGATGCGGTT TTGGCAGTAC ATCAATGGGC GTGGATAGCG GTTTGACTCA CGGGGATTTC 3180 CAAGTCTCCA CCCCATTGAC GTCAATGGGA GTTTGTTTTG GCACCAAAAT CAACGGGACT 3240 TTCCAAAATG TCGTAACAAC TCCGCCCCAT TGACGCAAAT GGGCGGTAGG CGTGTACGGT 3300 GGGAGGTCTA TATAAGCAGA GCATCGATGC GGCCGCGGTA CCTCTAGACT GTGCCTTCTA 3360 GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGGCCCCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT 3420 GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG 3480 TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC 3540 AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC TCTATGGTCT AGGCTGTGCC TTCTAGTTGC 3600 CAGCCATCTG TTGTTTGGCC CCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGG AAGGTGCCAC 3660 TCCCACTGTC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG CATTGTCTGA GTAGGTGTCA 3720 TTCTATTCTG GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GAGGATTGGG AAGACAATAG 3780 CAGGCATGCT GGGGATGCGG TGGGCTCTAT GGCGTACGGG ATGCTAGAGA ATTCTGTGGA 3840 ATGTGTGTCA GTTAGGGTGT GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA 3900 GCATGCATCT CAATTAGTCA GCAACCATAG TCCCGCCCCT AACTCCGCCC ATCCCGCCCC 3960 TAACTCCGCC CAGTTCCGCC CATTCTCCGC CCCATGGCTG ACTAATTTTT TTTATTTATG 4020 CAGAGGCCGA GGCGCCTCTG AGCTATTCCA GAAGTAGTGA GGAGGCTTTT TTGGAGGCCT 4080 AGGCTTTTGC AAAAAAGCTG CAGTCCCTCA TGGTTCGACC ATTGAACTGC ATCGTCGCCG 4140 TGTCCCAAAA TATGGGGATT GGCAAGAACG GAGACCTACC CTGGCCTCCG CTCAGGAACG 4200 AGTTCAAGTA CTTCCAAAGA ATGACCACAA CCTCTTCAGT GGAAGGTAAA CAGAATCTGG 4260 TGATTATGGG TAGGAAAACC TGGTTCTCCA TTCCTGAGAA GAATCGACCT TTAAAGGACA 4320 GAATTAATAT AGTTCTCAGT AGAGAACTCA AAGAACCACC ACGAGGAGCT CATTTTCTTG 4380 CCAAAAGTTT GGATGATGCC TTAAGACTTA TTGAACAACC GGAATTGTCA AGTAAAGTAG 4440 ACATGGTTTG GATAGTCGGA GGCAGTTCTG TTTACCAGGA AGCCATGAAT CAACCAGGCC 4500 ACCTCAGACT CTTTGTGACA AGGATCATGC AGGAATTTGA AAGTGACACG TTTTTCCCAG 4560 AAATTGATTT GGGGAAATAT AAACTTCTCC CAGAATACCC AGGCGTCCTC TCTGAGGTCC 4620 AGGAGGAAAA AGGCATCAAG TATAAGTTTG AAGTCTACGA GAAGAAAGAC TAACAGGAAG 4680 ATGCTTTCAA GTTCTCTGCT CCCCTCCTAA AGCTATGCAT TTTTATAAGA CCATGGGACT 4740 TTTGCTGGCT TTAAGATCCG TGACATAATT GGACAAACTA CCTACAGAGA TTTAAAGCTC 4800 TAAGGTAAAT ATAAAATTTT TAAGTGTATA ATGTGTTAAA CTACTGATTC TAATTGTTTG 4860 TGTATTTTAG ATTCCAACCT ATGGAACTGA TGAATGGGAG CAGTGGTGGA ATGCCTTTAA 4920 TGAGGAAAAC CTGTTTTGCT CAGAAGAAAT GCCATCTAGT GATGATGAGG CTACTGCTGA 4980 CTCTCAACAT TCTACTCCTC CAAAAAAGAA GAGAAAGGTA GAAGACCCCA AGGACTTTCC 5040 TTCAGAATTG CTAAGTTTTT TGAGTCATGC TGTGTTTAGT AATAGAACTC TTGCTTGCTT 5100 TGCTATTTAC ACCACAAAGG AAAAAGCTGC ACTGCTATAC CAGAAATTAT GAAATATTCT 5160 GTAACCTTTA TAAGTAGGCA TAACAGTTAT AATCATAACA TACTGTTTTT TCTTACTCCA 5220 CACAGGCATA GAGTGTCTGC TATTAATAAC TATGCTCAAA AATTGTGTAC CTTTAGCTTT 5280 TTAATTTGTA AAGGGGTTAA TAAGGAATAT TTGATGTATA GTGCCTTGAC TAGAGATCAT 5340 AATCAGCCAT ACCACATTTG TAGAGGTTTT ACTTGCTTTA AAAAACCTCC CACACCTCCC 5400 CCTGAACCTG AAACATAAAA TGAATGCAAT TGTTGTTGTT AACTTGTTTA TTGCAGCTTA 5460 TAATGGTTAC AAATAAAGCA ATAGCATCAC AAATTTCACA AATAAAGCAT TTTTTTCACT 5520 GCATTCTAGT TGTGGTTTGT CCAAACTCAT CAATGTATCT TATCATGTCT GGGCCCCTGC 5580 ATTAATGAAT CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT 5640 CCTCGCTCAC TGACTCGCTG CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT 5700 CAAAGGCGGT AATACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG 5760 CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA 5820 GGCTCCGCCC CCCTGACGAG CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC 5880 CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG 5940 TTCCGACCCT GCCGCTTACC GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC 6000 TTTCTCAATG CTCACGCTGT AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG 6060 GCTGTGTGCA CGAACCCCCC GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC 6120 TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA 6180 TTAGCAGAGC GAGGTATGTA GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG 6240 GCTACACTAG AAGGACAGTA TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA 6300 AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG 6360 TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT 6420 CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT 6480 TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT 6540 AAAGTATATA TGAGTAAACT TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA 6600 TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA 6660 CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC 6720 GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA 6780 GTGGTCCTGC AACTTTATCC GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG 6840 TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG 6900 TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG 6960 TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG 7020 TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC 7080 TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT 7140 TCTGAGAATA GTGTATGCGG CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA 7200 CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA 7260 AACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA 7320 ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC 7380 AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC 7440 TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG 7500 AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC 7560 CTGACGTCTA AGAAACCATT ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG CGTATCACGA 7620 GGCCCTTTCG TCCTC 7635 配列番号：26 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： AAGGAAAAAA GCGGCCGCAT GTCCCTGTTT CCATCACTC 配列番号：27 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： GCTCTAGATC AGATAGGGAA CTCACAGAC

【図面の簡単な説明】

【図１】コレクチンの構成を説明する図である。

【図２】ベクターpBBVの調製工程を説明する図であ
る。

【図３】プラスミドpCV3の調製工程を説明する図であ
る。

【図４】プラスミドpSVP(D)S-1の調製工程を説明する
図である。

【図５】プラスミドpSVP(D)S-2の調製工程を説明する
図である。

【図６】プラスミドpSVP(D)S/DHFRの調製工程を説明
する図である。

【図７】プラスミドpSVP(D)S/NEOの調製工程を説明す
る図である。

【図８】プラスミドpCV4の調製工程を説明する図であ
る。

【図９】ベクターpEXP-BL2の調製工程を説明する図で
ある。

【図１０】プラスミドpNOW1の調製工程を説明する図
である。

【図１１】プラスミドpNOW1の構造を示す図である。

【図１２】プラスミドpNOW1-hMBPの構造の模式図であ
る。

【図１３】ネオマイシン(G418)耐性クローンでのrhMB
Pの産生状況を示すグラフである。

【図１４】 MTX耐性クローンでのrhMBPの産生状況を示
すグラフである。

【図１５】 rhMBPのPAGE分析の結果を示す図である。

【図１６】 rhMBPのゲル濾過分析の結果を示すグラフ
である。

【図１７】 rhMBPとnative hMBPの糖結合活性を示すグ
ラフである。

【図１８】 rhMBPの赤血球凝集抑制(HI)活性を示す図
である。

【図１９】 rhMBPによるインフルエンザＡウイルス感
染の中和活性を示すグラフである。

【図２０】 rhMBPによるHIV-1、HBVおよびインフルエ
ンザＡウイルスへの結合活性を示すグラフである。

【図２１】 rhMBPによるウイルス増殖（感染拡大）の
阻止活性を示す図である。

【図２２】 rhMBPによる感作ヒツジ赤血球の溶解度を
示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲル濾過クロマトグラフィーで処理した
際の280nmでの吸光度が、1,000〜1,300kDaの分子量にて
特異的なピークを示すことを特徴とする組換えヒトマン
ナン結合タンパク質(rhMBP)。
【請求項２】前記分子量が、1,150kDaである請求項１
に記載の組換えヒトマンナン結合タンパク質(rhMBP)。
【請求項３】ゲル濾過クロマトグラフィーで処理した
際の280nmでの吸光度が、200〜400kDaの分子量にて特異
的なピークを示すことを特徴とする組換えヒトマンナン
結合タンパク質(rhMBP)。
【請求項４】前記分子量が、300kDaである請求項３に
記載の組換えヒトマンナン結合タンパク質(rhMBP)。
【請求項５】ゲル濾過クロマトグラフィーで処理した
際の280nmでの吸光度が、1,000〜1,300kDaおよび200〜4
00kDaの分子量にて特異的なピークを示すことを特徴と
する組換えヒトマンナン結合タンパク質(rhMBP)。
【請求項６】組換えヒトマンナン結合タンパク質(rhM
BP)の製造方法であって、以下の工程、すなわち；(a)
天然型ヒトマンナン結合タンパク質(native hMBP)のcDN
Aの66bp〜812bpに対応するcDNAを、プラスミドpNOW1に
挿入して発現ベクターpNOW1-hMBPを構築し、(b) 前記発
現ベクターpNOW1-hMBPを、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損(d
hfr^-)のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に導入し
て形質転換体を得、(c) 前記形質転換体をネオマイシン
を含んだ培養培地にて培養して、ネオマイシン耐性の細
胞を取得し、(d) 前記ネオマイシン耐性細胞をメトトレ
キセート(MTX)を含んだ培養培地にて培養して、MTX耐性
の細胞を取得し、および(e) 得られたMTX耐性細胞から
組換えヒトマンナン結合タンパク質(rhMBP)を回収す
る、工程を含むことを特徴とする組換えヒトマンナン結
合タンパク質(rhMBP)の製造方法。
【請求項７】前記組換えヒトマンナン結合タンパク質
(rhMBP)が、ゲル濾過クロマトグラフィーで処理した際
の280nmでの吸光度にて、1,000〜1,300kDaの分子量にて
特異的なピークを示す請求項６に記載の組換えヒトマン
ナン結合タンパク質(rhMBP)の製造方法。
【請求項８】前記組換えヒトマンナン結合タンパク質
(rhMBP)が、ゲル濾過クロマトグラフィーで処理した際
の280nmでの吸光度にて、200〜400kDaの分子量にて特異
的なピークを示す請求項６に記載の組換えヒトマンナン
結合タンパク質(rhMBP)の製造方法。
【請求項９】前記組換えヒトマンナン結合タンパク質
(rhMBP)が、ゲル濾過クロマトグラフィーで処理した際
の280nmでの吸光度にて、1,000〜1,300kDaおよび200〜4
00kDaの分子量にて特異的なピークを示す請求項６に記
載の組換えヒトマンナン結合タンパク質(rhMBP)の製造
方法。
【請求項１０】前記組換えヒトマンナン結合タンパク
質(rhMBP)が、インフルエンザウイルスによる赤血球凝
集の阻止活性を有する請求項６乃至９のいずれかに記載
の組換えヒトマンナン結合タンパク質(rhMBP)の製造方
法。
【請求項１１】請求項６乃至10のいずれかに記載の方
法によって製造されうる組換えヒトマンナン結合タンパ
ク質(rhMBP)。