DK172953B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af erythropoietin, DNA-sekvens indkodende erythropoietin, vektor indeholdende DNA-sekvensen - Google Patents

Description

i DK 172953 B1

Den foreliggende opfindelse angår en isoleret DNA-sekvens, der koder for humant erythropoietin som beskrevet i krav 1, samt en DNA-sekvens, der koder for aminosyresekvensen 1-166 af erythropoietin som vist i tabel s III og som beskrevet i krav 7 og 12, samt vektorer ejendommelige ved det i krav 2 hhv. krav 8 angivne og celler ejendommelige ved det i krav 4 hhv. krav 10 angivne. Desuden angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af en human cDNA-klon, der omfatter en nucleotidsekvens 10 vist i Tabel III, og som udtrykker biologisk aktivt erythropoietin som beskrevet i krav 14, samt en fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat af humant erythropoietin som beskrevet i krav 23. Endelig angår opfindelsen en pattedyrscelle, kendetegnet ved, at 15 den indeholder hele det bovine papillomvirus-DNA og DNA-sekvensen vist i tabel III, der koder for EPO.

Erythropoietin (herefter kaldet EPO) er et cirkulerende glycoprotein, der stimulerer erythrocytdannelsen hos højere organismer. Jfr. Carbot m.fl., Compt. Rend. 143, 20 384 (1906). Som sådan omtales EPO undertiden som en ery- thropoiese-stimulerende faktor.

Levetiden for human-erythrocytter er ca. 120 dage.

Således ødelægges ca. 1/120 af de totale erythrocytter daglig i det retikuloendoteliale system. Sideløbende 25 produceres et forholdsvis konstant antal erythrocytter daglig for at opretholde erythrocytnivauet til enhver tid [Guyton, Textbook of Medical Physiology, 'side 55-60, W.B.

Saunders Co., Philadelphia (1976)].

Erythrocytter produceres ved modning og differen-30 tiering af erythroblasteme i knoglemarv, og EPO er en faktor, der virker på mindre differentierede celler og igangsætter deres differentiering til erythrocytter (Guyton, supra).

EPO er et lovende terapeutisk middel til klinisk 35 behandling af anæmi eller især anæmi ved nyreinsufficiens (anæmia renalis). Uheldigvis er anvendelsen af EPO endnu ikke almindelig til praktisk terapi, fordi det er vanskeligt tilgængeligt.

DK 172953 B1 la Når EPO skal anvendes som et terapeutisk middel, må man tage eventuelle antigeneicitetsproblemer i betragtning, og det foretrækkes derfor, at EPO fremstil-30 les ud fra et råmateriale af human oprindelse. Således kan der anvendes humant blod eller urin fra patienter, der lider af aplåstisk anæmi eller lignende sygdomme, og som udsondrer store mængder EPO. Disse råmaterialer findes imidlertid i begrænset omfang. Jfr. f.eks. White 35 m.fl., Rec. Progr. Horm. Res. 16, 219 (1960), Espada m. fl., Biochem. Med, 3, 475 (1970), Fisher, Pharmacol.

2 DK 172953 B1

O

Rev. 24, 459 (1972) og Gordon, Vitam. Horm. (N.Y.) 31, 105 (1973) .

Fremstillingen af EPO-produkter er i reglen foregået via koncentration og rensning af urin fra pa-5 tienter, der udviser høje EPO-niveauer, såsom dem, der lider af aplastisk anæmi og lignende sygdomme. Jfr. f.eks. USA patentskrifterne nr. 4.397.840, 4.303.650 og 3.865.801. De begrænsede tilførsler af sådan urin er en hindring for praktisk anvendelse af EPO, og det er der-10 for yderst ønskeligt at kunne fremstille EPO-produkter ud fra urin fra sunde mennesker. Et problem ved anvendelsen af urin fra sunde mennesker er det lave indhold af EPO i denne i sammenligning med urin fra anæmiske patienter. Desuden Indeholder urin fra sunde individer 15 visse inhiberende faktorer, som i tilstrækkelig høj koncentration virker mod erythropoiese, så at man kun kan ·· opnå en tilfredsstillende terapeutisk virkning af herudfra afledt EPO efter betydelig rensning.

EPO kan også udvindes fra fåreblodplasma, og 20 fraskillelsen af EPO fra sådant blodplasma har givet tilfredsstillende kraftige og stabile vandopløselige præparater. Jfr. Goldwasser, Control Cellular Dif. Develop., afsnit A, side 487-494, Alan R. Liss, Inc., N.Y.

(1981). Fåre-EPO må imidlertid forventes at være anti-25 gent hos mennesker.

Medens således EPO er et ønskeligt terapeutisk middel, er gængse isolations- og rensningsmetoder, der anvendes i forbindelse med naturlige tilførselskilder, ikke egnede til massefremstilling af denne forbindelse.

30 I USA patentskrift nr. 4.377.513 beskrives en fremgangsmåde til massefremstilling af EPO, der omfatter in-vivo-formering af humane lymfoblastoide celler, herunder Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 og JBL.

» DK 172953 B1 2a I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 2708-2712 (1984) beskrives der en fremgangsmåde til kloning og ekspression af proteiner i E. coli, hvilke proteiner er immunologisk reaktive med et monoklonalt antistof rettet mod humant EPO.

5 Det vises dog ikke, at det udtrykte protein rent faktisk er EPO, da proteinprodukterne ikke oprenses og sekventeres.

Kloning og ekspression af abe og human EPO genet beskrives ligeledes i et mødeabstract publiceret i Exp. Hematol. 12, 357 (1984). Disse referencer beskriver ikke en fremgangs- 10 måde til tilvejebringelse af en EPO nucleotidsekvens, ej heller beskrives en nucleotidsekvens for humant EPO, hvorfor disse referencer ikke indeholder information, der ville sætte fagmanden i stand til at isolere, sekventere og udtrykke humant EPO-kodende DNA.

15 De øvrige rapporter, som andre har udarbejdet vedrørende produktion af EPO ved hjælp af genteknologiske metoder, er fremkommet i den kommercielle litteratur.

m

O

3 DK 172953 B1

Imidlertid er der endnu ikke blevet offentliggjort skrifter, der muliggør en produktion, eller som omhandler produktets kemiske natur. I modsætning hertil tilvejebringer den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til 5 massefremstilling af proteiner, der udviser human-EPO's biologiske egenskaber. Det er også muligt ved hjælp af sådanne metoder at fremstille proteiner, der ganske vist kan afvige kemisk fra autentisk human-EPO, men alligevel udviser lignende (og i nogle tilfælde forbedrede) e-10 genskaber. For nemheds skyld vil alle sådanne proteiner, der udviser human-EPO's biologiske egenskaber, blive omtalt som EPO, hvadenten de er kemisk identiske hermed eller ej.

Den foreliggende opfindelse angår kloning af 15 et gen, som udtrykker overraskende høje human-EPO-ni-veauer, ekspressionen deraf og masseproduktion in vitro af aktivt human-EPO derudfra. Ligeledes beskrives egnede ekspressionsvektorer til produktion af EPO, ekspressionsceller, rensningsskemaer og dermed beslægte-20 de fremgangsmåder.

Som det vil blive beskrevet nærmere nedenfor, fås EPO i delvis renset form og renses yderligere indtil homogenitet og fordøjes med trypsin til dannelse af bestemte fragmenter. Disse fragmenter renses og sekvens-25 bestemmes. Der konstrueres EPO-oligonucleotider på basis af disse sekvenser, og disse syntetiseres. Disse oli-goer anvendes til screening af et humant genombibliotek, hvorudfra der isoleres et EPO-gen.

EPO-Genet verificeres på basis af sin DNA-se-30 kvens, som svarer til mange af de sekvensbestemte tryp- tiske proteinfragmenter. Et stykke af den genomiske klon anvendes derpå til ved hybridisering at påvise, at EPO-mRNA kan påvises i human-foster-mRNA (20 uger gammelt) .

Der fremstilles og screenes et human-fosterlever-cDNA-bib-35 liotek. Der fås tre EPO-cDNA-kloner (efter screening af ;> 750.000 rekombinanter). To af disse kloner bestem-

Mt.

O

4 DK 172953 B1 mes til at have fuld længde at dømme efter fuldstændig kodningssekvens og væsentlig'utrånslateret 5- og 3-be-gyndelsessekvens. Disse cDNA'er er blevet udtrykt både i med SV-40-virus transformerede abeceller [C0S-1-5 -cellelinie, Gluzman, Cell 23, 175-182 (1981)] og i ovarieceller fra kinesisk hamster [CHO-cellelinie, G.

Urlaub og L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4280 (1980)]. EPO'et, der produceres ud fra COS--celler, er biologisk aktivt EPO in vitro og in vivo.

10 EPO produceret ud fra CHO-celler er også biologisk aktivt in vitro og in vivo.

EPO-cDNA-klonen har en interessant åben aflæsningsramme på 14-15 aminosyrer (aa) med initiator og terminator fra 20 til 30 nucleotider (nt) længere til-15 bage i kodningsregionen. En repræsentativ prøve af E. coli transficeret med det klonede EPO-gen er deponeret hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hvor den har fået deponeringsnummeret ATCC 40153.

Herefter følger en beskrivelse af tegningen, 20 på hvilken fig. 1 viser påvisningen af EPO-mRNA i human--fosterlever-mRNA, fig. 2 skematisk viser nucløotidsekvensen for EPO-cDNA i lambda-HEPOFL13, 25 fig. 3 viser de relative stillinger af fire uafhængige human-EPO-genomiske kloners indsatte DNA, fig. 4 viser et kort over den tilsyneladende intron- og exonstruktur i human-EPO-genet, fig. 5A, 5B og 5C viser konstruktionen af vekto-30 ren 91023 (B) , fig. 6 viser SDS-polyacrylamidgelanalyse af EPO produceret i COS-l-celler sammenlignet med naturligt EPO, fig. 7 skematisk viser plasmidet pRKl-4, og fig. 8 skematisk viser plasmidet pdBPV-MMTneo-35 (342-12), og tabel I viser basesekvensen i et exon på 87 basepar i et human-EPO-gen,

O

5 DK 172953 B1 tabel II viser aminosyresekvensen i et EPO-pro-tein afledt ud fra lambda-HEP0FL131 s nucleotidsekvens, tabel III viser nucleotidsekvensen for EPO-cDNA i lambda-HEPOFL13 og den derudfra afledte aminosyresekvens,

5 tabel IV viser en DNA-sekvens i det i fig. 4B

viste EPO-gen, tabel V viser nucleotid- og aminosyresekvensen i EPO-klonen, lambda-HEP0FL6, tabel VI viser nucleotid- og aminosyresekvensen 10 i EPO-klonen, lambda-HEP0FL8, og tabel VII viser nucleotid- og aminosyresekvensen i EPO-klonen, lambda-HEP0FL13 15 Den foreliggende opfindelse angår kloning af EPO-gener og fremstilling af EPO ved in-vitro-ekspression af disse gener.

Patentlitteraturen og den videnskabelige litteratur er fyldt med fremgangsmåder, der rapporteres at 20 vare anvendeliqe til fremstilling af rekombinantproduk-ter. I reglen indebærer disse metoder isolering eller syntese af en ønsket gensekvens og denne sekvens' ekspression i enten en procaryot eller eucaryot celle ved hjælp af metoder, der er almindelig tilgængelige for 25 fagfolk. Når først et bestemt gen er blevet isoleret, renset og indsat i en Overføringsvektor (dvs. klonet), er dets tilgængelighed i en væsentlig mængde sikret.

Vektoren med sit klonede gen overføres til en passende mikroorganisme,eller cellelinie , f.eks. bakterier, gær, 30 pattedyrecelle^ såsom C0S-1 (abenyre), CHO (kinesisk hamsterovarie), insektcellelinier og lignende, hvori vektoren kopieres, efterhånden som mikroorganismen eller cellelinien formeres, og hvorfra vektoren kan isoleres ved hjælp af gængse midler. Der er således til-35 vejebragt en genkilde, der kan fornyes kontinuerliat . for vderliaere manipulationer, modifikationer oa over- 6 DK 172953 B1 o førsler til andre vektorer eller andre steder inden for den samme vektor.

Ekspression kan ofte opnås ved at overføre det klonede gen, i korrekt orientering og aflæsnings-5 ramme, til et passende sted i en overføringsvektor, så at translationsgennemlæsningen fra et procaryotisk eller eucaryotisk gen resulterer i syntese af en pro-teinprecursor, der omfatter den aminosyresekvens, der er indkodet af det klonede gen bundet til Met eller en 10 amino-endestillet sekvens fra det procaryote eller eucaryote gen. I andre tilfælde kan signalerne til igangsætning af transcription og translation leveres af et passende genomisk fragment af det klonede gen.

Der kan anvendes en række forskellige specifikke pro-15 teinfraspaltningsmetoder for at fraspalte den eventuelt producerede proteinprecursor på et ønsket punkt, så at den ønskede aminosyresekvens frigøres, og denne kan så renses ved gængse metoder. I nogle tilfælde produceres proteinet, der indeholder den ønskede amino-20 syresekvens, uden at der er behov for særlige fraspalt-ningsmetoder, og det kan også frigøres fra cellerne til et ekstracellulært væsktmedium.

Isolering af en genomisk klon af huinan-EPO

Human-EPO tenses indtil homogeneitet ud fra urin 25 fra patienter med aplastisk anæmi som beskrevet nedenfor. Fuldstændig fordøjelse af dette rensede EPO med protea-sen trypsin giver fragmenter, der fraskilles ved højtydende omvendt-fase-væskechromatografi, udvindes fra gradientfraktioner og underkastes mikrosekvensanalyse. Se-30 kvenserne i de tryptiske fragmenter er understreget i tabellerne II og III og omtales mere detaljeret nedenfor.

To af aminosyresekvenserne, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys og Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg; vælges til konstruktion af oligonucleotidsonder (hvilket resulterer i en oligo-35 nucleotidpulje 17 nt lang og 32 gange degenereret, og en oligonucleotidpulje 18 nt lang og 128 gange degene 7 DK 172953 B1 o reret, ud fra det første tryptiske fragment, samt to puljer 14 nt lange, hver 48 gange degenereret, ud fra det sidstnævnte tryptiske fragment). Den 32 gange degenererede 17mer pulje anvendes til at screene et humant geno-5 misk DNA-bibliotek i en Ch4A-vektor (22) ved hjælp af en modifikation af Woo og O'Malley's in-situ-amplifikations-metode (47) til fremstilling af filtre til screening.

Som anvendt her refererer de arabiske tal i parenteser (1)-(60) til publikationer, der er anført i num-10 merorden i slutningen af beskrivelsen.

Fag, der hybridiserer til 17meren; udtages, slås sammen i små grupper og sonderes med 14mer- og 18mer-puljer. Fag, der hybridiserer til 17mer-, 18mer-og 14mer-puljer, renses for plaque, og fragmenterne sub-15 klones ind i Ml3-vektorer til sekvensbestemmelse ved hjælp af dideoxykædetermineringsmetoden ifølge Sanger og Coulson (23) (1977). Sekvensen i regionen, der hy bridiserer til den 32 gange degenererede 17mer i en af klonerne, ses i tabel I. DNA-Sekvensen indeholder inden 20 for en åben aflæsningeramme de nucleotider, som kan kode nøjagtig for det tryptiske fragment, der anvendes til at udlede 17mer-puljen af oligonucleotider. Endvidere viser analyse af DNA-sekvensen, at den 17mer hybridise-rende region indeholdes i et exon på 87 basepar bundet 25 af potentielle splejsningsacceptor- og donorsteder.

Positiv bekræftelse på, at disse to kloner (her betegnet lambda-HEPOl og lambda-HEP02) er EPO-ge-nomiske kloner, er opn&et ved at sekvensbestemme yderligere exoner, der indeholder anden information, der ko-30 der for tryptisk fragment.

35

O

8 DK 172953 B1 U O w Η ω <i i>t

< E < H

boj H m O

5 g < 5 o £ J*> •S aj <J <ί HH o *-* o ti bfl g O _ o ^ Cd bo <3 O « ty - oo o< & 10 S3 ^ c ^ ^ 1 o < CO < f>» 2

bo ^ S

g g3 go § o Η o H x; bo u H *J .Η Η ® 4-i to α bo ,r 03 O H C -> o 5; < w £ -μ < w < < ti o t: g o w h _ - bo U i>. Η οι o bo HU O > £

m bo "M

20 S O „ < „ H

« S < .2 < g. S

Λ O O s < ti EH O £ bO . S ' bo < 2. O Λ s

g C U < H o O

cj cd 25 bo O ^ < w cj rt cd 0< ϋ< taO g, g bc| cc bo Hw<oUm g bo O >, og <£ -g bp HU UCL4 U O g

30 o O.O^UH S

bo Q^?Hcd H cq *£ g U U U > < S g bo o U^Hf^Obo +->

•g O Λ U xz O u Z

bo < Η < Η < < α 35 9 DK 172953 B1 O >- u al o cc -£ £ „ x: o ~ (S) R — c >- LU cj <y —<

O -—1 < = O

=3 —ί - C C

ς _I «C ^ Μ Γ2 LO > O < ^ g O π £·

Ξ Q- 5 3 O

< 3 S § g > -» s < > 10 O o S 2 5

£rfci 3 g) S I

I 2T —t < OT S

O M b0 15 cu £ >, u c- 0 o < ^ « lu 3 « >>

—' Ja æ *J

cc - o H lu - £ * H ^ > O ^ 20 dl X) —, <o rr! bi cd <a t-ι ω. c *. o 5 O - —1 S < o < <

M

=3 . W OT l·· - I o ^ 25 £ g £1 5 °° < Οι ^

R O W j C

LU »£ j-ι CO

-lo fJ < =3 U __ £ c H > 30

"3 I M

LU 3 ... SL

—1 .3 = ^ £ bi c! h if; t« <ol x·

^ < <1 H

=3 o 35 LU O 3 £ -1 & <3 < CL· _ ^ S - 2 O. < °«

<X

—1 J2 £ "«3 ^ _. <· o > DK 172953 B1 3 0 u o c o« ° £ o S 3 "w ' S j td 3 5 β β £ g C <a « Jc - C < < * u 5

>. "t 2 Λ JC

5| .j o Η H

μ α «λ a ir* “ « * 5 £7

< < -i < H

10 3 ~ C « S

^ > O < J

h V) •3 M « JC Ϊ», > Ξ < H -3 cj £· φ 3 ? u s *-* 15 ^ ^ ’ — Ρ» cn 5 £ £ 3 £ >'

tJ o o ^ ^ J

o ^ td s « * ^ < o H m ** ^-

H

20 ^ 3 o o ^ o ? o ^ 0) o V o ^ — h « ^ XI ° J a Ch *-< < — <0 3 3 O ^ S £ o ^ w j ϋ *4 .. p. x> α p 3 α 2 _2 c c> —j £ 25 < H *-» < ^

3 o £ « S

5 £ H < < ^ ^ & fe 2 £ J3 U H w w ή < 30 , a ^ a £ fe S 2 £ ” ϋ 1/3 »J < ^ ^ a c o ·2 i? c o; οι — £ ri [-< C/J w < ^ ^

„ cl ti D N U

ei </) f-* m r

35 > <1 < < < H

£ «1 s ε £ I

o > <J Λ <x < >> O π > J o £ Jj υ 11 DK 172953 B1 o H f- r~i t-, s-.fl « U Μ H «3 0 DO o u H n , m ω if § O jo O O -C O O J u O c H o <j o S o o “ ω feu o O (M J < 1H< Ό O co J o — o < _ M e·

60 CO

o u

y ϋ tn n — o rtO CJ o CO CO —( O o O

O O >^0 tU H U '"J H ^ " O <73 H —t H

α u uh j o < o h < ou co > o j <

*? £2 rn <f i M 30 CH CO CO CJO o O

5 H ?? , *5 . T (1 7h c 6: ω «C J < n < HU —< o 6 ϋ g* o o< > O O O << UU OO -5 O <o u tfi ff n tn c 5 en «S' 30 3 o >·. O > O w*n 3 < ri λΛ m <; C*SO u H H < ^ O CJ > < w <

ϋ 03 “ S £ O J H UO OO OO J < OO

(J 03

u ° JO OO 30 CH —i O 030 c H <n O

<ti UJ H * OH M <C Of-. μ O/ WC 3s < >0 J o J O << >0 < O «CO J *2 <J cl

Η ϋ 0-0 3-0 1-. O 30 30 30 —O CO

10 03 of j O J O > <! O H 1 < «C O H <c Η h <J

1U if o o O o o HiH j h oo jo >o OO

00 03 f. M r«. r-< O OO *UO μ O ff O JO « H <3 o

a U - iu β H Bh if O Cl O of H Q H J < «-(O

5 O I S 5 J O << M< S < > O C: U < O

OH 30 O O CO O QH 30 >n< M M 2o J «C M J«nO μ O JO CH J o g, if o So O O CO O H «C < < O JO oo

C3 O M

C3 3 C p O 30 OU 0)0 3 < CO DO

,r 77 M oo G H fif H *H «C 7- < J < J «C cH

15 iJ S’ S’ j o jo p o j -5 oo ou jo c: O 63 “ O o’ ol O JO 3 < CO μ O ro 13 1-

“ u So «3Η J < CO CO CH JO

tf}H > O OO HH WH JO -co H S 3 po tf«; σ h oo 3 o oooclo r, r? o Gh o μ o o j o o j o o o h o c o —.uo

η J £ is JO —. < O r> < O I0<0 r-JO o\ C. O — «CO

H to tO O

Mif S 3 po CO OH μ H DO 30 3 H

on .c S O PH CO 3? 3nO >-«C c H J < CJ

20 H jj q j (J (/) < (/1 O Η Η H *-J U OO t-)U

<1) Μ M % m pi o o o >Jo oo ao co so S So <n < jlo jch jo μ o oh

j o 63 «ΛΗ <0 0.0 Η H «C O HH JO

u ca

O S) p O O) H ti O CH 30 OO μ H

63 61 G H se > O -C. o .«n-rf OH μο jCO

a O JO MUH H «c «C ^ JO H o H< U 63 1 IJ if PO OO HO J H 6sO CO μ o Λ_ (. 43 ω l-f Μ H .c CJ <C H *-<C5 »-< < ^ o 25 υ JO ·-< H < Ϊ» o oo oo P < o 63 pH 30 C O æ «C C O μ o 30

u O p h CH η H OO O H

υ O f-IU *J O ·-< < *J 5 O O w H —I o

u <J

a o c,u κ o c*η μ o co μ η μ o

O 63 2 U 60·« 0)1 < JTO μο 6*0 OO

63 O HH < O << H«C HH Μ Η 1Λ <

O Μ I

U U po C < 30 0.0 JO C, O 630 pH μο J ~i tn C <73 Η * «ο1 < < μο

30 jo o-u o o <o >o «;/ < < O

63 60

5 uf Ηθ C < «60 O «; JO < 3 H

«3 O S O μο JO μ O J «C <CH 61 H

63 a HH CL O <0 (X. O OO > O JO

63 <71 U o a 4-1 < o IC O 3 o H u Η < Z3 o >> o

υ «Ο Jo «- υ ·-»< CJ Η 1 H OH —* O

υ oo < o *-*<o o o >o > o *-JH o o i 35

O

12 DK 172953 B1 ot/><Oau *» o rj co u* co coo ^ nO H (J u lj CO <5 U r] *j u

-«i *J < —« < CJ «I 63 *0 OCOcO 60 U

O *J 60 U O U toti

<0 U aj <j CJ 60 CO AJ

CJ <->U <3 0 CO 60 6. O 30 OtO*_jn3<*3UO^

μ O ·“< < OOU<OtOCO<J*J

< U O O e}Uc4*j60C043 63

O O rj 4J CO CO O

^ ti O >- O

X μ h o

O- H O O

4J 63 U *-* O Ui «3 60 O o cO O O *-» 60 o

μ H P < OCOrO tOcJUiJAJ

£ u -C (J OricOrJorjotJ

Η < Η < oorsocoriOtJ

CJ U 60 60 60 CO O 60 oocaa^oucj D O P CJ Γ360060^600Γ3

σ: < >* < ucjoatJCOOO

< o HH CJ U μ 60 C3 u 6QO

10 d H 3 O

r—i O CJ H

< o H O

tq o 60 ctj r3 O C3 o OU4Jtlci3Oeu>60 p μ n o 0AJUOC3c0n360 £ u > < 00«JAJ000060

H < *-J < cotOriOCOiJOCO

ÅJ 60 60 U o o 60^ Π 63 60 CJ O 606003

ου D O O 60 nj <3U 60 U> CJ

*-*H 6 H to<3co<ooaco6i *-( <z .►jo tocoatoaucoo

15 "7 u < a U

ω .= o >< < « y? Hi c *J <i a -P tooo 60a rg*_iija μ * ijuu ejtocou u a O t: <C >>< u co to u to co u to σ uL μ o ·-< o υο60€Λ0 60υ60«

<0 UO C3U60C3XJC3OAJO

0 060600 04-»0cj o o a rtc3ua*ja H 0 3 0 o 6 o tjcjouoaaucj j, η c h m u υ ton 4J o -u o <j cj a J__J *-* < O 4JC3UUOU6060C] 20 r-ι o < n o

Q) Wi (J *J H

O (J P CJ 63

4J4J4J60tOC36060a 60Ocjt3nr4J6j4->a H tc H C* O CJ00 636304-»0U

*—i o -c h ntjoa6tuoj6ou <0 HH OO60 63O*3O63r3

U Π 4J 4J U ti 60 CO U

004-1636063630 OH CH <0000063630 r-<o C < · O 630 <0 <3 O 4J<tf

<0 < <2 ΗΟ60Λ63Ο QJ 6J CJ

25 l·. < »J U VO 60 <

CO OO O μ CO

ΙΟ μ W Η ^ < <ί ...

OcdOrJi-106063 O O O rj 4J 4-J 60 *-* coo u υ a-cj 00 6063600 au

·—» O > < W<O6060fc34JUOCJ

<U HH <0 u 4-» 63 63 O 6363 C

O 63rø4J O 60 63 63

OiTjOOCO^neJ

00 ·-* υ x o ooa60*-»o*3«i

c_> OH *-4 o O O ' O 4J *J o 60 O

<c u > o OC304J4J<004JtJO

30 o h 6d< μ < «π < μ o _c o < u < u H < 00600*30*360

i Oi0i-iO634JO4J

o< o CJ ciuuo r3c0O4JO*J

uo -CH uo 63 cj 600 COU Π3 c3

Π CJ HH << AJ 60 60 63 63 C3 *fl O

63 60 <3 rø *1 6Q 63 O

u tj nj o C0 *-* 600

OH 3 U wOaj «j cOCOCOO

UO OHX^O O U O 60 *-v aj aj o HU r-J O to O H LO U *-* O0*j O 60 rj 35

O

13 DK 172953 B1

Isolering af EPO-cDNA-kloner

Northern-analyse (56) af human fosterlever-mRNA (20 uger gammelt) gennemføres ved hjælp af en enkelt-strenget sonde på 95 nt fremstillet ud fra en M13-klon 5 indeholdende en del af det i tabel I beskrevne exon på 87 bp. Som vist i fig. 1 kan der påvises et kraftigt signal i fosterlever-mRNA. Den præcise identificering af dette bånd som EPO-mRNA opnås ved at anvende samme sonde til at screene et bhkteriofag-lambda-cDNA-bibliotek for 10 fosterlever-mRNA (25). Der fås adskillige hybridise-rende kloner med en hyppighed på ca. 1 positiv pr.

250.000 screenede rekombinanter, De fuldstændige nucleo-tid- og afledte aminosyresekvenser for disse kloner (lamb-da-HEPOFLl3 og lambda-HEPOFL8) ses i tabellerne V og VI.

15 Den for EPO-kodende information er indeholdt inden for 594 nt i den 5-første halvdel af cDNA'et, omfattende en meget hydrofob leader på 27 aminosyrer og det modne protein på 166 aminosyrer.

Identificeringen af det modne proteins N-ende-20 stilling er baseret på den N-endestillede sekvens i det protein, der udskilles i urinen fra personer med aplastisk anæmi,som vist her (tabel I) og som offentliggjort af Goldwasser (26), Sue og Sytkowski (27) og af Yangawa (21). Om denne N-endestilling (Ala-Pro-Pro-Arg---) re- 25 præsenterer den faktiske N-endestilling, der findes på EPO i kredsløb, eller om der foregår en eller anden spaltning i nyrerne eller urinen, vides for øjeblikket ikke.

Aminosyresekvenserne, der er understreget i tabellerne II og III, angiver de tryptiske fragmenter 30 eller den del af N-endeetillingen, for hvilken proteinsekvens der findes oplysninger. Den udledte aminosyre-sekvens stemmer nøjagtig med de tryptiske fragmenter, som er blevet sekvensbestemt, hvilket bekræfter, at det isolerede gen koder for human-EPO.

35

O

14 DK 172953 B1

Human-EPO-qenets struktur og sekvens

De relative stillinger for indsat DNA fra fire uafhængige genomiske human-EPO-kloner vises i fig. 3. Hybridiseringsanalyse af disse klonede DNA'er med oligonu-5 cleotidsonder og med forskellige sonder fremstillet ud fra de to typer EPO-cDNA-kloner anbringer EPO-genet inden for regionen på ca. 3,3 kb, der vises med en fortykket linie i fig. 3. Fuldstændig sekvensanalyse af denne region (jfr. eksempel 4) og sammenligning med cDNA-kloner 10 resulterer i kortet over intron- og exon-strukturen i EPO-genet, der er vist i fig. 4. EPO-genet er delt i 5 ex-oner. En del af exon I, alle exonerne II, III og IV og en del af exon V indeholder proteinkodende information.

Pesten af exonerne I og V koder for hhv. 5-begyndelses-15 og 3-begyndelsessekvenserne, der er utranslaterede.

Forbigående ekspression af EPO i COS-celler

For at vise, at biologisk aktivt EPO kan udtrykkes i et in-vitro-celledyrkningssystem, foretages der undersøgelser af COS-celleekspression (58). Den vek-20 tor, der anvendes til undersøgelserne, p91023(B), er beskrevet i eksempel 5. Denne vektor indeholder den store sene adenovirus-promotor, en SV40-polyadenyleringssekvens, en SV40-replikationskilde, SV40-forstærker og adenovirus-VA-genet. Det indsatte cDNA i lambda-25 -HEP0FL13 (jfr. tabel VI) indsættes i p91023(B)-vektoren længere fremme i forhold til den store sene adenovirus-promotor. Denne nye vektor identificeres som pPTFL13.

24 timer efter transfektion af denne konstruktion til COS-l-celler af M6-stammen [Horowitz m.fl., J.

30 Mol. Appl. Genet. 2, 147-149 (1983)] vaskes cellerne, flyttes til serumfrit medium, oq cellerne høstes 48 timer senere. Friqørelsesniveauet for EPO til dvrkninqs-væskeoverfasen undersøges ved hjælp af en kvantitativ radioimmunanalvse for EPO (55). Som vist i tabel VIII 35 (eksempel 6) udtrykkes immunoloqisk reaktivt EPO. Den biologiske aktivitet hos det EPO, der produceres ud fra

O

15 DK 172953 B1 COS-l-celler, undersøges ligeledes. Ved et separat eksperiment transficeres den vektor, der indeholder EPO-cDNA fra lambda-HEPOFL13, til COS-l-celler, og mediet høstes som beskrevet ovenfor. EPO i mediet mængdebastemmes så 5 ved hjælp af en af to biologiske in-vitro-prøver, ^H-try-midin og CFU-E (12, 29) og ved en af to in-vivo-prøver, hypoxisk mus og udsultet rotte (30,31) (jfr. tabel IX, eksempel 7). Disse resultater viser, at der produceres biologisk aktivt EPO i COS-l-celler. Ved Western-aftryk' 10 ved brug af et polyklont anti-EPO-antistof har det EPO, der produceres af COS-celler, en mobilitet på SDS-poly-acrylamidgeler, som er identisk med naturligt EPO's fremstillet ud fra human-urin (eksempel 8). Således kan gly-cosyleringsomfahget af af COS-1 produceret EPO ligne na-15 turligt EPO's.

Der kan også anvendes forskellige vektorer indeholdende andre promotorer i COS-celler eller i andre pattedyreceller eller eukaryote celler. Eksempler på sådanne andre promotorer, der kan anvendes ved udøvel-20 sen af den foreliggende opfindelse, omfatter tidliq oq sen SV40-promotor , musemetallothionein-genprornotor, den promotor, der findes i de lange endestillede gentagelser i fugle- eller pattedyreretrovira, bacculovirus-polyhedrongenpromotoren og andre. Eksempler på andre 25 celletyper, der kan anvendes ved udøvelse af opfindelsen, omfatter E.coli, gær, pattedyreceller, såsom CHO (kinesisk hamsterovarie), C127 (abeepithel), 3T3 (musefibro-blast), CV-1 (afrikansk grøn abenyre), og insektceller, såsom fra Spodoptera frugiperda og Drosophila melanoga-30 ster. Disse alternative promotorer og/eller celletyper kan tillade regulering af tidsberegningen eller niveauet for EPO-ekspression, fremstilling af en celle-specifik EPO-type eller vækst af store· mængder af EPO-producerendc celler under mindre kostbare og lettere regulerbare be-35 tingelser.

Et ekspressionssystem, som bibeholder fordelene 16 DK 172953 B1 o ved pattedyreekspression, men kræver mindre tid til at producere en celle-linie med højt ekspressionsniveau, er sammensat af en insekt-cellelinie og et DNA-virus, der reproducerer i denne cellelinie. Virusset er et 5 nukleært polyhedrosis-virus. Det har et dobbelstren-get cirkulært DNA-genom på 128 kb. Nucleocapsidet er stavformet og findes emballeret i to former, den ikke--occluderede form, et membranknopdannet virus, og en occluderet form, emballeret i et proteinkrystal i den 10 inficerede cellekerne. Disse vira kan formeres rutinemæssigt in vitro i insektcellekulturer og kan tilpasses til alle dyrevirologiske rutinemetoder. Celledyrkningsmediet er i reglen en næringssaltopløsning og 10% kalve fos terserum.

15 In vitro igangsættes virusvækst, når et ikke- -occluderet virus (NOV) trænger ind i en celle og bevæger sig mod kernen, hvor det replikerer. Replika-tionen er nukleær. Under den indledende fase (8-18 timer efter infektion) af den virale påføring samles nucleo-20 capsider i kernen og skyder derpå gennem plasmamembranen som NOV'er og spreder infektionen via cellekulturen.

Desuden forbliver nogle af nucleocapsiderne derpå (18+ timer post-infektion) i kernen og occluderes i en proteinmatrice, kaldet det polyhedrale inclusions legeme.

25 (PIB). Denne form er ikke infektiøs i cellekultur. Matricen er sammensat af et protein, kaldet polyhedrin, MW 33 kd. Hvert PIB er ca. 1 mm i diameter, og der kan være helt op til 100 PIB'er pr. kerne. Det er klart, at der produceres en stor mængde polyhedrin sent i infek-30 tionscyklen, helt op til 25% af det samlede cellulære protein.

Da PIB ikke spiller nogen rolle i replikations-cyklen in vitro, kan polyhedringenet udelades fra vi-ruschromosomet, uden at dette påvirker levedygtigheden 35 in vitro. Ved at anvende virusset som ekspressionsvektor er polyhedringenkodningsregionen blevet erstattet med

O

17 DK 172953 B1 det fremmede DNA, der skal udtrykkes, idet det anbringes under polyhedrinpromotorens styring. Dette resulterer i en virusphenotype, der ikke danner PIB.

Dette system er blevet benyttet af flere for-5 skere, hvoraf de kendteste er Pennock m.fl. og Smith m. fl. Førstnævnte (Gregory D. Pennock, Charles Shoemaker og Lois K. Miller, Molecular and Cell Biology 3, 84, side 399-406) har berettet om et bakterielt proteins, B-galactosidases høje ekspressionsniveau, når det sæt-10 tes under polyhedrinpromotorens styring.

En anden ekspressionsvektor afledt ud fra nu-kleært polyhedrose-virus er blevet omtalt af Smith m.fl.

(Gale E. Smith, Max D. Summers og M.J. Fraser, Molecular and Cell Biology, 16. maj 1983, side 2156-2165). De har 15 påvist deres vektors effektivitet ved hjælp af ekspression af human-B-interferon. Det syntetiserede produkt viste sig at være glycosyleret og at udskilles fra in-sektceller, som det var forventet. I eksempel 14 beskrives de modifikationer af plasmidet, der indeholder poly-20 hedrongenet for nuklesrt polyhedrose Autographa califor-nicavirus (AcnNPVj, som muliggør let indsættelse af EPO-genet i plasmidet, så at det kan være under polyhedrinpromotorens transcriptionsstyring. Det opnåede DNA co--transficeres med intakt chromosom-DNA fra en vild type 25 AcNPV til insektceller. En fuldført genetisk rekombination resulterer i erstatning af AcNPVC-polyhedrin-genre-gionen med DNA'et fra plasmidet. Det opnåede rekombinan-te virus kan identificeres blandt de virale efterkommere ved, at det er i besiddelse af EPO-genets DNA-sekven-30 ser. Dette rekombinante virus forventes efter reinfice-ring af insektceller at producere EPO.

Eksempler på EPO-ekspression i CHO, C127 og 3T3 samt insektceller findes i eksemplerne 10 og 11 (CHO) , 13 (C127 og 3T3) og 14 (insektceller).

35 Rekombinant EPO produceret i CHO-celler som i eksempel 11 renses ved gængse søjlechromatografiske me-

O

18 DK 172953 B1 toder. De relative sukkermængder, der forekommer i glycoproteinet, analyseres ved hjælp af to uafhængige metoder [(i) Reinhold, Methods in Enzymol. 50, 244-249 (Methanolyse), og (ii) H. Takemoto m.fl.. Anal. Biochem.

5 145, 245 (1985) (pyridylaminering sammen med uafhængig sialsyrebestemmelse)]. De resultater, der fås med hver af disse metoder, stemmer udmærket overens. Der foretages såledés adskillige bestemmelser, hvilket giver følgende gennemsnitsværdier, hvor N-acetylglucosamin 10 af hensyn til sammenligningen gives værdien 1.

Sukkerforbindelse Relativt molært niveau N-Acetylglucosamin 1

Hexoser: 1,4 15 Galactose 0,9

Mannose 0,5 N-Acetylneuraminsyre 1

Fucose 0,2 N-Acetylgalactosamin 0,1 20

Det skal bemærkes, at der reproducerbart iagttages signifikante niveauer af fucose og N-acetylgalac-tosamin, når begge de uafhængige sukkeranalysemetoder anvendes. Tilstedeværelsen af N-acetylgalactosamin 25 viser tilstedeværelse af O-bundet glycolysering på proteinet. Tilstedeværelsen af O-bundet glycosylering vises endvidere ved SDS-PAGE-analyse af glycoproteinet efter fordøjelse af glycoproteinet med forskellige kombinationer af glycosidiske enzymer. Efter enzymatisk fjernel-30 se af alt N-bundet carbonhydrat på glycoproteiner ved hjælp af enzympeptidet endo-F N-glycosidase reduceres proteinets molekylvægt især efter derpå følgende fordøjelse med neuraminidase 'som’bestemt ved SDS-PAGE-analyse .

35 Det rensede rekombinante EPO's biologiske ak tivitet in vitro afprøves ved hjælp af G. Krystal's me-

O

19 DK 172953 B1 tode i Exp. Hematol. 11, 649 (1983) (miltcelleprolifera-tionsbioanalyse) med proteinbestemmeIser udregnet på basis af aminosyresammensætningsdata. Efter mange bestemmelser beregnes det rensede rekombinante EPO's specifik-5 ke in-vitro-aktivitet til at være større end 200-000 enh./ mg protein. Gennemsnitværdien ligger i intervallet ca.

275.000-300.000 enh./mg protein. Desuden iagttages også værdier på mere end 300.000. In-vivo/(polycytæmisk museprøve, Kazal og Erslev, Am. Clinical Lab. Sci., bd. B, 10 91 (1975)/in-vitro-aktivitetsforhold iagttaget for det rekombinante materiale ligger i intervallet 0,7-1,3.

Det er interessant at sammenligne glycoprotein-karakteriseringen, der er anført ovenfor, med karakteriseringen af et rekombinant CHO-produceret EPO-materiale, 15 der tidligere er omtalt i offentliggjort international patentansøgning nr. WO 85/02610 (offentliggjort 20 juni 1985). Den tilsvarende sammenlignende sukkeranalyse, der er beskrevet på side 65 i ansøgningen, anfører en værdi på 0 for fucose og for N-acetylgalactosamin og et 20 hexoser/N-acetylgalactosamin-forhold på 15,09:1. Den manglende N-acetylgalactosamin tyder på manglende O-bundet glycosylering i det tidligere omtalte glycoprotein.

I modsætning hertil indeholder det rekombinante CHO-pro-ducerede EPO, der er beskrevet oven-

25 for, signifikante og reproducerbart påviselige mængder af både fucose og N-acetylgalactosamin, indeholder mindre end 1/10 af den relative hexosemængde og er karakteriseret ved tilstedeværelsen af O-bundet glycosylering. Yderligere kan den høje specifikke aktivitet af det oven-30 for beskrevne, af CHO afledte rekombinante EPO

direkte relateres til dets karakteristiske glycosyleringsmønster.

Det biologisk aktive EPO, der er produceret ved procaryot eller eucaryot ekspression af de klonede 35 EPO-gener ifølge opfindelsen, kan anvendes til in-vivo--behandling af pattedyrfearter af læger og/eller dyrlæ-

O

20 DK 172953 B1 ger. Mængden af aktivt stof vil naturligvis afhænge af sværhedsgraden af den lidelse, der behandles, den valgte indgiftsvej og det aktive EPO's specifikke aktivitet og vil i sidste instans blive afgjort af den læge eller dyr-5 læge, der har tilsynet. En sådan mængde aktivt EPO, der fastsættes af den tilsynsførende læge, vil her også blive omtalt som en ΈΡΟ-behandlingseffektiv" mængde. Således er til behandling af fremkaldt hypoproliferativ anæmi, der står i forbindelse med kronisk nyresvigt, hos får 1o den effektive daglige mængde EPO 10 enh./kg i fra 15 til 40 dage. Jfr. Eschbach m.fl., J. Clin. Invest. 74, 434 (1984) .

Det aktive EPO kan indgives ad en hvilken som helst vej, der er passende for den tilstand, der behand-15 les. Fortrinsvis injiceres EPO i blodstrømmen på det pattedyr, der behandles. Det vil for fagfolk være indlysende, at den foretrukne indgiftsvej varierer alt efter den sygdom, der skal behandles.

Selv om det er muligt at indgive det aktive EPO 20 som en ren eller i det væsentlige ren forbindelse, foretrækkes det at indgive det som en pharmaceutisk tilberedning eller præparat.

Tilberedningerne, både til veterinær og til human anvendelse, omfatter et aktivt 25 EPO-protein som beskrevet ovenfor sammen med et eller flere pharmaceutisk acceptable bærestoffer dertil og e-ventuelt andre terapeutiske bestanddele. Bærestoffet(rne) skal være "acceptable" i den forstand, at de er forligelige med de øvrige bestanddele i tilberedningen og ik-30 ke er skadelige for den, der skal indtage præparatet. Tilberedningen må helst ikke omfatte oxiderende midler eller andre stoffer, med hvilke man ved at peptider er uforligelige. Tilberedningerne kan bedst fremstilles i enhedsdoseringsform og ved hjælp af en hvilken som helst 35 af de velkendte metoder. Alle metoderne omfatter et trin, hvori det aktive stof associeres med bæreren, der

O

21 DK 172953 B1 er sammensat af en eller flere yderligere bestanddele.

I reglen fremstilles tilberedningerne ved at bringe det aktive stof i homogen og intim associering med flydende bærere eller findelte faste bærere eller begge dele S og derpå, om nødvendigt, udforme produktet til den ønskede tilberedning.

Tilberedninger, der er egnet til parenteral indgift, omfatter gerne sterile vandige opløsninger af det aktive stof med opløsninger, der fortrinsvis er iso-toniske med modtagerens blod. Sådanne tilberedninger fremstilles bedst ved at opløse fast aktivt stof i vand, så at der fås en vandig opløsning, og at gøre opløsningen steril og fylde den i enheds- eller multidosisbe-holdere, f.eks. lukkede ampuller eller hætteglas.

15 EPO/cDNA, som det anvendes her, omfatter det modne EPO/cDNA-gen, og forud herfor findes et ATG-codon og EPO/cDNA, der koder for allele variationer af EPO--protein. En allel er vist i tabellerne II og III.

EPO-Proteinet omfatter 1-methionin-derivatet af EPO-pro-20 tein (Met-Pro) og allele variationer af EPO-protein.

Det modne EPO-protein, der er vist ved sekvensen i tabel II, begynder med sekvensen Ala-Pro-Pro-Arg..., hvis begyndelse er afbildet ved tallet "1" i tabel II. Met-EPO begynder med sekvensen Met-Ala-Pro-Pro-Arg....

25 Opfindelsen Vil i det følgende blive nærmere belyst ved hjælp af eksempler, hvor alle temperaturer er anført i grader Celsius og er ukorrigerede.

Eksempel 1 30 Isolering af eft genomisk EPO-klon EPO renses ud fra urin fra patiénter med aplastisk anæmi hovedsagelig som tidligere beskrevet [Miyake m.fl., J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977)] med undtagelse af, at phenolbehandlingen elimineres og erstattes med 35 varmebehandling ved 80°C i 5 minutter for at inaktivere neuraminidase. Sluttrinnet i rensningen er fraktione-

O

22 DK 172953 B1 ring på en "C-4 Vydac" HPLC-kolonne (The Separations Group) ved hjælp af 0-95% acetonitrilgradient med 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) i løbet af 100 minutter. EPO' s stilling i gradienten bestemmes ved gelelektroforese og 5 N-endestillet-sekvensanalyse (21, 26, 27) af de største spidser. EPO elueres med ca. 53% acetonitril og repræsenterer ca. 40% af det protein, der underkastes omvendt--fase-HPLC. Fraktioner, der indeholder EPO, inddampes til lOO^uliter, justeres til pH 7,0 med ammoniumbicarbo-10 nat, fordøjes fuldstændig med 2% TPCK-behandlet trypsin (Worthington) i 18 timer ved 37°C. Det tryptisk fordøjede underkastes derpå omvendt-fase-HPLC som beskrevet ovenfor. Den optiske densitet ved både 280 og 214 nm overvåges. Godt adskilte spidser inddampes til næ-15 sten tørhed og underkastes direkte N-endestillet-amino-syresekvensanalyse (59) ved hjælp af en gasfasesequenta-tor model 480A fra Applied Biosystems. De opnåede sekvenser er understreget i tabellerne II og III. Som beskrevet ovenfor vælges to af disse tryptiske fragmenter 20 til syntese af oligonucleotidsonder. Ud fra sekvensen Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (aminosyrer 46-52 i tabellerne II og III) fremstilles en 17mer degenereret 32 gange

TTCCANGCGTAGAAGTT

25 og en 18mer deaenereret 128 aanae

CCANGCGTAGAAGTTNAC

30 Ud fra sekvensen Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (aminosyrer 14 4-150 i tabellerne II og III) fremstilles to pulj-er af 14mere, hver degenereret 32 gange

TACACCTAACTTCCT og TACACCTAACTTCTT

35 som er forskellige i leucincodonets første stilling. Oli- 32

O

23 DK 172953 B1 gonucleotiderne mærkes i 5-begyndelsesenden med P ved hjælp af polynucleotid-kinase (New England Biolabs) og 32 γ- P-ATP (New England Nuclear). Oligonucleotidernes specifikke aktivitet varierer mellem 1000 og 3000 Ci/ 5 mmol oligonucleotid. Et genomisk human-DNA-bibliotek i bakteriofag lambda (Lawn m.fl., 22) screenes ved hjælp af en modifikation af in-situ-amplifikationsmetoden, der oprindelig er beskrevet af Woo m.fl. (47), 1978.

5

Ca. 3,5 x 10 fag udstryges med en tæthed på 6000 fag 10 pr'. 150 nun Petriskål (NZCYM-medium) og inkuberes ved 37°C, indtil plaquerne er synlige, men små (ca. 0,5 mm). Efter afkøling ved 4°C i en time overføres duplikatkopier af plaquemønstrene til nylonmembraner (New England Nuclear) og inkuberes natten over ved 37°C på 15 friske NZCYM-plader. Filtrene denatureres derpå og neutraliseres ved at flyde hver i 10 minutter på en tynd film af hhv. 0,5N NaOH - 1 molær NaCl og 0,5 molær Tris (pH 8) - 1 molær NaCl. Efter bagning i vakuum ved 80°C i 2 timer vaskes filtrene i 5 x SSC, 0,5% SDS i 1 20 time, og celleresterne på filteroverfladen fjernes ved forsigtig skrabning med en våd serviet. Denne skrabning reducerer sondens'baggrundsbinding til filtrene. Filtrene skylles derpå med vand og præhybridiseres i 4-8 timer ved 48°C i 3 molær tetramethylammoniumchlorid, 25 10 mmolær NaPO. (pH 6,8), 5 x Denhardt's, 0,5% SDS og 4 32 10 mmolær EDTA. Den med P mærkede 17mer tilsættes derpå ved en koncentration på 0,1 pmol/ml, og hybridiserin-gen udføres ved 48°C i 72 timer. Efter hybri'disering vaskes filtrene omhyggeligt i 2 x SSC (0,4 molær NaCl -30 0,03 molær Na-citrat, pH 7) ved stuetemperatur og der på i én time i 3 molær TMAC1 - 10 mmolær NaP04 (pH 6,8) ved stuetempératur oq i 5-15 minutter ved hybridiserings-temperatur. Der påvises ca. 120 kraftige duplikatsignaler efter 2 dages autoradiografi med forstærkerskærm.

35 De positive udvælges»grupperes i puljer på 8, udstryges igen og screenes igen in triplo ved hjælp af halv- 24 DK 172953 B1 o delen af 14mer-puljen på hver af to filtre og 127meren på det tredje filter. Betingelserne og 17meren til ud-strygning og hybridisering er som beskrevet ovenfor med undtagelse af, at hybridisering for 14meren sker ved 37°C.

5 Efter autoradiografi fjernes sonden fra 17mer-filteret i 50% formamid i 20 minutter ved stuetemperatur, og filteret rehybridiseres ved 52°C med 18mer-sonden. To u-afhængige fag hybridiserer til alle tre sonder, DNA fra en af disse fag (her betegnet lambda-HEPOl) fordøjes 10 fuldstændig med Sau3A og subklones ind i M13 med henblik på DNA-sekvensanalyse ved hjælp af Sanger og Coulson's (23) dideoxykædetermineringsmetode (1977). Nucleotidse-kvensen og den udledte aminosyresekvens i den åbne af-læsningsramme, der koder for det tryptiske EPO-fragment 15 (understreget region), er beskrevet her. Intronsekvenser er anført med små bogstaver, og exonsekvenser (87 nt) er anført med store bogstaver. Sekvenser, der stemmer overens med samstemmende splejsningsacceptor-(a)- og -donor-(d)--steder, er understreget. (Jfr. tabel IV).

20 25 30 35

O

25 DK 172953 B1 c O o ° 0 οθοοθ2£ο£ ® o S 5 £ £22 2 __ n sr vo r- ct\—<-< —< ,, u CO <1 « fl U u o CO CO cd U μ bO CO O u

M2 u S ri « CJ u O d d co rt u G >o i-j o *J

MS MonuSioou d oo m CO α H uu < u o ΜιΜιΜιΜο^Πίου S d « U u to < 3< od «0 f? ff £? «JtJfOCOtO O S d CO O d CO 5 HU U CO tJ

2 Μ,. Μ ω ω rt o o o S cd cq ad co ω c_> o- o eo

'2 2 ωθ2θΟ-Ζθ d O*JOC0B3«)-dOCe CO

ηϊ» ? MunuS u 3 coco a <-> u *j U 4- u *-* f{ fo d ω (ΐ μ 2 co 8 cod ου CO a o C. CO o

in ti uUudofiOeOUU

10 ff ff “.ti u o U. O co · cfl nu coco du u-jur « JE f i > 1 II r h Q M (J CJ CO CO C* CO CO CO to ^ H d MM fJ u o ri O 2 o u co ci u a d u υ <u m cju co u co u o G ° ti coco u t> co o £2 π! £ΐ ri 5f Μ Μ «I a u n U ri CO α oo u o CO d*j U U < Η « " « M 2 S μ .3 S u oo uu ud o * o s h c u •CO U · d „ o R Μ Μ Μ M U CO CO O COij (n 4 ·; « u

Unto ϋυυϋυ o CO U4-* IJ BO Uy ϋιΟ<<^ ff 2 O uco22u CO M U O «COtoSlO^jOOW iiH M 11 IC K U M u α 4J4J to O to bfl h W <ί H tc H & S . & 3 2 u. o ϋ.α ω u MCI ^ “ S3 £ H S3 3 fiMouduOuU S) COCOCO«COut)tiO»Htl 15 - li I I I i IHIIHIIls

s£ssSs8§i? S, S a i? 8 S* ti S32SS

i il 11 ri 11 iHiit i i| e lI II|I i! f 1II11 irillil 20 2 ^ g “ 2 « 8 “ 2 E o « 5 S £? 2 “Sh3“· æ a u 2 * M 2 ft O-H Μ 2 “o « .s f. S fiio " Ϊ

ϊ ?»S“ifg§ga s f S · S “ 3 eJ^iS

“•S s 2 S g-B 8 *»8 is f 2 12'lllls . HS-iiii-liils i si!«!! '3 S J s|§ 8SS S! S 3 !3·5-!ξ> tåSstsiE§ss ss s sss E J8 Ss d 1 “ Η Μ Μ £ H S Ml co S ώ co o f! ο ο-υ *-* u.eo u.ti u M to, u «? *> fS f? f, u cOu u μ u α u S « S ? u a 8 ίί U 5 22 O U d 2 H f- < in « I 2 I § Hl 8 I 5 il ? 3 så.eisls • « o « f, 2 S, 8 R U a to u U U C U O Π-Η <n oo coo d c O ¢0 v U H ®5 m m ri u CO η u μ o ^ ® CO o ti o U o g o 2 g 22 2 ω 22 2 f- h <-> o •in °ti«>fci <3eptj<g 2 2ou«co«tjoociu ;·:ϊ'!ί5|'ίΓϊ S ϊί! eiS^s “Isfflålss ί;;!ίϋ Sits j s 35

O

26 DK 172953 B1 σ o o o o o O v O cn O ir»

r in VD CQ ·—< <N

° --i —< *-< Cvl <nj U u O X u 5$ tt> 50 ' fcO fl «J cj cj o < μ «! co 60 o ^ o o to u « U O. « <5 ti a JJ fltJto a m < ιλ to oo o ©o oo ω 4-i oo i_j 44 ca <J « *j u 44 ©o ae« a 4j -< o oo a ci oo « n u eo o u cj n ©° oo oo oo oo a οι oa u <J n r, aJ cj ifl β ^ «? aj g «3θΟ·Η^ to OO O ^ 00 fl <j

ri q μ C U ojAJaj*-* cjUctO

. cj ta , o > w cj to « «J.oo m o 00 J-, W 01 ©0 ti, Π 2, a O! oo ,u (j oo Li .c 4-i α oo 4-* oo a α oo O « «if v Cl " 44 Μ ° ° « ci u o o 4» Μ Ϊ 2 " σ oi oo 00 O’ U <3 2 2 (i <£ 44 C «-< 01 M ·* Si 41 β Cl 44 01 t-, 0 44 03 OO ΰ Οι U u 00 00 01 < (O iJ 44 J? a Jj* 44 44 jj oo oo <2 2 4J « oo a a m u o S’ < .5 o 4J . a oo α oo u «.os O oo c ^ 44 α oo 4J 44 o u O0

44 O o O 44 0 44 4J 44 ^ (_> 44 OO

oO O I_i rt *4 44 fl,4J0) O 01 oo a u < Jj 4J oo oo α oo ©o « u o . m 5 < 44 ω' oJ ft ω o 4 15 --- i- OO OJ) 33 *4 ^00^44 a 44 O)

1D · α OO 5} 44 0 U α S, 03 o OO

in -< 0 ΓΤ t 4J 01 0 ©0 0 Y\ £, S £ ^ 41 ^οοοοροοοίο

V C o ,„ S *4 u “.c 0.3 U.M

U O 03 < W 44 S 44 ^ 03 03 44 AJ

O 3 U UB ϋ α Γ3. <-> 03 „ a ^ η-ι α 44 y o ti 5? u ff o 2 u

>_4 t I 50 r. # * AJ t I Q (J ^ o CJ

Π 4J O 44 4J 00 44 00 00 44 a . 4_, o y —(00 44 a 00 44 rt o

t· M t) na O u O m Ο OO u 4J

H 2 03 2 3 M ir 00 o 00 „ 44 u o o 5 ,q 44 a ?P <-) 44 u o 03 20 5 5'^ 5 3 5 s S j i

*5 CJ CJ (j <] O ^ CJ H ^ ri CO ^ CO

(0 i/4«SmO44t0uMaR,o1j E-< u 3 G >, ω 3 « « οι 5 οι O OO^G'^^a S 03« <J 44 44 tJ O Γ, TI O 04> rt 44 JJ 44 JJ 0 u 2 01 „ i o 4- 2 « oo 4i u a0 cj oo tj o < ^ to ti ® t a J5 ° π rt.ouu<n 44 04 , 44 a (J 00. to S o ‘Η λ *5 ^ a t> a 44 « 44 44 o ϋ ??ϋ II ^ ^ o

t> M U 11 a y 00 00 a 44 (J

% α α o i- £f a o J ο ω μ a,i {- Η 44 <-i o οι υ 44 u ?5 S «44 CJ « 44 44 OO OJ CJ 01 44 ^ SSii uhu uMo « Me tv coij o < to oo a 44 0 eo “«« H ω tf 4J oo α oo u ti to. i, < u « · ο a ο 5.-0 OO 00 ofl (4 Η O 03 (J 44 4J 00 οι a«£f uo£ « ο ω 0 44to m«m H ·= oo οι σ oo oo < a touij {-< o- « oa ο οι to 5 a ίτ M ti pcSolO|OOco440 ϋ ω ff 5 q u 00 a oo 4J a a S a ti 5-¾ i, oo to 4j u a« tv S tv Η Η μ OOa « C3 «Cl

SuS p a u 4> o ti, a «44 £? «,« O > 44 y · 44 to to J. 44 30 t! rt U ·6“^2,4| 44 44«« ., cj #i ^ /i tfl w t3 ¢3 fly tt 5) y 5,5" *4 Μ ω " «44 it ω u owo o«4ju d4< 35

O

27 DK 172953 B1 s > § I § i § § i £ 3 o< S ^ ^ n ro

O

3.5823.5 8-¾¾¾¾¾ «sSSM SB § g^o £oo S ou§|l<g5 o ir irf ^ o -i 60 u OUHH o o y -$ < o < «

Η H O O O <! g 5 w 8 > O 5 O 3 o O ‘ S δ S

8 > 8 £8 8 2 853¾ E o P HO B S o fsgioB 3 y9 8 iu 8 < £ ου O H u

Sspt^-a 3££j!g. -s g'B s g y g g

10 ^sSB5 8 888^« 8§S“S§SS

8¾ §<2 8 3 S 3£83§£ 8§§§§·ΐ|·§ S?Cifi?»3 ?5SJ 8g g y g I “ <rt2 3h « « e® O «o >> O 5 Η o H 8 . o u o ^ o *c o *3 * *j ff 8<ο«/υ 8 g B's 8 8 £ δΰ^δί 3 s £·£§£&§ 83§£§ff O - H C S £ « g E fco £ 8 o C o < . O 0.0 ,5 ~ 88g>s£ £ g gj5g< oggg8 B g g S S>P<il S ||gå g i.8 88 3 8 a é I Ullif IH!Islll.ll.f * Ilfpl 1 I I! 1.11 •3 3 g dg £8 g> o£^S g ' § S'g 3 8 2 20 Λ 2 O oO >> £ 3 ^%dfc ^ 8 8 o 8 υυ α «ι eo Ri ou 4-i «0 § “< >> 5 8 £ 8 d . 8 8-0 o 8 ! < £ 3 s a 1 g j d g g § g g§ d 3 «ί8·3 ff δ <oo^8ggsg g.§ y s

<j o>o>.u oo g*;S^-gd’oo· 8 8 O ί JO

S yg83ffff 8 S g jj 8 o 8 8 8 oo oo ff Såsj a « p8|SoSgs.g3.8« 25 « υϊ H a u u p^tf^Oo8o<8oSoo S g| 85. S 8 p8o.g o.g g 8 8.8 -3 - 8 8 J o > S 8 858? S g < g g g § S 8 8 g]S3 »3 §3g! g g ili-ip-gs S y 5 8 3 8 8 S |-g| o o O o υ O o go u n q D C ^ 5? W Η ζί H j5, [j n » O O U ^ cd S 8 <H· ee o < o H C · o 2 S 2 r ri ^ 2 to S U jOU “ o SSji υ g S O 5 <B 3 3 30 i? B λ R ? i? eo 8^ομΓίοθ<οΗ8 o ~

S g_8 8 ^ a ff 8°8og HO OH HO H O

35

O

28 DK 172953 B1

Eksempel 2

Northern-analyse af human-fosterlever-mRNA

5^ug human-fosterlever-mRNA (fremstillet af en 20 uger gammel fosterlever) og voksen-lever-mRNA elektro-5 foreseres i en 0,8% agarose-formaldehydgel og overføres til nitrocellulose ved hjælp af Derman m.fl.'s metode,

Cell.· 23, 731 (1981). Derpå fremstilles en enkeltstren-get sonde ud fra en Ml3-skabelon indeholdende det i tabel I viste indsatte. Igangsætteren er en 20mer afledt 10 ud' fra samme tryptiske fragment som deri oprindelige 17mer-sonde. Sonden fremstilles som tidligere beskrevet af Anderson m.fl., PNAS, (50) (1984) med undtagelse af, at ef ter fordøjelse med Smal (som giver den ønskede sonde med en længde på 95 nt indeholdende 74 nt kodningssekvens) '5 renses det lille fragment fra Ml3-skabelonen ved chroma-tografi på en "Sepharose" Cl4B-kolonne i 0,IN NaOH -0,2 molær NaCl. Filteret hybridiseres til ca. 5 x I0b cpm af denne sonde i 12 dage ved 68°C, vaskes i 2 x SSC ved 68°C og eksponeres i 6 dage med en forstærkerskærm.

20 Et enkelt markørLmRNA på 1200 nt (vist ved pilen) køres i en tilstødende bane (fig. 1) .

Eksempel 3

Fosterlever-cDNA

25 En sonde, der er identisk med den i eksempel 2 beskrevne^fremstilles og anvendes til at screene et fo- · sterlever-cDNA-bibliotek fremstillet i vektoren lambda--Ch21A [Toole m.fl., Nature 25 (1984)] ved hjælp af standard-plaquescreening (Benton Davis, Science (54) 30 (1978). Der isoleres tre uafhængige positive kloner (her betegnet lambda-HEPOFL6 (1350 bp) , lambda-HEPOFL8 (700 bp) og lambda-HEP0FL13 (1400 bp) efter screening af 1 x 10^ plaquer. Hele det indsatte lambda-HEPOFLl3 og lambda-HEPOFL6 sekvensbesteinmes efter subkloning ind 35 i Ml3. (Hhv- tabellerne VII og V). Kun dele af lamb-da-HEPOFL8 sekvensbestemmes, og resten antages at være

O

29 DK 172953 B1 identisk med de to andre kloner (tabel VI). De utrans-laterede 5-begyndelses- og 3-begyndelsessekvenser er vist ved"små bogstaver. Kodningsregionen er vist ved store bogstaver.

5 10 15 20 25 30 35

O

30 DK 172953 B1 Γ3 cg OM >· O tflO Η H O tj 30 0UHOwOOv»< CO O .JO O >> O O O —1 CJ O CJ M O O O rsiCiO ντ X ^ fX, O O O <N _J <, ^ H < O s O 03 J u —' OQ < ^ M H —- -J < f3 to

Μ V

BO c/J H 3> O C O CJ O CO CO J O Cl U ωυ m >. (j UJ H J O j H J <J JO C Η η H J o u OH J O <0 J < OO <0 >0 J < < (_> 5 '

μ 3< JO 30 CH CO CO ΛΟ DO CO

π j .< < η «—(<.£</!< J < j < *—I O JO — H

rq 60 >0 OO < < OO OO <0 «£ O O H

to « j

2> O O < 30 30 X O X O »< 3< J H

B iJ c« O <3 Η ^ Η O H O S *n »C c_) CJ u cuO *JH O O OO O O Μ *< o O H < n to W “ 30 30 CH J O Μ O O. H tn O D.O, UH CH ca < o H CO tn <ί X < w < JO JO << >o < o < O J < o

10 60 tJ

ϋ β >* O CO 30 30 30 <-» o C O CH

u ti JO X < oH J < cH CH —·1 U

O O OO HH J H OO JO > O OO <0 t3 tD <

ff ff 30 MO 'JO JO —i O CH CO J H

π c to H JO o O cH c H J < J O r- O

u O JO < < 61 < j < > O 3 O <0 H< OH 30 tn O tOO CH 30 X < co

60 to ci O —(<3X0 JO —<U CH J O —<H

£? Q C, O OO O OH << <0 JO OO J < 15c o S U 30 30 CO too 3 < CO 30 j< ^ U hJU J u XO hJ< oo O o JO M<

C O

° if c; u JO 3 < D.O JO 3 0 CH 0<

Ui u CH —I < JO u U oH J U JO

co H >0 oo HH to(- JO < o < O

> il 30 tO< CH CO 30 00 0030 030

60 JH OJO O —i O O —I O OcH O J O J J O o U H

j (j JO —t < o <j < o m < O r^jo Oi t U “1 < O 'JO

20 d) cj -° i! 30 JO Cl H JH r O 30 3 H o <

<0 61 OH CJ O 3X0 X < cH —<< c H J O

H o jo <n < muh HH jo oo JO —o u

CIO C.U xo CO CO C. O 30 CH

Li u tn< —(O ÆH JO J p c H J O

CJ CO H < O OO HH < O HH JO < o u

v 30 οι H JO CH 30 OO JH C H

u OH 3X0 30 C < CH J O 30 JO

ti JO 61 U Η H < < < JO HO H< < o 25 u c 30 CO JO J Η X o CO JO j<

„ CJJ JH 30 CH JO J < 3 O

U fj o m < H< >0 OO OO H< OH

CJ j H 30 OO in < CO JO 30 CO

O OH CH j J X< j < OO o H JO

“ JO JO -< J < OO t/1 H JO <o

O

S 30 60 O CH JO 0.0 JH JO CO

o JU JO » 11 < 30 JO oo oo 5 O

ϋ HH < O <5 H < HH t/l H o>< < o 30 «j

U *~>CJ o C 30 Q.O H U CU Μ C_> O.M

3h 2u - < S< C H C tn < JO w <

JO Cl, CJ OO < O >0 << < o <C

CJ

u HO 0< <V o O < 3< JO 3> f—> P < if ecO JO JO JO J< CH oH >·0

t; HH HU <o CL. O oo :> O JO HO

CJ

Ξ ^ CJ rj O 30 JO j< 30 XO OH

• a 1 o MO —« <C OH* WM -hO v-*0 6J < o — < o OO 3-0 3-0 JH OO 0,0 35 31 DK 172953 B1 o o π υ *j u o 6o aj 60 to u

vO H O u U 60 W O flj4JU

*-i < O njoocOUOOrtiiOAJ

(J 4-1 CO w U U 60 Cl <g o u o <a m w u α o o o u 60 oo o

3 U

•—4 <* u «5 <J *0 60 00 U *-· oo cJUPJ^WtOtfltfl 5 uoce^^eo*-»

>N O H O

^ ^ 41 frø n CJ Li U tfl 63

U < U60«J60600UCJ

jc o u «β 60 π cj u u • h < ijOQ<J<e^u (j 4J Q06O6O6OO 60 ooflifliJjrøoco u rj cd60060cJ600rø

>L< 0*0«i *J 60 O U

JO HH O O.« 60 <Q CJ 600

3 O O H

^ υ rtuea«««™*-1.

UUUUflUUU cio oMtJucdwnjo v <r^ u u A u · U 00 rd 0>0

^3 neeSatouoM

^ ΰβοωουοίοου <3 60 Qt) t£ (J 63 60 3 o UWWflOOOoJOl oh co<otea<j«itxi4-| 15 *1 cj ·6* 6β «ο ω a o to o ~ « <* w >><S rj ^ 60* Οϋ60Ο*3υυ,3 M u4Joraoo63*JCJa o o»v <; u oo oo u co ea o oo <o .i; 4Γ3 ooStooooocorj

Zl 5 O «uScoucoo^« οοβοοοαουϋβ OOTO'OOC-'O'-’fl > o oo cj xjaouoqau« in μ M 60<eoiCJ*JOOO « 20 ,—( tioauotjoooooa <u •9 3 0 <a ς) (-, ^ »Jo fPuudOcortoeooej oo o cj oo « *j oo cJ js

410 OOOOOOOOOWOO

r μι fflUOOJJOOMO

λ_ fj m il 60 60 O Cj O 60

H O <* V V O o Ί* to O

il g U 6Q 60 60 60 Cl

tft-i *£0*00 O 60 60 W

SS •SooowwcJtJijo 25 S3 HOOsaooiJe«Jcj u o ό oo < CJ U Ό ti o OJ (-,—<< o U o O0 00

o S o «5 cj o 60 CJ

^ n 0.00 06060600 ^3 0 ^f· μ m 60 60 60 cj w O * HH < L? U O 60600 60 H H ^^0 600^ 0 606360 0<000*0<322 sy s S S ίί u s « 30 > CJ ΟΟυυ*-*^»-1^4-' ^ 60 < * ti cj j: o <tJ ^"'"’eotiootaorate ucguo οβριοί-; 0» O 60 CJ O«« M u u n JC(1 PCJ00«M«0 ^ CJ ™ 2

ft. c_4 <2 < U tO tO tO 64 O ®3 O

60 63 VO * *0 60 60

il”S3604J60U

30 * 60 *? ?? 2 <1 r. ·». *w C3 cj o O 60 u il u g 35 ,JOCo0^H60U*J60«0600

O

32 DK 172953 B1 ?? u 60 O Η Η O <a O HH « O 30 M oo *7 w o JO o^< o jr o OHO o ej h

oo O 60 W O OO CM J < MT H < vO<io eo J O

oo 60 60 <J u u

O 3 3 c/3 H D O Ό O 4)0 C O rtO

U O H O W H J o J H . J Γ1; ^ 9 5 13 U OH JO < O J *< OO C o

O to O < JO 30 C H CO CO

4J Q O O > O O O < s OO OO

U CO

u « c/) O O < 30 CO XO >,0

LI ΛΛ *_< <? r£ O 01 H <ί rHO f—lO

3 60 K O W O J H OO OO OO

CJ 60 “ α JO 3 U 30 C Η JO 600

10 5η«Η «Η C Η H O

>0 JO JO <1*5 > O < O

υ o U 3 Η O Η O HO 30 30 30

M u JO JO >> < <UH H< OH

ej cj OO OO HH tJH OO JO

60 60 U S f+- H O 3)0 600 H O Π O Η ύ

q yrJWH W Η ΠΟ <UO O H C H

O U 1 Z < JO < < o < S< > o

OH 30 cn O 600 «JH

15 UOOtOPSO-HCtt! >, O Η O H O

to u cd W O O O ΙΛ O H < < < O

CO o CO

So 3 υ 3)0 30 BO CO 3 < rj κλ λΛ tO F—4 4) {-* H rS H ^

3 u O JO JO 33 O J 5 OO

S3 WCdO JO 3-¾ p-O H O

w o <a h j-C ho 4)0

M to H > O OO HH MH

^ 3 60 03)0 6fl< O H CO 3 0

20 J to u 6OWHOHOOJOOJOO0H

α 0 co JO — < o o < o >o<o jjo

_q to 60 O

(tJ tf to 03)0 HO ®H H f-. 3 O

H 3 60 cj W H u O 35 >. O Η < 4)H

o U tj JO C/) < WOH HH JO

4-i CO CO

Cti O O* O >, O 4)0 «JO

W O 01 «0 JO 3 H J O

u o 60 W H < O OO HH <0

u u CO

COM Spo on H HO C H 30

25 S’ co u Ch 31 >. O .30 m< oH

u c cjjomoh h ·< jo to O 60

3)3 33)0 4)0 HO J H >> O

ti a 60 U H ' J H j3 O CH J^i

cj (J 60 3) H 30 4)0 « < CO

rju « w H oh J H ^ *5 r? T-.

y y CJ J O J O J "i J *4 O O

63 u CJ

n_ 3 3 3 Π O 600 CH HO C* O

30 ti u oa 2 o ho*®< -c o no

uS) t) HH <: O < < H < HH

to O 60 *" ° ° 3) O O < 30 <XO J o

WH HO J < n < «J H

JO HO OO < O > O

CJ 60 60 CO «TJ CO . .

u o o O-, o o< <0 O O < 3< to fj O Cc O U O H u ^ o 4j ¢0 u h h & U ^ O CVjCJ oo u co <d to ij o u U tJ < O cd O 30 —«O *H< 35 uu co Jo —< cj ««{-» fl h uu OO < o *— < o oo >o >o

O

33 DK 172953 B1 OHH OHO o ® 5

o O O M t) U "“S

^ (o < h W H

t- *-t o ci O f°Hao s <s f-. *-« h >b ~ < <«-> 33 as <8 ss sg ii si 1¾ is ►J-ς o o ^“5 k< 10 o. f-t o o 0.0 L „

< o j ^ <.u {V

-i o eg « f* 30 £ S 35 3 £ «η 5¾ 3« £δ 2¾ x. u < o ^ < j 5 15 — 3 O >,< 41 O _ i (j fs H O *“« H -| r , J JO O U «« 53

4J

U C O 90 £ < w0 O *-< <ς o H U V ^ £ O O JO H < k SS o JSP ^ £? > JO 2 o *<o uo 20 -< 0OOMOO9U-M.,

<D O E O -itjO *2 « h ° u O

X) o\C. U —' < O "<u <0 ^ £« 2£ 25»o o 5 jsb £u 35

«xo 9 O e f-j „ CJ

sa 5S se 25 g O Ϊ fl « ^ Ch £b 6¾ 38 33 5Ϊ3 S3 S8

O O H < WH {/) fT

h U 90 »O L (.

SS 53 38 £<

Of) i- t-ι n o «« o _, 0 CJ O O O <-«0 „ £; cot-< CO < <o > 5 cr CJ 680 O.t-4 oo <-

<•5 -so <o < Q

< CJ 3f« p< ti rj π μ ο h ».o Sir s» o JO B.U £ £ 35 3 o 9sO O N ,

ci m *-?0 »-O 3 H

J t- OO «X O j o

O

34 DK 172953 B1 C u OH Η O Μ ϋ U Η π n 3 O O L·. l·- r-ι ,

tf M p ^ S/?5> O-HU O O H Ooo rJO

ti to ^ -J < ^th< vd < o æ j u —« ct < u u u ci O CJ Μ μ 3 u D o OCJ CO raO , υ <J H O W H rHO -ih h < HU 7? H « *3 υ UH H O *< O *-< C o O <U i>u 1-1 ^ 60 60 u 6o r>< pJ o 30 c h co co <-o o " gj o o^ >o oo < ^ oo ou < O < 60 4-1 « ΙΛΟ 0< 30 30 o c- o WC -i υ to 4-4 < du OH -—4 < HO « u £ 5 3 a S ~ ^ <-> 4j H o o o o O O Π <! o

60 U

►j g py 30 C H H O 600 cx H n <H W H O H tn <0 nj H 440 </ < >.

1Q u o >U -> <> -> <-> >o <o <o o υ o u ^ u *-* >; u H O 6 u 30 30 30 —4 o c 60 *J OO *-20 >s< o E—* >—t <0 ci Η π i_, -4

u u OO oo Η Η -I H OO OU >o G

u σ 61 60 ^ H O OO 600 6.0 610 H O 4.1 4_ ra Π 6JISIUH UH 6,0 OO OH η H " 6. 61 I x: < HO < < 60 < x:< >0 = u < OH 30 tn O 600 <3H 30 -- 6J *>P 60 6 U H < 3: >, O μ o -40 OH h

15 “ g gj C-'-’ O O 60 U H < < <0 HO O

60 CJ 60 CO 61 O OO 30 HO HO 3< 30 3 6> CO 60 HH OH H < >· «3 —4 <0 — < -j

V g O HO HO =30 H 3 OO OO H

CO 61 to CO 61 40 Cd O —40 3 < 30 60 30 <3 6-U 43 6 —4 U O OO OH -—4 60 H > O OO HH co H HO < ίζί O to 6) 6/61 60 O =30 60 < O H CO 30 O O O 60

HtO 4-1 tO HH O U O OHO Oho OoH O 6 (/j — 6 Π 6) « HO — <0<-><0i0<0>^H0O=-0— < 20 H 60 60 o Λ1 tO 60 61 n 61 to U =30 6* O HH UH 30 30 3 •061 tO 61 HH O O S >4 0 - > < O H ~|< <y i0 61 *J C HO 00 < 60 O H HH HO O|U Π

E-t co to ( I

d O C. CJ MU O O CO cJo 3

U O 4.1 < —* O -= H HO U O CJ

6» co 60 H <0 olo HH <0 HH H

61 60 , ' O C 1

60 tO =30 WH U. O 3 H 30 OO U

to 4J UH =3 >\ O -3 O H<3 CJ H ucj —

CJ 61 HO 60 O H Hl < . < < HO d. <_> H

25 o to .Hf υ o 1 ti 3 U OO U O -IH ^u ru Jh U 00 ♦—« H -TO CH* —< o —Æ

-iu *-H< H< >U u o UO H

Cl to Uf-* 30 GU W< CO l-o 3

4J rz o H OH —<H >N< —< < OO O

CJ υ -JU O O *~4 < O < UU (o H o ti o ο υ

O O O, O CX o CH c. o C.U ι-H U

o to ci O u. o -K μ < x:o u U O O o co Cl HH <U << H< HH Wf· 30 o ta , 5 <J u 1 UO O < 30 3.0 HO r1 o to U C· o —i <J O <C oh ?: v.· < Vn HO 0-0 OO <0 >0 <*< < tc ta o to u u c-o o < co o < 3 —« o r o u s i; w. o —< o uo —« <: πη o

co <j HH CL.O < O 0-0 OO >0 O

to c 4J C/

U ti < O rj o 30 —fo —4 < - O

tO —- O ·—< O ·—* <C O f—* (Q H OH —* 35 ci co < O — -3 o uo >e> :>o hh u 35 DK 172953 B1 o

OrJCJ AJ U<t3 tO ±J fco cO U

Γ* 3 O —< U U^Jt0rzUr3L·JL·t ]^V 5 — < o ccDnuoocjtoci

^ U d CO U CJ (J CO (J

auuuncooo^j COUrøOCOCOU ^f. , \ O O OCOtJC3c3tJ<jn

Γ7 7\ —< < U <0 U «3 tO 60 <J U

2 o oo c: υ o to co <tj to ^ uoio^n^o^ 5 " ^ 38

£ H O O

n uMouauQto uotooauoo^

«, M UfcOWtOfcOOciiJ

-n .c o uatoccirjcici ΰ 2 r· < *JOQU<areutj U Cl tO 60 CO CO U to aunjounoir ft n »-* CJ CCOUfcC uccua

JT «£ >s < UrøUO-UCOUU

<*t5 c-«H uuutcrjAJCiflo 10 SB jg

^ ti m U

^ w tfi-itOiSeaurj*-» OCI4JC)<UObOtC U H « CJ O*JUAJ<5OCflt0 -- Γ3 5n< UU«4JO60Cfl63

<; f5toOC3C3tOiJ<jtO

4JOObOUAJfOco*j {0 0000500 CO CO «3 o n 30 050000504^0

Η μ OH CO Π CO O O o co *J

< -J o tocoacocootoo 15 ^ n u < ”52 4J JC o ^5 c «, M <* »-J < π ~ COOOtOOOuuo o w-u u a to co w u o <H t- < >>< o co to o co to u co o ^ u rj> O oococ:<j to o CJ o <- CJ OO C3 U CO O 1-1 O CJ *-> rj t, oococouuuu a rj _ OCJC3^0j4JOiJf3 p 030 o tao urJuuuoaur: > ro o M ir\ u O fc0f34JOuoc»oc: __ « J j — <0 4JCOU<AU<JCOCOq 20 »Η

Ϊ O < 3 O

Λ 2 3 O H

itj c^, μ o eo H 4J*Jije3toct:cotcr3 CO u CJ tor; ci coc» q (øm o O eouucscouciua b .c h aciri^uunjcou <rj H c-ι UUCOtOOcjotOrj

UQJCICIOOCOCOU d C5 u -CO CO CO CO CJ

CH C H <<jrjuooco«a •~>cj w < ·οωυ n ca aj o ci rj < o << HUCOfJCOCitgejn ^ <- W o «O 60 <

ς, O CJ O %D M O

Cl fl Cl ej 4-1 U coco u υ o «Ό u 4-i to lj no w»o cu O ci ci to to co a n o Η n >< 0»< Cl 00 t£ 63 4J ^ u nj

<fj HH <04-1 4J to CO ti C0f3 O

UCOrjiJOoOtUCO

UQouarjcga 73 o *“< O >^OCIUQC04-Ioc:c3 O ^ Η *Ηϋ<θν CI4J4JU too < :¾ > U OUCIuUffluuu^ 30 C. m * < ·< <

Jr > »- O ·£ CJ

< o < o H < ocitccjocjcjoo I On^OCOiJCci

n< o O C0L5 U U r: ecu *-/ U

cu ~ H »j L: tor 10*3 O0U Γ3 n

c. o ^<4-4 u, CO OC CO O ftg CJ

CO U-. Π c Q CO OO 4-i

*4 4-» ·0 CJ (O CJ O0 O

oi— 30 «5L>4-4 n i4 n co co co o kl 'J o m ift ^ O Cl *J to 4-» 4-1 u rj c*c —) *-> t/i o H*·· co u ci . ti il a to t 35

O

36 DK 172953 B1

Under henvisning til tabellerne II og III er den afledte aminosyresekvens, der vises under nucleotid-sekvensen, nummereret med 1 for den første aminosyre i det modne protein. Det formodede "leader"-peptid er an-5 ført med udelukkende store bogstaver for aminosyrebeteg-nelserne. Cysteinresterne i det modne protein er yderligere anført med SH og potentielle N-bundne glycosyle-ringssteder med en stjerne. De aminosyrer, der er understreget, angiver de rester, der er identificeret ved 10 N^endestillet proteinsekvensbestemmelse eller ved sekvensbestemmelse af tryptiske fragmenter af EPO som beskrevet i eksempel 1. Delvis understregning angiver rester i aminosyresekvensen i visse tryptiske fragmenter, der ikke éntydigt kan bestemmes. cDNA-Klonerne lambda-15 -HEPOFL6, lambda-HEP0FL8 og Iambda-HEP0FL13 er blevet deponeret og er tilgængelige i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland med deponeringsnumrene hhv. ATCC 40156, ATCC 40152 og ATCC 40153.

20 Eksempel 4 EPO-genets genomiske struktur

De relative størrelser og stillinger af fire uafhængige genomiske kloner (lambda-HEPOl, 2, 3 og 6) fra Haelll/AluI-biblioteket er vist ved overlappende linier i 25 fig. 3. Den fortykkede linie viser EPO-genets stilling.

Der er vist en målestok (i Kb) og kendte restriktions-endonuclasespaltningssteders stillinger. Regionen, der indeholder EPO-genet, er fuldstændig sekvensbestemt ud fra begge strenge ved hjælp af styrede, af exonuclease 30 in dannede udeladelsesserier i hele denne region.

En skematisk fremstilling af fem exoner, der koder for EPO-mRNA'er, ses i fig. 4. Den nøjagtige 5-begyndelses-afgrænsning for exon I er for øjeblikket ukendt. Den proteinkodende del af exonerne er gjort mørke. Regio-35 nens fuldstændige nucleotidsekvens er vist i tabel IV.

De kendte grænser for hvert exon er betegnet med optruk-

O

37 DK 172953 B1 ne lodrette streger. Genomiske kloner lambda-HEPOl, lambda-HEP02, lambda-HEP03 og lambda HEP06 er blevet deponeret og er tilgængelige hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland med deponeringsnumrene 5 hhv. ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150 og ATCC 40151.

Eksempel 5

Konstruktion af vektor p91023(b)

Transforma tionsvektoren er pAdD26SVpA(3) be-10 skrevet af Kaufman m.fl., Mol. Cell Biol. 2, 1304 (1982).

Denne vektors struktur er vist i fig. 5A. Kort omtalt indeholder dette plasmid et muse-dihydrofolat-reductase-(DFHR)-cDNA-gen, som er under transcriptionskontrol af den store adenovirus 2-(Ad2)-sene promotor. Et 5-begyn-15 delsesspléjsningssted er vist i adenovirus-DNA'et, og der forekommer et 3-begyndelsessplejsningssted, afledt ud fra et inununglobulingen, mellem Ad2-stor-sen-promo-toren og DFHR-kodningssekvensen. SV40-tidlig-polyade-riyleringsstedet forekommer længere fremme i forhold til 20 DHFR-kodningssekvensen. Den procaryot afledte sektion af pAdD26SVpA(3) er fra pSVOd [Mellon m.fl., Cell 27, 279 (1981)1 og indeholder ikke pBR322-sekvenserne, som vides at inhibere replikation i pattedyreceller [Lusky m.fl., Nature 293, 79 (1981)].

25 pAdD26SV£kA(3) omdannes til plasmid pCVSVL2 som vist i fig. 5A. pAdD26SVpA(3) omdannes til plasmid pAdD26SVpA(3)(d) ved udeladelse af et af de to Pstl-ste-der i pAdD26SVpA(3). Dette sker ved en delvis fordøjelse med Pstl ved hjælp af enzymmangel, så at der fås en 30 subpopulation af lineariserede plasmider, hvori kun'ét Pstl-sted spaltes, efterfulgt af behandling med Klenow, ligering for at atter at lukke cirklen og screening for udeladelse af Pstl**stedet anbragt i 3-begyndelsen ' af SV40-polyadenyleringssekvensen.

35 De tredelte-adenovirus-"leader"- og <rirus- associerede gener (VA-gener) indsættes i pAdD26SVpA(3)(d) som vist i fig. 5A. Først spaltes pAdD26SVpA(3)(d) med

O

38 DK 172953 B1

PvuII for at åbne et lineært molekyle i 3-begyndelsesde-len af de tre segmenter, der udgør den tredelte "leader".

Derpå fordøjes pJAW 43 [Zain m.fl., Cell 16, 851 (1979)] med Xho 1, behandles med Klenow, fordøjes med PvuII, og 5 det 140 bp store fragment indeholdende den anden del af den tredje leader isoleres ved elektroforese Då en acryl-amidgel (6% i Tris boratpuffer, Maniatis m.fl., ovenfor). Fragmentet på 140 bp ligeres derpå,til det med PvuII fordøjede pAdD26SVpA(3)(d). Ligeringsproduktet anven-10 des til at transformere E.coli til tetracyclinresistens, og kolonier screenes ved hjælp af Grunstein-Hogness-me-toden, ved hvilken der anvendes en med P mærket sonde, der hybridiserer til fragmentet på 140 bp. Der fremstilles DNA ud fra positivt hybridiserende kolonier for at 15 afprøve, om det rekonstruerede PvuII-sted er i 5-begyn-delsen eller i 3-begyndelsen af det indsatte DNA på 140 bp, der er specifikt for den anden og tredje sene adeno-virusleader. PvuII-stedets korrekte orientering er på 5-begyndelsessiden af de indsatte 140 bp. _Dette 20 plasmid betegnes tTPL i fig. 5A.

Ava II D-fragmentet i SV40 indeholdende SV40-forstærkersekvensen fås ved at fordøje SV40-DNA med Ava II i afstumpe enderne med Klenow-fragmentet i Pol I, ligere Xho 1-mellemled til fragmenterne, fordøje med Xho 1 25 for at åbne Xho 1-stedet og isolere det fjerde største (D) fragment ved gelelektroforese. Dette fragment li" geres derpå til med Xho 1 skåret pTPL, hvilket giver plasmidet pCVSVL2-TPL. SV40 D-fragmentets orientering i pCVSVL2-TPL er sådan, at den sene SV40-promotor har 30 samme orientering som den sene store adenoviruspromotor.

For at indføre de med adenovirus associerede (VA) gener i pCVSVL2-TPL konstrueres først et plasmid pBR322, som indeholder adenovirus type 2-Hind III-B-frag-mentet. Adenovirus type 2—DNA fordøjes med Hind III, og 35 B-fragmentet isoleres ved gelelektroforese. Dette fragment indsættes i pBR322, som i forvejen er fordøjet med

O

39 DK 172953 B1

Hind III. Efter at E.coli er transformeret til ampicil-linresistens, screenes rekombinanter for indsætning af Hind III-B-fragmentet/ og det indsattes orientering bestemmes ved restriktionsenzymfordøjelse. pBR322 - Ad 5 Hind ΙΙΪ-Β indeholder adenovirus type 2-Hind III B-frag-mentet i den i fig. 5B viste orientering.

Som vist i fig. 5B fås VA-generne bedst fra plasmid pBR322 - Ad Hind III-B ved fordøjelse med Hpa I, tilføjelse af EcoRl-mellemled og fordøjelse med 10 EcoRl efterfulgt af udvinding af det 1,4 kb store fragment. Fragmentet, der har EcoRl-klæbrige ender, ligeres derpå ind i PTL's EcoRl-sted, i forvejen fordøjet med EcoRl. Efter transformering af E.coli HB101 og udvælgelse ved tetracyclinresisténs screenes kolonier 15 ved filterhybridisering til DNA, der er specifikt for VA-generne. Der fremstilles DNA ud fra positivt hybri-diserende kloner, og det · karakteriseres ved restrik-tionsendonucleasefordøjelse. Det opnåede plasmid betegnes p91023.

20 Som vist i fig. 5C fjernes de to EcoRl-ste- der i p91023 ved helt at skære p91023 med EcoRl, hvorved der dannes to DNA-fragmenter, det ene på ca. 7 kb og det andet på ca. 1,3 kb. Sidstnævnte fraament indeholder VA-aenerne. Enderne oå becrqe fraomenter udfyl-25 des med Klenow-fragment af Poll, og de to fragmenter ligeres derpå sammen'. Et plasmid p91023(A) indeholdende VA-generne^og som ligner p91023 undtagen med hensyn til de to udeladte EcoRl-steder, identificeres ved hjælp af Grunstein-Hogness-screening med Va-genfragmen-30 tet og ved gængs resttiktionssted-analyse.

Det enkelt Pstl-sted i p91023(A) fjernes og erstattes med et EcoRl-sted. p91023(a)' skæres helt med Psti og behandles med Klenow-fragmentet af Poll, så at der dannes udfyldte ender. EcoRl-mellemled li-35 oeres til det afstumpede Pstl-sted i p91023(A). Det lineære p91023(A), hvor EcoRl-mellemleddene er bundet 0 40 DK 172953 B1 til det afstumpede Pstl-sted, fraskilles fra uligerede mellemled og fordøjes fuldstændig med EcoRl og reliqe-res. Der udvindes et plasmid p91023(B) som afbildet i fig. 50, der identificeres som havende en struktur, 5 der ligner p91023(A)'s, men med et EcoRl-sted i stedet for det tidligere Pstl-sted. Plasmid p91023 (B)' er deponeret og er tilgængeligt hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, med deponeringsnummeret ATCC 39754.

10

Eksempel 6 cDNA-Klonerne (lambda-EPOFL6 og lambda-EPOFLl3 , eksempel 3) indsættes i plasmidet p91023(B), så at der dannes hhv. pPTFL6 og pPTFL13. 8 .ug af hver af de rensede / g 15 DNA'er anvendes derefter til at transficere 5 x 10 COS--celler ved hjælp af DEAE-dekstran-metoden (nedenfor).

Efter 12 timer vaskes cellerne og behandles med "Chloro-quin" (0,1 mmolær) i 2 timer, vaskes igen og udsættes for 10 ml medium indeholdende 10% kalvefosterserum i 24 ti-20 mer. Mediet skiftes til 4 ml serumfrit medium og høstes 48 timer senere.

Produktion af immunologisk aktivt EPO mængdebestemmes ved en radioimmunprøve som beskrevet af Sherwood og Goldwasser (55). Antistoffet leveres af Dr. Ju-25 dith Sherwood. Det ioderede sporstof fremstilles ud fra det homogene EPO, der er beskrevet i eksempel 1.

Prøvens følsomhed er ca. 1 ng/ml. Resultaterne ses nedenfor i tabel VIII.

30 Tabel VIII

Niveau frigjort EPO

Vektor_i mediet (ng/ml) pPTFL13 330 pPTFL5 31 35

O

41 DK 172953 B1 PTFL13 er blevet deponeret og er tilgængelig hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland med deponeringsnummeret ATCC 39990.

5 Eksempel 7 EPO-cDNA (lambda-HEPOFLl3) indsættes i p91023 (B)-vektoren og transficeres ind i COS-l-celler og‘høstes som beskrevet ovenfor i eksempel 6, med undtagelse af^at "Chloroquin"-behandlingen udelades.

10 EPO, der er biologisk aktivt in vitro, måles ved hjælp af enten en kolonidannende prøve med musefosterleverceller som CFO-E-kilde eller en 3H-thymidin-op-tagelsesprøve ved hjælp af miltceller fra mus, der er injiceret med phenylhydrazin. Disse prøvers følsomhed 15 er ca. 25 menh./ml. In vivo biologisk aktivt EPO måles ved hjælp af metoden med enten hypoksiske mus eller udsultede rotter. Disse prøvers følsomhed er ca. 100 menh./ml. Der påvises ingen aktivitet ved nogen af prøverne ud fra medier med efterlignede betingelser. Re- 20 sultaterne af EPO udtrykt af klon EPOFL13 ses nedenfor i tabel IX, hvor de anførte aktiviteter er udtrykt som enh./ml, idet der anvendes kommercielt mængdebestemt EPO (Toyobo, Inc.) som standard.

25 Tabel IX

EPO udskilt af COS-celler transflceret med type 1 EPO-cDNA Prøve Aktivitet RIA 100 ng/ml CFU-E 2 0,5 enh./ml 3 30 H-Thy 3,1 1,8 enh./ml

Hypoksisk mus 1 enh./ml

Udsultet rotte 2 enh./ml 35

O

42 DK 172953 B1

Eksempel 8 SDS-Polyacrylamidgelanalyse af EPO fra COS-celler 180 ng EPO frigjort i et medie af COS-celler transficeret med EPO-(lambda-HEP0FL13)-cDNA i vektoren s 91023(B) (ovenfor) elektroforeseres på en 10% SDS Laem- lli-polyacrylamidgel og elektrooverføres til nitrocellulosepapir [Towbin m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 (1979)]. Filteret sonderes med anti-EPO-antistof som beskrevet i tabel VIII, vaskes og sonderes igen med 125 10 I-staph-A-prQtein. Filteret autoradiograferes i to dage. Oprindeligt homogent EPO beskrevet i eksempel 1 enten før (bane B) eller efter (bane C) iodering elektroforeseres (jfr. fig. 6). De anvendte markører omfatter med "^S-methionin mærket serumalbumin (68.000 15 dalton) og ovalbumin (45.000 dalton).

Eksempel 9

Konstruktion af RK1-4

Barn HI-PvuII-fragmentet fra plasmidet PSV2DHFR 20 [subramani m.fl., Mol. Cell. Biol. 1, 854τ\864 (1981)] indeholdende den tidlige SV40-reifion-promotor stødende op til muse-dihydrofolat-reduktase-(DHFR)-genet, en SV40-forstærker, et lille t-antigen-intron og SV40-polyadeny-leringssekvensen isoleres (fragment A). De øvrige frag-25 menter fås fra vektoren p9l023(A) (ovenfor) på følgende måde: p91023(A) fordøjes med Pst I i det eneste Pst I--sted nær ved adenovirus-promotoren for at linearisere plasmidet og enten ligeres til syntetisk Pst I til EcoRI-omdannere og gendannes til en ring (idet stederne 30 p§t I - EcoRI - Pst I dannes i det oprindelige Pst I-sted, 91023(B')) eller behandles med det store DNA-polymerase-fragment for at ødelægge Pst I-stederne og ligeres til et syntetisk EcoRI-mellemled og gendannes til en ring (idet der dannes et EcoRI-sted i det oprindelige Pst I-35 -sted, 91023(B)). Hvert af de to opnåede plasmider 91023(B) og 91023(B') fordøjes med Xba og EcoRI, så at

O

43 DK 172953 B1 der fås to fragmenter (F og G). Ved at sammenføje fragment F fra p91023(B) med fragment G fra p91023(b*) og fragment G fra p91023<B) med fragment F fra p91023(ts') dannes to nye plasmider, som enten indeholder et EcoRI-5 Pst I-sted eller et PstI - EcoRI-sted i det oprindelige Pst I-sted. Plasmidet med Pst I - EcoRI-stedet, hvor Pst I-stedet er nærmest den sene store adenovirus-pro-motor, betegnes p91023(C).

Vektoren p91023(C) fordøjes helt med Xhol, 10 og det opnåede lineariserede DNA med klæbrige ender af“ stumpes ved en éndeudfyldningsreaktion med det store DNA polymerase I-fragment i E.coli. Til dette DNA ligeres et Hind III - EcoRI-fragment på 340 bp indeholdende SV40-forstærkeren, der er fremstillet på følgende måde: 15 Hind III - Pvu Il-fragmentet fra SV40, som in deholder SV40-kilden eller -replikationen og forstærkeren, indsættes i plasmidet c lac [Little m.fl., Mol.

Biol. Med. 1, 473-488 (1983)]. c lac-Vektoren fremstilles ved at fordøje c lac-DNA med BamHI, udfylde den klæ-20 brige ende med det store DNA-polymerase I-fragment og fordøje DNA'et med Hind III. Det opnåede plasmid (c SVHPlac) gendanner BamHI-stedet ved ligering til den stumpe Pvu II--ende. EcoRI - Hind Ill-fragmentet fremstilles ud fra c SVHPlac og ligeres til EcoRI - Hind Ill-fragmentet i 25 PSVOd (Mellon m.fl., ovenfor), som indeholder plasmidets replikationskilde, og det opnåede plasmid pSVHPOd udvælges. EcoRI - Hind Ill-fragmentet på 340 bp i PSVHPOd indeholdende SV40<-kilden/forstærkeren fremstilles derpå, afstumpes i begge ender med det store DNA-polymerase 30 i-fragment og ligeres til den med Xhol fordøjede, afstumpede p91023(C)-vektor, der er beskrevet ovenfor. Det opnåede plasmid (p91023(C)/Xho/afstumpet plus EcoRI/Hind III/afstumpet SV40-kilde plus forstærker), hvori o-rienteringen af Hind III - EcoRI-fragmentet er således, 35 at BamHI-stedet inden for dette fragment ligger nærmest ved VA-genet,.. kaldes pES105. Plasmidet PES105 fordøjes

O

44 DK 172953 B1 med Barn HI og PvuII og også med PvuII alene, og BamHI -PvuII-fragmentet, der indeholder den store sene adeno-viruspromotor (fragment B) og PvuII-fragmentet, der indeholder plasmidets vedvarende resistensgen (tetra-5 cyclinresistens) og andre sekvenser (fragment C),isoleres. Fragmenterne A, B og C ligeres, og det opnåede plasmid, der er vist i fig. 7, isoleres og betegnes RKl-4. Plasmid RK1-4 er deponeret hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hvor det er ίο tilgængeligt under deponeringsnummer ATCC 39940.

Eksempel 10

EPO-Ekspression i CHO-celler - fremgangsmåde I

20^,ug DNA fra plasmidet pPTFL13, der er beskre-15 vet ovenfor (eksempel 6), fordøjes med restriktionsendo-nucleasen Cla I for at linearisere : plasmidet og ligeres til med Cla I fordøjet DNA fra 2^ug plasmid pAdD26SVp (A) 1, som indeholder et intakt dihydrofolat-reduktase-(DHFR)-gen drevet af en stor sen adenovirus-promotor 20 [Kaufman og Sharp, Mol. and Cell Biol. 2, 1304-1319 (1982)] . Dette ligerede DNA anvendes til at transfice-re DHFR-negative CHO-celler [DUKX-BII, L.A. Chasin og G.

Urlaub, PNAS 77, 4216-4220 (1980)], og efter vækst i to dage udvælges celler, der omfatter i det mindste ét 25 DHFR-gen, i α-medium, der mangler nucleotider og er suppleret med 10% dialyseret kalvefosterserum. Efter vækst i to uger i selektive medier fjernes kolonier fra de oprindelige plader, slås sammen til grupper på 10-100 kolonier pr. pulje,udstryges igen og dyrkes, til de løber 30 sammen, i α-medium uden nucleotider. Medieoverfasen fra puljerne, der er dyrket før methotrexat-udvælgelse, analyseres for EPO ved hjælp af RIA. Puljer, der udviser positiv EPO-produktion, dyrkes i nærvær af 0,02^umolær methotrexat og subklones derpå og analyseres igen. EPO 35 Cla 4 4.02-7, en enkelt subklonet fra EPO Cla 4 4.02-pul-jen, frigiver 460 ng/ml EPO til mediet, der indeholder

O

45 DK 172953 B1 0,02^,umolær MTX (tabel X). EPO Cla 4 4.02-7 er den cellelinie, der er valgt til EPO-produktion og er deponeret hos American Type Culture Collection med deponeringsnummer ATCC CRL8695. For tiden underkastes denne klon trin-5 vis udvælgelse i stigende MTX-koncentrationer og vil formodentlig give celler, der producerer endnu højere EPO-niveauer. Med henblik på puljer, der er negative ved RIA, analyseres methotrexat-resistente kolonier, der fås fra modpartkulturer, som dyrkes i nærvær af 0,02^umo-1Q lær methotrexan, igen i puljer for EPO ved hjælp af RIA.

De kulturer, som ikke er positive, subklones og underkastes vækst i yderligere stigende methotrexatkoncentrationer.

Der opnås trinvis methotrexat· (MTX)-udvælgelse ved gentagne cykler omfattende dyrkning af cellerne i nær-15 vær af stigende methotrexatkoncentrationer og udvælgelse af de overlevende. For hver cyklus måles EPO i kulturover-fasen ved hjælp af RIA og ved biologisk aktivitet in vitro.

De methotrexatniveauer, der anvendes ved hver trinvis forstærkning, er 0,02, 0,1 og 0,5^umolær. Som vist i ta-2o bel X frigives der efter 1 udvægelsescyklus i 0,02^umolær MTX signifikante EPO-niveauer i dyrkningsmediet.

, Tabel X

EPO-Niveau frigjort i mediet 25 Høst i a- Høst i a-medium med 0,02

Prøve_Analyse medium_,,umolær methotrexat 4 4 pulje RIA 17 ng/ml 50 ng/ml 4 4 enkelt koloni 30 Klon (0,02-7) RIA - 460 ng/ml

Eksempel 11 EPO-Ekspression i CHO-celler - fremgangsmåde II 35 DNA fra klonen lambda HEPOFL13 fordøjes med

EcoRI, og det lille Ri-fragment, der indeholder EPO-ge-

O

46 DK 172953 B1 net, subklones ind i EcoRI-stedet i plasmidet RK1-4 (jfr. eksempel 10). Dette DNA (RKFL13) anvendes derpå til at transficere de DHFR-negative CHO-celler direkte (uden fordøjelse), og udvælgelse og amplifikation udføres som 5 beskrevet ovenfor i eksempel 10.

RKFL13-DNA indsættes også i CHO-celler ved hjælp af protoplast-fusion og mikroinjektion. Plasmid RKFL13 er deponeret og er tilgængeligt hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland,med deponeringsnummer 10 ATCC 39989.

Tabel XI

EPO-nlveau frigjort i mediet Høst i a- Høst i a-medium med 0,02 15 Prøve_Analyse_medium_,umolær methotrexat

Koloni RIA 3 ng/ml 42 ng/ml (pulje)

Pulje A 150 ng/ml (klon) 3H-Thy — 1,5 enh./ml

Enk. koloni RIA — 90 ng/ml 20 klon (0,02 3H-Thy -- 5,9 enh./ml C-Z)

Mikroinji- RIA 60 ng/ml 160 ng/ml 3 ceret pul- H-Thy 1,8 enh./ml . — je (DEPO-1) 25

Den foretrukne enkelte koloniklon er blevet deponeret og er tilgængelig hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, med deponeringsnummer ATCC CRL869S.

30

Eksempel 12

Ekspression af EPO-genomisk klon i COS-l-celler

Den vektor, der anvendes til ekspression af den EPO-genomiske klon, er pSVOd (Mellon m.fl., ovenfor).

35 dNA fra pSVOD fordøjes helt med Hind III og afstumpes med det store DNA-polymerase I-fragment. EPO-genomisk o 47 DK 172953 B1 klon lambda-HEP03 fordøjes helt med EcoRI og Hind III, og fragmentet på 4,0 kb indeholdende EPO-genet isoleres og afstumpes som ovenfor. Nucleotidsekvensen i dette fragment fra Hind III-stedet til en region lige 5 på den anden side af polyadenyleringssignalet er vist i fig. 4 og tabel IV. EPO-genfragmentet indsættes i pSVOd--plasmidfragmentet, og korrekt konstruerede rekotnbinante i begge orienteringer isoleres og verificeres. Plasmidet CZ2-1 har EPO-genet i orientering "a" (dvs. med EPO's 5'-10 -ende nænosst SV40-oprindeIsen) , og plasmidet CZ1-3 er orienteret modsat (orientering "b").

Plasmiderne CZ1-3 og CZ2-1 transficeres ind i COS-l-celler som beskrevet i eksempel 7, og mediet høstes og analyseres for immunologisk reaktivt EPO. Der på-15 vises tilnærmelsesvis 31 ng/ml EPO i kulturoverfasen fra CZ2-1 og 16-31 ng/ml fra CZ1-3.

Genomiske kloner HEPOl, HEP02 og HEP06 kan indsættes i COS-celler for ekspression på lignende måde.

20 Eksempel 13

Ekspression i C127- og 1 3T3-celler Konstruktion af pBPVEPO

Et plasmid indeholdende den EPO-cDNA-sekvens, der er under transcriptionskontrol af en muse-metallo-25 thionein-promotor og bundet til det komplette okse-pa-pillomvirus-DNA, fremstilles på følgende måde: pEP049f: Plasmidet SP6/5 købes hos Promega Biotec. Dette plasmid fordøjes helt med EcoRL, og Eco Ri-fragmentet på 1340 bp fra Iambda-HEP0FL13 indsættes 30 ved hjælp af DNA-ligase. Et opnået plasmid, hvor EPO--genets 5'-ende ligger nærmest SP6-promotoren (bestemt ved Bgll— og Hind IH-fordøjelse)? kaldes pEP049F. I denne orientering ligger BamHI-stedet i PSP6/5-polyfor-bindelsesleddet direkte op til EPO-genets 5'-ende.

35 pMMTneo-BPV: Plasmidet pdBPV-MMTneo (342-12) [Law m.f1., Mol. and Cell Biol. 3, 2110-2115 (1983)],

O

48 DK 172953 B1 der er vist i fig. 8, fordøjes helt med BamHI, så at der fås to fragmenter: et stort fragment med en længde på ca. 8 kb indeholdende BPV-genomet og et mindre fragment med en længde på ca. 6,5 kb indeholdende pML2-re-5 plikations^ilden og ampiciilin-resistensgenet, me- tallothionein-promotoren, neomycin-resistensgenet og SV40-polyadenyleringssignalet. Det fordøjede DNA lukkes til en ring ved hjælp af DNA-ligase, og plasmider, der kun indeholder fragmentet på 6,8 kb, identificeres to ved hjælp af EcoRI- og BamHI-restriktionsendonuclease-fordøjelse. Et af disse plasmider kaldes pMMTneo BPV.

pEP015a: pMMTneo BPV fordøjes helt med Bgl II. ρΕΡ049ξ fordøjes helt med BamHI og Bglll, og fragmentet på ca. 700 bp indeholdende hele EPO-kodningsre-15 gionen fremstilles ved gelisolering. Det med Bglll for døjede pMMTneo BPV og BamHI/BgIII EPO-fragmentet på 700 bp ligeres, og opnåede plasmider indeholdende EPO-cDNA'et identificeres ved kolonihybridisering med en oligonu-cleotid-d(GGTCATCTGTCCCCTGTCC)-sonde, som er specifik for 20 EPO-genet. Af de plasmider, der er positive ved hybri-diseringsanalyse, identificeres et (pEP015a), hvor EPO--cDNA'et er sådan orienteret, at EPO-cDNA'ets 5'-ende er nærmest metallothionein-promotoren, ved hjælp af fordøjelse med EcoRI og Kpnl.

25 pBPV-EPO: Plasmidet pEP015A fordøjes helt med BamHI for at linearisere plasmidet. Plasmidet pdBPV-MMTneo (342-12) fordøjes også helt med BamHI, så at der fås to fragmenter på 6,5 og 8 kb. Fragmentet på 8 kb, som indeholder hele okse-papillom-virusgenomet, 30 gelisoleres. pEP015a/BamHI og BamHI-fragmentet på 8 kb ligeres sammen, og et plasmid (pBPV-EPO), som indeholder BPV-fragmentet, identificeres ved kolonihybridisering ved brug af en oligonucleotid-sonde d(P-CCACACCCGG-TACACA-OH), som er specifik for BPV-genomet. Fordøjelse 35 af pBPV—EPO-DNA med Hind III viser, at transscriptions-rétningen i BPV-genomet er den samme som transscrip-

O

49 DK 172953 B1 tionsretningen i metallothionein-promotoren (som i pdBPV-MMTneo (342-12), jfr. fig. 8). Plasmidet DdBPV— MMTneo (342-12) fås hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, med deponeringsnummeret ATCC 5 37224.

Ekspression. Følgende fremgangsmåder anvendes til at udtrykke EPO.

Fremgangsmåde I. Der fremstilles DNA-pBPV-EPO, og ca. 25^,ug anvendes feil at transficere ca. 1 x 106 i° C127-[Lowry m.fl., J. of Virol. 26, 291-298 (1978)]-CHO-celler ved hjælp af standard calclumphosphat-fældnings-metoder [Grahmm.fl., Virology 52, 456-467 (1973)]. Fem timer efter transfektion fjernes transfektionsmediet, cellerne får glycerolchock, vaskes, og der tilsættes frisk 15 o-medium indeholdende 10% kalvefosterserum. 48 timer senere trypsineres cellerne og deles i forholdet 1:10 i DME--medium indeholdende 500yUg/ml G418 (Southern m.fl., Mol.

Appl. Genet. 1, 327-341 (1982)], og cellerne inkuberes i 2-3 uger. G418-Resistente kolonier isoleres derpå hver 20 for sig i mikrotiterfordybninger og dyrkes indtil sub-sam-menflydende i nærvær af G418. Derpå vaskes cellerne, der tilsættes frisk medium indeholdende 10% kalvefosterserum, og mediet høstes 24 timer efter. Det.konditionerede medium afprøves og viser sig at være positivt over for EPO 25 ved radioimmunanalyse og ved biologisk in-vitro-analyse.

Fremgangsmåde II. C127- eller 3T3-celler co-transficeres med 25^ug pBPV-EPO og 2^,ug pSV2neo (Southern m.fl., ovenfor) som beskrevet i fremgangsmåde I. Dette er næsten 10 fold molært overskud af pBPV-EPO'et. Efter 30 transfektion er metoden den samme som i fremgangsmåde I.

Fremgangsmåde III. C127-Celler transficeres med 30yUg pBPV-EPO som beskrevet i fremgangsmåde I. Efter transfektion og opdeling (1:10) udskiftes mediet med nyt medium hver 3. dag. Efter ca. 2 uger er der synlige 35 steder med BPV-transformerede celler. Individuelle steder udtages separat over i 1 cm fordybninger i en mikro-

O

50 DK 172953 B1 titerplade, dyrkes til et sub-sairunenflydende monolag og afprøves for EPO-aktivitet eller antigeneitet i det konditionerede medium.

5 Eksempel 14

Ekspression 1 Insektceller Konstruktion af pIVEV EPOFL13

Plasmidvektoren pIVEV er deponeret og er tilgængelig hos American Type Culture Collection, Rockville, 10 Maryland under deponeringsnummeret ATCC 39991. Vektoren modificeres på følgende måde: pIVEVNI: pIVEV fordøjes med EcoRI for at line- arisere plasmidet, afstumpes ved hjælp af det store fragment i DNA-polymerase I og et enkelt NQtl-forbindelses-15 stykke

GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGG

indsættes ved stumpendeligering. Det opnåede plasmid kal-20 des pIVEVNI.

pIVEVSI: pIVEV fordøjes med Smal for at line- arisere plasmidet, og der indsættes et enkelt Sfil-for-bindelsesstykke

GGGCCCCAGGGGCCC 25 CCCGGGGTCCCCGGG

ved stumpendeligering. Det opnåede plasmid kaldes pIVEVSI.

pIVEVDlBgKp: Plasmidet pIVEVSI fordøjes med

Kpnl for at linearisere plasmidet, og ca. 0-100 bp fjer-30 nes fra hver ende ved fordøjelse med den dobbeltstrengede eksonuclease Bal 31. Eventuelle dpnåede ender, der ikke er fuldstændig stumpe, gøres stumpe ved hjælp af det store DNA-polymerase-I-fragment, og polyforbindelses-stykket

Xho I Xbal 35 i----» ----- ^BgJ/II jEcojRI jcial Kpnl agatctcga'gaattctaga'tcgatggtacc*

T CTAGAG CT CTTAAGATCTAG CTACCATGG

O

51 DK 172953 B1 indsættes ved stumpendeligering. Polyforbindelsesstykket indsættes i begge orienteringer. Et plasmid, hvori polyforbindelsesstykket er orienteret sådan, at Bglll--stedet i polyforbindelsesstykket ligger nærmest poly-5 hedron-genpromotoren, kaldes plVEVSlBgKp. Et plasmid, hvori KpnI-stedet i polyforbindelsesstykket ligger nærmest polyhedron-genpromotoren, kaldes pIVEVSIKpBg. Det antal basepar, som udelades mellem det oprindelige Kpnl--sted i pIVEVSI og polyhedronpromotoren, bestemmes ikke.

10 plVEVSlBgKp er deponeret og tilgængelig hos American

Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under deponeringsnummeret ATCC 39988.

pIVEVSIBqKpNl: pIVEVNI fordøjes helt med ΚρηΙ og PstI, så at der fås to fragmenter. Det store frag-15 ment, der rummer plasmidreplikationskilden og po- lyhedrongenets 3'-ende, fremstilles ved gelsiolering (fragment A). plVEVSlBgKp fordøjes helt med PstI og Kpn, så at der fås to fragmenter, og det mindste fragment, der indeholder polyhédrongenpromotoren og polyfor-20 bindelsesstykket, fremstilles ved gelisolering (fragment B). Fragment A og B damles ved DNA-ligase til dannelse af det nye plasmid pIVEVSIBgKpNl, som indeholder et delvis udeladt polyhedrongen, hvori et polyforbindelsesstykke er indsat, og indeholder også et Notl-sted (der er-25 statter det ødelagte EcoRI-sted) og et Sfil-sted, der flankerer polyhedrongenregionen.

pIVEPO; pIVEVSI-BgKpNI fordøjes helt med EcoRI for at linearisere plasmidet, og EcoRI-fragmentet på 1340 bp fra lambda-HEP0FL13 indsættes. Plasmider, der 30 indeholder EPO-genet sådan orienteret, at EPO-genets 5'--ende er nærmest polyhedron-promotoren og polyhedronge-nets 3'-ende, identificeres ved fordøjelse med Bglll.

Et af disse plasmider i den ovenfor beskrevne orientering betegnes pIVEPO.

35 Ekspression af EPO i Insektceller

Der fremstilles store mængder af pIVEPO-plas- o 52 DK 172953 B1 midet ved at transformere E.coli-stammen JM101-tgl. Plas-mid-DNA'et isoleres ved klaret lysat-teknik (Maniatis og Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) og renses yderligere ved CsCl-centrifugering. Vild-type Autographa cali-5 fornica polyhedrose-virus (AcNPV) stamme L-l-DNA fremstilles ved phenolekstraktion af viruspartikler og derpå følgende CsCl-rensning af det virale DNA.

Disse to DNA'er cotransficeres derpå ind i Spodoptera frugiperda-celler IPLB-SF-21 [Vaghn m.fl.,

In Vitro bd. B, 213-217 (1977)], idet calciumphosphat-transfektionsmetoden anvendes (Potter og Miller, 1977).

For hver plade celler, der cotransficeres, anvendes fiksering med vild-type AcNPV-DNA og lO^ug pIVEPO. Pladerne inkuberes ved 27°C i 5 dage. Væskeoverfasen høstes 15 derpå, og EPO-ekspression i væskeoverfasen bekræftes ved radioimmunanalyse og ved biologisk prøve in vitro.

Eksempel 15 Rensning af EPO

20 Med COS-celler konditioneret medie (121) med EPO-koncentrationer op til 200^ug/liter inddampes til 500 ml ved hjælp af 10.000 molekylvægt-udelukkelsesul- trafiltrationsmembraner, såsom "Millipore Pellican" for-2 synet med 0,46 m membran. Prøver foretages ved RIA som 25 beskrevet i eksempel 6. Retentatet fra ultrafiltreringen diafiltreres mod 4 ml 10 mmolær natriumphosphat pufret til pH 7,0. Det koncentrerede og diafiltrerede konditionsmedium indeholder 2,5 mg EPO i 380 mg totalt protein. EPO-opløsningen koncentreres yderligere til 30 186 ml, og de fældede proteiner fjernes ved centrifuge ring ved 110.000 G i 30 minutter.

Væskeoverfasen, der indeholder 2,0 mg EPO, justeres til pH 5,5 med 50% eddikesyre, omrøres ved 4°C i 30 minutter, og bundfaldet fjernes ved centrifugering 35 ved 13.000 G i 30 minutter.

O

53 DK 172953 B1

Carbonylme thy 1-11 Sepharose "-chroma tograf i Væskeoverfasen fra dentrifugeringen (20 ml), der indeholder 200^ug EPO (24 mg totalt protein) påføres på en kolonne pakket med 20 ml CM-"Sepharose" bragt i li-5 gevægt i 10 mmolær natriumacetat, pH 5,5, vaskes med 40 ml af samme puffer. EPO, som bindes til CM-"Sepharose"n, elueres med en 100 ml gradient af NaU(C-l) i 10 nunolær natriumphosphat, pH 5,5. Fraktionerne, der indeholder EPO (ialt 50^ug i 2 mg totale proteiner), slås sammen to 0g koncentreres til 2 ml ved hjælp af "Amicon" YM10-ul-trafiltreringsmembran.

Omvendt-fase-HPLC

De fra CM-"Sepharose" koncentrerede fraktioner, der indeholder EPO, renses yderligere ved omvendt-fase-15 -HPLC ved hjælp af en "Vydac" C-4-kolonne. EPO'et påføres på kolonnen, der er bragt i ligevægt i 10% opløsningsmiddel B (opløsningsmiddel A er 0,1% CF3C02H i vand, opløsningsmiddel B er 0,1% CF^C02H i CF^CN) med en strømningshastighed på 1 ml/min. Kolonnen vaskes med 10% B 20 i 10 minutter, og EPO'et elueres med lineær gradient af B (10-70% tbå 60 minutter) . De fraktioner, der indeholder EPO, slås sammen (ca. 40^,ug EPO i 120^ug samlede proteiner) og lyofiliseres. Det lyofiliserede EPO rekonstitueres i 0,1 molær Tris-HCl ved pH 7,5 indeholdende 25 0,15 molær NaCl og chromatograferes igen på omvendt fase HPLC-kolonnen. Fraktionerne, der indeholder EPO'et, slås sammen og analyseres ved hjælp af SDS-polyacrylamid-(10%)-gelelektroforese (Laemli, U.K., Nature). De kombinerede EPO-fraktioner indeholder 15,5^ug EPO i 25^ug 30 samlet protein.

Opfindelsen er blevet detaljeret beskrevet, herunder foretrukne udførelsesformer deraf. Det vil i-midlertid være indlysende for fagmænd, at der kan foretages modifikationer og forbedringer af opfindelsen.

35

O

54 DK 172953 B1

Referencer (1) L.O. Jacobson, E. Goldwasser,W. Fried og L.F. Plzak,

Trans. Assoc. Am. Physicians TO, 305-317 (1957) .

(2) S.B. Krantz og L.O. Jacobson Chicago: University of 5 Chicago Press 1970, side 29-31.

(3) D. Hammond og S. Winnick, Ann. N.Y. Acad. Sci. 230, 219-227 (1974).

(4) J.B. Sherwood og E. Goldwasser, Endocrinology 103, 866-870 (1978) .

10 (5) W. Fried, Blood 40, 671-677 (1972).

(6) J. Fisher, J. Lab. and Clin. Med. 93, 695-699 (1979).

(7) B.A. Naughton, S.M. Kaplan, M. Roy, A.J. Burdowski, A.S. Gordon og S.J. Piliero, Science 196 , 301-302.

(8) G.P. Lucarelli, D. Howard og F. Stohlman Jr., J.

15 Clin. Invest 43, 2195-2203 (1964).

(9) E.D. Zanjani, J. Poster, H. Burlington, L.I. Mann og L.R. Wasserman, J. Lab. Clin. Med. 89, 640-644 (1977).

(10) S.B. Krantz, O. Gallien-Lartigue og E. Goldwasser, J. Biol. Chem. 238, 4085-4090 (1963).

20 (11) C.D. Dunn, J.H. Jarvis og J.M. Greenman, Exp. Hema- tol. 3, 65-78 (1975) .

(12) G. Krystal, Exp. Hematol. 11, 649-660 (1983).

(13) N.N. Iscove og L.J. Guilbert, M.J. Murphy, Jr. (udg.)

New York, Springer-Verlag, side 3-7 (1978).

25 (14) E. Goldwasser, ICN UCLA Symposium, Control of Cellu lar Division and Development, A.R. Liss, Inc., side 487-494 (1981).

(15) M.J. Cline og D.W. Golde, Nature 277, 177-181 (1979) .

(16) D. Metcalf, G.R. Johnson og A.W. Burgess, Blood 55, 30 138- (1980).

(17) N. Krane, Henry Ford Hosp. Med. J. 31, 177-181 (1983).

(18) J. Eschbach, J. Madenovic, J. Garcia, P. Wahl og J.

Adamson, J. Clin. Invest. 74, 434-441 (1984).

(19) A. Anagnostou, J. Barone, A. Vedo og W. Fried, Br.

35 J. Hematol. 37, 85-91 (1977).

O

55 DK 172953 B1 (20) T. Miyake, C. Kung og E. Goldwasser, J. Biol. Chem.

252, 5558-5564 (1977).

(21) S. Yanagawa, K.Hirade, H. Ohnota, R. Sasaki, H. Chiba, M.Veda og M. Goto, J. Biol. Chem. 259, 2707-2710 5 (1984).

(22) R.M. Lawn, E.F. Fritsch, R.C. Parker, G. Blake og T. Maniatis, Céll 15, 1157- (1978).

(23) F. Sanger, S. Nicklen og A.R. Couson, Proc. Nat'l.

Acad. Sci. USA 74, 5463- (1977).

10 (24) E.D. Zanjanc, J.L. Ascensao, P.B. McGlave, M. Bani- sadre og R.C. Ash, J. Clin. Invest. 67, 1183- (1981).

(25) J.J. Toole, J.L. Knopf, J.M. Wozney, L.A. Sultzman, J. L. Buecker, D.D. Pittman, R.J. Kaufman, E. Brown, C.

Shoemaker, E.C. Orr, G.W. Amphlett, W.B. Foster, M.L. Coe, 15 G.J. Knutson, D.N. Fass og R.M. Hewick, Nature in Press.

(26) E. Goldwasser, Blood Suppl. 1, 58, xlii (a.bstr) (1981) .

(27) J.M. Sue og A.J. Sytkowdki, Proc. Nat'l. Acad. Sci.

USA 80 , 3651-3655 (1983) .

(29) N. Bersch og D.W. Golde, In Vitro Aspects of Ery-20 thropoiesis, M.J. Murphy (udg.) New York, Springer-Verlag (1978).

(30) P.M. Cotes og D.R. Bangham, Nature 191, 1065- (1961).

(31) E. Goldwasser og M. Gross, Methods in Enzymol. 37, 109-121 (1975).

25 (32) Y. -i Nabeshima, Y. Fujii-Kuriyama, M. Muramatsu og K. Ogata, Nature 308, 333-338 (1984).

(33) R.A, Young, O. Hagencuhle og U. Schibler, Cell 23, 451-558 (1981).

(34) R.M. Medford, H.T. Nguyen, A.T. Destree, E. Summers 30 0g B. Nadal-Ginard, Cell 38, 409-421 (1984).

(35) E.B. Ziff, Nature 287, 491-499 (1980).

(36) P. Early, Cell 20, 313-319 (1980) (37) A. Sytkowski, Bio. Biop. Res. Comm. 96, 143-149 (1980).

(38) M. Murphy og T. Miyaka, T. Acta. Haematol. Jpn. 46, 35 1380-1396 (1983).

O

56 DK 172953 B1 (39) P.V. Wagh og O.P. Bahl, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 307-377 (1981).

(40) F.F. Wang, C.K. -H. Kung og E. Goldwasser, Fed.

Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 42, 1872 (abstr) (1983).

5 (41) P. Lowy, G. Keighley og H. Borsook, Nature 185, 102-103 (1960).

(42) L. VanLenten og G. Ashwell, J. Biol. Chem. 247, 4633-4640 (1972).

(43) S. Lee-Huang, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81, 2708--2712 (1984) .

(44) F. Fyhrquist, K. Rosenlof, C. Gronhagen-Riska, L.

Hortling og I. Tikkanen, Nature 308, 649-562 (1984).

(45) H. Ohkubo, R. Kageyama, M. Vjihara, T. Hirose, S.

Inayama og S. Nakanishi, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80, 15 2196-2200 (1983)·.

(46) S.V. Suggs, R.B. Wallace, T. Hirose, E.H. Kawashima og K. Itakura, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 78, 6613-6617 (1981) .

(47) S.L.C. Woo, A. Dugaiczyk, M. -J. Tsai, E.C. Lai, 20 J.F. Catterall og B.W. O'Malley, Proc. Nat'l.-Acad. Sci.

USA 75, 3688- (1978) .

(48) W.B. Melchior og P.H. VonHippel, Proc. Nat'l. Acad.

Soc. USA 70, 298-302 (1973).

(49) J.M. Orosz og J.G. Wetmis, Biopolymers 16, 1183- 25 1199 (1977) .

(50) S. Anderson og I.B. Kingston, Proc. Nat'l. Acad.

Sci. USA 80, 6836-6842 (1983).

(51) A. Ullrich, L. Coussens, J.S. Hayflick, T.J. Dull, A. Gray, A.W. Tam, J. Lee, Y. Yarden, T.A. Libermann, J.

30 Schlessinger, J. Downward, E.L.V. Mayes, H. Whittle, M.

D. Waterfield og P.H. Seeburg, Nature 309, 418-425 (1984).

(52) J. Fisher, Proc. Soc. Exptl. Biol, and Med. 173, 289-305 (1983).

(53) M. Kozak, Nuc. Acid Res. 12, 857-872 (1984).

35 (54) W.D. Benton og R.W. Davis, Science 196, 180-182 (1977) ,

O

57 DK 172953 B1 (55) J.B. Sherwood og E. Goldwasser, Blood 54, 885-893 (1979).

(56) E. Derman, K. Krauter, L. Walling, C. Weinberger, M. Ray og J.T. Darnell, Cell 23, 731- (1981) .

5 (57) Y. Gluzman, Cell 23, 175-182 (1981).

(58) R.M. Hewick, M.E. Hunkapiller, L.E. Hood og W.J.

Dreyer, J. Biol. Chem. 256, 7990-7997 (1981) .

(59) H. Towbin, T. Stachelin og J. Gordon, Proc. Nat'l.

Acad. Sci. 76, 4380- (1979).

10 (60) P. Carnott, D. DePlandre, C.R. Acad. Sci. Paris 143, 432- (1960) .

15 20 25 30 35

Claims (26)

1. 58 DK 172953 B1
2. 1. Isoleret DNA-sekvens, der koder for humant erythropoietin, kendetegnet ved, at den omfatter nukleotidsekven- s sen angivet i tabel IV fra sekvensen ATG, der koder for det indledende Met, til og med AGA, der koder for det terminale Arg.
3. 2. Vektor, io kendetegnet ved, at den indeholder DNA-sekvensen ifølge krav l.
4. 3. Rekombinant DNA-vektor ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den omfatter en genomisk DNA-15 klon, der har en nukleotidsekvens som vist i tabel IV.
5. 4. Isoleret pattedyrværtscelle, kendetegnet ved, at den er transformeret med vektoren ifølge krav 2. 20
6. 5. Pattedyrscellelinie, kendetegnet ved, at den er transformeret med vektoren ifølge krav 3.
7. 6. Cellelinie ifølge krav 5, kendetegnet ved, at pattedyrscellerne er CHO-celler.
8. 7. DNA-Sekvens, der koder for aminosyresekvensen 1-166 af oo erythropoietin som vist i tabel III, kendetegnet ved, at den omfatter nukleotiderne "GGTC", der er 50 nukleotider opstrøms for ATG-codonet, der koder for -27 Met, til og med nukleotiderne TGA, der efterfølger AGA-codonet, der koder for 166 Arg. 35
9. 8. Rekombinant DNA-vektor, kendetegnet ved, at den omfatter en heterolog promoter og DNA-sekvensen ifølge krav 7. 59 DK 172953 B1
10. 9. Rekombinant DNA-plasmidvektor ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den indeholder cDNA, som koder for humant erythropoietin, fra klonen lambda-HEPOFL13 (ATCC 5 40153).
11. 10. Pattedyrscellelinie, kendetegnet ved, at den er transformeret med vektoren ifølge krav 8 eller 9. 10
12. 11. Cellelinie ifølge krav 10, kendetegnet ved, at pattedyrscellerne er 3T3-, C127- eller CHO-celler. 12. cDNA-sekvens, der koder for aminosyresekvensen 1-166 af erythropoietin, kendetegnet ved, at den omfatter sekvensen fra tabel III fra GCC-codonet, der koder for 1 Ala, til og med AGA-codonet, der koder for 166 Arg. 20 13. cDNA-sekvens ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter en DNA-sekvens, der koder for aminosyre"leader"-sekvensen MET GLY ... LEU GLY som vist i tabel III. 25
13. 14. Fremgangsmåde til fremstilling af en human cDNA-klon, der omfatter en nucleotidsekvens vist i Tabel III, og som udtrykker biologisk aktivt erythropoietin, kendetegnet ved, at 30 (a) renset erythropoietinprotein fordøjes med trypsin, (b) der fremstilles en pulje af oligonucleotidsonder baseret på aminosyresekvensen i de tryptiske fragmenter fremstillet i 35 trin (a) , (c) et humant genomisk DNA-bibliotek screenes med oligonucle-otidsonderne fra trin (b), 60 DK 172953 B1 (d) der udvælges kloner, der hybridiserer til sonderne, og klonerne sekvensbestemmes for at afgøre, om de er erythropoi-etinkloner, 5 (e) en erythropoietinklon fra trin (d) identificeres, {f) klonen fra trin (e) anvendes til at screene et DNA-bib-liotek fremstillet af human-fosterlever, og 10 (g) en erythropoietinklon udvælges fra fosterlever-cDNA-biblioteket i trin (f).
14. 15. Fremgangsmåde til fremstilling af humant erythropoietin, 15 kendetegnet ved, at eukaryote værtsceller, der indeholder en DNA-sekvens som vist i tabel III eller en DNA-sekvens ifølge krav 7, 12 eller 13 operativt bundet til en ekspressionskontrolsekvens, dyrkes i et egnet medium, og at det således fremstillede erythropoietin adskilles fra celler-20 ne og mediet.
15. 16. Fremgangsmåde til fremstilling af humant erythropoietin, kendetegnet ved, at eukaryote værtsceller, der indeholder en DNA-sekvens som vist i tabel IV operativt 25 bundet til en ekspressionskontrolsekven's, dyrkes i et egnet medium, og at det således fremstillede erythropoietin adskilles fra cellerne og mediet.
16. 17. Fremgangsmåde ifølge krav 15 eller 16, 30 kendetegnet ved, at dyrkningsmediet indeholder fosterserum.
17. 18. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 15-17, 35 kendetegnet ved, at værtscellerne er pattedyrsceller.
18. 19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, 61 DK 172953 B1 kendetegnet ved, at pattedyrscellerne er COS-, CHO-, C127- eller 3T3-celler.
19. 20. Fremgangsmåde ifølge krav 18, skendetegnet ved, at pattedyrscellerne er 3T3- celler.
20. 21. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at pattedyrscellerne er ovarie -io celler fra kinesisk hamster (CHO).
21. 22. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen er indeholdt i en vektor, der også indeholder oksepapillomvirus-DNA. 15
22. 23. Fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat af humant erythropoietin, kendetegnet ved, at 20 (a) at eukaryote værtsceller, der er transformeret med en DNA-sekvens, som koder for humant erythropoietin, dyrkes i et passende medium, hvilken DNA-sekvens er valgt blandt: DNA'et vist i tabel III; DNA'et vist i tabel IV; DNA'et vist i tabel IV, som omfatter nukle-25 otiderne "GGTC" halvtreds nukleotider opstrøms for ATG-codonet, der koder for -27 Met, til og med nukle-otiderne TGA, som efterfølger AGA-codonet, der koder for 166 Arg; og DNA'et vist i tabel IV, som omfatter ATG-codonet, der koder for -27 Met, til og med nukle-30 otiderne TGA, som efterfølger AGA-codonet, der koder for 166 Arg, hvilken sekvens er operativet bundet til en ekspressionskontrolsekvens, (b) det således fremstillede humane erythropoietin adskilles 35 fra cellerne og mediet, og (c) erythropoietinet formuleres i forbindelse med en farmaceutisk acceptabel bærer. 62 DK 172953 B1
23. 24. Pattedyrscelle, kendetegnet ved, at den indeholder hele det bovine papillomvirus-DNA og DNA-sekvensen vist i tabel III, der 5 koder for EPO.
24. 25. Pattedyrscelle ifølge krav 24, kendetegnet ved, at cellen er en C127- eller 3T3-celle. 10
25. 26. Pattedyrscelle ifølge krav 25, kendetegnet ved, at EPO-DNA'et er under transskriptionskontrol af en musemetallothionein-promotor.
26. 27. Pattedyrscelle ifølge krav 26, kendetegnet ved, at cellen indeholder et plasmid omfattende DNA fra pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224).