JPH11206379A - マラセチア由来抗原性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】マラセチア由来の抗原性を有する純粋な新規ポ
リペプチド、及びその抗原性ポリペプチドをコードする
ＤＮＡを提供すること。 【解決手段】1)配列番号：１に示されるアミノ酸配列か
らなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、2)かかるアミ
ノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、
挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするＤＮＡ、3)配列番号：２に示される塩基配
列からなるＤＮＡ、4)かかる塩基配列において、１個以
上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列か
らなるＤＮＡ、及び5)1)〜4)いずれかのＤＮＡにストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、から
なる群より選ばれるＤＮＡであって、マラセチア由来の
抗原性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、並び
にかかるＤＮＡにコードされる、マラセチア由来の抗原
性を有するポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はマラセチア属真菌を
始めとする真菌による感染症やアレルギー疾患の予防、
治療、診断に有用な、マラセチア由来の抗原性を有する
ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡに
関する。更に、本発明は該ＤＮＡを含有するベクター、
該ベクターによって形質転換された形質転換体、該形質
転換体を用いたポリペプチドの生産方法に関する。更に
本発明は、その医薬組成物又は診断用組成物としての利
用に関する。

【０００２】

【従来の技術】マラセチア（Malassezia、以下、Ｍ．と
略する。）属真菌としては、M. furfur 、M. pachyderm
atis、M. sympodialisが知られている。これらマラセチ
ア属真菌は各種動物、ヒトの体表に常在しており、アレ
ルギー疾患における役割については、古くから注目さ
れ、研究されてきた。マラセチア属真菌は皮膚炎、癜
風、毛包炎、フケなどの原因菌として、また、アトピー
性皮膚炎などのアレルギー性疾患との関連も疑われてい
る。上記のように、マラセチア属真菌は種々の疾患の原
因菌として関わっている可能性が高い。

【０００３】従来、マラセチア抗原タンパク質として、
アレルギー性疾患患者由来の血清ＩｇＥと結合するアレ
ルゲン性タンパク質が単離されている（WO 97/21817 、
Eur.J. Biochem. 246, 181-185, 1997 ）。しかし、抗
原タンパク質は複数存在することが知られており、どの
タンパク質が主要アレルゲンであるか、さらに予防、治
療、診断等に有用であるかは不明である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
のような現状を考慮し、マラセチア由来の抗原性を有す
る純粋な新規ポリペプチドを提供することにある。更
に、その抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供
することにある。更に、かかるＤＮＡを含有するベクタ
ーを提供することにある。更に、かかるベクターによっ
て形質転換された形質転換体を提供することにある。更
に、かかる形質転換体を上記ポリペプチドの発現可能な
条件下で培養するポリペプチドの生産方法を提供するこ
とにある。更に、上記ポリペプチドを有効成分とする、
医薬組成物及び診断用組成物を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
〔１〕 （Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列
からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、（Ｂ）配列
番号：１に示されるアミノ酸配列において、１個以上の
アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配
列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、（Ｃ）配
列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｄ）
配列番号：２に示される塩基配列において、１個以上の
塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からな
るＤＮＡ、及び（Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮ
Ａにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤ
ＮＡ、からなる群より選ばれるＤＮＡであって、マラセ
チア由来の抗原性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ、〔２〕 前記〔１〕記載のＤＮＡを含有するベ
クター、〔３〕 前記〔２〕記載のベクターによって
形質転換された形質転換体、〔４〕 前記〔３〕記載
の形質転換体を、前記〔１〕記載のＤＮＡにコードされ
るポリペプチドの発現可能な条件下で培養するポリペプ
チドの生産方法、〔５〕 前記〔１〕記載のＤＮＡに
コードされる、マラセチア由来の抗原性を有するポリペ
プチド、

【０００６】〔６〕 前記〔５〕記載のポリペプチド
と免疫学的に同等なポリペプチドであって、マラセチア
由来の抗原性を有するポリペプチド、〔７〕 前記
〔５〕及び／又は〔６〕記載のポリペプチドを有効成分
とする医薬組成物、〔８〕 前記〔５〕及び／又は
〔６〕記載のポリペプチドを有効成分とする診断用組成
物、

〔９〕 前記〔１〕記載のＤＮＡを有効成分とす
る医薬組成物、〔１０〕 前記〔１〕記載のＤＮＡを有
効成分とする診断用組成物、〔１１〕 前記〔５〕記載
のポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体断片、
〔１２〕 前記〔１〕記載のＤＮＡの全部又は一部とハ
イブリダイズするプローブ又はプライマー、に関するも
のである。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】１．本発明のＤＮＡ 本発明のＤＮＡとしては以下のものが挙げられる。例え
ば、（Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドをコードするＤＮＡ、（Ｂ）配列番号：
１に示されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ
酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列から
なるポリペプチドをコードするＤＮＡ、（Ｃ）配列番
号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｄ）配列
番号：２に示される塩基配列において、１個以上の塩基
が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるＤ
ＮＡ、及び（Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡに
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
Ａ、からなる群より選ばれるＤＮＡであって、マラセチ
ア由来の抗原性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａである。

【０００９】本明細書において「マラセチア由来の抗原
性を有する」とは、本発明のポリペプチドがマラセチア
アレルギー疾患患者由来のＩｇＥ抗体との結合性を有す
ることを言い、具体的には、 ¹²⁵Ｉ標識抗ＩｇＥ血清を
用いるRAST法、酵素標識抗ＩｇＥ血清を用いるDirect-R
AST RIA 法やＥＬＩＳＡ法により測定して、標準血清と
の比較等により有為な結合が得られることを言う。

【００１０】（Ｃ）に規定される、配列番号：２に示さ
れる塩基配列からなるＤＮＡは、Ｍ．ファーファ中のＤ
ＮＡに見出される。また、（Ａ）に規定される、配列番
号：１に示されるアミノ酸配列は配列番号：２に示され
る塩基配列から導かれるアミノ酸配列である。なお、配
列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡは、マラ
セチア由来の抗原性タンパク質のＮ末端領域をコードす
る配列を欠いたものであると考えられる。

【００１１】さらに、上記の（Ｂ）で規定されるＤＮＡ
のような、配列番号：１に示されるアミノ酸配列におい
て、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加さ
れたアミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードするＤ
ＮＡ、及び上記の（Ｄ）で規定されるＤＮＡのような、
配列番号：２に示される塩基配列において、１個以上の
塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からな
るＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。本明細書にお
ける、「１個以上」とは、１個又は数個若しくはそれ以
上の個数をいう。

【００１２】塩基配列及びアミノ酸配列において、１個
以上の塩基及びアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を
行う手法としては、モレキュラー クローニング：ア
ラボラトリー マニュアル第２版（１９８９年、コール
ド スプリング ハーバーラボラトリー発行、Ｔ．マニ
アティスら編集）等に記載されている、種々の遺伝子工
学的手法が挙げられる。

【００１３】さらに、（Ｅ）で規定されるＤＮＡも本発
明のＤＮＡに包含される。本明細書において「ストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、
プローブとともに０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、
０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子Ｄ
ＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を
示す。）中、５０℃にて１２〜２０時間インキュベート
した後に、プローブとハイブリダイズしているＤＮＡを
いう。

【００１４】また、コードされるポリペプチドがマラセ
チア由来の抗原性を有する限り、上記の本発明のＤＮＡ
及び該ＤＮＡのフラグメントも本発明に包含される。ま
た、本発明のポリペプチドの一部が脱離したポリペプチ
ド、又は本発明のポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末
端に、例えば、Ｔ７ファージ由来のタンパク質、ヒスチ
ジンポリマー、マルトース結合タンパク質、グルタチオ
ンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダ
ーゼ等が付加された融合タンパク質をコードするＤＮＡ
も、かかるポリペプチドや融合タンパク質がマラセチア
由来の抗原性を示す限り本発明に包含される。

【００１５】また本発明のＤＮＡの全部又は一部とハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドプローブ又はプライマ
ーも本発明に含まれる。このポリヌクレオチドプローブ
は、ハイブリダイゼーションによるＭ．ファーファ抗原
遺伝子の検出やポリヌクレオチドプローブを用いたＤＮ
Ａ増幅方法に利用可能である。

【００１６】また、マラセチア・ファーファの変異株、
近縁菌（例えばM. pachydermatis,M. sympodialis等の
マラセチ属真菌）由来のＤＮＡであって、本発明のＤＮ
Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能で
あり、かつ免疫学的に同等な、マラセチア由来の抗原性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明に含
まれる。

【００１７】２．本発明のポリペプチド 本発明のポリペプチドとしては以下のものが挙げられ
る。例えば、（Ａ’）配列番号：１に示されるアミノ酸
配列からなるポリペプチド、（Ｂ’）配列番号：１に示
されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠
失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポ
リペプチド、（Ｃ’）配列番号：２に示される塩基配列
からなるＤＮＡにコードされるポリペプチド、（Ｄ’）
配列番号：２に示される塩基配列において、１個以上の
塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からな
るＤＮＡにコードされるポリペプチド、及び（Ｅ’）
（Ａ’）〜（Ｄ’）のいずれかのポリペプチドをコード
するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡにコードされるポリペプチド、からなる群
より選ばれるポリペプチドであって、マラセチア由来の
抗原性を有するポリペプチド等である。

【００１８】（Ａ’）に規定されるポリペプチドは、
Ｍ．ファーファのｃＤＮＡ発現ライブラリーについて、
Ｍ．ファーファに対する抗血清を用いてイムノスクリー
ニングすることにより、マラセチア由来の抗原性を有す
る組換えポリペプチドとして見出した新規のポリペプチ
ドである。

【００１９】また、本発明のＤＮＡにコードされるポリ
ペプチドと免疫学的に同等の性質を有するポリペプチド
であって、マラセチア由来の抗原性を有するポリペプチ
ドも本発明に含まれ、抗原性ポリペプチドとして好適に
利用される。例えば、リシルエンドペプチダーゼ、トリ
プシン等のプロテアーゼによる酵素消化又は臭化シアン
等による化学的処理により、配列番号：１に示されるア
ミノ酸配列からなるポリペプチドの切断を行い、目的の
抗原性を有するペプチド断片を単離精製することにより
得られるポリペプチド、及び配列番号：１に示されるア
ミノ酸配列からなるポリペプチド又は前記の抗原性ペプ
チド断片のＮ末端又はＣ末端にＴ７タグなどのペプチド
が付加された融合タンパク質であって該抗原性を有する
もの等である。

【００２０】したがって、本発明のポリペプチドは、マ
ラセチア由来の抗原性を有する限り、天然由来又は化学
合成されたポリペプチドでも良く、遺伝子組換え技術に
よって調製されるポリペプチドでも良く、遺伝子組換え
技術によって改変されたポリペプチドでも良い。また、
本明細書において「免疫学的に同等」とは、同等のマラ
セチア由来の抗原性を有することを言う。

【００２１】また、Ｍ．ファーファの変異株、近縁菌
（例えばM. pachydermatis、M. sympodialis等のマラセ
チア属真菌）由来のポリペプチドであって、前記配列番
号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと
免疫学的に同等のポリペプチド及びその誘導体も本発明
に含まれる。

【００２２】次に、本発明の、ポリペプチドを生産する
方法を説明する。例えば、本発明のＤＮＡを含有するベ
クターによって形質転換された形質転換体を、本発明の
ＤＮＡにコードされるポリペプチドの発現可能な条件下
で培養することにより本発明のポリペプチドを生産する
ことができる。

【００２３】形質転換体の培養条件としては特に限定さ
れるものではなく、本発明のＤＮＡの発現可能な条件で
あれば良い。また、発現されたタンパク質は、当該分野
で知られる公知のタンパク質の精製方法により回収、精
製することができる。

【００２４】本発明のベクターは本発明のＤＮＡを含有
してなるベクターであり、発現ベクターのみならず、本
発明のＤＮＡを含有するあらゆるベクターが含まれる。
このようなベクターは、本発明のＤＮＡを大腸菌等の宿
主に安定に保持させることができる。かかるベクターの
構築に用いられるベクターとしては、例えばｐＧＥＸ−
１λＴ、ｐＵＣ１１８、ｐＷＨ５、ｐＴＶ１１８等が挙
げられるが、本発明のＤＮＡが挿入できるものであれば
特に限定されない。ＤＮＡをベクターに挿入する方法は
特に限定されるものではなく、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いる方法等の公知の方法を用いることができる。

【００２５】本発明の形質転換体は、本発明のベクター
によって形質転換されてなるものである。このような形
質転換体は、本発明のベクターを宿主に導入することに
より得られる。宿主としては、大腸菌、バチルス属等の
細菌、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセ
ス・ポンベ、カンジダ属等の酵母、アスペルギルス属、
ピキア・パストリス等の真菌の他、昆虫細胞、ＣＯＳ−
７、Ｖｅｒｏ細胞等の動物細胞を用いることができる。
本発明のベクターを宿主に導入する方法としては、例え
ば、リン酸カルシウム法、ＣａＣｌ₂ 法、ＤＥＡＥデキ
ストラン法、エレクトロポーレーション法等の公知の方
法が挙げられる。

【００２６】上記のように、本発明のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡはクローニングされているので、これら
のＤＮＡを導入した形質転換体を作製して本発明のポリ
ペプチドを大量生産することが可能である。また、本発
明のポリペプチドの生産に使用できる、上記のベクタ
ー、上記の形質転換体も本発明に包含される。

【００２７】また、本発明は、上記のマラセチア由来の
抗原性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体又
はその断片を提供する。本発明の抗体又はその断片は常
法により得ることができる。かかる抗体はポリクローナ
ル抗体でも良く、モノクローナル抗体でも良い。抗体断
片は本発明のポリペプチドに特異的に結合するものであ
れば、特に限定されない。

【００２８】３．本発明の医薬組成物・診断用組成物 さらに、本発明の医薬組成物及び診断用組成物は、本発
明のポリペプチドを有効成分とする。かかるポリペプチ
ドは単独で用いても良く、２種以上を混合して用いても
良い。かかるポリペプチドは、マラセチア属真菌を原因
とするアレルギー疾患の予防、治療や診断のための抗原
として有用である。また、哺乳類において、Ｍ．ファー
ファを始めとするマラセチア菌による感染に対する感染
防御免疫を誘導するためのワクチン用の抗原として、ま
た感染の有無や進行状態を診断するための抗原として有
用である。

【００２９】感染防御免疫を誘導するための医薬組成物
の使用の際には、より強い体液性及び／又は細胞性免疫
を得るために、本発明のポリペプチドを下記のようなア
ジュバントを含む懸濁液又は溶液として製剤化し投与す
ることが一般的である。アジュバントは、普通、抗原性
成分である本発明のポリペプチドと共に投与されるが、
抗原性成分を投与する前又は後に与えてもよい。哺乳類
のワクチン接種に適当なアジュバントとしては特に限定
されるものではなく、例えば、フロイント（Freund's）
の完全又は不完全アジュバント；水酸化アルミニウム、
みょうばん等の無機物ゲル；リゾレシチン、ジメチルオ
クタデシルアンモニウムブロミド、リゾレシチン等の界
面活性剤；硫酸デキストラン、ポリIC等のポリアニオ
ン；ムラミルペプチド、タフトシン等のペプチド；Ribi
社製のモノフォスフォリルリピドＡ（MPL ）；コレラト
キシンのＢサブユニット等が挙げられる。抗原性成分は
リポソーム又は他のマイクロキャリアーに取り込ませて
投与しても良い。

【００３０】アレルギー疾患の予防、治療のための医薬
組成物の使用の際には、適当な塩溶液や懸濁液の形で用
いることができ、例えばポリエチレングリコールやフェ
ノールを添加しても良い。更に上記のようなアジュバン
トを含む懸濁液又は溶液として投与することもできる。
アジュバントは、普通、抗原性成分と共に投与される
が、抗原性成分の投与の前又は後に与えてもよい。抗原
性成分はリポソーム又は他のマイクロキャリアーに取り
込ませて投与することもできる。

【００３１】上記の医薬組成物の投与方法としては、経
口、経粘膜（鼻、膣等）、経皮（皮下又は皮内）的に、
又は静脈内に投与すればよい。投与量は、タンパク質量
として０．０１μｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好まし
く、１〜１００μｇ／ｋｇ体重の範囲がより好ましい。
なお、必要とする予防の程度に応じて、投与量を増加し
たり、投与回数を増大させても良い。

【００３２】本発明の診断用組成物を生体内診断の目的
で、個体に対し、例えば、吸入誘発試験、皮膚テスト、
鼻や眼の粘膜試験で使用する際は、凍結乾燥粉末や適当
な塩溶液や懸濁液の形で用いることができ、さらにポリ
エチレングリコールやフェノールを添加してもよい。パ
ッチテストには、白色ワセリンを基剤としてラウリル硫
酸ナトリウム等の界面活性剤を添加したものに上記抗原
性成分を溶解したものを使用することができる。

【００３３】本発明の診断用組成物は、実験室診断、例
えば、抗原抗体反応である凝集反応、沈降反応、中和反
応、標識抗体法を用いた診断法、ヒスタミン遊離試験、
リンパ球幼若化試験、白血球遊走阻止試験等にも使用す
ることができる。例えば、ＩｇＥ抗体価測定用の抗原と
して本発明のポリペプチドを使用する際には、ペーパー
ディスク、セルローススポンジ、マイクロプレート等の
固相体に該ポリペプチドを固定化して使用することがで
きる。

【００３４】また、本発明のＤＮＡは、哺乳類におい
て、Ｍ．ファーファを始めとするマラセチア菌による感
染や他の真菌感染に対する感染防御免疫を誘導するため
のワクチン用の抗原遺伝子として、また、Ｍ．ファーフ
ァを始めとする真菌を原因とするアレルギー疾患の予
防、治療や診断のための抗原遺伝子として有用である。
抗原遺伝子を感染防御やアレルギー疾患の治療のために
用いる場合は、哺乳類細胞内で発現可能となるように適
当なプロモーターの下流に本発明のＤＮＡを含んでいる
プラスミドをそのまま、又はレトロウイルスやアデノウ
イルスに挿入して投与することができる。医薬組成物と
して使用する際には、適当な塩溶液や懸濁液の形で用い
ることができる。抗原遺伝子はリポソーム又は他のマイ
クロキャリアーに取り込ませたり、適当なポリカチオン
系脂質に混合して投与することもできる。

【００３５】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はかかる実施例により何ら限定されるもの
ではない。

【００３６】実施例１ 抗マラセチア抗体の調製 抗マラセチア血清を得るために、Ｍ．ファーファＴＩＭ
Ｍ２７８２株の菌体を３００ｍＬのＹＮＢ培地（０．６
７重量％バクトイーストナイトロゲンベース、０．５重
量％バクトカシトン、０．１重量％Ｔｗｅｅｎ６０、
２．０重量％グルコース、５重量％ＭＥＭ−ビタミン
液）で培養後、３０００ｒｐｍの遠心により集菌した。
フロイント完全アジュバントと共に、得られた菌体の５
０ｍｇ（１．２×１０⁹ 細胞）を用いて、ウサギ（日本
白色種）を免疫した。免疫は２週間隔で４回行った。最
終免疫から１０日後に該ウサギの血液を採取し、血清を
調製した。この血清を抗マラセチア血清とした。

【００３７】なお、ここで用いた上記の菌株は、Malass
ezia furfur TIMM2782と表示され、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所〔あて名：日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番３号〕にＦＥＲＭ ＢＰ−５６１１
（原寄託日：１９９５年９月１２日；国際寄託への移管
請求日：１９９６年７月２９日）として寄託されてい
る。

【００３８】マラセチアタンパク質に特異的に反応する
抗体を得るために、マラセチアタンパク質を固定化した
アフィニティカラムを作製した。即ち、Ｍ．ファーファ
菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄した後、
菌体湿重量の２倍量のＰＢＳに懸濁した。次いで、懸濁
液の等容量の０．５ｍｍ径のガラスビーズを得られた懸
濁液に加え、ＭＳＫセルホモゲナイザーにより菌体を破
砕して抽出液を得た。得られた菌体破砕抽出液を遠心分
離（１８０００ｒｐｍ、３０分間）にかけ、上清を得
た。この上清を精製水に対して透析し、次いで０．４５
μｍのメンブレンフィルターでろ過滅菌後、凍結乾燥す
ることによりマラセチア粗抗原を得た。

【００３９】この粗抗原を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に溶解させて、硫安塩析を行った。硫安
５０％から９０％飽和で沈殿する画分を遠心分離で集め
た。得られた沈殿を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。透析さ
れた画分を可溶性画分とした。この画分をＣＮＢｒ−活
性化Sepharose 4Bに結合させ、マラセチアタンパク質ア
フィニティカラムを作製した。

【００４０】抗マラセチア血清１ｍＬをマラセチアタン
パク質アフィニティカラムに吸着させ、ＰＢＳで洗浄
後、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で溶出することに
より、マラセチアタンパク質と特異的に結合する抗マラ
セチア抗体を得た。

【００４１】実施例２ Ｍ．ファーファｃＤＮＡ発現ラ
イブラリーによる抗原分子のスクリーニング （ａ）Ｍ．ファーファのｃＤＮＡライブラリーの作製 Ｍ．ファーファＴＩＭＭ２７８２株の菌体より全ＲＮＡ
を得るために、以下の操作を行った。即ち、Ｍ．ファー
ファＴＩＭＭ２７８２株の菌体を３００ｍＬのＹＮＢ培
地で培養後、３０００ｒｐｍの遠心により集菌した。得
られた菌体を洗浄し、次いで液体窒素により急速凍結し
た。乳鉢により凍結菌体を粉末状に破砕した後、ＲＮＡ
エクストラクションキット（ファルマシア社製）により
全ＲＮＡ１．３ｍｇを回収、精製した。

【００４２】精製された全ＲＮＡ１ｍｇからオリゴテッ
クス−ｄＴ３０＜スーパー＞（宝酒造社製）を用いるこ
とにより、２０μｇのポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを精製した。
ｃＤＮＡ合成キット（宝酒造社製）を用いて、得られた
ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ５μｇからｃＤＮＡを合成した。合
成されたｃＤＮＡと発現用プラスミドベクターｐＧＥＸ
−１λＴ（ファルマシア社製）と連結することによりｃ
ＤＮＡライブラリーを作製した。

【００４３】（ｂ）抗原性を有するポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡのクローニング （ａ）において得られたｃＤＮＡライブラリーを宿主大
腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換後、アンピシリンを含むＬ
Ｂプレート上にまき、３７℃で一夜培養した。生じた形
質転換体のコロニー（２．５×１０⁴ コロニー）から、
マラセチア由来の抗原性を有するポリペプチドをコード
するｃＤＮＡをクローニングするために、実施例１で得
られた抗マラセチア抗体を用いるイムノスクリーニング
を行った。即ち、あらかじめＩＰＴＧ溶液（１０ｍＭ）
に浸した後、乾燥させたニトロセルロースメンブレン
（Hybond-C extra、アマシャム社製）へ上記のＬＢプレ
ート上のコロニーを移した。次いで、アンピシリンを含
む新しいＬＢプレート上にこのメンブレンを載せ、３７
℃で２時間、この状態で保温した。

【００４４】メンブレンを取り出した後、このメンブレ
ンをクロロホルム蒸気で２５分間、室温で処理した。さ
らにメンブレンをリゾチーム（４００μｇ／ｍＬ）とＤ
Ｎａｓｅ（１０μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳで１時間、室
温で処理した。次に０．１重量％Ｔｗｅｅｎ４０を含む
ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でこのメンブレンの洗浄を４回行っ
た後、過剰量のブロックエース（大日本製薬社製）に浸
し、一夜室温で放置することによりブロッキングした。
このメンブレンを実施例１で調製した抗マラセチア抗体
（２５０倍希釈液）と３時間室温で反応させ、ＰＢＳＴ
で洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体
（１０００倍希釈）と１時間室温で反応させた。ＰＢＳ
Ｔで洗浄後、Super Signal Substrate Western Blottin
g （Pierce社製）により、マラセチア由来の、抗マラセ
チア抗体と結合する抗原性ポリペプチドを発現している
形質転換体コロニーを検出した。

【００４５】２．５×１０⁴ コロニーをスクリーニング
した結果、抗血清と反応するコロニーは１００〜１５０
個存在した。これらのうち、特に非常に強く反応した２
個のコロニーに注目し、それに含まれるｃＤＮＡを解析
した。即ち、抗血清と反応した形質転換体コロニーより
プラスミドを抽出、精製し、抗原性ポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列を決定した。その結果、１個
の形質転換体コロニーより得られたｃＤＮＡは新規の塩
基配列を有するものであり、該ＤＮＡはタンパク質にお
けるＮ末端をコードする領域を欠いていると考えられ
た。このｃＤＮＡを含むプラスミドをｐＭＩＳ１２と名
づけた。このＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号：２
に示す。また、配列番号：２に示される塩基配列にコー
ドされるアミノ酸配列を配列表の配列番号：１に示す。

【００４６】本実施例においては、大腸菌を宿主とした
発現ライブラリーを用いたため、得られたポリペプチド
は単純タンパク質として発現されている。従って、抗マ
ラセチア血清中に多く含まれる糖鎖に対する抗体の影響
を除き、ポリペプチド部分に対する抗体により抗原性ポ
リペプチドをスクリーニングしたことになる。

【００４７】実施例３ 組換え抗原性ポリペプチドの発
現及び精製 実施例２の（ｂ）において得られたＤＮＡを含むプラス
ミドｐＭＩＳ１２により形質転換されたＥ．コリ形質転
換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃
で１時間培養した。ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう
に添加し、さらに３時間培養を続けた。培養液を遠心し
菌体を回収、洗浄後、菌体を０．８ｍＭΡ−ＡＰＭＳＦ
〔（ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリ
ド塩酸塩〕と２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁し、
超音波破砕機により菌破砕を行った。破砕液へ終濃度１
重量％となるようにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え、１
８０００rpm 、３０分間の遠心を行った。上清及び沈殿
画分をそれぞれＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、ポリペプチドの発現を抗マラセチア抗体を用
いたイムノブロットアッセイにより調べた。その結果、
２９ｋＤａのＧＳＴ（グルタチオン Ｓ トランスフェ
ラーゼ）タグ領域を含む７７ｋＤａの融合タンパク質と
して両画分に存在することが明かとなった。

【００４８】次に上清画分から、glutathione sepharos
e 4B（ファルマシア社製）へのＧＳＴタグ領域の特異的
結合を利用したアフィニティ精製により、融合タンパク
質の精製を行った。さらに精製融合タンパク質よりＧＳ
Ｔタグ領域を除くため、抗原性ポリペプチド部分とタグ
領域との間に存在するスロンビン切断部位をスロンビン
処理（１０ユニット／ｍＬ、２５℃、２２時間）により
切断した。この反応液を透析後、再度、glutathione se
pharose 4Bにかけ、素通り画分（グルタチオン非結合画
分）に抗原性ポリペプチドを回収精製した。１２０ｍＬ
の組換え体培養液より、約１ｍｇの本発明の抗原性ポリ
ペプチドを精製できた。

【００４９】実施例４ 精製組換え抗原性ポリペプチド
の診断への応用 マラセチア粗抗原を用いたRAST陽性（スコア１以上）の
アトピー性皮膚炎患者２５例を対象にして、本発明の精
製組換え抗原性ポリペプチドに対するＩｇＥ抗体価をDi
rect RAST RIA 法（ＥＩＡ法）で測定した。すなわち、
ポリスチレンチューブに本発明の抗原性ポリペプチドを
カップリングさせたペーパーディスク１枚と患者血清５
０μＬを加えて、室温で２時間インキュベートした。ペ
ーパーディスクの臭化シアンによる活性化、及び精製組
換え抗原性ポリペプチドのペーパーディスクへのカップ
リングは宮本らの方法（アレルギー、２２、５８４−５
９４、１９７３）に準じて行った。０．２重量％のＴｗ
ｅｅｎ２０を含む生理食塩水でペーパーディスクを３回
洗浄後、β−ガラクトシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体５
０μＬを加えて室温で１晩インキュベートした。再度３
回洗浄後、基質溶液（ＯＮＰＧ）１００μＬを加え、４
１５ｎｍの吸光度を測定した。同時に測定したキットの
リファレンス試薬で作成した標準曲線からＩｇＥ抗体価
を算出した。

【００５０】その結果、８例の患者血清中に、本発明の
マラセチア由来の抗原性ポリペプチドに対するＩｇＥ抗
体が存在することが明確になった。このことから、本発
明のポリペプチドはアトピー性皮膚炎の診断薬として使
用できることが分かった。

【００５１】実施例５ マラセチアアレルギー皮内反応
診断試薬および診断用滴定試薬の調製 精製されたポリペプチドを乾燥して粉末状で採取して、
マラセチアアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及
びマラセチアアレルギー診断用滴定試薬として用いる。
皮内反応診断試薬には０．５％フェノールを添加した
０．９％生理食塩水を溶媒とし、ポリペプチドの２０万
倍希釈液を調製して用いる。また、マラセチアアレルギ
ー診断用滴定試薬には、ポリペプチドを１ｍｇ／ｍＬの
濃度でハンクス緩衝液に溶解し、これをヒスタミン遊離
滴定用試薬の原液としてその希釈液を用いる。

【００５２】実施例６ 減感作治療用抗原製剤の調製 精製されたポリペプチドを乾燥して粉末状で採取して、
マラセチアアレルギー疾患に対する減感作治療剤として
用いる。ポリペプチドを１ｍｇ／ｍＬの濃度で０．５％
フェノールを添加した０．９％生理食塩水に溶解し、減
感作治療用抗原の原液とする。

【００５３】

【発明の効果】本発明のマラセチア由来抗原性ポリペプ
チドは、マラセチア属真菌によるアレルギー疾患や感染
症の治療、診断に有用な医薬組成物、診断用組成物とし
て用いることができる。また、本発明のＤＮＡはかかる
有用なポリペプチドをコードするものであり、該ＤＮＡ
を含有するベクターによって形質転換された形質転換体
を培養することにより、本発明のポリペプチドを生産す
ることができる。

【００５４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４４２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ser Asn Ile Gln Lys Val Gln Gly Arg Ile Ile Ile Asp Ser Arg 1 5 10 15 Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Ile Val Thr Asp Lys Gly Leu 20 25 30 Phe Arg Ala Gly Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile His Glu 35 40 45 Ala Val Glu Leu Arg Asp Asn Asp Ser Ser Arg Trp Val Gly Lys 50 55 60 Gly Val Asp Lys Ala Val Ala Asn Val Asn Asp Val Ile Gly Pro 65 70 75 Ala Leu Ile Lys Ser Gly Ile Pro Ile Thr Ser Gln Lys Glu Ile 80 85 90 Asp Asp Phe Leu Ile Lys Leu Asp Gly Thr Pro Asn Lys Gly Lys 95 100 105 Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu Gly Val Ser Ile Ala Ala Ala Lys 110 115 120 Ala Gly Ala Gly Glu Lys Gly Val Pro Leu Tyr Gln Tyr Leu Ser 125 130 135 Glu Ile Ala Asn Thr Lys Ala Pro Tyr Ile Leu Pro Ala Pro Ala 140 145 150 Met Asn Val Ile Asn Gly Gly Ser His Ala Gly Asn Ser Leu Ala 155 160 165 Phe Gln Glu Phe Met Ile Val Pro Thr Gly Ala Glu Thr Phe Thr 170 175 180 Glu Ala Met Arg Met Gly Thr Glu Thr Tyr His Thr Leu Lys Lys 185 190 195 Val Ile Lys Ala Lys Tyr Gly Ile Asp Ala Thr Asn Val Gly Asp 200 205 210 Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Val Lys Ser Ala Asp Glu Ala Leu 215 220 225 Asp Leu Leu Val Glu Ala Ile Thr Lys Ala Gly Tyr Lys Gly Lys 230 235 240 Val Asn Ile Ser Leu Asp Val Ala Ser Ser Glu Phe Tyr Lys Asp 245 250 255 Gly Lys Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Asn Pro Asn Ser Asp Pro Ser 260 265 270 Lys Trp Ile Ser Gly Lys Asp Leu Ala Gln Ile Tyr Leu Gly Tyr 275 280 285 Ile Lys Lys Tyr Pro Ile Ile Ser Ile Glu Asp Pro Phe Asp Gln 290 295 300 Asp Asp Trp Glu Ala Trp Ser Val Leu Arg Ala Glu Ala Gly Ile 305 310 315 Thr Ile Ile Gly Asp Asp Leu Thr Val Thr Asn Pro Leu Arg Ile 320 325 330 Lys Thr Ala Ile Glu Lys Lys Val Cys Asn Gly Leu Leu Leu Lys 335 340 345 Ile Asn Gln Ile Gly Thr Ile Ser Glu Ser Ile Gln Ala Ala Gln 350 355 360 Leu Ala Gln Ser Asp Asn Trp Ala Val Met Val Ser His Arg Ser 365 370 375 Gly Glu Thr Glu Asp Thr Thr Ile Ala Asp Val Ala Val Ala Leu 380 385 390 Asn Ala Gly Ile Ile Lys Thr Gly Ala Pro Ala Arg Ser Glu Arg 395 400 405 Val Ala Lys Tyr Asn Ala Leu Leu Arg Ile Glu Ser Thr Glu Lys 410 415 420 Asp Ala Val Tyr Ala Gly Ile Asp Gly Phe Thr Gln Gly Asp Ala 425 430 435 Ala Pro Lys Val Ile Arg Lys 440

【００５５】配列番号：２ 配列の長さ：１４２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GAGCAACATT CAGAAGGTGC AAGGTCGTAT TATTATCGAC TCGCGTGGTA ACCCCACGGT 60 CGAGGTCGAC ATCGTGACCG ACAAGGGTCT GTTCCGCGCC GGCGTGCCCT CGGGTGCCTC 120 GACGGGTATC CACGAGGCCG TGGAGCTGCG CGACAACGAC TCTTCGCGCT GGGTCGGCAA 180 GGGTGTCGAC AAGGCCGTTG CCAACGTCAA CGACGTGATC GGCCCTGCGC TGATCAAGTC 240 GGGCATCCCG ATCACCTCGC AGAAGGAGAT TGACGACTTC CTGATCAAGC TCGACGGCAC 300 GCCGAACAAG GGCAAGCTGG GTGCGAACGC GATCCTCGGT GTGTCGATTG CCGCGGCCAA 360 GGCCGGCGCG GGTGAGAAGG GTGTGCCGCT GTACCAGTAC CTCTCGGAGA TCGCGAACAC 420 CAAGGCGCCC TACATTCTGC CTGCGCCTGC GATGAACGTC ATCAACGGTG GCTCGCACGC 480 CGGCAACTCG CTGGCCTTCC AGGAGTTCAT GATTGTGCCC ACCGGCGCCG AGACGTTCAC 540 CGAGGCGATG CGCATGGGTA CCGAGACATA CCACACGCTC AAGAAGGTCA TCAAGGCCAA 600 GTACGGCATT GACGCGACCA ACGTCGGTGA CGAGGGTGGC TTTGCGCCCA ACGTCAAGTC 660 GGCGGACGAG GCGCTCGACC TGCTTGTCGA GGCGATCACC AAGGCCGGCT ACAAGGGCAA 720 GGTGAACATC TCGCTCGATG TGGCCAGCTC CGAGTTCTAC AAGGACGGCA AGTACGACCT 780 TGACTTCAAG AACCCCAACT CGGACCCGAG CAAGTGGATC TCGGGCAAGG ACCTTGCGCA 840 GATCTACCTG GGCTACATCA AGAAGTACCC GATCATCTCG ATCGAGGACC CCTTCGACCA 900 GGACGACTGG GAGGCGTGGA GCGTGCTGCG CGCCGAGGCG GGCATCACCA TCATTGGTGA 960 CGACCTGACT GTCACCAACC CGCTGCGCAT CAAGACGGCC ATCGAGAAGA AGGTGTGCAA 1020 CGGTCTGCTG CTCAAGATCA ACCAGATTGG CACCATCTCG GAGTCGATCC AGGCCGCGCA 1080 GCTCGCGCAG TCGGACAACT GGGCCGTGAT GGTCTCGCAC CGCTCGGGTG AGACGGAGGA 1140 CACGACGATC GCCGACGTCG CCGTCGCGCT CAACGCGGGA ATCATCAAGA CGGGTGCGCC 1200 CGCCCGCTCG GAGCGTGTCG CCAAGTACAA CGCGCTGCTC CGCATCGAGT CCACCGAGAA 1260 GGACGCCGTG TACGCGGGCA TTGACGGCTT CACCCAGGGC GACGCGGCGC CCAAGGTGAT 1320 CCGCAAGTAG GCTGACGGCG CATCGCGTCG TGGCCTGCGC TGTAGACATT ATCTTTTGTA 1380 GCAAGTACGA TATATGCTAC TACAGAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1428

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 大門 尚志 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸
   配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、（Ｂ）
   配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、１個以
   上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ
   酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
   （Ｃ）配列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮ
   Ａ、（Ｄ）配列番号：２に示される塩基配列において、
   １個以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基
   配列からなるＤＮＡ、及び（Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）のいず
   れかのＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダ
   イズするＤＮＡ、からなる群より選ばれるＤＮＡであっ
   て、マラセチア由来の抗原性を有するポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡを含有するベクタ
   ー。
3. 【請求項３】 請求項２記載のベクターによって形質転
   換された形質転換体。
4. 【請求項４】 請求項３記載の形質転換体を、請求項１
   記載のＤＮＡにコードされるポリペプチドの発現可能な
   条件下で培養するポリペプチドの生産方法。
5. 【請求項５】 請求項１記載のＤＮＡにコードされる、
   マラセチア由来の抗原性を有するポリペプチド。
6. 【請求項６】 請求項５記載のポリペプチドと免疫学的
   に同等なポリペプチドであって、マラセチア由来の抗原
   性を有するポリペプチド。
7. 【請求項７】 請求項５及び／又は６記載のポリペプチ
   ドを有効成分とする医薬組成物。
8. 【請求項８】 請求項５及び／又は６記載のポリペプチ
   ドを有効成分とする診断用組成物。
9. 【請求項９】 請求項１記載のＤＮＡを有効成分とする
   医薬組成物。
10. 【請求項１０】 請求項１記載のＤＮＡを有効成分とす
    る診断用組成物。
11. 【請求項１１】 請求項５記載のポリペプチドに特異的
    に結合する抗体又は抗体断片。
12. 【請求項１２】 請求項１記載のＤＮＡの全部又は一部
    とハイブリダイズするプローブ又はプライマー。