JPH11209404A - 新規バクテリアセルロース - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 濃縮操作等の処理を迅速に行うことができ、
又、シート状に成形した際にその透明度が低くなり、画
像の裏写りのないシート等が得られるようなバクテリア
セルロースを提供すること。 【解決手段】 比粘度が1未満であり、分散性が30%
未満であり、且つ吸光度が0.4以上であるようなバク
テリアセルロース。
又、シート状に成形した際にその透明度が低くなり、画
像の裏写りのないシート等が得られるようなバクテリア
セルロースを提供すること。 【解決手段】 比粘度が1未満であり、分散性が30%
未満であり、且つ吸光度が0.4以上であるようなバク
テリアセルロース。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な諸特性を有
するバクテリアセルロース、該バクテリアセルロースを
生産する菌及び該バクテリアセルロースの製造方法に関
する。
するバクテリアセルロース、該バクテリアセルロースを
生産する菌及び該バクテリアセルロースの製造方法に関
する。
【0002】
【従来の技術】セルロース生産菌を培養することによっ
て製造されるバクテリアセルロース(BC)は、木材パ
ルプ等から製造されるセルロースに較べてフィブリル
(又は微細繊維)の断面幅が2ケタ程度小さいことを特
徴とする。従って、この構造的特徴に基づいて、高分
子、特に、水系高分子用補強剤としての各種産業用途が
ある。例えば、かかるBCの離解物を紙状シート又は固
型形状に固化した物質は高い引っ張り弾性率を示すの
で、フィブリルの構造的特徴に基づく優れた機械特性が
期待され、各種産業用素材として利用されている。或い
は、製紙工程における填料歩留まり剤としても使用され
ている。また、BCは可食性であり、無味無臭であるた
めに、食品分野で多く利用される他、水系分散性に優れ
ているので、食品、化粧品、又は塗料等の粘度の保持、
食品原料生地の強化、水分の保持、食品安定性の向上、
低カロリー添加物又は乳化安定化補助剤としての産業上
の利用価値がある。
て製造されるバクテリアセルロース(BC)は、木材パ
ルプ等から製造されるセルロースに較べてフィブリル
(又は微細繊維)の断面幅が2ケタ程度小さいことを特
徴とする。従って、この構造的特徴に基づいて、高分
子、特に、水系高分子用補強剤としての各種産業用途が
ある。例えば、かかるBCの離解物を紙状シート又は固
型形状に固化した物質は高い引っ張り弾性率を示すの
で、フィブリルの構造的特徴に基づく優れた機械特性が
期待され、各種産業用素材として利用されている。或い
は、製紙工程における填料歩留まり剤としても使用され
ている。また、BCは可食性であり、無味無臭であるた
めに、食品分野で多く利用される他、水系分散性に優れ
ているので、食品、化粧品、又は塗料等の粘度の保持、
食品原料生地の強化、水分の保持、食品安定性の向上、
低カロリー添加物又は乳化安定化補助剤としての産業上
の利用価値がある。
【0003】
【本発明が解決しようとする課題】しかしながら、上で
述べたように粘度及び分散性が高いという特性を有する
が故に、逆に、濃縮操作等では、コスト及び処理時間が
多くかかる、という問題点を有していた。又、従来のB
Cは他のセルロースに較べ吸光度が低い為、シート状に
成形した際にその透明度が高くなり、画像の裏写りが生
じるなど紙としての特性に劣る面もあった。
述べたように粘度及び分散性が高いという特性を有する
が故に、逆に、濃縮操作等では、コスト及び処理時間が
多くかかる、という問題点を有していた。又、従来のB
Cは他のセルロースに較べ吸光度が低い為、シート状に
成形した際にその透明度が高くなり、画像の裏写りが生
じるなど紙としての特性に劣る面もあった。
【0004】
【課題を解決する為の手段】本発明者は、かかる課題を
解決するために研究した結果、従来のBCに較べて、比
粘度及び分散性が低く、且つ、吸光度が大きいことによ
って特徴づけられる新規なBCを見出し、本発明を完成
させたのである。即ち、本発明は、比粘度が1未満、好
ましくは0.5未満であり、分散性が30%未満、好ま
しくは25%未満であり、吸光度が0.4以上、好まし
くは0.5以下であるようなBCに係わる。
解決するために研究した結果、従来のBCに較べて、比
粘度及び分散性が低く、且つ、吸光度が大きいことによ
って特徴づけられる新規なBCを見出し、本発明を完成
させたのである。即ち、本発明は、比粘度が1未満、好
ましくは0.5未満であり、分散性が30%未満、好ま
しくは25%未満であり、吸光度が0.4以上、好まし
くは0.5以下であるようなBCに係わる。
【0005】ここで、比粘度、分散性及び吸光度は、以
下に示す方法によって測定される。比粘度 BC1.25g(乾燥物換算)に蒸留水を加えて全量を
250gとし、ミキサー(オスターブレンダー、OSTERI
ZER 製)で1分間、最高回転(LIQUEFY)で攪拌して、濃
度0.5%の離解BC懸濁液を調製する。この離解BC
懸濁液2mlに蒸留水3mlと0.5%コンゴーレッド5ml
を加えて、BC−コンゴーレッド混合懸濁液10mlを調
製する。このBC−コンゴーレッド混合懸濁液の30℃
での粘度をオストワルド粘度計を用いて測定する。BC
懸濁液の代わりに蒸留水を使用した、0.25%コンゴ
ーレッド水溶液についても同様に粘度を測定し、以下の
式から比粘度を求める。
下に示す方法によって測定される。比粘度 BC1.25g(乾燥物換算)に蒸留水を加えて全量を
250gとし、ミキサー(オスターブレンダー、OSTERI
ZER 製)で1分間、最高回転(LIQUEFY)で攪拌して、濃
度0.5%の離解BC懸濁液を調製する。この離解BC
懸濁液2mlに蒸留水3mlと0.5%コンゴーレッド5ml
を加えて、BC−コンゴーレッド混合懸濁液10mlを調
製する。このBC−コンゴーレッド混合懸濁液の30℃
での粘度をオストワルド粘度計を用いて測定する。BC
懸濁液の代わりに蒸留水を使用した、0.25%コンゴ
ーレッド水溶液についても同様に粘度を測定し、以下の
式から比粘度を求める。
【0006】
【数1】比粘度の計算 η=(B/b)−1 η:比粘度 B:BC−コンゴーレッド混合懸濁液でのオストワルド
粘度(秒) b:0.25%コンゴーレッド水溶液でのオストワルド
粘度(秒)
粘度(秒) b:0.25%コンゴーレッド水溶液でのオストワルド
粘度(秒)
【0007】分散性 上記のBC−コンゴーレッド混合懸濁液10mlを遠心機
(日立多本架冷却遠心機CR5DL、(株)日立製作所
製)を用いて、3000rpm で15分間遠心沈降処理
し、繊維分の体積を目視により測定して全体量との比
(%)をとり、分散性を求める。
(日立多本架冷却遠心機CR5DL、(株)日立製作所
製)を用いて、3000rpm で15分間遠心沈降処理
し、繊維分の体積を目視により測定して全体量との比
(%)をとり、分散性を求める。
【0008】吸光度 前記0.5%離解BC懸濁液2mlに、蒸留水3mlと2%
低粘度カルボキシメチルセルロース(SIGMA low viscos
ity)5mlを加えて、BC−CMC混合懸濁液を調製す
る。このBC−CMC混合懸濁液について、分光光度計
(U2000形ダブルビーム分光光度計、(株)日立製
作所製)を用いて660nmでの吸光度を測定する。
低粘度カルボキシメチルセルロース(SIGMA low viscos
ity)5mlを加えて、BC−CMC混合懸濁液を調製す
る。このBC−CMC混合懸濁液について、分光光度計
(U2000形ダブルビーム分光光度計、(株)日立製
作所製)を用いて660nmでの吸光度を測定する。
【0009】更に、本発明は、かかる新規なBCを生産
することの出来る、新規な菌体に係わる。このような菌
体は、以下に述べるような従来公知のセルロース生産菌
に、NTG等の従来公知の変異剤を使用して突然変異を
誘発させ、こうして得られた突然変異株が生産するBC
の性質を調べることによって、当業者であれば容易に得
ることが出来る。また、当業者には周知の方法によっ
て、土壌等の自然界から探索することによっても、容易
に取得することができる。
することの出来る、新規な菌体に係わる。このような菌
体は、以下に述べるような従来公知のセルロース生産菌
に、NTG等の従来公知の変異剤を使用して突然変異を
誘発させ、こうして得られた突然変異株が生産するBC
の性質を調べることによって、当業者であれば容易に得
ることが出来る。また、当業者には周知の方法によっ
て、土壌等の自然界から探索することによっても、容易
に取得することができる。
【0010】本発明の菌体の好適例として、以下の実施
例に詳しく記載したように、アセトバクター・キシリナ
ム・サブスピーシーズ・ノンアセトオキシダンス(A.xy
linum subsp. nonacetoxidans)に属する757−3−5
−11株を突然変異処理して得られた67−2株を挙げ
ることが出来る。尚、757−3−5−11株の取得方
法及び菌学的性質は、PCT/JP97/00514に
詳しく記載されており、該株は1996年4月12日付
で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物
寄託センターに寄託され(受託番号FERM P−15
564)、その後、1997年2月10日付で特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
に基づく寄託(受託番号FERM BP−5815)に
移管されている。一方、67−2株は、平成9年5月2
9日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所特
許微生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM
P−16249を付されている。
例に詳しく記載したように、アセトバクター・キシリナ
ム・サブスピーシーズ・ノンアセトオキシダンス(A.xy
linum subsp. nonacetoxidans)に属する757−3−5
−11株を突然変異処理して得られた67−2株を挙げ
ることが出来る。尚、757−3−5−11株の取得方
法及び菌学的性質は、PCT/JP97/00514に
詳しく記載されており、該株は1996年4月12日付
で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物
寄託センターに寄託され(受託番号FERM P−15
564)、その後、1997年2月10日付で特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
に基づく寄託(受託番号FERM BP−5815)に
移管されている。一方、67−2株は、平成9年5月2
9日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所特
許微生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM
P−16249を付されている。
【0011】更に、本発明は、本発明のBC生産菌を培
養し、培地中に蓄積したBCを回収することから成る本
発明に係わる新規なBCの製造方法に係わる。BC生産
菌の培養自体は、以下に述べるように、当業者には公知
の方法で行うことが出来る。
養し、培地中に蓄積したBCを回収することから成る本
発明に係わる新規なBCの製造方法に係わる。BC生産
菌の培養自体は、以下に述べるように、当業者には公知
の方法で行うことが出来る。
【0012】本発明における新規なセルロース生産菌の
創製の為に使用される公知のセルロース生産菌は、例え
ば、BPR2001株に代表されるアセトバクター・キ
シリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタン
ス(Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans)、
アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinum)
ATCC23768、アセトバクター・キシリナムAT
CC23769、アセトバクター・パスツリアヌス(A.
pasteurianus )ATCC10245、アセトバクター
・キシリナムATCC14851、アセトバクター・キ
シリナムATCC11142及びアセトバクター・キシ
リナムATCC10821等の酢酸菌(アセトバクター
属)、その他に、アグロバクテリウム属、リゾビウム
属、サルシナ属、シュードモナス属、アクロモバクター
属、アルカリゲネス属、アエロバクター属、アゾトバク
ター属及びズーグレア属並びにそれらをNTG(ニトロ
ソグアニジン)等を用いる公知の方法によって変異処理
することにより創製される各種変異株である。
創製の為に使用される公知のセルロース生産菌は、例え
ば、BPR2001株に代表されるアセトバクター・キ
シリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタン
ス(Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans)、
アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinum)
ATCC23768、アセトバクター・キシリナムAT
CC23769、アセトバクター・パスツリアヌス(A.
pasteurianus )ATCC10245、アセトバクター
・キシリナムATCC14851、アセトバクター・キ
シリナムATCC11142及びアセトバクター・キシ
リナムATCC10821等の酢酸菌(アセトバクター
属)、その他に、アグロバクテリウム属、リゾビウム
属、サルシナ属、シュードモナス属、アクロモバクター
属、アルカリゲネス属、アエロバクター属、アゾトバク
ター属及びズーグレア属並びにそれらをNTG(ニトロ
ソグアニジン)等を用いる公知の方法によって変異処理
することにより創製される各種変異株である。
【0013】尚、BPR2001株は、平成5年2月2
4日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特
許微生物寄託センターに寄託され(受託番号FERM
P−13466)、その後1994年2月7日付で特許
手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約に基づく寄託(受託番号FERM BP−454
5)に移管されている。
4日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特
許微生物寄託センターに寄託され(受託番号FERM
P−13466)、その後1994年2月7日付で特許
手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約に基づく寄託(受託番号FERM BP−454
5)に移管されている。
【0014】NTG等の変異剤を用いての化学的変異処
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. l, p.297−302
(1988)及び J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−2
929(1989) 等に記載されているものがある。従って、当
業者であればこれら公知の方法に基づき本発明で用いる
変異株を得ることができる。また、本発明で用いる変異
株は他の変異方法、例えば放射線照射等によっても得る
ことができる。
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. l, p.297−302
(1988)及び J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−2
929(1989) 等に記載されているものがある。従って、当
業者であればこれら公知の方法に基づき本発明で用いる
変異株を得ることができる。また、本発明で用いる変異
株は他の変異方法、例えば放射線照射等によっても得る
ことができる。
【0015】培養に用いる培地の組成物中、炭素源とし
てはシュクロース、グルコース、フラクトース、マンニ
トール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース、エ
リスリット、グリセリン、エチレングリコール、エタノ
ール等を単独或いは併用して使用することができる。更
にはこれらのものを含有する澱粉水解物、シトラスモラ
セス、ビートモラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、
柑橘類を始めとする果汁等をシュクロースに加えて使用
することもできる。 また、窒素源としては硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のア
ンモニウム塩、硝酸塩、尿素等有機或いは無機の窒素源
を使用することができ、或いはBacto−Pepto
ne、Bacto−Soytone、Yeast−Ex
tract、豆濃などの含窒素天然栄養源を使用しても
よい。有機微量栄養素としてアミノ酸、ビタミン、脂肪
酸、核酸、2,7,9−トリカルボキシ−1Hピロロ
〔2,3,5〕−キノリン−4,5−ジオン、亜硫酸パ
ルプ廃液、リグニンスルホン酸等を添加してもよい。
てはシュクロース、グルコース、フラクトース、マンニ
トール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース、エ
リスリット、グリセリン、エチレングリコール、エタノ
ール等を単独或いは併用して使用することができる。更
にはこれらのものを含有する澱粉水解物、シトラスモラ
セス、ビートモラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、
柑橘類を始めとする果汁等をシュクロースに加えて使用
することもできる。 また、窒素源としては硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のア
ンモニウム塩、硝酸塩、尿素等有機或いは無機の窒素源
を使用することができ、或いはBacto−Pepto
ne、Bacto−Soytone、Yeast−Ex
tract、豆濃などの含窒素天然栄養源を使用しても
よい。有機微量栄養素としてアミノ酸、ビタミン、脂肪
酸、核酸、2,7,9−トリカルボキシ−1Hピロロ
〔2,3,5〕−キノリン−4,5−ジオン、亜硫酸パ
ルプ廃液、リグニンスルホン酸等を添加してもよい。
【0016】生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添する
ことが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト
塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用
される。更に、イノシトール、フィチン酸、ピロロキノ
リンキノン(PQQ)(特公平5−1718号公報;高
井光男,紙パ技協誌,第42巻,第3号,第237〜2
44頁)、カルボン酸又はその塩(特開平7−3938
6号公報)、インベルターゼ(特開平7−184677
号公報)及びメチオニン(特開平7−184675号公
報)等のセルロース生成促進因子を適宜培地中に添加す
ることもできる。例えば、本発明の培養に際しては、例
えば、培養のpHは3ないし7に、好ましくは5付近に
制御する。培養温度は10〜40℃、好ましくは25〜
35℃の範囲で行う。培養装置に供給する酸素濃度は1
〜100%、望ましくは21〜80%であれば良い。こ
れら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する菌体の
接種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得るもの
である。本発明方法では、従来より、微生物を培養する
培養形式として公知の形式、即ち、静置、振盪もしくは
通気攪拌培養等、また、培養操作法として公知の、いわ
ゆる回分発酵法、流加回分発酵法、反復回分発酵法及び
連続発酵法等を用いることができる。尚、攪拌手段とし
ては、例えばインペラー(攪拌羽根)、エアーリフト発
酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、及びこれら手段の
組合せ等が使用されている。
異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添する
ことが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト
塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用
される。更に、イノシトール、フィチン酸、ピロロキノ
リンキノン(PQQ)(特公平5−1718号公報;高
井光男,紙パ技協誌,第42巻,第3号,第237〜2
44頁)、カルボン酸又はその塩(特開平7−3938
6号公報)、インベルターゼ(特開平7−184677
号公報)及びメチオニン(特開平7−184675号公
報)等のセルロース生成促進因子を適宜培地中に添加す
ることもできる。例えば、本発明の培養に際しては、例
えば、培養のpHは3ないし7に、好ましくは5付近に
制御する。培養温度は10〜40℃、好ましくは25〜
35℃の範囲で行う。培養装置に供給する酸素濃度は1
〜100%、望ましくは21〜80%であれば良い。こ
れら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する菌体の
接種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得るもの
である。本発明方法では、従来より、微生物を培養する
培養形式として公知の形式、即ち、静置、振盪もしくは
通気攪拌培養等、また、培養操作法として公知の、いわ
ゆる回分発酵法、流加回分発酵法、反復回分発酵法及び
連続発酵法等を用いることができる。尚、攪拌手段とし
ては、例えばインペラー(攪拌羽根)、エアーリフト発
酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、及びこれら手段の
組合せ等が使用されている。
【0017】尚、攪拌培養とは、培養液を攪拌しながら
行なう培養法であり、当該攪拌培養中に受ける攪拌作用
によって、BCの構造が、例えば、結晶化指数が低下し
て非晶部が増すように変化する。攪拌手段としては、例
えばインペラー、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポ
ンプ駆動循環、及びこれら手段の組合せ等を使用するこ
とができる。培養操作法としては、いわゆる回分発酵
法、流加回分発酵法、反復回分発酵法及び連続発酵法等
がある。更に、本出願人名義の特開平8−33494号
公報に記載された培養装置と分離装置の間で菌体を含む
培養液を循環させるセルロース性物質の製造方法であっ
て、該分離装置に於いて、生産物であるセルロース性物
質を菌体及び培養液から分離することを特徴とする前記
方法や、同じく、本出願人名義の特開平8−33495
号公報に記載されたセルロース生産菌を培養してセルロ
ース性物質を製造する方法であって、培養期間中、培養
系からの培養液の引き抜き及び該引き抜き量とほぼ等容
量の新たな培養液の供給を連続的に行なうことによっ
て、培養中の培養液に於けるセルロース性物質の濃度を
低く維持することを特徴とする前記製造方法がある。
行なう培養法であり、当該攪拌培養中に受ける攪拌作用
によって、BCの構造が、例えば、結晶化指数が低下し
て非晶部が増すように変化する。攪拌手段としては、例
えばインペラー、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポ
ンプ駆動循環、及びこれら手段の組合せ等を使用するこ
とができる。培養操作法としては、いわゆる回分発酵
法、流加回分発酵法、反復回分発酵法及び連続発酵法等
がある。更に、本出願人名義の特開平8−33494号
公報に記載された培養装置と分離装置の間で菌体を含む
培養液を循環させるセルロース性物質の製造方法であっ
て、該分離装置に於いて、生産物であるセルロース性物
質を菌体及び培養液から分離することを特徴とする前記
方法や、同じく、本出願人名義の特開平8−33495
号公報に記載されたセルロース生産菌を培養してセルロ
ース性物質を製造する方法であって、培養期間中、培養
系からの培養液の引き抜き及び該引き抜き量とほぼ等容
量の新たな培養液の供給を連続的に行なうことによっ
て、培養中の培養液に於けるセルロース性物質の濃度を
低く維持することを特徴とする前記製造方法がある。
【0018】前記攪拌培養を行なうための槽としては、
例えば、ジャーファーメンター及びタンク等の攪拌槽、
並びにバッフル付きフラスコ、坂口フラスコ及びエアー
リフト型の攪拌槽が使用可能であるがこの限りではな
い。本発明でいう攪拌培養においては、攪拌と同時に、
必要に応じて、通気を行なっても良い。ここでいう通気
とは、例えば空気等の酸素を含有するガス、並びに例え
ばアルゴン及び窒素等の酸素を含有しないガスのいずれ
を通気しても良く、これらガスは培養系の条件に合わせ
て当業者により適宜、選択されよう。例えば、嫌気性の
微生物の場合は、不活性ガスを通気をすれば、その気泡
によって培養液を攪拌することができる。好気性の微生
物の場合には、酸素を含有するガスを通気することで微
生物の成育に必要な酸素を供給すると同時に、培養液を
攪拌することができる。
例えば、ジャーファーメンター及びタンク等の攪拌槽、
並びにバッフル付きフラスコ、坂口フラスコ及びエアー
リフト型の攪拌槽が使用可能であるがこの限りではな
い。本発明でいう攪拌培養においては、攪拌と同時に、
必要に応じて、通気を行なっても良い。ここでいう通気
とは、例えば空気等の酸素を含有するガス、並びに例え
ばアルゴン及び窒素等の酸素を含有しないガスのいずれ
を通気しても良く、これらガスは培養系の条件に合わせ
て当業者により適宜、選択されよう。例えば、嫌気性の
微生物の場合は、不活性ガスを通気をすれば、その気泡
によって培養液を攪拌することができる。好気性の微生
物の場合には、酸素を含有するガスを通気することで微
生物の成育に必要な酸素を供給すると同時に、培養液を
攪拌することができる。
【0019】攪拌培養により得た本発明BCは遠心分離
法又は濾過法等により培養液から分離した後に、菌体と
一緒に回収してもよく、さらに本物質中に含まれる菌体
を含むセルロース性物質以外の不純物を取り除く処理を
施すことが出来る。不純物を取り除くためには、水洗、
加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ
及び過酸化水素などの漂白剤による処理、リゾチームな
どの菌体溶解酵素による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デ
オキシコール酸などの界面活性剤による処理、常温から
200℃の範囲の加熱洗浄などを単独及び併用して行
い、セルロース性物質から不純物をほぼ完全に除去する
ことができる。
法又は濾過法等により培養液から分離した後に、菌体と
一緒に回収してもよく、さらに本物質中に含まれる菌体
を含むセルロース性物質以外の不純物を取り除く処理を
施すことが出来る。不純物を取り除くためには、水洗、
加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ
及び過酸化水素などの漂白剤による処理、リゾチームな
どの菌体溶解酵素による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デ
オキシコール酸などの界面活性剤による処理、常温から
200℃の範囲の加熱洗浄などを単独及び併用して行
い、セルロース性物質から不純物をほぼ完全に除去する
ことができる。
【0020】尚、BC蓄積量(g/l)は、培養終了
後、培養液中の固形物を集積し、水洗して培地成分を除
去した後、0.1N NaOH水溶液中で80℃、20
分間処理して菌体を除去した。さらに、洗浄液が中性付
近になるまで生成セルロースを水洗した後、80℃で1
2時間真空乾燥して乾燥重量を測定することで求めた。
また(消費糖)収率(%)は以下のようにして求めた。
後、培養液中の固形物を集積し、水洗して培地成分を除
去した後、0.1N NaOH水溶液中で80℃、20
分間処理して菌体を除去した。さらに、洗浄液が中性付
近になるまで生成セルロースを水洗した後、80℃で1
2時間真空乾燥して乾燥重量を測定することで求めた。
また(消費糖)収率(%)は以下のようにして求めた。
【0021】
【数2】消費糖収率(%)の計算 YBC=BC/(RCMF−RCBF)*100 YBC :対消費糖収率(%) BC :BC蓄積量(g/l) RCMF:培地の糖濃度(g/l) RCBF:培養後の培地の糖濃度(g/l)
【0022】
【発明の実施の形態】本発明を、以下の実施例を参照し
ながら詳しく説明する。かかる実施例が本発明の範囲を
何等制限するものでないことは、当業者には周知のこと
である。
ながら詳しく説明する。かかる実施例が本発明の範囲を
何等制限するものでないことは、当業者には周知のこと
である。
【0023】
【実施例】実施例1:67−2株の取得 使用菌株 757−3−5−11株67−2株の取得方法 (1)757−3−5−11株の変異処理 菌体をCSL−Suc培地で28℃、3時間培養し、こ
の培養液を集菌後10mM燐酸緩衝液(pH6.0)で
洗浄した。得られた菌体を40μg/mlNTG(10mM
燐酸緩衝液(pH6.0))中で30℃、30分間処理
した。変異処理した菌体を集菌し、前記のように洗浄し
CSL−Suc培地で28℃、一夜培養し変異を固定し
た。 (2)67−2株の取得 変異処理した757−3−5−11株を以下のAAS培
地プレートで塗抹培養(28℃、7日間)し、得られた
コロニーのうちコロニー形態が757−3−5−11株
と異なる60個のコロニーを選択した。選択した60株
をフラスコ培養しBC蓄積量の高かった44株を選択し
た。
の培養液を集菌後10mM燐酸緩衝液(pH6.0)で
洗浄した。得られた菌体を40μg/mlNTG(10mM
燐酸緩衝液(pH6.0))中で30℃、30分間処理
した。変異処理した菌体を集菌し、前記のように洗浄し
CSL−Suc培地で28℃、一夜培養し変異を固定し
た。 (2)67−2株の取得 変異処理した757−3−5−11株を以下のAAS培
地プレートで塗抹培養(28℃、7日間)し、得られた
コロニーのうちコロニー形態が757−3−5−11株
と異なる60個のコロニーを選択した。選択した60株
をフラスコ培養しBC蓄積量の高かった44株を選択し
た。
【0024】
【表1】AAS培地組成 シュクロース 5%、KH2 PO4 0.3%、MgS
O4 ・7H2 O 0.24%、硫安 0.1%、総合ア
ミノ酸 0.5%、50%フィチン酸 0.01%、p
H5.0、寒天2%
O4 ・7H2 O 0.24%、硫安 0.1%、総合ア
ミノ酸 0.5%、50%フィチン酸 0.01%、p
H5.0、寒天2%
【0025】フラスコ培養方法 前培養:50mlCSL−Suc培地(250ml容量ルー
フラスコ)で28℃、3日間静置培養した。 本培養:前培養の菌液7.5mlを68mlCSL−Suc
培地(300ml容量三角フラスコ)に植菌し、28℃、
4日間、150rpmで培養した。
フラスコ)で28℃、3日間静置培養した。 本培養:前培養の菌液7.5mlを68mlCSL−Suc
培地(300ml容量三角フラスコ)に植菌し、28℃、
4日間、150rpmで培養した。
【0026】
【表2】 ─────────────────────────────────── 菌株 BC(g/l) 平均値 収率(%) 平均値(%) (g/l) ─────────────────────────────────── 757-3-5-11株 3.7 3.7 19.4 18.1 2.7 19.5 4.8 15.4 ─────────────────────────────────── 67株 7.6 8.1 20.6 21.2 8.4 22.0 8.3 20.9 ───────────────────────────────────
【0027】67株を純化のためAASプレートに塗抹
培養(28℃、7日間)し、5個のコロニーを選択し
た。この5個のコロニーを上記のようにフラスコ培養
し、最もBC蓄積量の高かった67−2株を選択した。
培養(28℃、7日間)し、5個のコロニーを選択し
た。この5個のコロニーを上記のようにフラスコ培養
し、最もBC蓄積量の高かった67−2株を選択した。
【0028】
【表3】 ────────────────────── 菌株 BC(g/l) 収率(%) ────────────────────── 757-3-5-11株 3.7 18.1 ────────────────────── 67−1株 9.9 24.8 67−2株 10.7 26.8 67−3株 9.7 24.3 67−4株 9.9 24.8 67−5株 9.8 24.5 ──────────────────────
【0029】67−2株の1Lジャー培養 培養方法 前々培養:100mlCSL−Suc培地(750ml容量
ルーフラスコ)で28℃、3日間静置培養した。 前培養:前々培養の菌液12.5mlを112mlCSL−
Suc培地(500ml容量三角フラスコ)に植菌し、2
8℃、3日間、150rpmで培養した。 本培養:前培養液をブレンダーでよく離解した後、60
mlを植菌した。 培地:600mlCSL−Suc培地(但しCSL4%、
硫安0.1%)/1Ljar DO(溶存酸素):1〜3%(攪拌速度の調節によりD
O制御) 温度 :30℃ 通気 :1/3vvm 得られた結果を以下の表4に示す。
ルーフラスコ)で28℃、3日間静置培養した。 前培養:前々培養の菌液12.5mlを112mlCSL−
Suc培地(500ml容量三角フラスコ)に植菌し、2
8℃、3日間、150rpmで培養した。 本培養:前培養液をブレンダーでよく離解した後、60
mlを植菌した。 培地:600mlCSL−Suc培地(但しCSL4%、
硫安0.1%)/1Ljar DO(溶存酸素):1〜3%(攪拌速度の調節によりD
O制御) 温度 :30℃ 通気 :1/3vvm 得られた結果を以下の表4に示す。
【0030】
【表4】 ───────────────────── 菌株 BC(g/l) 収率(%) ───────────────────── 757-3-5-11株 9.0 22.5 67−2株 12.0 30.0 ─────────────────────
【0031】
【表5】 培地組成 CSL−Suc培地 シュクロース 4.0 (%) KH2 PO4 0.1 MgSO4 ・7H2 O 0.025 (NH4 )2 SO4 0.33 ビタミン混合液 1.0 塩類混合液 1.0 CSL(コーンステープリカー) 2.0 pH 5.0
【0032】
【表6】ビタミン混合液 化合物 mg/L イノシトール 200 ナイアシン 40 ピリドキシンHCl 40 チアミンHCl 40 パントテン酸カルシウム 20 リボフラビン 20 p−アミノ安息香酸 20 葉 酸 0.2 ビオチン 0.2
【0033】
【表7】塩類混合液 FeSO2 ・7H2 O 360mg/L CaCl2 ・2H2 O 1470mg/L Na2 MoO2 ・2H2 O 242mg/L ZnSO4 ・7H2 O 173mg/L MnSO4 ・5H2 O 139mg/L CuSO4 ・5H2 O 5mg/L
【0034】終了後、得られた培養液を酢酸緩衝液で約
5倍に希釈した後、遠心分離し沈殿物を回収した。沈殿
を蒸留水で最初の培養液量の約8倍に希釈後、80℃、
20分間加熱し、加熱後遠心分離により沈殿物を回収し
た。沈殿物を同じく8倍量の0.1N NaOHに懸濁
し80℃、20分間加熱することにより溶菌し、溶菌後
遠心分離により沈殿物を回収した。この後、さらに8倍
量の蒸留水に沈殿を懸濁し80℃、20分間加熱し、加
熱後遠心分離し沈殿物を回収することによりセルロース
の洗浄を行った。同様の洗浄を3回行うことにより精製
BCを得た。こうして得られた67−2株及び757-3-5-
11株由来のBCについて、それらの比粘度、分散性及び
吸光度等を前に記載した方法で測定した。得られた結果
を以下の表8に示す。
5倍に希釈した後、遠心分離し沈殿物を回収した。沈殿
を蒸留水で最初の培養液量の約8倍に希釈後、80℃、
20分間加熱し、加熱後遠心分離により沈殿物を回収し
た。沈殿物を同じく8倍量の0.1N NaOHに懸濁
し80℃、20分間加熱することにより溶菌し、溶菌後
遠心分離により沈殿物を回収した。この後、さらに8倍
量の蒸留水に沈殿を懸濁し80℃、20分間加熱し、加
熱後遠心分離し沈殿物を回収することによりセルロース
の洗浄を行った。同様の洗浄を3回行うことにより精製
BCを得た。こうして得られた67−2株及び757-3-5-
11株由来のBCについて、それらの比粘度、分散性及び
吸光度等を前に記載した方法で測定した。得られた結果
を以下の表8に示す。
【0035】
【表8】 ───────────────────────────────── 菌株 比粘度 分散性 吸光度 50% 粒径 CDH 吸着量 (%) (μm ) (mg/g) ───────────────────────────────── 67−2株 0.48 24 0.580 28.02 161 757-3-5-11株 1.25 30 0.388 91.34 144 ─────────────────────────────────
【0036】尚,50%粒径及びセロビオース脱水素酵
素(CDH)吸着量は以下の様にして測定した。50%粒径 比粘度測定の際に調製した0.5%離解BC懸濁液を粒
度分析計(マイクロトラック粒度分析計 モデルNo.922
0FRA、日機装(株)製)を用いて、流速1000rpm で
の50%粒径を測定した。
素(CDH)吸着量は以下の様にして測定した。50%粒径 比粘度測定の際に調製した0.5%離解BC懸濁液を粒
度分析計(マイクロトラック粒度分析計 モデルNo.922
0FRA、日機装(株)製)を用いて、流速1000rpm で
の50%粒径を測定した。
【0037】セロビオース脱水素酵素(CDH)吸着量 0.1%に希釈したBC懸濁液500μlに、1Mの酢
酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)150μlを加え、
さらにCDH懸濁液(濃度約1mg/ml) をCDH量が1
20、240、360、480、600μgとなるよう
に添加した後に蒸留水を加え、全量を1500μlとし
た。これらを30℃で3時間振盪させながらインキュベ
ーションした後、15000rpm で5分間遠心分離して
BCを除去し、上澄み液を回収した。各CDH添加量サ
ンプルの上澄み液の421nmでの吸光度を測定し、あら
かじめ作成した検量線から上澄み液中のCDH量を求め
た。最初に添加したCDH量から上澄み液中のCDH量
を差し引いてBCに吸着したCDH量を求めた。このよ
うにして得られた各CDH添加量サンプルでのBC試料
に吸着したCDH量、上澄み液中に残存するCDH量を
用いて以下のLangmuirの吸着等温式に近似してプロット
し、CDHの飽和吸着量〔A〕max を求めた。
酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)150μlを加え、
さらにCDH懸濁液(濃度約1mg/ml) をCDH量が1
20、240、360、480、600μgとなるよう
に添加した後に蒸留水を加え、全量を1500μlとし
た。これらを30℃で3時間振盪させながらインキュベ
ーションした後、15000rpm で5分間遠心分離して
BCを除去し、上澄み液を回収した。各CDH添加量サ
ンプルの上澄み液の421nmでの吸光度を測定し、あら
かじめ作成した検量線から上澄み液中のCDH量を求め
た。最初に添加したCDH量から上澄み液中のCDH量
を差し引いてBCに吸着したCDH量を求めた。このよ
うにして得られた各CDH添加量サンプルでのBC試料
に吸着したCDH量、上澄み液中に残存するCDH量を
用いて以下のLangmuirの吸着等温式に近似してプロット
し、CDHの飽和吸着量〔A〕max を求めた。
【0038】
【数3】CDHの飽和吸着量の計算 〔E〕/〔A〕=1/(Kad *〔A〕max)+(1/
〔A〕max)*〔E〕 〔A〕max :BC繊維表面に吸着されるCDHの飽和吸
着量 〔A〕 :BC試料に吸着したCDH量 〔E〕 :上澄み液中に残存するCDH量 Kad :吸着平衡定数
〔A〕max)*〔E〕 〔A〕max :BC繊維表面に吸着されるCDHの飽和吸
着量 〔A〕 :BC試料に吸着したCDH量 〔E〕 :上澄み液中に残存するCDH量 Kad :吸着平衡定数
【0039】又、757−3−5−11株、67−2株
の残糖のグラフを図1に示した。図1に見られるように
757−3−5−11株に比べ67−2株はSuc(シ
ュクロース)分解能が高く早期にSucが分解されてい
る。
の残糖のグラフを図1に示した。図1に見られるように
757−3−5−11株に比べ67−2株はSuc(シ
ュクロース)分解能が高く早期にSucが分解されてい
る。
【0040】ヤング率の測定 更に、以下の方法で本発明の67−2株から得られたB
Cのヤング率を求めた。刃付ミキサーで18000rpm
、BC濃度0.5%、容量200mlの条件で1分間離
解処理を行った。離解物は乾燥BC換算で0.2%〜
0.5%程度の濃度に純水で希釈後、真空下で脱気し
た。これを直径5cmのアクリル製シャーレに深さ8mm程
度入れ、水平な場所において、50℃で約5hr乾燥し
た。乾燥後、シャーレに接着したシートを注意深く剥が
した。また、ヤング率は以下のように測定した。すなわ
ち、調製した離解物シートから5×30mmの短冊状サン
プルを切り出し、厚さと重量を測定後、セイコー電子工
業(株)製の動的粘弾性測定装置「DMS210」を用
いて測定した。測定は自動テンション測定で、初期テン
ションを4000g/mm2 、変異量±20μm:周波数
10Hzの条件下で昇温測定を行い、引張貯蔵弾性率(ヤ
ング率)及び内部損失を求めた。ヤング率の温度分散パ
ターン(温度範囲28℃〜75℃)の最高値を絶乾状態
のヤング率とみなした。サンプル断面積は厚さと幅から
計算した。さらにセルロースの比重を一定1.58と
し、上記のヤング率の値を補正した値を計算し、真のヤ
ング率とした。このようにしてヤング率の値を測定した
ところ、平均値で32.6GPa であった。この値は、通
常の攪拌培養で得られたBCのシートのヤング率の中で
は高い方に属するものであった。
Cのヤング率を求めた。刃付ミキサーで18000rpm
、BC濃度0.5%、容量200mlの条件で1分間離
解処理を行った。離解物は乾燥BC換算で0.2%〜
0.5%程度の濃度に純水で希釈後、真空下で脱気し
た。これを直径5cmのアクリル製シャーレに深さ8mm程
度入れ、水平な場所において、50℃で約5hr乾燥し
た。乾燥後、シャーレに接着したシートを注意深く剥が
した。また、ヤング率は以下のように測定した。すなわ
ち、調製した離解物シートから5×30mmの短冊状サン
プルを切り出し、厚さと重量を測定後、セイコー電子工
業(株)製の動的粘弾性測定装置「DMS210」を用
いて測定した。測定は自動テンション測定で、初期テン
ションを4000g/mm2 、変異量±20μm:周波数
10Hzの条件下で昇温測定を行い、引張貯蔵弾性率(ヤ
ング率)及び内部損失を求めた。ヤング率の温度分散パ
ターン(温度範囲28℃〜75℃)の最高値を絶乾状態
のヤング率とみなした。サンプル断面積は厚さと幅から
計算した。さらにセルロースの比重を一定1.58と
し、上記のヤング率の値を補正した値を計算し、真のヤ
ング率とした。このようにしてヤング率の値を測定した
ところ、平均値で32.6GPa であった。この値は、通
常の攪拌培養で得られたBCのシートのヤング率の中で
は高い方に属するものであった。
【0041】
【発明の効果】以上の結果から、本発明に属する67−
2株から得られたBCは、従来のBCに較べて比粘度及
び分散性が低く、濃縮操作等の処理が迅速に行えること
が判った。また、濾過速度が速く、紙を抄きやすい。従
って、高いヤング率のシートを従来のBCの場合よりも
容易に作成することができる。又、本発明のBCは従来
のBCに較べ吸光度が高い為、シート状に成形した際に
その透明度が低くなり、画像の裏写りのないシート等が
得られることが判った。更に、本発明のBCは他のBC
に較べ粒径が著しく小さい割にはタンパク質の吸着量が
従来のものに較べてむしろ大きいので、例えば、各種の
薬剤の体内投与(DDS)の際の担体として有用である
と思われる。
2株から得られたBCは、従来のBCに較べて比粘度及
び分散性が低く、濃縮操作等の処理が迅速に行えること
が判った。また、濾過速度が速く、紙を抄きやすい。従
って、高いヤング率のシートを従来のBCの場合よりも
容易に作成することができる。又、本発明のBCは従来
のBCに較べ吸光度が高い為、シート状に成形した際に
その透明度が低くなり、画像の裏写りのないシート等が
得られることが判った。更に、本発明のBCは他のBC
に較べ粒径が著しく小さい割にはタンパク質の吸着量が
従来のものに較べてむしろ大きいので、例えば、各種の
薬剤の体内投与(DDS)の際の担体として有用である
と思われる。
【図1】757−3−5−11株及び67−2株の培養
に於ける培地中の残糖の濃度の変化を示す。
に於ける培地中の残糖の濃度の変化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 扇谷 浩 神奈川県川崎市高津区坂戸3丁目2番1号 株式会社バイオポリマー・リサーチ内 (72)発明者 石川 篤志 神奈川県川崎市高津区坂戸3丁目2番1号 株式会社バイオポリマー・リサーチ内 (72)発明者 土田 隆康 神奈川県川崎市高津区坂戸3丁目2番1号 株式会社バイオポリマー・リサーチ内 (72)発明者 竹村 浩 愛知県半田市中村町2−6 株式会社中埜 酢店中埜中央研究所内
Claims (4)
- 【請求項1】 比粘度が1未満であり、分散性が30%
未満であり、且つ吸光度が0.4以上であるようなバク
テリアセルロース。 - 【請求項2】 請求項1に記載されたバクテリアセルロ
ースを生産する菌。 - 【請求項3】 67−2株(FERM P−1624
9)である請求項2に記載されたバクテリアセルロース
を生産する菌。 - 【請求項4】 請求項2又は3に記載のバクテリアセル
ロース生産菌を培養し、培地中に蓄積したバクテリアセ
ルロースを回収することから成る、請求項1に記載され
たバクテリアセルロースの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2259798A JPH11209404A (ja) | 1998-01-20 | 1998-01-20 | 新規バクテリアセルロース |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2259798A JPH11209404A (ja) | 1998-01-20 | 1998-01-20 | 新規バクテリアセルロース |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11209404A true JPH11209404A (ja) | 1999-08-03 |
Family
ID=12087260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2259798A Pending JPH11209404A (ja) | 1998-01-20 | 1998-01-20 | 新規バクテリアセルロース |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11209404A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100358812C (zh) * | 2006-05-19 | 2008-01-02 | 东华大学 | 高效快速吸附重金属离子的细菌纤维素悬浮液制备方法 |
-
1998
- 1998-01-20 JP JP2259798A patent/JPH11209404A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100358812C (zh) * | 2006-05-19 | 2008-01-02 | 东华大学 | 高效快速吸附重金属离子的细菌纤维素悬浮液制备方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Effective date: 20040420 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20071113 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080408 |