JPH11221079A - 糖転移酵素および該酵素をコードするｄｎａ - Google Patents
糖転移酵素および該酵素をコードするｄｎａInfo
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- JPH11221079A JPH11221079A JP10023389A JP2338998A JPH11221079A JP H11221079 A JPH11221079 A JP H11221079A JP 10023389 A JP10023389 A JP 10023389A JP 2338998 A JP2338998 A JP 2338998A JP H11221079 A JPH11221079 A JP H11221079A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なβ1,4-ガラクトース転移酵素活性を有
する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを
用いたβ1,4-ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質
の製造法、および該蛋白質を用いたガラクトース含有糖
質の製造法が求められている。 【解決手段】 本発明によれば、β1,4-ガラクトース転
移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体Ｄ
ＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いたβ1,
4-ガラクトース転移酵素の製造法、および該形質転換体
を用いたガラクトース含有糖質の製造法を提供すること
ができる。
する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを
用いたβ1,4-ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質
の製造法、および該蛋白質を用いたガラクトース含有糖
質の製造法が求められている。 【解決手段】 本発明によれば、β1,4-ガラクトース転
移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体Ｄ
ＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いたβ1,
4-ガラクトース転移酵素の製造法、および該形質転換体
を用いたガラクトース含有糖質の製造法を提供すること
ができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、β1,4-ガラクトー
ス転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え
体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いた
β1,4-ガラクトース転移酵素の製造法、および該形質転
換体を用いたガラクトース含有糖質の製造法に関する。
ス転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え
体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いた
β1,4-ガラクトース転移酵素の製造法、および該形質転
換体を用いたガラクトース含有糖質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】β1,4-ガラクトース転移酵素遺伝子に関
して、動物由来の遺伝子〔J. Biol. Chem., 263, 10420
(1988)、Biochem. Biophys. Res. Commun., 157, 657
(1988)、Eur. J. Biochem., 183, 211 (1989)〕、ナイ
セリア・ガナリーア由来の遺伝子〔WO 96/10086〕およ
びストレプトコッカス・ニューモニエ由来の遺伝子〔Mo
l. Microbiol., 26, 197 (1997)〕が取得されている。
して、動物由来の遺伝子〔J. Biol. Chem., 263, 10420
(1988)、Biochem. Biophys. Res. Commun., 157, 657
(1988)、Eur. J. Biochem., 183, 211 (1989)〕、ナイ
セリア・ガナリーア由来の遺伝子〔WO 96/10086〕およ
びストレプトコッカス・ニューモニエ由来の遺伝子〔Mo
l. Microbiol., 26, 197 (1997)〕が取得されている。
【０００３】また、ヘリコバクター・ピロリのリポ多糖
のＯ抗原は哺乳動物のルイスＸ〔Galβ1-4(Fucα1-3)Gl
cNAc〕およびルイスＹ〔Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)Gl
cNAc〕エピトープと同じ構造を有しており、ヘリコバク
ター・ピロリにおいてβ1,4-ガラクトース転移酵素活性
の存在が予測されている〔Glycobiology, 5, 683 (199
5)〕。該微生物において、既知のβ1,4-ガラクトース転
移酵素と相同性の高いタンパク質は知られておらず、β
1,4-ガラクトース転移酵素遺伝子は特定されていない
〔Nature, 388, 539 (1997)〕。
のＯ抗原は哺乳動物のルイスＸ〔Galβ1-4(Fucα1-3)Gl
cNAc〕およびルイスＹ〔Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)Gl
cNAc〕エピトープと同じ構造を有しており、ヘリコバク
ター・ピロリにおいてβ1,4-ガラクトース転移酵素活性
の存在が予測されている〔Glycobiology, 5, 683 (199
5)〕。該微生物において、既知のβ1,4-ガラクトース転
移酵素と相同性の高いタンパク質は知られておらず、β
1,4-ガラクトース転移酵素遺伝子は特定されていない
〔Nature, 388, 539 (1997)〕。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、β1,
4-ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質
をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用いたβ1,4-ガラクト
ース転移酵素活性を有する蛋白質の製造法、および該蛋
白質を用いたガラクトース含有糖質の製造法を提供する
ことにある。
4-ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質
をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用いたβ1,4-ガラクト
ース転移酵素活性を有する蛋白質の製造法、および該蛋
白質を用いたガラクトース含有糖質の製造法を提供する
ことにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を行い、ヘリコバクター・ピロ
リのゲノムライブラリーからβ1,4-ガラクトース転移酵
素の活性を指標にしたスクリーニングを行うことによ
り、これまで特定されていなかった該糖転移酵素遺伝子
を取得し、その配列決定をして、本発明を完成するに至
った。
解決するために鋭意研究を行い、ヘリコバクター・ピロ
リのゲノムライブラリーからβ1,4-ガラクトース転移酵
素の活性を指標にしたスクリーニングを行うことによ
り、これまで特定されていなかった該糖転移酵素遺伝子
を取得し、その配列決定をして、本発明を完成するに至
った。
【０００６】即ち、本発明の第１の発明は、以下の(a)
または(b)の蛋白質： (a) 配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質 (b) (a)の蛋白質の有するアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつβ1,4-ガラクトース転移酵
素活性を有する蛋白質である。
または(b)の蛋白質： (a) 配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質 (b) (a)の蛋白質の有するアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつβ1,4-ガラクトース転移酵
素活性を有する蛋白質である。
【０００７】上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加
は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により
実施することができ、また、１若しくは数個のアミノ酸
とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換若しくは
付加できる程度の数のアミノ酸を意味する。かかる１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつβ1,4-ガラクトース転移酵
素活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Labor
atory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor L
aboratory Press (1989)、Current Protocols in Molec
ular Biology, John Wiley &Sons (1987-1997)、Nuclei
c Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl.Aca
d. Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (198
5)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc.
Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)等に記載の方法
に準じて調製することができる。
は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により
実施することができ、また、１若しくは数個のアミノ酸
とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換若しくは
付加できる程度の数のアミノ酸を意味する。かかる１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつβ1,4-ガラクトース転移酵
素活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Labor
atory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor L
aboratory Press (1989)、Current Protocols in Molec
ular Biology, John Wiley &Sons (1987-1997)、Nuclei
c Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl.Aca
d. Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (198
5)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc.
Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)等に記載の方法
に準じて調製することができる。
【０００８】本発明の第２の発明は、上記蛋白質をコー
ドするＤＮＡ、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａ、または配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ
1,4-ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をコード
するＤＮＡからなるＤＮＡである。上記の「ストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配
列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブ
として、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラー
ク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリ
ダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡ
を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来
のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0Ｍ
のNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った
後、0.1×〜２×SSC（saline-sodium citrate）溶液
〔１×SSC溶液（150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウ
ム）；ｎ×はｎ倍濃度の溶液を示す。〕を用い、65℃条
件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮ
Ａをあげることができる。
ドするＤＮＡ、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａ、または配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ
1,4-ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をコード
するＤＮＡからなるＤＮＡである。上記の「ストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配
列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブ
として、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラー
ク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリ
ダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡ
を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来
のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0Ｍ
のNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った
後、0.1×〜２×SSC（saline-sodium citrate）溶液
〔１×SSC溶液（150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウ
ム）；ｎ×はｎ倍濃度の溶液を示す。〕を用い、65℃条
件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮ
Ａをあげることができる。
【０００９】ハイブリダイゼーションは、Molecular Cl
oning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold S
pring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Prot
ocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (198
7-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practic
al Approach, Second Edition, Oxford University (19
95)等の実験書に記載されている方法に準じて行うこと
ができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的に
は、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも80％以
上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは95％以上の相同
性を有するＤＮＡをあげることができる。
oning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold S
pring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Prot
ocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (198
7-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practic
al Approach, Second Edition, Oxford University (19
95)等の実験書に記載されている方法に準じて行うこと
ができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的に
は、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも80％以
上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは95％以上の相同
性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００１０】本発明の第３の発明は、上記ＤＮＡをベク
ターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡである。本発
明の第４の発明は、上記組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導
入して得られる形質転換体である。本発明の第５の発明
は、上記形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記蛋
白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取する
ことを特徴とする該蛋白質の製造方法である。
ターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡである。本発
明の第４の発明は、上記組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導
入して得られる形質転換体である。本発明の第５の発明
は、上記形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記蛋
白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取する
ことを特徴とする該蛋白質の製造方法である。
【００１１】本発明の第６の発明は、上記形質転換体の
培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該
酵素源、糖基質およびウリジン二リン酸ガラクトースを
水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でガラクトース
をβ1,4結合で糖基質に転移させることによりガラクト
ース含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からガラク
トース含有糖質を採取することを特徴とするガラクトー
ス含有糖質の製造法である。
培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該
酵素源、糖基質およびウリジン二リン酸ガラクトースを
水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でガラクトース
をβ1,4結合で糖基質に転移させることによりガラクト
ース含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からガラク
トース含有糖質を採取することを特徴とするガラクトー
ス含有糖質の製造法である。
【００１２】以下に本発明を詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】[1] 本発明のＤＮＡの調製 (1) ゲノムＤＮＡライブラリーの作製 本発明のＤＮＡはヘリコバクター属に属する微生物より
調製することができる。
調製することができる。
【００１４】ヘリコバクター属に属する微生物として
は、例えばヘリコバクター・ピロリをあげることがで
き、具体的にはヘリコバクター・ピロリNCTC11637株等
をあげることができる。ヘリコバクター属に属する微生
物を公知の方法〔例えば、Mol. Microbiol., 20, 833
(1996)〕により培養する。
は、例えばヘリコバクター・ピロリをあげることがで
き、具体的にはヘリコバクター・ピロリNCTC11637株等
をあげることができる。ヘリコバクター属に属する微生
物を公知の方法〔例えば、Mol. Microbiol., 20, 833
(1996)〕により培養する。
【００１５】培養後、公知の方法〔例えば、Current Pr
otocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1
987-1997)〕により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精
製する。得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断
し、シュークロース密度勾配超遠心分離等の手法により
ＤＮＡ断片を分画し、2〜6ｋｂのＤＮＡ断片を回収す
る。
otocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1
987-1997)〕により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精
製する。得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断
し、シュークロース密度勾配超遠心分離等の手法により
ＤＮＡ断片を分画し、2〜6ｋｂのＤＮＡ断片を回収す
る。
【００１６】常法〔例えば、Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual, Second Edition;Cold Spring Harbor
Laboratory (1989)等〕に準じて、該回収ＤＮＡ断片
を、大腸菌用発現ベクターのプロモーターの下流に挿入
した組換え体ＤＮＡを作成し、該組換え体ＤＮＡを大腸
菌に導入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作
製することができる。
oratory Manual, Second Edition;Cold Spring Harbor
Laboratory (1989)等〕に準じて、該回収ＤＮＡ断片
を、大腸菌用発現ベクターのプロモーターの下流に挿入
した組換え体ＤＮＡを作成し、該組換え体ＤＮＡを大腸
菌に導入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作
製することができる。
【００１７】発現ベクターとしては、pBTrp2、pBTac1、
pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、pKK2
33-2（ファルマシア社製）、pGEX（ファルマシア社
製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プ
ロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジ
ェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Ag
ric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric.
Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII S
K+（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK(-)（ス
トラタジーン社製）、pTrS30〔Escherichia coli JM109
/pTrS30(FERM BP-5407)より調製〕およびpTrS32〔Esche
richia coli JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製〕、
pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28（宝酒造社
製）、pUC118（宝酒造社製）、pPA1（特開昭63-23379
8）等を例示することができる。
pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、pKK2
33-2（ファルマシア社製）、pGEX（ファルマシア社
製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プ
ロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジ
ェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Ag
ric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric.
Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII S
K+（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK(-)（ス
トラタジーン社製）、pTrS30〔Escherichia coli JM109
/pTrS30(FERM BP-5407)より調製〕およびpTrS32〔Esche
richia coli JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製〕、
pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28（宝酒造社
製）、pUC118（宝酒造社製）、pPA1（特開昭63-23379
8）等を例示することができる。
【００１８】大腸菌としては、例えば、Escherichia co
li XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichi
a coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia c
oliKY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia col
i JM109、Escherichia coliHB101、Escherichia coli N
o.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coliNY4
9、Escherichia coli MP347、Escherichia coli NM522
等をあげることができる。
li XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichi
a coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia c
oliKY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia col
i JM109、Escherichia coliHB101、Escherichia coli N
o.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coliNY4
9、Escherichia coli MP347、Escherichia coli NM522
等をあげることができる。
【００１９】組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポ
レーション法〔Nucleic Acids Research, 16, 6127 (19
88)〕等をあげることができる。
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポ
レーション法〔Nucleic Acids Research, 16, 6127 (19
88)〕等をあげることができる。
【００２０】(2) スクリーニングおよび本発明のＤＮ
Ａの調製 上記で作製したゲノムＤＮＡライブラリーの大腸菌を通
常の方法［例えば、ＬＢ培地〔バクトトリプトン（ディ
フコ社製）10ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）5ｇ
／ｌ、ＮａＣｌ 5ｇ／ｌ（ｐＨ7.2）〕を用い、20〜45
℃で5〜24時間］培養する。
Ａの調製 上記で作製したゲノムＤＮＡライブラリーの大腸菌を通
常の方法［例えば、ＬＢ培地〔バクトトリプトン（ディ
フコ社製）10ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）5ｇ
／ｌ、ＮａＣｌ 5ｇ／ｌ（ｐＨ7.2）〕を用い、20〜45
℃で5〜24時間］培養する。
【００２１】培養後、培養液を遠心分離し、湿菌体を取
得する。該湿菌体を用い、β1,4-ガラクトース転移酵素
活性を指標として、β1,4-ガラクトース転移酵素遺伝子
を有する大腸菌をスクリーニングする。該スクリーニン
グ法は公知の方法〔J. Biol. Chem., 271, 28271 (199
6)〕に準じて、あるいは下記の方法で行うことができ
る。
得する。該湿菌体を用い、β1,4-ガラクトース転移酵素
活性を指標として、β1,4-ガラクトース転移酵素遺伝子
を有する大腸菌をスクリーニングする。該スクリーニン
グ法は公知の方法〔J. Biol. Chem., 271, 28271 (199
6)〕に準じて、あるいは下記の方法で行うことができ
る。
【００２２】該湿菌体、50ｍＭ ＭＥＳ〔2-(N-Morpholi
no)ethanesulfonic acid, monohydrate〕（ｐＨ6.0）、
10ｍＭ ＭｎＣｌ2、0.2ｍＭ ウリジン二リン酸ガラクト
ース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、0.4％ナイミーンS-215および
後述の参考例１に準じた方法で調製したＬＮＴ−２（Gl
cNAcβ1-3Galβ1-4Glc）の蛍光標識体を0.2ｍＭ含む反
応液0.02ｍｌ中で37℃で16時間反応を行う。
no)ethanesulfonic acid, monohydrate〕（ｐＨ6.0）、
10ｍＭ ＭｎＣｌ2、0.2ｍＭ ウリジン二リン酸ガラクト
ース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、0.4％ナイミーンS-215および
後述の参考例１に準じた方法で調製したＬＮＴ−２（Gl
cNAcβ1-3Galβ1-4Glc）の蛍光標識体を0.2ｍＭ含む反
応液0.02ｍｌ中で37℃で16時間反応を行う。
【００２３】反応終了後、遠心分離により菌体を除去
し、上清を取得する。該上清をシリカゲル-60ＴＬＣプ
レート（メルク社製）上に乗せ、酢酸エチル：メタノー
ル：水：酢酸＝7：２：１：０．１で展開し、展開終了
後プレートを乾燥し、ＵＶ365ｎｍによりスポットの確
認を行う。大腸菌湿菌体の代わりにβ1,4-ガラクトース
転移酵素（シグマ社製）を用い同様の操作を行い、該操
作により生じたラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎ
Ｔ: Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）の蛍光標識体
（蛍光標識ＬＮｎＴ）に相当するＴＬＣ上のスポットを
確認する。
し、上清を取得する。該上清をシリカゲル-60ＴＬＣプ
レート（メルク社製）上に乗せ、酢酸エチル：メタノー
ル：水：酢酸＝7：２：１：０．１で展開し、展開終了
後プレートを乾燥し、ＵＶ365ｎｍによりスポットの確
認を行う。大腸菌湿菌体の代わりにβ1,4-ガラクトース
転移酵素（シグマ社製）を用い同様の操作を行い、該操
作により生じたラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎ
Ｔ: Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）の蛍光標識体
（蛍光標識ＬＮｎＴ）に相当するＴＬＣ上のスポットを
確認する。
【００２４】大腸菌湿菌体を用いた操作において、該Ｔ
ＬＣプレート上で蛍光標識ＬＮｎＴと同じ位置にスポッ
トの現われる大腸菌をβ1,4-ガラクトース転移酵素遺伝
子を有する菌株として選択する。選択されたクローンよ
り常法〔例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual Second Edition; Cold Spring Harbor Laboratory
(1989)等〕により目的とするＤＮＡを取得することが
できる。
ＬＣプレート上で蛍光標識ＬＮｎＴと同じ位置にスポッ
トの現われる大腸菌をβ1,4-ガラクトース転移酵素遺伝
子を有する菌株として選択する。選択されたクローンよ
り常法〔例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual Second Edition; Cold Spring Harbor Laboratory
(1989)等〕により目的とするＤＮＡを取得することが
できる。
【００２５】取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当
な制限酵素などで切断後常法によりベクターに組み込
み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキ
シ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (197
7)〕あるいは373A・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・
エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析する
ことにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
な制限酵素などで切断後常法によりベクターに組み込
み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキ
シ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (197
7)〕あるいは373A・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・
エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析する
ことにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００２６】該ＤＮＡを組み込むベクターとしては、pB
luescript KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT〔Nu
cleic Acids Research, 18, 6069 (1990)〕、pCR-Scrip
t Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジ
ェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）、pCR-TR
AP（ジーンハンター社製）およびpNoTAT7（５プライム
→３プライム社製）などをあげることができる。
luescript KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT〔Nu
cleic Acids Research, 18, 6069 (1990)〕、pCR-Scrip
t Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジ
ェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）、pCR-TR
AP（ジーンハンター社製）およびpNoTAT7（５プライム
→３プライム社製）などをあげることができる。
【００２７】上記のようにして取得された新規な塩基配
列を有するＤＮＡとして、例えば、配列番号２で表され
る配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。配列番
号２で表される配列を有するＤＮＡを保有するプラスミ
ドを保有する大腸菌として、例えばEscherichia coli N
M522/pPT1（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２２６）をあげること
ができる。
列を有するＤＮＡとして、例えば、配列番号２で表され
る配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。配列番
号２で表される配列を有するＤＮＡを保有するプラスミ
ドを保有する大腸菌として、例えばEscherichia coli N
M522/pPT1（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２２６）をあげること
ができる。
【００２８】また、上記により決定された塩基配列に基
づいたプライマーを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリー
を鋳型として、ＰＣＲ法（PCR Protocols, Academic Pr
ess(1990)〕により目的とするＤＮＡを取得することが
できる。更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づい
て、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮ
Ａ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とす
るＤＮＡを調製することもできる。
づいたプライマーを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリー
を鋳型として、ＰＣＲ法（PCR Protocols, Academic Pr
ess(1990)〕により目的とするＤＮＡを取得することが
できる。更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づい
て、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮ
Ａ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とす
るＤＮＡを調製することもできる。
【００２９】[2] 本発明の蛋白質の調製 上記[1]に記載の方法により取得した本発明のＤＮＡを
宿主細胞中で発現させるために、Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Second Edition. (1989)やCurren
t Protocols in Molecular Biology (1987-1997)等に記
載された方法を用いることができる。
宿主細胞中で発現させるために、Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Second Edition. (1989)やCurren
t Protocols in Molecular Biology (1987-1997)等に記
載された方法を用いることができる。
【００３０】即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクタ
ーのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを作
成し、それを宿主細胞に導入することにより、本発明の
蛋白質を発現する形質転換体を得ることができる。宿主
細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、目
的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用い
ることができる。
ーのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを作
成し、それを宿主細胞に導入することにより、本発明の
蛋白質を発現する形質転換体を得ることができる。宿主
細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、目
的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用い
ることができる。
【００３１】発現ベクターとしては、上記宿主細胞にお
いて自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、
本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有
しているものが用いられる。細菌等の原核生物を宿主細
胞として用いる場合は、本発明の蛋白質遺伝子発現ベク
ターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロ
モーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写
終結配列、より構成された組換え体ＤＮＡであることが
好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれてい
てもよい。
いて自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、
本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有
しているものが用いられる。細菌等の原核生物を宿主細
胞として用いる場合は、本発明の蛋白質遺伝子発現ベク
ターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロ
モーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写
終結配列、より構成された組換え体ＤＮＡであることが
好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれてい
てもよい。
【００３２】発現ベクターとしては、pBTrp2、pBTac1、
pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、pKK2
33-2（ファルマシア社製）、pGEX（ファルマシア社
製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プ
ロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジ
ェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Ag
ric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric.
Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII S
K+（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK(-)（ス
トラタジーン社製）、pTrS30〔大腸菌JM109/pTrS30(FER
M BP-5407)より調製〕、pTrS32〔大腸菌JM109/pTrS32(F
ERM BP-5408)より調製〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (198
5)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pUC118（宝酒造社製）、pP
A1（特開昭63-233798）等を例示することができる。
pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、pKK2
33-2（ファルマシア社製）、pGEX（ファルマシア社
製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プ
ロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジ
ェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Ag
ric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric.
Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII S
K+（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK(-)（ス
トラタジーン社製）、pTrS30〔大腸菌JM109/pTrS30(FER
M BP-5407)より調製〕、pTrS32〔大腸菌JM109/pTrS32(F
ERM BP-5408)より調製〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (198
5)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pUC118（宝酒造社製）、pP
A1（特開昭63-233798）等を例示することができる。
【００３３】プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細
胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、
ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモータ
ー、T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来す
るプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモータ
ー、penPプロモーター等をあげることができる。またＰ
trpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp×２）、tac
プロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーター
のように人為的に設計改変されたプロモーター等も用い
ることができる。
胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、
ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモータ
ー、T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来す
るプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモータ
ー、penPプロモーター等をあげることができる。またＰ
trpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp×２）、tac
プロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーター
のように人為的に設計改変されたプロモーター等も用い
ることができる。
【００３４】リボソーム結合配列としては、大腸菌等の
宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでも
よいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と
開始コドンとの間を適当な距離（例えば5〜18塩基）に
調節した組換え体ＤＮＡを用いることが好ましい。本発
明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現
には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝
子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでも
よいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と
開始コドンとの間を適当な距離（例えば5〜18塩基）に
調節した組換え体ＤＮＡを用いることが好ましい。本発
明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現
には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝
子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００３５】原核生物としては、エシェリヒア属、コリ
ネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス
属、ミクロバクテリウム属、セラチア属、シュードモナ
ス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1
-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli
DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY
3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM1
09、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.4
9、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、
Escherichia coli MP347、Escherichia coli NM522、Ba
cillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevi
bacterium ammoniagenes、Brevibacteriumimmariophilu
m ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14
066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacteri
um lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium gluta
micum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13
869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Coryneb
acterium acetoacidophilumATCC13870、Microbacterium
ammoniaphilum ATCC15354等をあげることができる。
ネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス
属、ミクロバクテリウム属、セラチア属、シュードモナ
ス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1
-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli
DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY
3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM1
09、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.4
9、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、
Escherichia coli MP347、Escherichia coli NM522、Ba
cillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevi
bacterium ammoniagenes、Brevibacteriumimmariophilu
m ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14
066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacteri
um lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium gluta
micum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13
869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Coryneb
acterium acetoacidophilumATCC13870、Microbacterium
ammoniaphilum ATCC15354等をあげることができる。
【００３６】組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポ
レーション法〔Nucleic Acids Research, 16, 6127 (19
88)〕等をあげることができる。
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポ
レーション法〔Nucleic Acids Research, 16, 6127 (19
88)〕等をあげることができる。
【００３７】酵母菌株を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC3711
5）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS1
9、pHS15等を用いることができる。プロモーターとして
は、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのもの
を用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロ
モーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1
プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポ
リペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1
プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
は、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC3711
5）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS1
9、pHS15等を用いることができる。プロモーターとして
は、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのもの
を用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロ
モーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1
プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポ
リペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1
プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００３８】酵母菌株としては、Saccharomyces cerevi
sae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lact
is、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluviu
s等をあげることができる。組換え体ＤＮＡの導入方法
としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれ
も用いることができ、例えば、エレクトロポレーション
法〔Methods in Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェ
ロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889
(1984)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163
(1983)〕等をあげることができる。
sae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lact
is、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluviu
s等をあげることができる。組換え体ＤＮＡの導入方法
としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれ
も用いることができ、例えば、エレクトロポレーション
法〔Methods in Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェ
ロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889
(1984)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163
(1983)〕等をあげることができる。
【００３９】動物細胞を宿主として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、pAGE107（特開平3-2297
9）、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8〔Nature, 329,
840 (1987)〕、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社
製）、pREP4（インビトロジェン社製）、pAGE103〔J. B
iochem, 101, 1307 (1987)〕等が用いられる。プロモー
ターとしては、動物細胞中で発現できるものであればい
ずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイル
ス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモータ
ー、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネイン
のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒー
トショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげ
ることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハン
サーをプロモーターと共に用いてもよい。
現ベクターとして、例えば、pAGE107（特開平3-2297
9）、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8〔Nature, 329,
840 (1987)〕、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社
製）、pREP4（インビトロジェン社製）、pAGE103〔J. B
iochem, 101, 1307 (1987)〕等が用いられる。プロモー
ターとしては、動物細胞中で発現できるものであればい
ずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイル
ス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモータ
ー、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネイン
のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒー
トショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげ
ることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハン
サーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００４０】動物細胞としては、ヒトの細胞であるナマ
ルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャ
イニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637
（特開昭63-299）等をあげることができる。組換え体Ｄ
ＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する
方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレ
クトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (199
0)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフ
ェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413
(1987)〕等をあげることができる。
ルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャ
イニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637
（特開昭63-299）等をあげることができる。組換え体Ｄ
ＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する
方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレ
クトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (199
0)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフ
ェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413
(1987)〕等をあげることができる。
【００４１】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例
えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory M
anual, W. H. Freeman and Company, New York (199
2)、Current Protocols in Molecular Biology (1987-1
997)、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方
法によって、蛋白質を発現することができる。即ち、組
換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫
細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス
を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染さ
せ、蛋白質を発現させることができる。
えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory M
anual, W. H. Freeman and Company, New York (199
2)、Current Protocols in Molecular Biology (1987-1
997)、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方
法によって、蛋白質を発現することができる。即ち、組
換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫
細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス
を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染さ
せ、蛋白質を発現させることができる。
【００４２】該方法において用いられる遺伝子導入ベク
ターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacII
I（ともにインビトロジェン社製）等をあげることがで
きる。バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆
虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォ
ルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autog
rapha californica nuclear polyhedrosis virus) 等を
用いることができる。
ターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacII
I（ともにインビトロジェン社製）等をあげることがで
きる。バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆
虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォ
ルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autog
rapha californica nuclear polyhedrosis virus) 等を
用いることができる。
【００４３】昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperd
aの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔Baculovirus Expression
Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and C
ompany, New York (1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細
胞であるHigh 5（インビトロジェン社製）等を用いるこ
とができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげるこ
とができる。
aの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔Baculovirus Expression
Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and C
ompany, New York (1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細
胞であるHigh 5（インビトロジェン社製）等を用いるこ
とができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげるこ
とができる。
【００４４】遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second
Edition (1989)に記載されている方法等に準じて、分
泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。酵母、
動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖
あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
に、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second
Edition (1989)に記載されている方法等に準じて、分
泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。酵母、
動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖
あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
【００４５】以上のようにして得られる形質転換体を培
地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積さ
せ、該培養物から採取することにより、本発明の蛋白質
を製造することができる。本発明の形質転換体を培地に
培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に
従って行うことができる。
地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積さ
せ、該培養物から採取することにより、本発明の蛋白質
を製造することができる。本発明の形質転換体を培地に
培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に
従って行うことができる。
【００４６】大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核
生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地と
しては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類
等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地で
あれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭
素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、
グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有
する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭
水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、
プロパノール等のアルコール類等を用いることができ
る。
生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地と
しては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類
等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地で
あれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭
素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、
グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有
する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭
水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、
プロパノール等のアルコール類等を用いることができ
る。
【００４７】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム
塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌
体、およびその消化物等を用いることができる。
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム
塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌
体、およびその消化物等を用いることができる。
【００４８】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条
件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、
通常5〜96時間である。培養中ｐＨは3.0〜9.0に保持す
る。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶
液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行
う。
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条
件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、
通常5〜96時間である。培養中ｐＨは3.0〜9.0に保持す
る。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶
液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行
う。
【００４９】また、培養中必要に応じて、アンピシリン
やテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモータ
ーを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養す
るときにはインドールアクリル酸等を培地に添加しても
よい。
やテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモータ
ーを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養す
るときにはインドールアクリル酸等を培地に添加しても
よい。
【００５０】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地〔The Journal of the American Medical Associ
ation, 199, 519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science,
122, 501 (1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396 (19
59)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the
Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培
地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができ
る。
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地〔The Journal of the American Medical Associ
ation, 199, 519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science,
122, 501 (1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396 (19
59)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the
Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培
地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができ
る。
【００５１】培養は、通常ｐＨ6〜8、30〜40℃、5％Ｃ
Ｏ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。また、培養中必
要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を
培地に添加してもよい。昆虫細胞を宿主として得られた
形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されて
いるTNM-FH培地〔ファーミンジェン社製〕、Sf-900 II
SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、
ExCell405〔いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製〕、
Grace's Insect Medium〔Nature, 195, 788 (1962)〕等
を用いることができる。
Ｏ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。また、培養中必
要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を
培地に添加してもよい。昆虫細胞を宿主として得られた
形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されて
いるTNM-FH培地〔ファーミンジェン社製〕、Sf-900 II
SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、
ExCell405〔いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製〕、
Grace's Insect Medium〔Nature, 195, 788 (1962)〕等
を用いることができる。
【００５２】培養は、通常ｐＨ6〜7、25〜30℃等の条件
下で1〜5日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタ
マイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。上記形
質転換体の培養液から、上記方法により発現させた蛋白
質を単離精製するためには、通常の酵素の単離、精製法
を用いればよい。
下で1〜5日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタ
マイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。上記形
質転換体の培養液から、上記方法により発現させた蛋白
質を単離精製するためには、通常の酵素の単離、精製法
を用いればよい。
【００５３】例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解
状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離
により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フ
レンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイ
ノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該
無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清か
ら、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安
等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエ
チルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA
-75（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換ク
ロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社
製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィ
ー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の
レジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を
用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー
法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電
気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精
製標品を得ることができる。
状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離
により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フ
レンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイ
ノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該
無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清か
ら、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安
等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエ
チルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA
-75（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換ク
ロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社
製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィ
ー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の
レジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を
用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー
法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電
気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精
製標品を得ることができる。
【００５４】また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成し
て発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分
離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法
により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変
性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含ま
ないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない
程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を
正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製
法により精製標品を得ることができる。
て発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分
離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法
により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変
性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含ま
ないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない
程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を
正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製
法により精製標品を得ることができる。
【００５５】本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の
誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋
白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収すること
ができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の
手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該
可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いること
により、精製標品を得ることができる。 [３] ガラクトース含有糖質の調製 上記[2]記載の培養により得られた形質転換体の培養液
および該培養液を種々処理した培養液の処理物を酵素源
として用い、水性媒体中でガラクトース含有糖質を製造
することができる。
誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋
白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収すること
ができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の
手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該
可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いること
により、精製標品を得ることができる。 [３] ガラクトース含有糖質の調製 上記[2]記載の培養により得られた形質転換体の培養液
および該培養液を種々処理した培養液の処理物を酵素源
として用い、水性媒体中でガラクトース含有糖質を製造
することができる。
【００５６】培養液の処理物としては、培養液の濃縮
物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる菌
体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界
面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械
的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理
物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは
該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげること
ができる。
物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる菌
体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界
面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械
的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理
物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは
該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげること
ができる。
【００５７】ガラクトース含有糖質の生成において用い
られる酵素源は、37℃で1分間に1μモルのガラクトース
含有糖質を生成することのできる活性を1単位（Ｕ）と
して、0.1ｍＵ／ｌ〜10,000Ｕ／ｌであり、好ましくは1
ｍＵ／ｌ〜1,000Ｕ／ｌの濃度で用いる。ガラクトース
含有糖質の生成において用いられる水性媒体としては、
水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸
塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなど
のアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセト
ンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などを
あげることができる。また、酵素源として用いた微生物
の培養液を水性媒体として用いることができる。
られる酵素源は、37℃で1分間に1μモルのガラクトース
含有糖質を生成することのできる活性を1単位（Ｕ）と
して、0.1ｍＵ／ｌ〜10,000Ｕ／ｌであり、好ましくは1
ｍＵ／ｌ〜1,000Ｕ／ｌの濃度で用いる。ガラクトース
含有糖質の生成において用いられる水性媒体としては、
水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸
塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなど
のアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセト
ンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などを
あげることができる。また、酵素源として用いた微生物
の培養液を水性媒体として用いることができる。
【００５８】ガラクトース含有糖質の生成において、必
要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよ
い。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタ
デシルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社
製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアン
モニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルア
ンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油
脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザ
ルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジ
メチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）な
どの三級アミン類など、ガラクトース含有糖質の生成を
促進するものであればいずれでもよく、１種または数種
を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常
0.1〜50ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤として
は、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセト
ン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常0.1〜50ｍｌ／ｌ
の濃度で用いられる。
要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよ
い。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタ
デシルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社
製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアン
モニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルア
ンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油
脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザ
ルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジ
メチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）な
どの三級アミン類など、ガラクトース含有糖質の生成を
促進するものであればいずれでもよく、１種または数種
を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常
0.1〜50ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤として
は、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセト
ン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常0.1〜50ｍｌ／ｌ
の濃度で用いられる。
【００５９】ガラクトース含有糖質の生成において用い
られる糖ヌクレオチド基質であるウリジン二リン酸ガラ
クトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）としては、市販品の他、微
生物等の活性を利用して生成した反応液あるいは該反応
液から精製したものを用いることができる。該糖ヌクレ
オチド基質は0.1〜500ｍＭの濃度で用いる。
られる糖ヌクレオチド基質であるウリジン二リン酸ガラ
クトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）としては、市販品の他、微
生物等の活性を利用して生成した反応液あるいは該反応
液から精製したものを用いることができる。該糖ヌクレ
オチド基質は0.1〜500ｍＭの濃度で用いる。
【００６０】ガラクトース含有糖質の生成において用い
られる糖基質としては、糖転移酵素の基質となるもので
あればいずれも用いることができ、例えば、グルコース
（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc（ＬＮＴ−２）の他、非
還元末端の糖がＧｌｃまたはＧｌｃＮＡｃであるオリゴ
糖などを例示することができる。
られる糖基質としては、糖転移酵素の基質となるもので
あればいずれも用いることができ、例えば、グルコース
（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc（ＬＮＴ−２）の他、非
還元末端の糖がＧｌｃまたはＧｌｃＮＡｃであるオリゴ
糖などを例示することができる。
【００６１】該糖基質は0.1〜500ｍＭの濃度で用いる。
該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ2等の無機
塩、β−メルカプトエタノール等を添加することができ
る。ガラクトース含有糖質の生成反応は水性媒体中、ｐ
Ｈ5〜10、好ましくはｐＨ6〜8、20〜50℃の条件で1〜96
時間行う。
該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ2等の無機
塩、β−メルカプトエタノール等を添加することができ
る。ガラクトース含有糖質の生成反応は水性媒体中、ｐ
Ｈ5〜10、好ましくはｐＨ6〜8、20〜50℃の条件で1〜96
時間行う。
【００６２】水性媒体中に生成したガラクトース含有糖
質の定量は公知の方法に準じて行うことができる〔化学
と工業, 43, 953 (1990)〕。反応液中に生成したガラク
トース含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂など
を用いる通常の方法によって行うことができ、例えば、
Ｎ−アセチルラクトサミンにおいてはJ. Org. Chem., 4
7, 5416 (1982)記載の方法に準じて行うことができる。
質の定量は公知の方法に準じて行うことができる〔化学
と工業, 43, 953 (1990)〕。反応液中に生成したガラク
トース含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂など
を用いる通常の方法によって行うことができ、例えば、
Ｎ−アセチルラクトサミンにおいてはJ. Org. Chem., 4
7, 5416 (1982)記載の方法に準じて行うことができる。
【００６３】以下に本発明の実施例を示すが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。以下に本発明
の実施例を示す。
これら実施例に限定されるものではない。以下に本発明
の実施例を示す。
【００６４】
【実施例】実施例１ ヘリコバクター・ピロリゲノムラ
イブラリーの作製Helicobacter pylori(NCTC11637, ATCC43504)をMol. Mi
crobiol., 20 833 (1996)に記載の方法で培養した。培
養後、Current Protocols in Molecular Biology (1987
-1997)に記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを
単離精製した。
イブラリーの作製Helicobacter pylori(NCTC11637, ATCC43504)をMol. Mi
crobiol., 20 833 (1996)に記載の方法で培養した。培
養後、Current Protocols in Molecular Biology (1987
-1997)に記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを
単離精製した。
【００６５】該染色体ＤＮＡ １０μｇを制限酵素Ｓａ
ｕ３ＡＩで部分分解後、シュークロース密度勾配超遠心
分離によりＤＮＡ断片を分画し、2〜6ｋｂの断片を回収
した。該ＤＮＡ断片0.5μｇおよび制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断後ホスファターゼ処理したｐＵＣ１１８ ＤＮＡ
0.2μｇ（宝酒造社製）をライゲーションキット（宝酒
造社製）を用いて、16℃、16時間、連結反応を行った。
ｕ３ＡＩで部分分解後、シュークロース密度勾配超遠心
分離によりＤＮＡ断片を分画し、2〜6ｋｂの断片を回収
した。該ＤＮＡ断片0.5μｇおよび制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断後ホスファターゼ処理したｐＵＣ１１８ ＤＮＡ
0.2μｇ（宝酒造社製）をライゲーションキット（宝酒
造社製）を用いて、16℃、16時間、連結反応を行った。
【００６６】該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株
を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地〔バク
トトリプトン（ディフコ社製）10ｇ／ｌ、酵母エキス
（ディフコ社製）5ｇ／ｌ、ＮａＣｌ 5ｇ／ｌ（ｐＨ7.
2）、寒天15ｇ／ｌ〕に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株をβ1,4-ガラクトース転移酵素
遺伝子のスクリーニングに供した。
を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地〔バク
トトリプトン（ディフコ社製）10ｇ／ｌ、酵母エキス
（ディフコ社製）5ｇ／ｌ、ＮａＣｌ 5ｇ／ｌ（ｐＨ7.
2）、寒天15ｇ／ｌ〕に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株をβ1,4-ガラクトース転移酵素
遺伝子のスクリーニングに供した。
【００６７】実施例２．スクリーニング 実施例１で作製したヘリコバクター・ピロリ由来のＤＮ
Ａ断片を保有する大腸菌株を10株ずつまとめてアンピシ
リン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地0.8ｍｌの入った48穴
マイクロ・プレートに接種し、37℃で17時間培養した。
Ａ断片を保有する大腸菌株を10株ずつまとめてアンピシ
リン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地0.8ｍｌの入った48穴
マイクロ・プレートに接種し、37℃で17時間培養した。
【００６８】該培養液150μｌ分を遠心分離し湿菌体を
取得した。該湿菌体は必要に応じて-20℃で保存するこ
とが可能で、使用前に解凍して用いることができる。ス
クリーニングの反応は該大腸菌湿菌体、50ｍＭ ＭＥＳ
（ｐＨ6.0）、10ｍＭＭｎＣｌ2、0.2ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａ
ｌ、0.4％ナイミーンS-215および後述の参考例１で調製
したFCHASE-LNT-2を0.2ｍＭ含む反応液0.02ｍｌ中で37
℃で16時間反応を行った。
取得した。該湿菌体は必要に応じて-20℃で保存するこ
とが可能で、使用前に解凍して用いることができる。ス
クリーニングの反応は該大腸菌湿菌体、50ｍＭ ＭＥＳ
（ｐＨ6.0）、10ｍＭＭｎＣｌ2、0.2ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａ
ｌ、0.4％ナイミーンS-215および後述の参考例１で調製
したFCHASE-LNT-2を0.2ｍＭ含む反応液0.02ｍｌ中で37
℃で16時間反応を行った。
【００６９】反応終了後、遠心分離により菌体を除去
し、上清を取得した。該上清をシリカゲル-60ＴＬＣプ
レート（メルク社製）上に乗せ、酢酸エチル：メタノー
ル：水：酢酸＝7：２：１：０．１で展開し、展開終了
後プレートを乾燥し、ＵＶ365nmによりスポットの確認
を行った。大腸菌湿菌体の代わりにβ1,4-ガラクトース
転移酵素（シグマ社製）を用い同様の操作を行い、該操
作により生成された蛍光標識ラクト−Ｎ−ネオテトラオ
ース（FCHASE-LNnT）のＴＬＣ上の位置を確認した。
し、上清を取得した。該上清をシリカゲル-60ＴＬＣプ
レート（メルク社製）上に乗せ、酢酸エチル：メタノー
ル：水：酢酸＝7：２：１：０．１で展開し、展開終了
後プレートを乾燥し、ＵＶ365nmによりスポットの確認
を行った。大腸菌湿菌体の代わりにβ1,4-ガラクトース
転移酵素（シグマ社製）を用い同様の操作を行い、該操
作により生成された蛍光標識ラクト−Ｎ−ネオテトラオ
ース（FCHASE-LNnT）のＴＬＣ上の位置を確認した。
【００７０】FCHASE-LNnTと同じＴＬＣ上の位置にスポ
ットの現われる大腸菌湿菌体の集団から単集落分離した
菌株について、同様のスクリーニングを実施して、β1,
4-ガラクトース転移酵素活性を示す菌株である（Escher
ichia coli NM522/pPT1）を選択した。Escherichia col
i NM522/pPT1株は平成１０年１月２０日付けで工業技術
院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１
丁目１番３号（郵便番号３０５００４６）にＦＥＲＭ
ＢＰ−６２２６として寄託されている。
ットの現われる大腸菌湿菌体の集団から単集落分離した
菌株について、同様のスクリーニングを実施して、β1,
4-ガラクトース転移酵素活性を示す菌株である（Escher
ichia coli NM522/pPT1）を選択した。Escherichia col
i NM522/pPT1株は平成１０年１月２０日付けで工業技術
院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１
丁目１番３号（郵便番号３０５００４６）にＦＥＲＭ
ＢＰ−６２２６として寄託されている。
【００７１】この菌株の保有するプラスミドｐＰＴ１に
ついて、その構造を解析したところプラスミドｐＵＣ１
１８のＢａｍＨＩ部位にヘリコバクター・ピロリ由来の
2ｋｂ断片が挿入した図１に示すような構造を有してい
た。該2ｋｂ挿入断片のＤＮＡ塩基配列を決定したとこ
ろ配列表の配列番号２に示すようなオープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）が見い出された。該ＯＲＦに対応
するアミノ酸配列を配列番号１に示した。
ついて、その構造を解析したところプラスミドｐＵＣ１
１８のＢａｍＨＩ部位にヘリコバクター・ピロリ由来の
2ｋｂ断片が挿入した図１に示すような構造を有してい
た。該2ｋｂ挿入断片のＤＮＡ塩基配列を決定したとこ
ろ配列表の配列番号２に示すようなオープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）が見い出された。該ＯＲＦに対応
するアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【００７２】実施例３．Ｎ−アセチルラクトサミンの生
産 実施例２で得たEscherichia coli NM522/pPT1株をアン
ピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地8ｍｌの入った太
型試験管に接種し28℃で17時間培養した。該培養液をア
ンピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地8ｍｌの入った
太型試験管に1％接種し37℃で5時間培養した。該培養液
0.1ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は
必要に応じて-20℃で保存することが可能で、使用前に
解凍して用いることができる。
産 実施例２で得たEscherichia coli NM522/pPT1株をアン
ピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地8ｍｌの入った太
型試験管に接種し28℃で17時間培養した。該培養液をア
ンピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地8ｍｌの入った
太型試験管に1％接種し37℃で5時間培養した。該培養液
0.1ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は
必要に応じて-20℃で保存することが可能で、使用前に
解凍して用いることができる。
【００７３】該湿菌体（0.1ｍｌ分）、50ｍＭ ＭＥＳ
（ｐＨ6.0）、10ｍＭ ＭｎＣｌ2、0.2ｍＭ ＧｌｃＮＡ
ｃ、0.2ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、0.4％ナイミーンS-215か
らなる0.1ｍｌの反応液中で、37℃、16時間反応を行っ
た。反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分
析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に12.7ｍｇ／
ｌのＮ−アセチルラクトサミンが生成蓄積していること
を確認した。
（ｐＨ6.0）、10ｍＭ ＭｎＣｌ2、0.2ｍＭ ＧｌｃＮＡ
ｃ、0.2ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、0.4％ナイミーンS-215か
らなる0.1ｍｌの反応液中で、37℃、16時間反応を行っ
た。反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分
析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に12.7ｍｇ／
ｌのＮ−アセチルラクトサミンが生成蓄積していること
を確認した。
【００７４】実施例４．ラクト−Ｎ−ネオテトラオース
の生産 実施例２で得たEscherichia coli NM522/pPT1株をアン
ピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地8ｍｌの入った太
型試験管に接種し28℃で17時間培養した。
の生産 実施例２で得たEscherichia coli NM522/pPT1株をアン
ピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地8ｍｌの入った太
型試験管に接種し28℃で17時間培養した。
【００７５】該培養液をアンピシリン50μｇ／ｍｌを含
むＬＢ培地8ｍｌの入った太型試験管に1％接種し37℃で
5時間培養した。該培養液0.1ｍｌ分を遠心分離し湿菌体
を取得した。該湿菌体は必要に応じて-20℃で保存する
ことが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
該湿菌体（0.1ｍｌ分）、50ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ6.0）、1
0ｍＭ ＭｎＣｌ2、0.2ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、0.4％ ナ
イミーンS-215および参考例２で調製したＬＮＴ−２を
0.2ｍＭ含む反応液0.1ｍｌ中で、37℃、16時間反応を行
った。
むＬＢ培地8ｍｌの入った太型試験管に1％接種し37℃で
5時間培養した。該培養液0.1ｍｌ分を遠心分離し湿菌体
を取得した。該湿菌体は必要に応じて-20℃で保存する
ことが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
該湿菌体（0.1ｍｌ分）、50ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ6.0）、1
0ｍＭ ＭｎＣｌ2、0.2ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、0.4％ ナ
イミーンS-215および参考例２で調製したＬＮＴ−２を
0.2ｍＭ含む反応液0.1ｍｌ中で、37℃、16時間反応を行
った。
【００７６】反応終了後、反応生成物をダイオネックス
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に6
1.6ｍｇ／ｌのラクト−Ｎ−ネオテトラオースが生成蓄
積していることを確認した。
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に6
1.6ｍｇ／ｌのラクト−Ｎ−ネオテトラオースが生成蓄
積していることを確認した。
【００７７】参考例１ 蛍光標識ＬＮＴ−２(FCHASE-LN
T-2)の調製 [1] 蛍光標識ラクトース（FCHASE-Lac）の調製 蛍光標識したラクトース(FCHASE-Lac)の調製は、アミノ
フェニルラクトース（シグマ社製）と６-(5-fluorescei
n-carboxamido)-hexanoic acid succimidyl ester (FCH
ASE, モレキュラー・プローブ社製)から公知の方法〔J.
Biol. Chem.,271, 19166 (1996)〕により調製した。
T-2)の調製 [1] 蛍光標識ラクトース（FCHASE-Lac）の調製 蛍光標識したラクトース(FCHASE-Lac)の調製は、アミノ
フェニルラクトース（シグマ社製）と６-(5-fluorescei
n-carboxamido)-hexanoic acid succimidyl ester (FCH
ASE, モレキュラー・プローブ社製)から公知の方法〔J.
Biol. Chem.,271, 19166 (1996)〕により調製した。
【００７８】[2] Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素
発現菌株の造成 (1) 発現ベクターｐＰＡＣ３１の造成 トリプトファンプロモーターを含むプラスミドｐＴｒＳ
３０(FERM BP-5407)およびＰLプロモーターを含むプラ
スミドｐＰＡ１（特開昭63-233798）、ｐＰＡＣ１(FERM
BP-6054)については、これらのプラスミドを保有する
菌株から公知の方法によりプラスミドＤＮＡを単離精製
した。
発現菌株の造成 (1) 発現ベクターｐＰＡＣ３１の造成 トリプトファンプロモーターを含むプラスミドｐＴｒＳ
３０(FERM BP-5407)およびＰLプロモーターを含むプラ
スミドｐＰＡ１（特開昭63-233798）、ｐＰＡＣ１(FERM
BP-6054)については、これらのプラスミドを保有する
菌株から公知の方法によりプラスミドＤＮＡを単離精製
した。
【００７９】ｐＴｒＳ３０ ＤＮＡ 0.2μｇを制限酵素
ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンIIキッ
ト（バイオ101社製）により3.4ｋｂの断片を回収した。
ｐＰＡ１ ＤＮＡ 0.5μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣ
ｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ
断片を分離し、同様に1.0ｋｂの断片を回収した。
ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンIIキッ
ト（バイオ101社製）により3.4ｋｂの断片を回収した。
ｐＰＡ１ ＤＮＡ 0.5μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣ
ｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ
断片を分離し、同様に1.0ｋｂの断片を回収した。
【００８０】該3.4ｋｂの断片および1.0ｋｂの断片をラ
イゲーションキットを用いて、16℃、16時間、連結反応
を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、37℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコ
ロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出
し、ＰLプロモーターによる発現ベクターであるｐＰＡ
３１を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により
確認した（図２）。
イゲーションキットを用いて、16℃、16時間、連結反応
を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、37℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコ
ロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出
し、ＰLプロモーターによる発現ベクターであるｐＰＡ
３１を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により
確認した（図２）。
【００８１】ｐＰＡ３１ ＤＮＡ 0.2μｇを制限酵素Ｐ
ｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンIIキット
により3.4ｋｂの断片を回収した。ｐＰＡＣ１ ＤＮＡ
0.5μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同
様に2.3ｋｂの断片を回収した。
ｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンIIキット
により3.4ｋｂの断片を回収した。ｐＰＡＣ１ ＤＮＡ
0.5μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同
様に2.3ｋｂの断片を回収した。
【００８２】該3.4ｋｂの断片および2.3ｋｂの断片をラ
イゲーションキットを用いて、16℃、16時間、連結反応
を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、37℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコ
ロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出
し、ｃＩ８５７リプレッサーを含むＰLプロモーターに
よる発現ベクターであるｐＰＡＣ３１を取得した。
イゲーションキットを用いて、16℃、16時間、連結反応
を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、37℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコ
ロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出
し、ｃＩ８５７リプレッサーを含むＰLプロモーターに
よる発現ベクターであるｐＰＡＣ３１を取得した。
【００８３】該プラスミドの構造を制限酵素消化により
確認した（図２）。
確認した（図２）。
【００８４】(2) ｌｇｔＡ発現プラスミドの造成 ナイセリア・ガナリーア（Neisseria gonorrhoeae）ATC
C33084株の染色体ＤＮＡを実施例１と同様の方法により
単離精製した。配列番号３記載のセンス鎖ＤＮＡプライ
マーと、配列番号４記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライ
マーをパーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型Ｄ
ＮＡ合成機を用いて合成した。
C33084株の染色体ＤＮＡを実施例１と同様の方法により
単離精製した。配列番号３記載のセンス鎖ＤＮＡプライ
マーと、配列番号４記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライ
マーをパーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型Ｄ
ＮＡ合成機を用いて合成した。
【００８５】該合成ＤＮＡをプライマーとして、Neisse
ria gonorrhoeae ATCC33084株の染色体ＤＮＡを鋳型と
してＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ 0.1μｇ、
プライマー各0.5μＭ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ス
トラタジーン社製） 2.5units、Ｐｆｕ ＤＮＡ ポリメ
ラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製） 4μｌ、
deoxyNTP各200μＭを含む反応液40μｌを用い、94℃-1
分、42℃-2分、72℃-3分の工程を30回繰り返すことによ
り行った。
ria gonorrhoeae ATCC33084株の染色体ＤＮＡを鋳型と
してＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ 0.1μｇ、
プライマー各0.5μＭ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ス
トラタジーン社製） 2.5units、Ｐｆｕ ＤＮＡ ポリメ
ラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製） 4μｌ、
deoxyNTP各200μＭを含む反応液40μｌを用い、94℃-1
分、42℃-2分、72℃-3分の工程を30回繰り返すことによ
り行った。
【００８６】該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳
動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの
反応液と等量のＴＥ〔10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
8.0）、1ｍＭ ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホル
ム（1ｖｏｌ／1ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液
を遠心分離後、得られた上層に2倍容量の冷エタノール
を加えて混合し、-80℃に30分放置した。該放置液を遠
心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの
反応液と等量のＴＥ〔10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
8.0）、1ｍＭ ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホル
ム（1ｖｏｌ／1ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液
を遠心分離後、得られた上層に2倍容量の冷エタノール
を加えて混合し、-80℃に30分放置した。該放置液を遠
心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
【００８７】該ＤＮＡの沈殿を20μｌのＴＥに溶解し
た。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンII
キットにより1.0ｋｂの断片を回収した。pBluescriptII
SK+ ＤＮＡ0.2μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢ
ａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離し、同様に3.0ｋｂの断片を回収した。
た。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンII
キットにより1.0ｋｂの断片を回収した。pBluescriptII
SK+ ＤＮＡ0.2μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢ
ａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離し、同様に3.0ｋｂの断片を回収した。
【００８８】該1.0ｋｂおよび4.2ｋｂの断片をライゲー
ションキットを用いて、16℃、16時間、連結反応を行っ
た。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の
公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピ
シリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、30℃
で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーよ
り前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇ
ｔＡ発現プラスミドであるｐＮＴ５９Ｐを得た。該プラ
スミドの構造を制限酵素消化により確認した（図３）。
ションキットを用いて、16℃、16時間、連結反応を行っ
た。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の
公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピ
シリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、30℃
で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーよ
り前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇ
ｔＡ発現プラスミドであるｐＮＴ５９Ｐを得た。該プラ
スミドの構造を制限酵素消化により確認した（図３）。
【００８９】該ｐＮＴ５９Ｐ ＤＮＡ 0.5μgを制限酵素
ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し1.0ｋｂの断片を回収
した。上記で造成したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ0.2μｇを制
限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロース
ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に5.5ｋ
ｂの断片を回収した。
ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し1.0ｋｂの断片を回収
した。上記で造成したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ0.2μｇを制
限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロース
ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に5.5ｋ
ｂの断片を回収した。
【００９０】該1.0ｋｂおよび5.5ｋｂの断片をライゲー
ションキットを用いて、16℃、16時間、連結反応を行っ
た。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の
公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピ
シリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、30℃
で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーよ
り前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇ
ｔＡ発現プラスミドであるｐＮＴ５９を得た。該プラス
ミドの構造を制限酵素消化により確認した（図３）。
ションキットを用いて、16℃、16時間、連結反応を行っ
た。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の
公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピ
シリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、30℃
で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーよ
り前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇ
ｔＡ発現プラスミドであるｐＮＴ５９を得た。該プラス
ミドの構造を制限酵素消化により確認した（図３）。
【００９１】[3] 蛍光標識ＬＮＴ−２(FCHASE-LNT-2)
の調製 上記で得たEscherichia coli NM522/pNT59株をアンピシ
リン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地8ｍｌの入った太型試
験管に接種し、28℃で17時間培養した。該培養液をアン
ピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地8ｍｌの入った太
型試験管に1％接種し、28℃で4時間培養後、温度を40℃
に上げてさらに3時間培養した。
の調製 上記で得たEscherichia coli NM522/pNT59株をアンピシ
リン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地8ｍｌの入った太型試
験管に接種し、28℃で17時間培養した。該培養液をアン
ピシリン50μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地8ｍｌの入った太
型試験管に1％接種し、28℃で4時間培養後、温度を40℃
に上げてさらに3時間培養した。
【００９２】該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。
該湿菌体は必要に応じて-20℃で保存することが可能
で、使用前に解凍して用いることができる。該湿菌体20
ｍｇ、50ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ6.0）、10ｍＭ ＭｎＣｌ2、
20ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、0.4％ナイミーンS-215
および上記[1]で調製したFCHASE-Lacを20ｍＭ含む反応
液0.1ｍｌ中で、37℃、16時間反応を行った。
該湿菌体は必要に応じて-20℃で保存することが可能
で、使用前に解凍して用いることができる。該湿菌体20
ｍｇ、50ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ6.0）、10ｍＭ ＭｎＣｌ2、
20ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、0.4％ナイミーンS-215
および上記[1]で調製したFCHASE-Lacを20ｍＭ含む反応
液0.1ｍｌ中で、37℃、16時間反応を行った。
【００９３】反応終了後、遠心分離により菌体を除去し
た上清をＴＬＣにより分離した。ＴＬＣによる分離はシ
リカゲル-60ＴＬＣプレート（メルク社製）を用い、酢
酸エチル：メタノール：水：酢酸＝7：２：１：０．１
で展開することにより行った。展開終了後、該ＴＬＣプ
レートを乾燥し、ＵＶ365ｎｍによりスポットの確認を
行った。
た上清をＴＬＣにより分離した。ＴＬＣによる分離はシ
リカゲル-60ＴＬＣプレート（メルク社製）を用い、酢
酸エチル：メタノール：水：酢酸＝7：２：１：０．１
で展開することにより行った。展開終了後、該ＴＬＣプ
レートを乾燥し、ＵＶ365ｎｍによりスポットの確認を
行った。
【００９４】該ＴＬＣ上のFCHASE-LNT-2に対応するスポ
ットの部分をかきとり、水を用いて抽出した後、遠心分
離・フィルターろ過によりシリカゲルを除いたものを凍
結乾燥し、基質であるFCHASE-LNT-2を取得した。
ットの部分をかきとり、水を用いて抽出した後、遠心分
離・フィルターろ過によりシリカゲルを除いたものを凍
結乾燥し、基質であるFCHASE-LNT-2を取得した。
【００９５】参考例２ ＬＮＴ−２基質の調製 ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（オックスフォード・グ
ライコシステムズ社製）にβ-ガラクトシダーゼ（生化
学工業社製）を作用させ、ラクト−Ｎ−ネオテトラオー
スの非還元末端のガラクトースを完全に除去した後、10
0℃で5分間熱処理することによりβ-ガラクトシダーゼ
活性を失活させた反応液をＬＮＴ−２基質として、上記
実施例で用いた。
ライコシステムズ社製）にβ-ガラクトシダーゼ（生化
学工業社製）を作用させ、ラクト−Ｎ−ネオテトラオー
スの非還元末端のガラクトースを完全に除去した後、10
0℃で5分間熱処理することによりβ-ガラクトシダーゼ
活性を失活させた反応液をＬＮＴ−２基質として、上記
実施例で用いた。
【００９６】
【発明の効果】本発明により、β1,4-ガラクトース転移
酵素を遺伝子組換え手法により大量に生産することが可
能となる。また、該酵素を用いることにより効率的にガ
ラクトース含有糖質を製造できる。
酵素を遺伝子組換え手法により大量に生産することが可
能となる。また、該酵素を用いることにより効率的にガ
ラクトース含有糖質を製造できる。
【００９７】
配列番号：１ 配列の長さ：273 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Leu Arg Val Phe Ile Ile Ser Leu Asn Gln Lys Val Cys Asp Thr Phe 1 5 10 15 Gly Leu Val Phe Arg Asp Thr Thr Thr Leu Leu Asn Asn Ile Asn Ala 20 25 30 Thr His His Gln Ala Gln Ile Phe Asp Ala Ile Tyr Ser Lys Thr Phe 35 40 45 Glu Gly Gly Leu His Pro Leu Val Lys Lys His Leu His Pro Tyr Phe 50 55 60 Ile Thr Gln Asn Ile Lys Asp Met Gly Ile Thr Thr Asn Leu Ile Ser 65 70 75 80 Glu Val Ser Lys Phe Tyr Tyr Ala Leu Lys Tyr His Ala Lys Phe Met 85 90 95 Ser Leu Gly Glu Leu Gly Cys Tyr Ala Ser His Tyr Ser Leu Trp Glu 100 105 110 Lys Cys Ile Glu Leu Asn Glu Ala Ile Cys Ile Leu Glu Asp Asp Ile 115 120 125 Thr Leu Lys Glu Asp Phe Lys Glu Gly Leu Asp Phe Leu Glu Lys His 130 135 140 Ile Gln Glu Leu Gly Tyr Val Arg Leu Met His Leu Leu Tyr Asp Pro 145 150 155 160 Asn Val Lys Ser Glu Pro Leu Asn His Lys Asn His Glu Ile Gln Glu 165 170 175 Arg Val Gly Ile Ile Lys Ala Tyr Ser His Gly Val Gly Thr Gln Gly 180 185 190 Tyr Val Ile Thr Pro Lys Ile Ala Lys Val Phe Lys Lys His Ser Arg 195 200 205 Lys Trp Val Val Pro Val Asp Thr Ile Met Asp Ala Thr Phe Ile His 210 215 220 Gly Val Lys Asn Leu Val Leu Gln Pro Phe Val Ile Ala Asp Asp Glu 225 230 235 240 Gln Ile Ser Thr Ile Ala Arg Lys Glu Glu Pro Tyr Ser Pro Lys Ile 245 250 255 Ala Leu Met Arg Glu Leu His Phe Lys Tyr Leu Lys Tyr Trp Gln Phe 260 265 270 Val 273
【００９８】配列番号：２ 配列の長さ：819 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 配列 TTGCGTGTTT TTATCATTTC TTTAAATCAA AAAGTGTGCG ATACATTTGG TTTGGTTTTT 60 AGAGACACCA CGACTTTACT CAATAATATT AATGCCACCC ACCACCAAGC GCAAATTTTT 120 GATGCGATTT ATTCTAAAAC TTTTGAAGGC GGGTTGCACC CCTTAGTGAA AAAGCATTTA 180 CACCCTTATT TCATCACGCA AAACATCAAA GACATGGGGA TTACAACCAA TCTCATCAGT 240 GAGGTTTCTA AGTTTTATTA CGCTTTAAAA TACCATGCGA AGTTTATGAG CTTGGGGGAG 300 CTTGGGTGCT ATGCGAGCCA TTATTCCTTG TGGGAAAAAT GCATAGAACT CAATGAAGCG 360 ATCTGTATTT TAGAAGACGA TATAACCTTA AAAGAGGATT TTAAAGAGGG ATTGGATTTT 420 TTAGAAAAAC ACATCCAAGA GTTAGGCTAT GTTCGCTTGA TGCATTTATT ATATGACCCC 480 AATGTTAAAA GTGAGCCATT GAACCATAAA AACCACGAGA TACAAGAGCG TGTGGGGATC 540 ATTAAAGCTT ATAGTCATGG GGTGGGGACG CAAGGCTATG TGATCACGCC CAAGATTGCC 600 AAAGTTTTTA AAAAACACAG CCGAAAATGG GTTGTTCCTG TGGATACGAT AATGGACGCT 660 ACTTTTATCC ATGGCGTGAA AAATCTGGTG TTACAACCTT TTGTGATCGC TGATGATGAG 720 CAGATCTCTA CGATAGCACG AAAAGAAGAA CCTTATAGCC CTAAAATCGC CTTAATGAGA 780 GAACTCCATT TTAAATATTT GAAATATTGG CAGTTTGTA 819
【００９９】配列番号：3 配列の長さ：30 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGTAAAGCTT ATGCAGCCTC TGGTTTCCGT 30
【０１００】配列番号：4 配列の長さ：29 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AAACGGATCC TTGGCTCTGC ATTAGATCT 29
【図１】図１はβ1,4-ガラクトース転移酵素遺伝子発現
プラスミドｐＰＴ１の構造を示す。
プラスミドｐＰＴ１の構造を示す。
【図２】図２は発現プラスミドｐＰＡ３１およびｐＰＡ
Ｃ３１の造成工程を示す。
Ｃ３１の造成工程を示す。
【図３】図３はｌｇｔＡ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ５
９の造成工程を示す
９の造成工程を示す
Ampr：アンピシリン耐性遺伝子 Ptrp：トリプトファンプロモーター PL：PLプロモーター cI857： cI857リプレッサー lgtA：β1,3-Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子 Gal Tase：β1,4-ガラクトース転移酵素遺伝子
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (9)
- 【請求項１】 以下の(a)または(b)の蛋白質。 (a) 配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質 (b) (a)の蛋白質の有するアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつβ1,4-ガラクトース転移酵素
活性を有する蛋白質 - 【請求項２】 請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮ
Ａ。 - 【請求項３】 以下の(a)または(b)のＤＮＡからなるＤ
ＮＡ。 (a) 配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ (b) (a)のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつβ1,4-ガラクトース転移酵素活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ - 【請求項４】 ＤＮＡがヘリコバクター・ピロリ由来の
ＤＮＡである、請求項２または３記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項２〜４に記載のＤＮＡから選ばれ
るＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮ
Ａ。 - 【請求項６】 請求項５記載の組換え体ＤＮＡを宿主細
胞に導入して得られる形質転換体。 - 【請求項７】 形質転換体がエシェリヒア・コリであ
る、請求項６記載の形質転換体。 - 【請求項８】 請求項６または７記載の形質転換体を培
地に培養し、培養物中にβ1,4-ガラクトース転移酵素活
性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白
質を採取することを特徴とする、β1,4-ガラクトース転
移酵素活性を有する蛋白質の製造方法。 - 【請求項９】 請求項６または７記載の形質転換体の培
養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該酵
素源、糖基質およびウリジン二リン酸ガラクトースを水
性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でガラクトースを
β1,4結合で糖基質に転移させることによりガラクトー
ス含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からガラクト
ース含有糖質を採取することを特徴とするガラクトース
含有糖質の製造法。
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