JPH1123468A - 光導波路を使用した固相表面上の蛍光分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】安価で、高い検出感度を期待でき、しかも検出
限界の良好な蛍光分析装置を提供する。 【解決手段】分析対象である蛍光物質からの蛍光に対し
て透明な物質を材料とする光導波路と、励起光に対して
透明な物質を材料とし、内部に光導波路及び分析対象を
含むと予想される検査溶液を収容する収納容器と、蛍光
物質を蛍光励起し得る波長の光を放射できる光放射源で
あって、収容容器内に収容された光導波路の主側面に対
向する側から該面に向かって励起光を出射するように配
置される光放射源等から構成される蛍光分析装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、固相表面上に直接
又は間接的に拘束された蛍光物質、或いは、固相表面の
近傍に位置する蛍光物質からの蛍光信号を検出する固相
表面上の蛍光分析装置であって、上記の固相として光導
波路を使用した蛍光分析装置に関するものである。また
本発明は、いわゆるサンドイッチ法、競合法を利用して
抗原及び／又は抗体の存在や濃度等を測定する免疫測定
を行うための、光導波路を使用した蛍光分析装置に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】固相として光導波路を使用し、固相表面
上に直接又は間接的に拘束された蛍光物質を測定するた
めの蛍光分析装置は、既にいくつか提案されている。例
えば、免疫反応や吸着反応を経由して固相表面上に直接
又は間接的に拘束された蛍光物質や、或いは、固相表面
の近傍に位置する蛍光物質からの蛍光信号を検出する装
置が知られている。より具体的には、例えば、光導波路
の側から励起光を入射し、その全反射時に光導波路外に
しみ出す光いわゆるエバネッセント光を使って、光導波
路表面上に直接又は間接的に拘束された蛍光物質や、或
いは、光導波路表面の近傍に位置する蛍光物質からの蛍
光信号を検出することにより、検査溶液中の特定成分の
量を求める装置として、図３に表示したような装置が提
案されている。

【０００３】図３に表示した装置では、プリズム（４
８）の一表面をひとつの区画面とする反応槽（４７）を
設け、プリズムの上記一表面を特定成分の吸着を促進す
る物質でコーティングしておき、この反応槽内部に蛍光
物質を結合した特定成分を含む検査溶液（４９）を注入
する。こうすることによって、検査溶液中の特定成分の
濃度に対応する量の蛍光物質がプリズムのコーティング
表面に吸着する。励起光（４３）を、プリズムの上記コ
ーティング表面とは別の面から、そのコーティング表面
と溶液の界面において臨界角以上の角度となるように入
射させると、励起光はプリズムのコーティング表面にお
いて一回だけ全反射し、他の面から出射するが、その全
反射時に一部の光がエバネッセント光として検査溶液中
にしみ出す。 しみ出す距離ｄｐ（その電解強度が１／
ｅとなる距離）は下記式に従っており、一般には１００
ｎｍ前後であるため、プリズムのコーティング表面に拘
束された蛍光物質を選択的に励起することができる。

【０００４】

【数１】

【０００５】なお、上記式において、λは光の波長、ｎ
１はプリズムの屈折率、ｎ２は溶液の屈折率、θはプリ
ズムと溶液の界面に入射する光の入射角である。こうし
て誘起された蛍光（４４）をプリズムのコーティング表
面に対向する方向から検出し、コーティング表面に拘束
された蛍光物質の物理量、更には検査溶液中の特定成分
の濃度に対応する物理量を算出するのである。

【０００６】また、具体的に例えば、図４に表示したよ
うな装置も提案されている。この装置では、スラブ型の
光導波路（５２）の一表面をひとつの区画面とする反応
槽を設け、スラブ型光導波路の上記一表面に拘束用抗体
又は拘束用抗原をあらかじめ固定しておき、この反応槽
の内部に検査溶液と蛍光物質を結合した標識抗体又は標
識抗原を注入して免疫反応を実施する。こうすることに
よって、検査溶液中の抗原又は抗体の濃度に対応する量
の蛍光物質がスラブ型光導波路のコーティング表面に拘
束される。励起光（４３）をスラブ型光導波路の一端面
から入射させると光導波路の表面で全反射を繰り返しな
がら伝播していくが、その全反射時に検査溶液中にしみ
出すエバネッセント光を使って、コーティング表面に拘
束された蛍光物質を選択的に励起することができるので
ある。

【０００７】このような装置の場合、コーティング面に
おいて複数回の全反射が起こるため、図３に表示したよ
うなプリズム表面における一回の全反射を利用する場合
と比較して蛍光量が多く、検査溶液中の抗原又は抗体に
対して高感度な測定が可能であるという利点がある。

【０００８】更に、具体的に例えば、図５に表示したよ
うな、ファイバー型の光導波路（５３）を反応槽（５
１）に浸たした装置も提案されている。ファイバー型光
導波路の表面に拘束用抗体又は拘束用抗原をあらかじめ
固定しておき、このファイバー型光導波路を浸した反応
槽の内部に検査溶液（４９）と蛍光物質を結合した標識
抗体又は標識抗原を注入して免疫反応を実施する。こう
することによって、検査溶液中の抗原又は抗体の濃度に
対応する量の蛍光物質がファイバー型光導波路のコーテ
ィング表面に拘束される。励起光（４３）をファイバー
型光導波路の一端面から入射させると光導波路の表面で
全反射を繰り返しながら伝播していくが、その全反射時
において溶液中にしみ出すエバネッセント光を使って、
コーティング表面に拘束された蛍光物質を選択的に励起
することができるのである。

【０００９】このような装置の場合も、コーティング面
において複数回の全反射が起こるため、図３に表示した
ようなプリズム表面における一回の全反射を利用する場
合と比較して蛍光量が多く、検査溶液中の抗原又は抗体
に対して高感度な測定が可能であるという利点がある。

【００１０】なお、図４や図５に表示した装置におい
て、標識抗体又は標識抗原の標識物質を酵素とし、その
酵素の作用によって蛍光物質に変換される酵素基質（蛍
光物質前駆物質）を注入すれば、光導波路表面に拘束さ
れた酵素の作用によって生成する蛍光物質は、光導波路
表面近傍に一時的に存在することになるため、光導波路
からしみ出すエバネッセント光を使って光導波路表面の
近傍に存在する蛍光物質を選択的に励起することができ
る。従って、光導波路に拘束された酵素や検査溶液中の
抗原又は抗体の定量が可能となる。

【００１１】光導波路の表面から溶液中にしみ出したエ
バネッセント光は、再び光導波路の内部に入射し伝播し
ていくことが知られているが、この現象はエバネッセン
ト光によって誘起された蛍光についても同様である。す
なわち、図６に表示したように、エバネッセント光がし
み出す範囲で発生し光導波路（１）の内部に侵入した蛍
光（１０５）は、光導波路の側からその表面で反射する
場合に臨界角以上の角度を持つ成分を有しており、この
ような蛍光は全反射を繰り返しながら光導波路を伝播し
ていく。従って、スラブ型かファイバー型かに限らず、
光導波路の端面から励起光を入射してその表面における
多重反射を利用する場合には、その蛍光を検出する方向
において、光導波路のコーティング表面に対向する方向
から検出する方法、励起光が出射する端面の側において
検出する方法、そして励起光が入射する端面の側におい
て検出する方法の３通りの方法が考えられる。最近で
は、図４及び図５に表示したように、励起光を入射する
端面の側において検出する方法が多く採用されている
が、その意図するところは光導波路の表面における選択
性の向上と励起光バックグラウンドの除去にある。

【００１２】なお、図４及び図５から明らかなように、
スラブ型光導波路における光の封じ込めは一次元である
のに対し、ファイバー型光導波路の場合は二次元である
ため、光導波路における蛍光の伝播は、ファイバー型光
導波路の方がより効率的である。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】光導波路の表面上に直
接又は間接的に拘束された蛍光物質、或いは、光導波路
表面の近傍に位置する蛍光物質からの蛍光信号を検出す
る、従来の固相表面上の蛍光分析装置であって、光導波
路の側面から入射した励起光が全反射する際にしみ出す
エバネッセント光を使って蛍光を誘起する図４に表示し
たような蛍光分析装置には以下のような課題がある。

【００１４】第１に、光導波路を伝播する光のほとんど
は光導波路の内部に閉じ込められ、光導波路から溶液中
にエバネッセント光としてしみ出す光量はわずかであ
り、光放射源からの励起光の一部分しか有効に利用でき
ない。蛍光分析における蛍光強度は励起光の強度に比例
するため、励起光の一部しか利用できない場合、大きな
蛍光信号を期待することはできず、検査溶液中の特定成
分を定量する目的では、高い検出感度を期待することが
できない。

【００１５】第２に、光導波路自体が蛍光を発してしま
うという課題がある。安価なガラスや、ポリスチレン、
ポリメチルメタクリレート等の安価なプラスチック材料
の場合は、強い蛍光を発する物質や不純物を含んでいる
ため、光導波路自体からの自己蛍光が伝播し、蛍光分析
におけるバックグラウンド要因となる。従来法では、光
導波路を進行する距離が長いだけにその影響は大きく、
結果として検査溶液中の特定成分を定量する目的に使用
する場合、その検出限界を悪化させる。合成石英のよう
に、不純物が極端に少なく、通常の波長領域でその蛍光
がほとんど無視できる材料を光導波路として使用すれば
光導波路自体の蛍光の影響は無視できるが、合成石英等
は高価で高度な加工技術を要求されるため、コスト的な
課題を生じ、ディスポーザブルな使用には向かない。

【００１６】第３に、光導波路の端面から励起光を入射
させる場合、励起光が散乱や反射を起こしてしまい、バ
ックグラウンドが上昇して信号のＳ／Ｎ比を悪化させる
という課題がある。従来法で多用されているような、励
起光が入射する端面の側において蛍光を検出する方法で
は、蛍光の測定方向が励起光の入射方向とほぼ同一の軸
上にあるため、光導波路の入射端面や出射端面での散乱
光・反射光を充分に除去することが困難であり、結果と
して検査溶液中の特定成分の定量を行う場合、その検出
限界を悪化させるのである。

【００１７】第４に、光導波路の入射端面の形状が複雑
化するという課題がある。光導波路への励起光の入射効
率を高めたり、端面での反射を減少させるため、従来法
では入射端面をプリズム形状やレンズ形状に成形してい
るが、これが結果として製造コストを押し上げているの
である。

【００１８】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに成された本願請求項１項の装置は、固相表面上に直
接又は間接的に拘束された蛍光物質、或いは、固相表面
の近傍に位置する蛍光物質からの蛍光信号を検出する固
相表面上の蛍光分析装置において、分析対象である蛍光
物質からの蛍光に対して透明な物質を材料とし、上記固
相表面を提供する光導波路と、分析対象である蛍光物質
を励起する励起光に対して透明な物質を材料とし、内部
に上記光導波路及び分析対象を含むと予想される検査溶
液を収容する収納容器と、上記蛍光物質を蛍光励起し得
る波長の光を放射できる光放射源であって、収容容器内
に収容された光導波路の主側面に対向する側から該面に
向かって励起光を出射するように配置される光放射源
と、光導波路の端面から出射する光信号を、上記蛍光物
質から放射される蛍光波長を選別する光学手段を介して
検出するように配置され、光導波路に侵入して光導波路
を伝播する蛍光を受光し得るように配置される受光セン
サーから構成されていることを特徴とする。

【００１９】また、上記課題を解決するために成され
た、本願請求項２項の免疫分析装置は、あらかじめ固相
表面上に拘束用抗体又は拘束用抗原を固定しておき、該
固相を検査溶液中の抗原性物質及びあらかじめ蛍光物質
又は酵素を結合した標識抗体又は標識抗原と反応させて
上記標識抗体又は標識抗原を固相表面上に間接的に拘束
した後、拘束された標識抗体又は標識抗原に結合された
蛍光物質或いは酵素作用によって生成した蛍光物質の蛍
光信号を検出することにより、検査溶液中の上記抗原性
物質の存在又は濃度に関する物理量を分析する免疫分析
装置において、上記蛍光物質からの蛍光に対して透明な
物質を材料とし、上記固相表面を提供する光導波路と、
分析対象である蛍光物質を励起する励起光に対して透明
な物質を材料とし、内部に上記光導波路及び検査溶液を
収容する収納容器と、上記蛍光物質を蛍光励起し得る波
長の光を放射できる光放射源であって、収容容器内に収
容された光導波路の主側面に対向する側から該面に向か
って励起光を出射するように配置される光放射源と、光
導波路の端面から出射する光信号を、上記蛍光物質から
放射される蛍光波長を選別する光学手段を介して検出す
るように配置され、光導波路に侵入して光導波路を伝播
する蛍光を受光し得るように配置される受光センサーか
ら構成されていることを特徴とする。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、図面に基づき本発明を詳細
に説明する。

【００２１】図１は本願請求項１の蛍光分析装置の一実
施形態を示す図であり、図２は本願請求項２の免疫分析
のうちの一実施形態を示す図である。

【００２２】いずれの装置も、分析対象である蛍光物質
からの蛍光に対して透明な物質を材料とする光導波路
（１）と、分析対象である蛍光物質を励起する励起光に
対して透明な物質を材料とし、内部に上記光導波路及び
分析対象を含むと予想される検査溶液を収容するように
した収納容器（３）と、上記蛍光物質を蛍光励起し得る
波長の光（７）を放射できる光放射源であって、収容容
器内に収容された光導波路の主側面に対向する側から該
面に向かって出射されるように配置される光放射源
（４）と、光導波路の端面から出射する光信号を、上記
蛍光物質から放射される蛍光波長を選別する光学手段
（５）を介して検出するように配置され、光導波路に侵
入して光導波路を伝播する蛍光（８）を受光するように
した受光センサー（６）から構成されている。なお、光
導波路の材料は、分析対象である蛍光物質からの蛍光に
対して透明であること以外に、分析対象を含むと予想さ
れる検査溶液よりも大きな屈折率を有することが必要で
あるが、通常、検査溶液は血液や血清等の生体試料に代
表される水溶液であることが多いことから、実質的には
特に制限されない。

【００２３】これら装置では、光導波路（１）として蛍
光信号が出射する側を除く３つの端面に光吸収用の黒色
ゴムを塗布した光学顕微鏡用スライドグラス（サイズ；
２６×７６×０．９mm、屈折率＝１．５２）を、収納容
器（３）として内径φ２８×外径φ３０×高さ６０mmの
ガラス製ビーカーを、光放射源（４）としてキセノンフ
ラッシュランプを、受光センサー（６）として光電子増
倍管を使用している。図１の装置においては、光導波路
（１）上に分析対象である蛍光物質を拘束するためのコ
ーティングを施し、図２の装置においては、その一部分
（２）に分析対象に対する抗体を固定してある。ここ
で、例えば、１個の光導波路を複数の画分に区切り、各
画分にそれぞれ異なる物質を拘束するためのコーティン
グを施し、或いはそれぞれ異なる分析対象に対する抗体
を固定しておけば、１個の光導波路を用いるのみで複数
の分析対象の蛍光分析が可能となる。即ち、複数の光照
射源を、上記各画分のそれぞれを照射し得るように配置
しておき、光照射源の切り換えて異なる分析対象を測定
するのである。むろん、１個の光照射源を、上記各画分
を照射するために移動可能に配置しておいても良い。更
には、複数の光導路を収容容器内に併設可能としてお
き、各光導波路上に１又は複数の上記画分を設けること
も可能である。

【００２４】図７は、上記装置を更に詳細に示した図で
ある。光導波路（１）は、四弗化エチレンを材料とし、
表面に黒色のゴムコート処理を施した上部に２箇所のデ
ーパ部を有する組立部品（２１）を介して収納容器
（３）内に設置される。収納容器（３）は、Ｚ軸ステー
ジのテーブル上に設置されており、Ｚ軸ステージの操作
により組立部品（２１）のテーパ部とテーブル（２３
ｂ）の上面を接続部品（２４）に接するように移動する
ことで、光導波路（１）と光放射源（４）及び光導波路
（１）と受光センサー（６）の位置関係を決定できる。
なお、光放射源（４）から出射される励起光は、光放射
源側に設置した光学フィルター（４ｂ）によって波長選
択され，光学レンズ（４ｃ）によって光束調製されたう
えで光導波路（１）上の特定の領域を照射する。光導波
路（１）の上端面から出射した蛍光信号は、光学レンズ
（５ａ、５ｃ）、ダイクロイックミラー（５ｂ）、光学
フィルター （５ｄ）を介して光導波路を伝搬する蛍光
物質からの蛍光のみが選択された後、受光センサー
（６）で検出される。

【００２５】上記例では、固相表面を提供する光導波路
（１）として光学顕微鏡用のスライドグラスを使用した
が、これ以外にも、スラブ型形状の光導波路、ファイバ
ー型形状の光導波路、これらに準じた形状の導波路のい
ずれでも、蛍光物質からの蛍光に対して透明で、かつ、
検査溶液よりも大きな屈折率を有するものであれば特に
制限なく使用できる。ここで、光導波路が励起光に対し
ても透明であれば、励起光が照射された側（主側面）を
通過して反対側にぬけ、該反対面においても蛍光物質を
励起可能となり、特に好ましい。

【００２６】なお、光導波路は、その全体が励起光に対
して透明である必要はなく、少なくとも、分析対象であ
る蛍光物質を拘束するためのコーティング領域、或い
は、免疫反応により抗原性物質を拘束するための抗原又
は抗体を固定した領域であって、励起光が照射される領
域が透明であれば良い。ここで、上記コーティング領域
又は抗体等を固定した領域は、光導波路の主側面に設け
られる。本願発明においては、蛍光物質や抗原性物質を
拘束するためのコーティング領域又は抗体等を固定した
領域が存在する光導波路の一面が主側面であり、そして
光導波路に進入してその内部を伝搬する蛍光物質からの
蛍光を受光センサーに導くための面が端面である。

【００２７】収容容器（３）に関しては、図１及び図２
の例ではガラス製ビーカー等を使用したが、収容容器は
励起光に対して透明なもので作られ、内部に検査溶液を
収容可能で、光導波路（１）の上記コーティング領域又
は抗体等を固定した領域が検査溶液と接触でき、そして
光導波路に進入してその内部を伝搬する蛍光物質からの
蛍光を受光センサーに導くために少なくとも光導波路の
一端面が検査溶液に浸らないような大きさ、形状であれ
ば特に制限はない。なお、収容容器は、その全体が励起
光に対して透明である必要はなく、少なくとも、光導波
路における上記コーティング領域又は抗体等を固定した
領域に励起光が照射されるようにその一部分が透明であ
れば良い。収容容器（３）は、前記例の他に例えば図７
に示したように、ガラス製ビーカーに代えてスライドグ
ラス（１）上の上記コーティング領域又は抗体等を固定
した領域を覆うように配置した透明なカバーグラス
（３）であっても良い。この場合、スライドグラスとカ
バーグラスの間に適当な厚みを有するパッキング等を配
置して検査溶液を収容する空間とすることができる。

【００２８】また上記例では、紫外域から可視域に至る
幅広い波長の光を四方に発するキセノンフラッシュラン
プ（４ａ）を使用したため、光学フィルター（４ｂ）及
び光学レンズ（４ｃ）を介して波長選択と光束の調製を
行っているが、例えばレーザー等、限定された波長及び
光束の光を発する光放射源等を用いる場合はこの限りで
はなく、使用する光放射源の特性に適した光学系を採用
することができる。光放射源は、上記した収容容器の透
明部分を通して、少なくとも光導波路主側面上の上記コ
ーティング領域又は抗体等を固定した領域を照射できれ
ば良い。特に、励起光が主側面から入射し、光導波路の
主側面の反対面を通過して光導波路内を伝搬しないよう
な角度で励起光を照射できるように光放射源を配置する
ことが好ましい。また、蛍光物質を蛍光励起するための
励起光の光放射源は、光導波路の周囲に少なくとも１つ
配置すれば良いが、その数を増強することにより、光導
波路の表面又は表面近傍に位置する標識抗体の蛍光物質
に対する励起効率を向上することができ、好ましい。

【００２９】更に上記例では、光導波路の上端面から出
射した蛍光信号を光学フィルターを介して波長選別した
後に受光センサーで検出したが、光学レンズ（５ａ、５
ｃ）やダイクロイックミラー（５ｂ）等については、従
来公知の種々の光学部品を用いることが可能で、上記例
に限定されない。光導波路と光放射源、及び、光導波路
と受光センサーの位置関係の決定手段等も、コネクタを
利用するなどの他の手段も考えられる。

【００３０】図２（図７）に示した本願請求項２項の免
疫分析装置を使用する種々の免疫分析について説明す
る。

【００３１】第１の方法は、まず、分析に供されるべき
血清や尿等の試料溶液に、適当な緩衝溶液、標識抗体又
は標識抗原を含む溶液を順次又は一度に注入して反応溶
液を調製し、試料溶液中の特定の抗原又は抗体（抗原性
物質）と標識抗体又は標識抗原との間で免疫反応を生じ
させる。次に、あらかじめ上記抗原性物質を拘束するた
めの抗体又は抗原を固定した領域を有する光導波路と反
応溶液を接触させ、標識抗体又は標識抗原と結合した試
料溶液中の特定の抗原性物質と光導波路主側面に固定さ
れた拘束用抗体又は拘束用抗原との間で免疫反応を生じ
させる。これにより、光導波路主側面上には、試料溶液
中の特定の抗原性物質の濃度に対応した量の標識抗体又
は標識抗原の拘束が実現する。ここで、前記標識が蛍光
標識である場合には、反応溶液を検査溶液として、前記
標識が酵素等である場合には、酵素の作用によって蛍光
物質に変換される前駆物質を入れて検査溶液を形成した
うえで、光放射源から励起光を光導波路に照射し、誘起
された蛍光物質からの蛍光のうち光導波路に侵入して全
反射を繰り返しながら伝播していく蛍光を光導波路の上
端面から受光すれば良い。

【００３２】なお、標識が酵素等である場合には、光導
波路上の拘束用抗体等と反応溶液との反応を、上記前駆
物質の共存下で実施することもできる。また、最終的に
は検査溶液について収容容器内で蛍光励起できれば、上
記各反応の一部又は全ては別途用意した容器内で生じさ
せるようにしても良い。更に、特定の抗原性物質の濃度
に対応しない蛍光を除去するためには、光導波路上に間
接的に拘束された標識抗体等以外の標識物を、蛍光測定
に先だって除去しておくことが好ましい。この目的のた
めには、例えば反応溶液と光導波路の接触を収容容器外
で実施し、光導波路を洗浄した後、収容容器に入れて蛍
光測定を行うことが例示できる。

【００３３】光導波路に侵入して全反射を繰り返しなが
ら伝播していく蛍光は、光導波路に光を伝播させた場合
にエバネッセント光がしみ出す範囲で発生した蛍光であ
るため、光導波路上に拘束された標識抗体又は標識抗原
に結合した蛍光物質か、或いは、光導波路上に拘束され
た標識抗体又は標識抗原に結合した酵素等の近傍に存在
する蛍光物質からの蛍光を選択的に含んでおり、標識抗
体又は標識抗原が光導波路へ拘束された量又は拘束速度
に対応する。これらの物理量は上記から明らかなように
試料溶液中の特定の抗原又は抗体の濃度に関係してお
り、特定の抗原又は抗体の濃度が既知の標準溶液につい
て同様の操作を実施して作成した検量線と照合すること
により、試料溶液中の特定の抗原又は抗体の濃度を算出
することができる。

【００３４】第２の方法は、試料溶液中の特定の抗原性
物質と光導波路上に固定された拘束用抗体又は拘束用抗
原との間でまず免疫反応を生じさせ、その後、標識抗体
又は標識抗原の溶液を注入して試料溶液中の特定の抗原
性物質と標識抗体又は標識抗原との間の免疫反応を生じ
させるのである。この他の点については、上記第１の方
法と同様の操作を行えば良い。

【００３５】第３の方法は、試料溶液中の特定の抗原性
物質、標識抗体又は標識抗原、そして光導波路上に固定
された拘束用抗体又は拘束用抗原との間の免疫反応を同
時に生じさせるのである。この他の点については、上記
第１の方法と同様の操作を行えば良い。

【００３６】そして第４の方法は、上記各方法におい
て、試料溶液中の特定の抗原と標識抗原を光導波路上に
固定された拘束用抗体と競合反応させるか、試料溶液中
の特定の抗体と標識抗体を光導波路上に固定された拘束
用抗原と競合反応させるのである。この他の点について
は、上記第１の方法と同様の操作を行えば良い。

【００３７】実施例１ 図７に示した蛍光分析装置を用いて、以下の方法によ
り、光導波路表面に存在する蛍光物質の蛍光分析を実施
した。

【００３８】まず、光導波路として使用した、励起光を
も透過するスライドグラス（１）と収容容器として使用
したカバーグラス（３）を厚さ１６０μｍの四弗化エチ
レンテープを挟んで接着し、その空隙に濃度５μＭのＥ
ｕ３＋キレート溶液４０μｌ又はＥｕ３＋を含まないブ
ランク溶液４０μｌを注入した。このあと、光放射源
（４）から励起光を収容容器（３）中の各溶液に照射
し、誘起されたＥｕ３＋キレートからの蛍光のうち、光
導波路に侵入して全反射を繰り返しながら伝播していく
蛍光を光導波路の上端面から受光した。

【００３９】光導波路に侵入して全反射を繰り返しなが
ら伝播していく蛍光は、光導波路に光を伝播させた場合
にエバネッセント光がしみ出す範囲で発生した蛍光であ
るため、光導波路の表面近傍に存在するＥｕ３＋キレー
トからの信号を選択的に含んでいるが、光導波路に光を
伝播させた場合にエバネッセント光がしみ出す範囲は、
本実施例で使用したスライドグラスや溶液の屈折率から
計算すると、約１００ｎｍである。もちろん、１００ｎ
ｍ以上表面から離れたところに存在するＥｕ３＋からの
蛍光も一端は光導波路内に侵入するが、光導波路表面で
の入射角が全反射の臨界角より小さいため、その多くは
光導波路外へ出射し、反射を繰り返すうちに減衰してい
くため、光導波路の端面で蛍光を検出することにより、
エバネッセント光のしみ出し深さ( 本実施例の場合は約
１００ｎｍ) の範囲に存在するＥｕ３＋キレートからの
蛍光を選択的に検出することができる。

【００４０】比較のため、第８図に図示した従来の蛍光
分析装置を使用して、励起光を光導波路の端面から入射
してエバネッセント励起光により蛍光物質を励起する従
来の方法で同一のサンプルを測定した。

【００４１】第７図の装置で測定した蛍光信号の時間分
解データと従来法の図８の装置で測定した蛍光信号の時
間分解データを図９に図示する。

【００４２】５μＭのＥｕ３＋キレート溶液とブランク
溶液の信号差を比較すると、従来装置よりも明らかに大
きく、表面から１００ｎｍの範囲の励起に関与した励起
光強度で補正すると約２００倍となる。すなわち、従来
装置よりも多くの信号量を得ることができることが明ら
かである。

【００４３】図７の装置又は図８の装置で光導波路とし
て使用したスライドグラスのみを測定したときの蛍光信
号を図１０に図示する。蛍光信号量及びその時間変化は
図９のブランク溶液の信号とほとんど同じであることか
ら、ブランク溶液を測定したときに観察される蛍光信号
は、光導波路として使用したスライドグラス自体からの
蛍光により支配されていることがわかる。従って、図９
において、ブランク溶液の信号量を比較することによ
り、妨害信号となる光導波路からの自己蛍光の影響を見
積ることができるが、約１／４０と、従来装置よりも明
らかに妨害信号が小さいことがわかる。

【００４４】

【発明の効果】光導波路の表面上に直接又は間接的に拘
束された蛍光物質、或いは、光導波路表面の近傍に位置
する蛍光物質の蛍光分析を実施するに際し、本願発明の
蛍光分析装置を用いた場合、従来装置を用いる場合と比
較して以下のような利点がある。 第１に、励起光の全
てを有効に利用できるため、光導波路から溶液中にしみ
出すエバネッセント光を利用した従来法に比較して高効
率の蛍光誘起が行え、その結果、大きな蛍光信号を得る
ことが可能になる。従って、免疫分析装置等に代表され
る、検査溶液中の特定成分の定量等を行う装置において
は、その検出限界を向上させることが可能である。加え
て、光導波路の周囲に複数の光放射源を配置することに
より、更に蛍光強度を増加したり、種々の抗原性物質の
分析を連続的に行う等、付随的な効果も生じる。

【００４５】第２に、光導波路の材料に石英以外のガラ
ス材料およびポリスチレンやポリメチルメタクリレート
などの安価なプラスチック材料を使用した場合でも、励
起光は光導波路を進行する距離が短いために、光導波路
自体からの妨害蛍光の影響が小さく、蛍光信号に含まれ
るバックグラウンドを減少することが可能である。その
結果、蛍光信号のＳ／Ｎ比が増加し、免疫分析など検査
溶液中の特定成分の定量に応用した場合にも、その検出
限界を向上させることができる。例えば実施例に示した
ように、一般に広く繁用されている光学顕微鏡用のスラ
イドグラスを使用することにより、石英などの高価な材
料を使用する必要がない。

【００４６】第３に、光導波路の端面から励起光を入射
するわけではないので、光導波路の端面における励起光
の散乱・反射が皆無であり、蛍光信号に含まれるバック
グラウンドを減少することが可能である。その結果、蛍
光信号のＳ／Ｎ比が増加し、免疫分析など検査溶液中の
特定成分の定量に応用した場合にも、その検出限界を向
上させることができる。

【００４７】第４に、光導波路の端面から励起光を入射
するわけではないので、その端面をプリズム形状やレン
ズ形状に成形する必要がなく、従って、製造コストを抑
制することができる。

【００４８】第５に、光導波路に侵入して全反射を繰り
返しながら伝播していく蛍光を検出するため、光導波路
に励起光を入射した場合にエバネッセント光がしみ出す
範囲で発生した蛍光を選択することができ、光導波路の
表面選択性を確保することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の蛍光分析装置の一実施例を示す概念図
である。

【図２】本発明の蛍光分析装置を免疫分析に応用したと
きの一実施例を示す概念図である。

【図３】従来の蛍光分析装置の概略図である。

【図４】従来の蛍光分析装置の概略図である。

【図５】従来の蛍光分析装置の概略図である。

【図６】蛍光のエバネッセントコレクションを説明する
概念図である。

【図７】本発明の蛍光分析装置の一実施例を示す組立詳
細図である。

【図８】従来の蛍光分析装置を示す組立詳細図である。

【図９】実施例の結果を示す図である。

【図１０】実施例の結果を示す図である。

【符号の説明】

１；光導波路 ２；拘束用抗体又は拘束用抗原を固定化した領域 ３；収納容器 ４；光放射源 ４ａ；キセノンフラッシュランプ ４ｂ；光学フィルター ４ｃ；光学レンズ ５；光学手段 ５ａ，５ｃ；光学レンズ ５ｂ；ダイクロイックミラー ５ｄ；光学フィルター ６；受光センサー ７；励起光 ８；蛍光 ２１；組立部品 ２２；Ｚ軸ステージ ２３ａ，２３ｂ；Ｚ軸ステージ上のテーブル ２４；接続部品 １０１；拘束用抗体 １０２；検査対象の抗原 １０３；拘束された標識抗体 １０４；拘束されなかった標識抗体 １０５；拘束された標識抗体からの光信号 １０６；拘束されなかった標識抗体からの光信号

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】固相表面上に直接又は間接的に拘束された
   蛍光物質、或いは、固相表面の近傍に位置する蛍光物質
   からの蛍光信号を検出する固相表面上の蛍光分析装置に
   おいて、分析対象である蛍光物質からの蛍光に対して透
   明な物質を材料とし、上記固相表面を提供する光導波路
   と、分析対象である蛍光物質を励起する励起光に対して
   透明な物質を材料とし、内部に上記光導波路及び分析対
   象を含むと予想される検査溶液を収容する収納容器と、
   上記蛍光物質を蛍光励起し得る波長の光を放射できる光
   放射源であって、収容容器内に収容された光導波路の主
   側面に対向する側から該面に向かって励起光を出射する
   ように配置される光放射源と、光導波路の端面から出射
   する光信号を、上記蛍光物質から放射される蛍光波長を
   選別する光学手段を介して検出するように配置され、光
   導波路に侵入して光導波路を伝播する蛍光を受光し得る
   ように配置される受光センサーから構成されていること
   を特徴とする上記装置。
2. 【請求項２】あらかじめ固相表面上に拘束用抗体又は拘
   束用抗原を固定しておき、該固相を検査溶液中の抗原性
   物質及びあらかじめ蛍光物質又は酵素を結合した標識抗
   体又は標識抗原と反応させて上記標識抗体又は標識抗原
   を固相表面上に間接的に拘束した後、拘束された標識抗
   体又は標識抗原に結合された蛍光物質或いは酵素作用に
   よって生成した蛍光物質の蛍光信号を検出することによ
   り、検査溶液中の上記抗原性物質の存在又は濃度に関す
   る物理量を分析する免疫分析装置において、上記蛍光物
   質からの蛍光に対して透明な物質を材料とし、上記固相
   表面を提供する光導波路と、分析対象である蛍光物質を
   励起する励起光に対して透明な物質を材料とし、内部に
   上記光導波路及び検査溶液を収容する収納容器と、上記
   蛍光物質を蛍光励起し得る波長の光を放射できる光放射
   源であって、収容容器内に収容された光導波路の主側面
   に対向する側から該面に向かって励起光を出射するよう
   に配置される光放射源と、光導波路の端面から出射する
   光信号を、上記蛍光物質から放射される蛍光波長を選別
   する光学手段を介して検出するように配置され、光導波
   路に侵入して光導波路を伝播する蛍光を受光し得るよう
   に配置される受光センサーから構成されていることを特
   徴とする上記装置。