JPH11243799A - 植物におけるエチレン生合成の遺伝子制御 - Google Patents
植物におけるエチレン生合成の遺伝子制御Info
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- JPH11243799A JPH11243799A JP10303075A JP30307598A JPH11243799A JP H11243799 A JPH11243799 A JP H11243799A JP 10303075 A JP10303075 A JP 10303075A JP 30307598 A JP30307598 A JP 30307598A JP H11243799 A JPH11243799 A JP H11243799A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8249—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving ethylene biosynthesis, senescence or fruit development, e.g. modified tomato ripening, cut flower shelf-life
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 エチレン生合成をコントロールする植物を構
築すること。 【解決手段】 （ｉｉａ）Ｓ−アデノシルメチオニンを
ホモセリン及び５’−メチルチオアデノシンに加水分解
する、配列番号１のアミノ酸配列で示されるタンパク質
であるＳ−アデノシルメチオニン加水分解酵素をコード
し、発現するか、または（ｉｉｂ）Ｓ−アデノシルメチ
オニン加水分解酵素を示す配列番号１のアミノ酸配列に
おいて、１または複数のアミノ酸が付加、欠失および／
または他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有し、
かつ、配列番号１のアミノ酸配列で示されるＳ−アデノ
シルメチオニン加水分解酵素と実質的に同等の酵素機能
を有するタンパク質をコードし、発現するＤＮＡ配列を
含むトランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）植物
細胞、を含むトランスジェニック植物。
築すること。 【解決手段】 （ｉｉａ）Ｓ−アデノシルメチオニンを
ホモセリン及び５’−メチルチオアデノシンに加水分解
する、配列番号１のアミノ酸配列で示されるタンパク質
であるＳ−アデノシルメチオニン加水分解酵素をコード
し、発現するか、または（ｉｉｂ）Ｓ−アデノシルメチ
オニン加水分解酵素を示す配列番号１のアミノ酸配列に
おいて、１または複数のアミノ酸が付加、欠失および／
または他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有し、
かつ、配列番号１のアミノ酸配列で示されるＳ−アデノ
シルメチオニン加水分解酵素と実質的に同等の酵素機能
を有するタンパク質をコードし、発現するＤＮＡ配列を
含むトランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）植物
細胞、を含むトランスジェニック植物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は植物におけるエチレ
ン生合成の遺伝子制御に関する。
ン生合成の遺伝子制御に関する。
【０００２】
【従来の技術】エチレンは、植物の成長及び発達の多く
の面で影響を及ぼす植物ホルモンである。全ての不飽和
炭素化合物のうちで最も簡単なこの化合物が、少量で植
物代謝、活動及び他の植物ホルモンとの相互作用を強力
に制御する。
の面で影響を及ぼす植物ホルモンである。全ての不飽和
炭素化合物のうちで最も簡単なこの化合物が、少量で植
物代謝、活動及び他の植物ホルモンとの相互作用を強力
に制御する。
【０００３】エチレンは選択された細胞群においても、
また果実、葉、又は花のような全器官においても植物の
老化を促進する。老化とは、通常植物の死に至る、遺伝
的に制御された退行性過程である。たとえ低濃度であっ
ても（エチレンは生理的条件下では気体である）、エチ
レンは植物に対して強いホルモン作用を有する。エチレ
ンの効果は、たとえそれが植物自身によって生産された
ものであっても、外部から適用されたものであっても、
多くの劇的な、そして商業的にかなり重要なものであ
る。各種の生理的作用のうちには以下のものがある： ａ．果実及び野菜における成熟の刺激 ｂ．葉の離脱 ｃ．花の色あせ ｄ．花のしおれ ｅ．葉の黄色化 ｆ．葉の上偏生長 通常は植物組織からのエチレン生産は低い。しかしなが
ら、成熟及び老化過程においては大量のエチレンが生産
される。化学物質、極端な温度、水による圧迫、紫外
線、昆虫による被害、病気、又は機械的外傷によって引
き起こされる創傷の後にも大量のエチレンが生産され
る。このような条件下において植物によって生産される
エチレンは「創傷エチレン」又は「ストレスエチレン」
と呼ばれる。果実や野菜では、切断又はきずによるエチ
レン生産の刺激は非常に大きく、貯蔵効率にかなり影響
する。エチレン誘導性の葉の褐色化がレタスやタバコを
含む多くの植物における共通の損失となっている。ある
種の組織においては、ほんの少量のエチレンにさらすだ
けで、新鮮な農産物などにおいて隣接する植物や植物組
織にエチレン生産のなだれ現象を引き起こす。この自動
触媒的効果は極めて著しく、輸送及び貯蔵中の果実の品
質を落とすことになる。
また果実、葉、又は花のような全器官においても植物の
老化を促進する。老化とは、通常植物の死に至る、遺伝
的に制御された退行性過程である。たとえ低濃度であっ
ても（エチレンは生理的条件下では気体である）、エチ
レンは植物に対して強いホルモン作用を有する。エチレ
ンの効果は、たとえそれが植物自身によって生産された
ものであっても、外部から適用されたものであっても、
多くの劇的な、そして商業的にかなり重要なものであ
る。各種の生理的作用のうちには以下のものがある： ａ．果実及び野菜における成熟の刺激 ｂ．葉の離脱 ｃ．花の色あせ ｄ．花のしおれ ｅ．葉の黄色化 ｆ．葉の上偏生長 通常は植物組織からのエチレン生産は低い。しかしなが
ら、成熟及び老化過程においては大量のエチレンが生産
される。化学物質、極端な温度、水による圧迫、紫外
線、昆虫による被害、病気、又は機械的外傷によって引
き起こされる創傷の後にも大量のエチレンが生産され
る。このような条件下において植物によって生産される
エチレンは「創傷エチレン」又は「ストレスエチレン」
と呼ばれる。果実や野菜では、切断又はきずによるエチ
レン生産の刺激は非常に大きく、貯蔵効率にかなり影響
する。エチレン誘導性の葉の褐色化がレタスやタバコを
含む多くの植物における共通の損失となっている。ある
種の組織においては、ほんの少量のエチレンにさらすだ
けで、新鮮な農産物などにおいて隣接する植物や植物組
織にエチレン生産のなだれ現象を引き起こす。この自動
触媒的効果は極めて著しく、輸送及び貯蔵中の果実の品
質を落とすことになる。
【０００４】エチレンがその影響を及ぼすメカニズムは
ついこの数年に明らかになったばかりである。多数のデ
ータから判断して、エチレンに対する各応答は、エチレ
ンリセプター部位−金属酵素を含む。エチレンとリセプ
ターとの反応が一連の生理的出来事の引き金を引く。Ｒ
ＮＡ及びタンパク質の量の顕著な増加がエチレンに応答
して起きる。セルラーゼ、α−アミラーゼやインベルタ
ーゼのようないくつかの酵素のレベルもエチレンに応答
して増加することが認められた。
ついこの数年に明らかになったばかりである。多数のデ
ータから判断して、エチレンに対する各応答は、エチレ
ンリセプター部位−金属酵素を含む。エチレンとリセプ
ターとの反応が一連の生理的出来事の引き金を引く。Ｒ
ＮＡ及びタンパク質の量の顕著な増加がエチレンに応答
して起きる。セルラーゼ、α−アミラーゼやインベルタ
ーゼのようないくつかの酵素のレベルもエチレンに応答
して増加することが認められた。
【０００５】収穫後の貯蔵寿命に特に向けられた現存の
技術はもう数十年来のものであり、高コスト、副作用、
及びエチレン生産を完全に断ち切ることができないなど
の問題点によって制限されてきた。このような技術に
は、制御雰囲気（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｔｍｏｓｐ
ｈｅｒｅ：ＣＡ）、化学的処置、パッケージング、及び
照射が含まれる。
技術はもう数十年来のものであり、高コスト、副作用、
及びエチレン生産を完全に断ち切ることができないなど
の問題点によって制限されてきた。このような技術に
は、制御雰囲気（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｔｍｏｓｐ
ｈｅｒｅ：ＣＡ）、化学的処置、パッケージング、及び
照射が含まれる。
【０００６】ＣＡ施設は（１）低温、（２）酸素レベル
を３％以下に減少する、及び（３）貯蔵領域の二酸化炭
素レベルを３％〜５％に上げる、ことによってエチレン
生合成を遅らせる。大気中に既に排出されたエチレンを
減少するために高価なガス洗浄装置が加えられることも
ある。この方法の欠点は、ＣＡ施設の建設が高価なこ
と、使用コストが高いこと、及びエチレン生産と副作用
を完全に排除することができないことである。また、Ｃ
Ａ貯蔵法は外部エチレンを制御することができるだけ
で、植物組織中に存在するエチレンを制御することがで
きない。ＣＡ貯蔵はまた好ましくない副作用をもたら
す。高ＣＯレベル、低Ｏレベル、又は低温のために障害
が起こり得る。
を３％以下に減少する、及び（３）貯蔵領域の二酸化炭
素レベルを３％〜５％に上げる、ことによってエチレン
生合成を遅らせる。大気中に既に排出されたエチレンを
減少するために高価なガス洗浄装置が加えられることも
ある。この方法の欠点は、ＣＡ施設の建設が高価なこ
と、使用コストが高いこと、及びエチレン生産と副作用
を完全に排除することができないことである。また、Ｃ
Ａ貯蔵法は外部エチレンを制御することができるだけ
で、植物組織中に存在するエチレンを制御することがで
きない。ＣＡ貯蔵はまた好ましくない副作用をもたら
す。高ＣＯレベル、低Ｏレベル、又は低温のために障害
が起こり得る。
【０００７】別のアプローチは化学的処置によって植物
組織内でのエチレン生合成を制限することである。抗生
物質リゾビトキシン（ｒｈｉｚｏｂｉｔｏｘｉｎｅ）の
類似体であるアミノエトキシビニルグリシン（ＡＶＧ）
がこのような阻害剤である。チオ硫酸銀（ＳＴＳ）もま
た果実の成熟と花の色あせを遅らせるのに効果的である
が、毒性であり、食物には使えない。ＳＴＳはある種の
花にのみ有効であり、しばしば黒点を生じる。
組織内でのエチレン生合成を制限することである。抗生
物質リゾビトキシン（ｒｈｉｚｏｂｉｔｏｘｉｎｅ）の
類似体であるアミノエトキシビニルグリシン（ＡＶＧ）
がこのような阻害剤である。チオ硫酸銀（ＳＴＳ）もま
た果実の成熟と花の色あせを遅らせるのに効果的である
が、毒性であり、食物には使えない。ＳＴＳはある種の
花にのみ有効であり、しばしば黒点を生じる。
【０００８】アミノ酸であるメチオニンが植物組織内で
のエチレンの前駆体であることが示されている。しかし
ながら、メチオニンは直接の前駆体ではなく、まず最初
にスルフォニウム化合物Ｓ−アデノシルメチオニン（Ａ
ｄｏＭｅｔ）に変換され、次いで１−アミノシクロプロ
パン−１カルボン酸（ＡＣＣ）となり、次いでエチレン
に変換されなければならない。以下に示す代謝反応（図
１も参照されたい）が、正常状態及びストレス状態のい
ずれにおいても、メチオニンからエチレンヘの合成を示
すものとして受け入れられている： メチオニン→ＡｄｏＭｅｔ→ＡＣＣ→エチレン。
のエチレンの前駆体であることが示されている。しかし
ながら、メチオニンは直接の前駆体ではなく、まず最初
にスルフォニウム化合物Ｓ−アデノシルメチオニン（Ａ
ｄｏＭｅｔ）に変換され、次いで１−アミノシクロプロ
パン−１カルボン酸（ＡＣＣ）となり、次いでエチレン
に変換されなければならない。以下に示す代謝反応（図
１も参照されたい）が、正常状態及びストレス状態のい
ずれにおいても、メチオニンからエチレンヘの合成を示
すものとして受け入れられている： メチオニン→ＡｄｏＭｅｔ→ＡＣＣ→エチレン。
【０００９】成熟直前の最大呼吸値に至る前のある種の
果実組織を除いて、ＡＣＣのエチレンヘの変換系はほと
んどの植物組織において本質的であるように思われる。
ＡＣＣ合成酵素はＡｄｏＭｅｔをＡＣＣと５’−メチル
チオアデノシン（ＭＴＡ）とに分解するのを触媒する。
この酵素反応がエチレン形成の律速段階であるように思
われる。ＡｄｏＭｅｔはメチオニンとアデノシン三リン
酸（ＡＴＰ）との縮合反応を介して合成される。Ａｄｏ
Ｍｅｔ合成の速度をコントロールすることによってＡｄ
ｏＭｅｔのレベルを制御する試みは、主として３つの異
なる遺伝子によってコードされる少なくとも３つの異な
るＡｄｏＭｅｔ合成酵素が存在するように思われること
によって失敗に終わった。更に、ＡｄｏＭｅｔ合成の既
知の生化学的阻害剤が哺乳動物細胞には極めて毒性であ
る。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「高等植物におけるエチ
レン生合成とその制御」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ３５：１５５−１８９， １９８
４； Ｖｅｅｎ ｅｔａｌ．， ＳｃｉＨｏｒｔｉｃ，
１８：２７７−２８６； Ｓｉｓｌｅｒ ｅｔａｌ．，
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ６３：１１４−１
２０； 及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ８９；４３４−４３８。
果実組織を除いて、ＡＣＣのエチレンヘの変換系はほと
んどの植物組織において本質的であるように思われる。
ＡＣＣ合成酵素はＡｄｏＭｅｔをＡＣＣと５’−メチル
チオアデノシン（ＭＴＡ）とに分解するのを触媒する。
この酵素反応がエチレン形成の律速段階であるように思
われる。ＡｄｏＭｅｔはメチオニンとアデノシン三リン
酸（ＡＴＰ）との縮合反応を介して合成される。Ａｄｏ
Ｍｅｔ合成の速度をコントロールすることによってＡｄ
ｏＭｅｔのレベルを制御する試みは、主として３つの異
なる遺伝子によってコードされる少なくとも３つの異な
るＡｄｏＭｅｔ合成酵素が存在するように思われること
によって失敗に終わった。更に、ＡｄｏＭｅｔ合成の既
知の生化学的阻害剤が哺乳動物細胞には極めて毒性であ
る。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「高等植物におけるエチ
レン生合成とその制御」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ３５：１５５−１８９， １９８
４； Ｖｅｅｎ ｅｔａｌ．， ＳｃｉＨｏｒｔｉｃ，
１８：２７７−２８６； Ｓｉｓｌｅｒ ｅｔａｌ．，
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ６３：１１４−１
２０； 及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ８９；４３４−４３８。
【００１０】植物組織は長期間に渡ってエチレン生産の
実質的速度を維持することが知られているが、そのメチ
オニンレベルは非常に低いことが知られている。エチレ
ン生産を続けるためには、ＭＴＡ中に含まれる硫黄がメ
チオニンヘと再循環されて、連続的なエチレン生産のた
めにメチオニンを適度に供給しなければならない。この
経路が植物組織中に存在することが最近明らかになった
（図１ｃ参照）。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“高等植物
におけるエチレン生合成とその制御”、Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ３５：１５５−
１８９，１９８４も参照されたい。ＭＴＡがＡＣＣ合成
酵素の強力な阻害剤であるという知見に照らして、ＭＴ
Ａの分解が重要性を増してきた。この経路はエチレン生
合成のためのメチオニン供給を単に維持するものであっ
て、メチオニン合成の全体の増加をもたらすものではな
いという点に注意すべきである。
実質的速度を維持することが知られているが、そのメチ
オニンレベルは非常に低いことが知られている。エチレ
ン生産を続けるためには、ＭＴＡ中に含まれる硫黄がメ
チオニンヘと再循環されて、連続的なエチレン生産のた
めにメチオニンを適度に供給しなければならない。この
経路が植物組織中に存在することが最近明らかになった
（図１ｃ参照）。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“高等植物
におけるエチレン生合成とその制御”、Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ３５：１５５−
１８９，１９８４も参照されたい。ＭＴＡがＡＣＣ合成
酵素の強力な阻害剤であるという知見に照らして、ＭＴ
Ａの分解が重要性を増してきた。この経路はエチレン生
合成のためのメチオニン供給を単に維持するものであっ
て、メチオニン合成の全体の増加をもたらすものではな
いという点に注意すべきである。
【００１１】大腸菌バクテリオファージＴ３によってコ
ードされる酵素が、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ａｄｏ
Ｍｅｔ）をホモセリンと５’−メチルチオアデノシン
（ＭＴＡ）とに加水分解する。この酵素はその推奨され
る名前であるＡｄｏＭｅｔ加水分解酵素（ＡｄｏＭｅｔ
ａｓｅ）、又は別の名前であるＳ−アデノシルメチオニ
ン開裂酵素（ＳＡＭａｓｅ）として知られている。Ｓｔ
ｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，「バクテリオファージＴ３
のＳＡＭａｓｅ遺伝子が宿主制限克服の任務を担う」、
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９：１
３５−１４５，１９７６ を参照されたい。この反応の
いずれの生産物もメチオニンに再循環され；図１で既に
示したＭＴＡ及びホモセリンが、代謝経路を介して植物
組織内に存在していることが知られている。ＡｄｏＭｅ
ｔａｓｅ遺伝子は同定され、単離され、クローン化さ
れ、そして配列化されている。Ｊ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓ
ｅｔａｌ．，「クローン化コリファージＴ３ Ｓ−アデ
ノシルメチオニン遺伝子が大腸菌におけるＤＮＡメチル
化及びポリアミン生合成を阻害する」、Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．，１６９：３６２５−３６３２， １９８７ 及び
Ｊ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓｅｔ ａｌ．，「コリファージ
Ｔ３ Ｓ−アデノシルメチオニンのヌクレオチド配列
と分析、及びその周囲のリボヌクレアーゼＩＩＩプロセ
ッシング部位」、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １
５：７１７−７２９，１９８７を参照されたい。この遺
伝子は、１７１０５及び１３９７８ダルトンのポリペプ
チドを特定する２個のフレーム内読み取り配列を含む。
いずれのポリペプチドも同じオーカー（ｏｃｈｒｅ）コ
ドンで終止する。この結果、長い方のポリペプチドのカ
ルボキシル末端から出発する１７ｋｄのポリペプチドと
８２％相同である１４ｋｄのポリペプチドを生じる。い
ずれのポリペプチドも、Ｔ３バクテリオファージに感染
した細胞から、及びクローン化遺伝子を発現する大腸菌
からの活性ＡｄｏＭｅｔａｓｅの部分精製調製物中に存
在する。Ｊ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，「コリ
ファージＴ３ Ｓ−アデノシルメチオニンハイドロラー
ゼ遺伝子のヌクレオチド配列と分析、及びその周囲のリ
ボヌクレアーゼＩＩＩプロセッシング部位」、Ｎｕｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５：７１７−７２９， １
９８７及び Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，
「バクテリオファージＴ３のＳＡＭａｓｅ遺伝子が宿主
制限克服の任務を担う」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．， １９：
１３５−１４５，１９７６ を参照されたい。
ードされる酵素が、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ａｄｏ
Ｍｅｔ）をホモセリンと５’−メチルチオアデノシン
（ＭＴＡ）とに加水分解する。この酵素はその推奨され
る名前であるＡｄｏＭｅｔ加水分解酵素（ＡｄｏＭｅｔ
ａｓｅ）、又は別の名前であるＳ−アデノシルメチオニ
ン開裂酵素（ＳＡＭａｓｅ）として知られている。Ｓｔ
ｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，「バクテリオファージＴ３
のＳＡＭａｓｅ遺伝子が宿主制限克服の任務を担う」、
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９：１
３５−１４５，１９７６ を参照されたい。この反応の
いずれの生産物もメチオニンに再循環され；図１で既に
示したＭＴＡ及びホモセリンが、代謝経路を介して植物
組織内に存在していることが知られている。ＡｄｏＭｅ
ｔａｓｅ遺伝子は同定され、単離され、クローン化さ
れ、そして配列化されている。Ｊ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓ
ｅｔａｌ．，「クローン化コリファージＴ３ Ｓ−アデ
ノシルメチオニン遺伝子が大腸菌におけるＤＮＡメチル
化及びポリアミン生合成を阻害する」、Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．，１６９：３６２５−３６３２， １９８７ 及び
Ｊ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓｅｔ ａｌ．，「コリファージ
Ｔ３ Ｓ−アデノシルメチオニンのヌクレオチド配列
と分析、及びその周囲のリボヌクレアーゼＩＩＩプロセ
ッシング部位」、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １
５：７１７−７２９，１９８７を参照されたい。この遺
伝子は、１７１０５及び１３９７８ダルトンのポリペプ
チドを特定する２個のフレーム内読み取り配列を含む。
いずれのポリペプチドも同じオーカー（ｏｃｈｒｅ）コ
ドンで終止する。この結果、長い方のポリペプチドのカ
ルボキシル末端から出発する１７ｋｄのポリペプチドと
８２％相同である１４ｋｄのポリペプチドを生じる。い
ずれのポリペプチドも、Ｔ３バクテリオファージに感染
した細胞から、及びクローン化遺伝子を発現する大腸菌
からの活性ＡｄｏＭｅｔａｓｅの部分精製調製物中に存
在する。Ｊ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，「コリ
ファージＴ３ Ｓ−アデノシルメチオニンハイドロラー
ゼ遺伝子のヌクレオチド配列と分析、及びその周囲のリ
ボヌクレアーゼＩＩＩプロセッシング部位」、Ｎｕｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５：７１７−７２９， １
９８７及び Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，
「バクテリオファージＴ３のＳＡＭａｓｅ遺伝子が宿主
制限克服の任務を担う」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．， １９：
１３５−１４５，１９７６ を参照されたい。
【００１２】ＡｄｏＭｅｔａｓｅ又はＳＡＭａｓｅをコ
ードするその他のバクテリオファージは、コリファージ
ＢＡ１４、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ファ
ージＫ１１、及びセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）ファー
ジＩＶである。Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ，「コリフ
ァージＢＡ１４：ファージＴ７の新規近縁種」、Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．， ６２：３３１−３４１，１９８
２； Ｒ．Ｈａｕｓｍａｎ， Ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｐｈａｇｅｓ， １：２７９−２８３，１９８８，
Ｒ．Ｃａｌｅｎｄｅｒ（ｅｄ．）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐ
ｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； 及び Ｋ．Ｈ．Ｋｏ
ｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， 「ファージＴ７に形態的
に類似する非コリファージの系統発生的関係への基準と
しての感染戦略」Ｊ．Ｂｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．， ４３：
５７−７３，１９７９ を参照されたい。
ードするその他のバクテリオファージは、コリファージ
ＢＡ１４、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ファ
ージＫ１１、及びセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）ファー
ジＩＶである。Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ，「コリフ
ァージＢＡ１４：ファージＴ７の新規近縁種」、Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．， ６２：３３１−３４１，１９８
２； Ｒ．Ｈａｕｓｍａｎ， Ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｐｈａｇｅｓ， １：２７９−２８３，１９８８，
Ｒ．Ｃａｌｅｎｄｅｒ（ｅｄ．）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐ
ｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； 及び Ｋ．Ｈ．Ｋｏ
ｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， 「ファージＴ７に形態的
に類似する非コリファージの系統発生的関係への基準と
しての感染戦略」Ｊ．Ｂｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．， ４３：
５７−７３，１９７９ を参照されたい。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、エチレン生
合成をコントロールする植物の構築を目的とする。
合成をコントロールする植物の構築を目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明により、植物中に
おけるエチレン生合成をコントロールする方法が提供さ
れる。この方法は、植物プロモーターのコントロール下
に抗生物質耐性をコードする選択遺伝子と、図６で定義
される機能性異種ポリペプチド、又は図６のポリペプチ
ドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭ
ｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチドのためのコド
ンからなるＤＮＡ挿入物、とを含むベクターを提供し、
ここで該ＤＮＡ挿入物は一方で植物プロモーターと隣り
合っており、他方でポリＡシグナル配列と隣り合ってい
る；そして該ベクターで植物宿主を形質転換し、これに
よって形質転換された植物宿主はコントロール領域のコ
ントロール下に、図６で定義される異種ポリペプチド、
又は図６のポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と
実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリ
ペプチドを発現することができる、ことを含む。
おけるエチレン生合成をコントロールする方法が提供さ
れる。この方法は、植物プロモーターのコントロール下
に抗生物質耐性をコードする選択遺伝子と、図６で定義
される機能性異種ポリペプチド、又は図６のポリペプチ
ドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭ
ｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチドのためのコド
ンからなるＤＮＡ挿入物、とを含むベクターを提供し、
ここで該ＤＮＡ挿入物は一方で植物プロモーターと隣り
合っており、他方でポリＡシグナル配列と隣り合ってい
る；そして該ベクターで植物宿主を形質転換し、これに
よって形質転換された植物宿主はコントロール領域のコ
ントロール下に、図６で定義される異種ポリペプチド、
又は図６のポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と
実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリ
ペプチドを発現することができる、ことを含む。
【００１５】１つの実施態様では、植物宿主の形質転換
は、直接形質転換、電気穿孔、マイクロインジェクショ
ン、及びマイクロプロジェクタイルボンバードメントか
らなる群から選択される方法によって実施され得る。
は、直接形質転換、電気穿孔、マイクロインジェクショ
ン、及びマイクロプロジェクタイルボンバードメントか
らなる群から選択される方法によって実施され得る。
【００１６】好ましい実施態様では、植物宿主の形質転
換は、二元系ベクター又は三分節系ベクターを用いる直
接形質転換法によって実施され得る。
換は、二元系ベクター又は三分節系ベクターを用いる直
接形質転換法によって実施され得る。
【００１７】さらに好ましい実施態様では、二元系ベク
ターは、（ａ）「Ｔ−ＤＮＡのない」Ｔｉプラスミド、
（ｂ）Ｔ−ＤＮＡ境界、植物プロモーターのコントロー
ル下にある選択遺伝子、及び一方で植物プロモーターと
隣り合っており、他方でポリＡシグナル配列と隣り合っ
ている、図６で定義される機能性異種ポリペプチド、又
は図６のポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実
質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペ
プチドのためのコドンからなるＤＮＡ挿入物、ここでこ
れによって形質転換された該植物宿主はコントロール領
域のコントロール下に、図６で定義される異種ポリペプ
チド、又は図６のポリペプチドと実質的に同じアミノ酸
配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異
種ポリペプチドを発現することができる、ような該ＤＮ
Ａ挿入物を含む広い宿主域プラスミドからなり得る。
ターは、（ａ）「Ｔ−ＤＮＡのない」Ｔｉプラスミド、
（ｂ）Ｔ−ＤＮＡ境界、植物プロモーターのコントロー
ル下にある選択遺伝子、及び一方で植物プロモーターと
隣り合っており、他方でポリＡシグナル配列と隣り合っ
ている、図６で定義される機能性異種ポリペプチド、又
は図６のポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実
質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペ
プチドのためのコドンからなるＤＮＡ挿入物、ここでこ
れによって形質転換された該植物宿主はコントロール領
域のコントロール下に、図６で定義される異種ポリペプ
チド、又は図６のポリペプチドと実質的に同じアミノ酸
配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異
種ポリペプチドを発現することができる、ような該ＤＮ
Ａ挿入物を含む広い宿主域プラスミドからなり得る。
【００１８】さらにより好ましい実施態様では、この方
法は、該二元系ベクターを有する微生物宿主を提供する
工程を更に含み得、ここで該微生物宿主は植物宿主を形
質転換することができる。微生物宿主はバクテリアであ
り得る。選択遺伝子はカナマイシン耐性をコードし得
る。植物プロモーターは構成性（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉ
ｖｅ）ノパリン合成酵素プロモーター、または構成性
（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）発現プロモーターであり
得る。構成性発現プロモーターはカリフラワーモザイク
ウィルスプロモーターであり得る。
法は、該二元系ベクターを有する微生物宿主を提供する
工程を更に含み得、ここで該微生物宿主は植物宿主を形
質転換することができる。微生物宿主はバクテリアであ
り得る。選択遺伝子はカナマイシン耐性をコードし得
る。植物プロモーターは構成性（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉ
ｖｅ）ノパリン合成酵素プロモーター、または構成性
（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）発現プロモーターであり
得る。構成性発現プロモーターはカリフラワーモザイク
ウィルスプロモーターであり得る。
【００１９】別の実施態様において、図６で定義される
ポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に同じ
アミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を
有する異種ポリペプチド、をコードする該コドンは、大
腸菌バクテリオファージＴ３、コリファージＢＡ１４、
クレブシエラファージＫ１１、及びセラチアファージＩ
Ｖからなる群から選択されるバクテリオファージに由来
するものであり得る。バクテリオファージは大腸菌バク
テリオファージＴ３であり得る。図６で定義されるポリ
ペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に同じアミ
ノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有す
る異種ポリペプチド、をコードする該コドンは植物にお
ける翻訳効率を増加するように修飾され得る。
ポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に同じ
アミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を
有する異種ポリペプチド、をコードする該コドンは、大
腸菌バクテリオファージＴ３、コリファージＢＡ１４、
クレブシエラファージＫ１１、及びセラチアファージＩ
Ｖからなる群から選択されるバクテリオファージに由来
するものであり得る。バクテリオファージは大腸菌バク
テリオファージＴ３であり得る。図６で定義されるポリ
ペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に同じアミ
ノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有す
る異種ポリペプチド、をコードする該コドンは植物にお
ける翻訳効率を増加するように修飾され得る。
【００２０】別のより好ましい実施態様において、三分
節系ベクターは、（ａ）「Ｔ−ＤＮＡのない」Ｔｉプラ
スミド、（ｂ）クローン化ｖｉｒＧ遺伝子を含む、広い
宿主域Ｐ不和合性群プラスミド、及び（ｃ）Ｔ−ＤＮＡ
境界、植物プロモーターのコントロール下にある選択遺
伝子、及び一方で植物プロモーターと隣り合っており、
他方でポリＡシグナル配列と隣り合っている、図６で定
義される機能性異種ポリペプチド、又は図６のポリペプ
チドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏ
Ｍｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチドのためのコ
ドンからなるＤＮＡ挿入物、ここでこれによって形質転
換された該植物宿主はコントロール領域のコントロール
下に、図６で定義される異種ポリペプチド、又は図６の
ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同
じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチドを
発現することができる、ような該ＤＮＡ挿入物を含む広
い宿主域プラスミドからなり得る。この方法は、該三分
節系ベクターを有する微生物宿主を提供する工程を更に
含み得、ここで該微生物宿主は植物宿主を形質転換する
ことができる。図６で定義されるポリペプチド、又は図
６のポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的
に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチ
ド、をコードする該コドンは、大腸菌バクテリオファー
ジＴ３、コリファージＢＡ１４、クレブシエラファージ
Ｋ１１、及びセラチアファージＩＶからなる群から選択
されるバクテリオファージに由来するものであり得る。
バクテリオファージは大腸菌バクテリオファージＴ３で
あり得る。図６で定義されるポリペプチド、又は図６の
ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同
じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチド、
をコードする該コドンは、真核生物における翻訳効率を
増加するように修飾され得る。選択遺伝子は、カナマイ
シン耐性をコードし得る。植物プロモーターは、構成性
ノパリン合成酵素プロモーター、または構成性発現プロ
モーターであり得る。構成性発現プロモーターは、カリ
フラワーモザイクウィルスプロモーターであり得る。植
物宿主は、ニコチアナ・タバカムＬ．ｃｖ．ウィスコン
シンであり得る。微生物宿主はバクテリアであり得る。
節系ベクターは、（ａ）「Ｔ−ＤＮＡのない」Ｔｉプラ
スミド、（ｂ）クローン化ｖｉｒＧ遺伝子を含む、広い
宿主域Ｐ不和合性群プラスミド、及び（ｃ）Ｔ−ＤＮＡ
境界、植物プロモーターのコントロール下にある選択遺
伝子、及び一方で植物プロモーターと隣り合っており、
他方でポリＡシグナル配列と隣り合っている、図６で定
義される機能性異種ポリペプチド、又は図６のポリペプ
チドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏ
Ｍｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチドのためのコ
ドンからなるＤＮＡ挿入物、ここでこれによって形質転
換された該植物宿主はコントロール領域のコントロール
下に、図６で定義される異種ポリペプチド、又は図６の
ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同
じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチドを
発現することができる、ような該ＤＮＡ挿入物を含む広
い宿主域プラスミドからなり得る。この方法は、該三分
節系ベクターを有する微生物宿主を提供する工程を更に
含み得、ここで該微生物宿主は植物宿主を形質転換する
ことができる。図６で定義されるポリペプチド、又は図
６のポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的
に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチ
ド、をコードする該コドンは、大腸菌バクテリオファー
ジＴ３、コリファージＢＡ１４、クレブシエラファージ
Ｋ１１、及びセラチアファージＩＶからなる群から選択
されるバクテリオファージに由来するものであり得る。
バクテリオファージは大腸菌バクテリオファージＴ３で
あり得る。図６で定義されるポリペプチド、又は図６の
ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同
じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチド、
をコードする該コドンは、真核生物における翻訳効率を
増加するように修飾され得る。選択遺伝子は、カナマイ
シン耐性をコードし得る。植物プロモーターは、構成性
ノパリン合成酵素プロモーター、または構成性発現プロ
モーターであり得る。構成性発現プロモーターは、カリ
フラワーモザイクウィルスプロモーターであり得る。植
物宿主は、ニコチアナ・タバカムＬ．ｃｖ．ウィスコン
シンであり得る。微生物宿主はバクテリアであり得る。
【００２１】さらに別の実施態様において、本発明の方
法は、電気穿孔、マイクロインジェクション、又はマイ
クロプロジェクタイルボンバードメントによる形質転換
がベクターを用い、該ベクターが、植物プロモーターの
コントロール下にある選択遺伝子、および一方で植物プ
ロモーターと隣り合っており、他方でポリＡシグナル配
列と隣り合っている、図６で定義される機能性異種ポリ
ペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に同じアミ
ノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有す
る異種ポリペプチドのためのコドンからなるＤＮＡ挿入
物、ここでこれによって形質転換された該植物宿主はコ
ントロール領域のコントロール下に、図６で定義される
異種ポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に
同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活
性を有する異種ポリペプチドを発現することができる、
ような該ＤＮＡ挿入物、からなり得る。
法は、電気穿孔、マイクロインジェクション、又はマイ
クロプロジェクタイルボンバードメントによる形質転換
がベクターを用い、該ベクターが、植物プロモーターの
コントロール下にある選択遺伝子、および一方で植物プ
ロモーターと隣り合っており、他方でポリＡシグナル配
列と隣り合っている、図６で定義される機能性異種ポリ
ペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に同じアミ
ノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有す
る異種ポリペプチドのためのコドンからなるＤＮＡ挿入
物、ここでこれによって形質転換された該植物宿主はコ
ントロール領域のコントロール下に、図６で定義される
異種ポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に
同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活
性を有する異種ポリペプチドを発現することができる、
ような該ＤＮＡ挿入物、からなり得る。
【００２２】好ましい実施態様において、図６で定義さ
れるポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に
同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活
性を有する異種ポリペプチド、をコードする該コドン
が、大腸菌バクテリオファージＴ３、コリファージＢＡ
１４、クレブシエラファージＫ１１、及びセラチアファ
ージＩＶからなる群から選択されるバクテリオファージ
に由来するものであり得る。バクテリオファージは、大
腸菌バクテリオファージＴ３であり得る。図６で定義さ
れるポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に
同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活
性を有する異種ポリペプチド、をコードする該コドン
は、真核生物における翻訳効率を増加するように修飾さ
れ得る。選択遺伝子は、カナマイシン耐性をコードし得
る。植物プロモーターは、構成性ノパリン合成酵素プロ
モーター、または構成性発現プロモーターであり得る。
構成性発現プロモーターは、カリフラワーモザイクウィ
ルスプロモーターであり得る。植物宿主は、ニコチアナ
・タバカムＬ．ｃｖ．ウィスコンシンであり得る。
れるポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に
同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活
性を有する異種ポリペプチド、をコードする該コドン
が、大腸菌バクテリオファージＴ３、コリファージＢＡ
１４、クレブシエラファージＫ１１、及びセラチアファ
ージＩＶからなる群から選択されるバクテリオファージ
に由来するものであり得る。バクテリオファージは、大
腸菌バクテリオファージＴ３であり得る。図６で定義さ
れるポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に
同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活
性を有する異種ポリペプチド、をコードする該コドン
は、真核生物における翻訳効率を増加するように修飾さ
れ得る。選択遺伝子は、カナマイシン耐性をコードし得
る。植物プロモーターは、構成性ノパリン合成酵素プロ
モーター、または構成性発現プロモーターであり得る。
構成性発現プロモーターは、カリフラワーモザイクウィ
ルスプロモーターであり得る。植物宿主は、ニコチアナ
・タバカムＬ．ｃｖ．ウィスコンシンであり得る。
【００２３】本発明によれば、植物宿主の形質転換に用
い得るベクターが提供される。このベクターは、植物プ
ロモーターのコントロール下にある選択遺伝子、及び一
方で植物プロモーターと隣り合っており、他方でポリＡ
シグナル配列と隣り合っている、図６で定義される機能
性異種ポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的
に同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ
活性を有する異種ポリペプチドのためのコドンからなる
ＤＮＡ挿入物、ここでこれによって形質転換された該植
物宿主はコントロール領域のコントロール下に、図６で
定義される異種ポリペプチド、又は図６のポリペプチド
と実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅ
ｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチドを発現すること
ができる、ような該ＤＮＡ挿入物を含み得る。
い得るベクターが提供される。このベクターは、植物プ
ロモーターのコントロール下にある選択遺伝子、及び一
方で植物プロモーターと隣り合っており、他方でポリＡ
シグナル配列と隣り合っている、図６で定義される機能
性異種ポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的
に同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ
活性を有する異種ポリペプチドのためのコドンからなる
ＤＮＡ挿入物、ここでこれによって形質転換された該植
物宿主はコントロール領域のコントロール下に、図６で
定義される異種ポリペプチド、又は図６のポリペプチド
と実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅ
ｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチドを発現すること
ができる、ような該ＤＮＡ挿入物を含み得る。
【００２４】本発明によれば、植物宿主の形質転換に用
い得る二元系ベクターが提供される。このベクターは、
（ａ）「Ｔ−ＤＮＡのない」Ｔｉプラスミド、（ｂ）Ｔ
−ＤＮＡ境界、植物プロモーターのコントロール下にあ
る選択遺伝子、及び一方で植物プロモーターと隣り合っ
ており、他方でポリＡシグナル配列と隣り合っている、
図６で定義される機能性異種ポリペプチド、又は図６の
ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同
じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチドの
ためのコドンからなるＤＮＡ挿入物、ここでこれによっ
て形質転換された該植物宿主はコントロール領域のコン
トロール下に、図６で定義される異種ポリペプチド、又
は図６のポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実
質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペ
プチドを発現することができる、ような該ＤＮＡ挿入物
を含む広い宿主域プラスミドを含み得る。
い得る二元系ベクターが提供される。このベクターは、
（ａ）「Ｔ−ＤＮＡのない」Ｔｉプラスミド、（ｂ）Ｔ
−ＤＮＡ境界、植物プロモーターのコントロール下にあ
る選択遺伝子、及び一方で植物プロモーターと隣り合っ
ており、他方でポリＡシグナル配列と隣り合っている、
図６で定義される機能性異種ポリペプチド、又は図６の
ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同
じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチドの
ためのコドンからなるＤＮＡ挿入物、ここでこれによっ
て形質転換された該植物宿主はコントロール領域のコン
トロール下に、図６で定義される異種ポリペプチド、又
は図６のポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実
質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペ
プチドを発現することができる、ような該ＤＮＡ挿入物
を含む広い宿主域プラスミドを含み得る。
【００２５】１つの実施態様において、このベクターに
おいて、図６で定義されるポリペプチド、又は図６のポ
リペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同じ
ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチド、を
コードする該コドンは、大腸菌バクテリオファージＴ
３、コリファージＢＡ１４、クレブシエラファージＫ１
１、及びセラチアファージＩＶからなる群から選択され
るバクテリオファージに由来するものであり得る。バク
テリオファージは、大腸菌バクテリオファージＴ３であ
り得る。図６で定義されるポリペプチド、又は図６のポ
リペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同じ
ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチド、を
コードする該コドンは、真核生物における翻訳効率を増
加するように修飾され得る。選択遺伝子は、カナマイシ
ン耐性をコードし得る。植物プロモーターは、構成性ノ
パリン合成酵素プロモーター、または構成性発現プロモ
ーターであり得る。構成性発現プロモーターは、カリフ
ラワーモザイクウィルスプロモーターであり得る。植物
宿主は、ニコチアナ・タバカムＬ．ｃｖ．ウィスコンシ
ンであり得る 本発明によれば、植物宿主を形質転換することのでき
る、上記の二元系ベクターを含む微生物宿主が提供され
る。１つの実施態様において、微生物宿主は、バクテリ
アであり得る。このバクテリアは、アグロバクテリウム
・ツメファシエンスであり得る。これは、アグロバクテ
リウム・ツメファシエンスＰＣ２７６０／ｐＢｌ１２１
−ＡｄｏＭｅｔａｓｅ株、アクロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスＰＣ２７６０／ｐＢｌ１２１−ＳＡＭ−Ｋ
株、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンスＰＣ
２７６０／ｐＧＡ４８２−ＮＯＳ−ＳＡＭであり得る。
おいて、図６で定義されるポリペプチド、又は図６のポ
リペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同じ
ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチド、を
コードする該コドンは、大腸菌バクテリオファージＴ
３、コリファージＢＡ１４、クレブシエラファージＫ１
１、及びセラチアファージＩＶからなる群から選択され
るバクテリオファージに由来するものであり得る。バク
テリオファージは、大腸菌バクテリオファージＴ３であ
り得る。図６で定義されるポリペプチド、又は図６のポ
リペプチドと実質的に同じアミノ酸配列と実質的に同じ
ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する異種ポリペプチド、を
コードする該コドンは、真核生物における翻訳効率を増
加するように修飾され得る。選択遺伝子は、カナマイシ
ン耐性をコードし得る。植物プロモーターは、構成性ノ
パリン合成酵素プロモーター、または構成性発現プロモ
ーターであり得る。構成性発現プロモーターは、カリフ
ラワーモザイクウィルスプロモーターであり得る。植物
宿主は、ニコチアナ・タバカムＬ．ｃｖ．ウィスコンシ
ンであり得る 本発明によれば、植物宿主を形質転換することのでき
る、上記の二元系ベクターを含む微生物宿主が提供され
る。１つの実施態様において、微生物宿主は、バクテリ
アであり得る。このバクテリアは、アグロバクテリウム
・ツメファシエンスであり得る。これは、アグロバクテ
リウム・ツメファシエンスＰＣ２７６０／ｐＢｌ１２１
−ＡｄｏＭｅｔａｓｅ株、アクロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスＰＣ２７６０／ｐＢｌ１２１−ＳＡＭ−Ｋ
株、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンスＰＣ
２７６０／ｐＧＡ４８２−ＮＯＳ−ＳＡＭであり得る。
【００２６】本発明によれば、植物宿主の形質転換に用
い得る三分節系ベクターが提供される。このベクター
は、（ａ）「Ｔ−ＤＮＡのない」Ｔｉプラスミド、
（ｂ）クローン化ｖｉｒＧ遺伝子を含む、広い宿主域Ｐ
不和合性（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）群プラス
ミド、及び（ｃ）Ｔ−ＤＮＡ境界、植物プロモーターの
コントロール下にある選択遺伝子、及び一方で植物プロ
モーターと隣り合っており、他方でポリＡシグナル配列
と隣り合っている、図６で定義される機能性異種ポリペ
プチド、又は図６のポリペプチドと実質的に同じアミノ
酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する
異種ポリペプチドのためのコドンからなるＤＮＡ挿入
物、ここでこれによって形質転換された該植物宿主はコ
ントロール領域のコントロール下に、図６で定義される
異種ポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に
同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活
性を有する異種ポリペプチドを発現することができる、
ような該ＤＮＡ挿入物を含む広い宿主域プラスミドを含
み得る。
い得る三分節系ベクターが提供される。このベクター
は、（ａ）「Ｔ−ＤＮＡのない」Ｔｉプラスミド、
（ｂ）クローン化ｖｉｒＧ遺伝子を含む、広い宿主域Ｐ
不和合性（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）群プラス
ミド、及び（ｃ）Ｔ−ＤＮＡ境界、植物プロモーターの
コントロール下にある選択遺伝子、及び一方で植物プロ
モーターと隣り合っており、他方でポリＡシグナル配列
と隣り合っている、図６で定義される機能性異種ポリペ
プチド、又は図６のポリペプチドと実質的に同じアミノ
酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する
異種ポリペプチドのためのコドンからなるＤＮＡ挿入
物、ここでこれによって形質転換された該植物宿主はコ
ントロール領域のコントロール下に、図６で定義される
異種ポリペプチド、又は図６のポリペプチドと実質的に
同じアミノ酸配列と実質的に同じＡｄｏＭｅｔａｓｅ活
性を有する異種ポリペプチドを発現することができる、
ような該ＤＮＡ挿入物を含む広い宿主域プラスミドを含
み得る。
【００２７】本発明によれば、Ｓ−アデノシルメチオニ
ンをホモセリンと５’−メチルチオアデノシンとに加水
分解する、ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する、植物中で
発現された酵素が提供される。
ンをホモセリンと５’−メチルチオアデノシンとに加水
分解する、ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する、植物中で
発現された酵素が提供される。
【００２８】本発明によれば、Ｓ−アデノシルメチオニ
ンをホモセリンと５’−メチルチオアデノシンとに加水
分解する、ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する酵素を発現
することのできる植物宿主が提供される。
ンをホモセリンと５’−メチルチオアデノシンとに加水
分解する、ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する酵素を発現
することのできる植物宿主が提供される。
【００２９】
【発明の実施の形態】ＡｄｏＭｅｔａｓｅは通常植物組
織中には存在しない。ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子は極め
て珍しい酵素活性を有するタンパク質をコードする。バ
クテリオファージＴ３、コリファージＢＡ１４、クレブ
シエラファージＫ１１、及びセラチアファージＩＶのみ
が、この活性をコードする遺伝子の既知の供給源であ
る。トランスジェニック植物中におけるＡｄｏＭｅｔａ
ｓｅ遺伝子の存在、及びＡｄｏＭｅｔａｓｅの発現がＡ
ｄｏＭｅｔレベルを低くする。この効果を図１ｂに模式
的に示す。ＡｄｏＭｅｔはエチレン生合成のための単一
の前駆体であるので、利用できるＡｄｏＭｅｔが減少す
ると対応するエチレン生合成も減少する。更に、Ａｄｏ
ＭｅｔａｓｅによるＡｄｏＭｅｔの加水分解はＭＴＡを
生じ、ＭＴＡは植物によるエチレン生合成の主要酵素で
あるＡＣＣ合成酵素の阻害剤である。正味の効果は、前
駆体の利用可能性における減少と、エチレン生合成の直
接阻害とによって２倍となる。アグロバクテリウム（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）移動系を用いて、Ｔ３ Ａ
ｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子の少なくとも１コピーを含むト
ランスジェニック植物を構築することによって、制限さ
れた条件下にエチレン生合成をコントロールできる植物
の構築が可能となる。かくして、本発明はバクテリオフ
ァージ生化学と植物生化学という２つの非常に異なる研
究分野からの知識を組み合わせてなされる。本発明は、
商品寿命と品質保存とを改善するようにあらかじめ内的
に修飾された果実、野菜、及び花をもたらす。
織中には存在しない。ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子は極め
て珍しい酵素活性を有するタンパク質をコードする。バ
クテリオファージＴ３、コリファージＢＡ１４、クレブ
シエラファージＫ１１、及びセラチアファージＩＶのみ
が、この活性をコードする遺伝子の既知の供給源であ
る。トランスジェニック植物中におけるＡｄｏＭｅｔａ
ｓｅ遺伝子の存在、及びＡｄｏＭｅｔａｓｅの発現がＡ
ｄｏＭｅｔレベルを低くする。この効果を図１ｂに模式
的に示す。ＡｄｏＭｅｔはエチレン生合成のための単一
の前駆体であるので、利用できるＡｄｏＭｅｔが減少す
ると対応するエチレン生合成も減少する。更に、Ａｄｏ
ＭｅｔａｓｅによるＡｄｏＭｅｔの加水分解はＭＴＡを
生じ、ＭＴＡは植物によるエチレン生合成の主要酵素で
あるＡＣＣ合成酵素の阻害剤である。正味の効果は、前
駆体の利用可能性における減少と、エチレン生合成の直
接阻害とによって２倍となる。アグロバクテリウム（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）移動系を用いて、Ｔ３ Ａ
ｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子の少なくとも１コピーを含むト
ランスジェニック植物を構築することによって、制限さ
れた条件下にエチレン生合成をコントロールできる植物
の構築が可能となる。かくして、本発明はバクテリオフ
ァージ生化学と植物生化学という２つの非常に異なる研
究分野からの知識を組み合わせてなされる。本発明は、
商品寿命と品質保存とを改善するようにあらかじめ内的
に修飾された果実、野菜、及び花をもたらす。
【００３０】本発明は、植物プロモーターのコントロー
ル下にある選択遺伝子を含む広い宿主域プラスミドから
なる、植物宿主を形質転換するのに有用なベクターに関
する。該ベクターはまた、ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有
する機能性異種ポリペプチド、又はＡｄｏＭｅｔａｓｅ
と実質的に同じ生物活性を有する異種ポリペプチドに対
するコドンからなるＤＮＡ挿入物も含む。異種ポリペプ
チドは一方では植物プロモーターと隣り合っており、他
方ではポリＡシグナル配列と隣り合っている。その結
果、形質転換された植物宿主はコントロール領域のコン
トロールの下に、異種ポリペプチドを発現することがで
きる。ＤＮＡコドンはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから得
ることができ、或いはＤＮＡ合成法によって調製するこ
とができる。
ル下にある選択遺伝子を含む広い宿主域プラスミドから
なる、植物宿主を形質転換するのに有用なベクターに関
する。該ベクターはまた、ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有
する機能性異種ポリペプチド、又はＡｄｏＭｅｔａｓｅ
と実質的に同じ生物活性を有する異種ポリペプチドに対
するコドンからなるＤＮＡ挿入物も含む。異種ポリペプ
チドは一方では植物プロモーターと隣り合っており、他
方ではポリＡシグナル配列と隣り合っている。その結
果、形質転換された植物宿主はコントロール領域のコン
トロールの下に、異種ポリペプチドを発現することがで
きる。ＤＮＡコドンはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから得
ることができ、或いはＤＮＡ合成法によって調製するこ
とができる。
【００３１】本発明は更に、「Ｔ−ＤＮＡのない」Ｔｉ
プラスミド、及びＴ−ＤＮＡ境界と植物プロモーターの
コントロール下にある選択遺伝子とを含む広い宿主域プ
ラスミドからなる、植物宿主を形質転換するのに有用な
二元系ベクターに関する。該ベクターはまた、ＡｄｏＭ
ｅｔａｓｅ活性を有する機能性異種ポリペプチド、又は
ＡｄｏＭｅｔａｓｅと実質的に同じ生物活性を有する異
種ポリペプチドに対するコドンからなるＤＮＡ挿入物も
含む。異種ポリペプチドは一方では植物プロモーターと
隣り合っており、他方ではポリＡシグナル配列と隣り合
っている。その結果、形質転換された植物宿主はコント
ロール領域のコントロールの下に、異種ポリペプチドを
発現することができる。
プラスミド、及びＴ−ＤＮＡ境界と植物プロモーターの
コントロール下にある選択遺伝子とを含む広い宿主域プ
ラスミドからなる、植物宿主を形質転換するのに有用な
二元系ベクターに関する。該ベクターはまた、ＡｄｏＭ
ｅｔａｓｅ活性を有する機能性異種ポリペプチド、又は
ＡｄｏＭｅｔａｓｅと実質的に同じ生物活性を有する異
種ポリペプチドに対するコドンからなるＤＮＡ挿入物も
含む。異種ポリペプチドは一方では植物プロモーターと
隣り合っており、他方ではポリＡシグナル配列と隣り合
っている。その結果、形質転換された植物宿主はコント
ロール領域のコントロールの下に、異種ポリペプチドを
発現することができる。
【００３２】本発明は更に、（ａ）「Ｔ−ＤＮＡのな
い」Ｔｉプラスミド、（ｂ）クローン化ｖｉｒＧ遺伝子
を含む、広い宿主域Ｐ不和合性群プラスミド、及び
（ｃ）Ｔ−ＤＮＡ境界と植物プロモーターのコントロー
ル下にある選択遺伝子とを含む広い宿主域プロモータ
ー、からなる植物宿主を形質転換するのに有用な三分節
系ベクターに関する。該ベクターはまた、ＡｄｏＭｅｔ
ａｓｅ活性を有する機能性異種ポリペプチド、又はＡｄ
ｏＭｅｔａｓｅと実質的に同じ生物活性を有する異種ポ
リペプチド、又はその機能性誘導体に対するコドンから
なるＤＮＡ挿入物も含む。異種ポリペプチドは一方では
植物プロモーターと隣り合っており、他方ではポリＡシ
グナル配列と隣り合っている。その結果、形質転換され
た植物宿主はコントロール領域のコントロール下に、異
種ポリペプチドを発現することができる。Ｃｅｌｌ，
５６：１９３−２０１を参照されたい。特定すれば、こ
れはｐＴｉＡ６ＮＣのＴ−ＤＮＡのない誘導体を含むア
グロバクテリウム ＰＣ２７６０株を用いて構築され
る。この移動系に、プラスミドｐＴｉＢｏ５４２ ｖｉ
ｒＧ遺伝子挿入物を含むプラスミドｐＶＫ１０２を加え
た。この挿入物は、ｐＧＡ ４８２−Ｓａｍ−Ｋであ
れ、又はｐＢｌ １２１−ＡｄｏＭｅｔａｓｅであれ、
第３のプラスミド上に含まれるＴ−ＤＮＡ境界を含むＤ
ＮＡの移動を増強する。要約すると、同一のバクテリア
株中に全てが含まれる３つのプラスミドによって移動系
が得られる。第１のプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ境界を欠
いている点以外は、植物に遺伝子を移動するのに必要な
全ての遺伝情報を含む。第２のプラスミドは、移動工程
を増強するビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）遺伝子の
うちの１つの余分のコピーを含む。第３のプラスミド
は、２つのＴ−ＤＮＡ境界の間で操作された植物細胞に
与えられるべきＤＮＡを含む。この系は、広範囲の植物
種への効率よい移動を達成するために、３つのプラスミ
ドと、ビルレンス遺伝子産物（ｐＴｉＡ６ＮＣ及びｐＴ
ｉＢｏ５４２からのもの）を用いる点において文献既知
のものと異なる。
い」Ｔｉプラスミド、（ｂ）クローン化ｖｉｒＧ遺伝子
を含む、広い宿主域Ｐ不和合性群プラスミド、及び
（ｃ）Ｔ−ＤＮＡ境界と植物プロモーターのコントロー
ル下にある選択遺伝子とを含む広い宿主域プロモータ
ー、からなる植物宿主を形質転換するのに有用な三分節
系ベクターに関する。該ベクターはまた、ＡｄｏＭｅｔ
ａｓｅ活性を有する機能性異種ポリペプチド、又はＡｄ
ｏＭｅｔａｓｅと実質的に同じ生物活性を有する異種ポ
リペプチド、又はその機能性誘導体に対するコドンから
なるＤＮＡ挿入物も含む。異種ポリペプチドは一方では
植物プロモーターと隣り合っており、他方ではポリＡシ
グナル配列と隣り合っている。その結果、形質転換され
た植物宿主はコントロール領域のコントロール下に、異
種ポリペプチドを発現することができる。Ｃｅｌｌ，
５６：１９３−２０１を参照されたい。特定すれば、こ
れはｐＴｉＡ６ＮＣのＴ−ＤＮＡのない誘導体を含むア
グロバクテリウム ＰＣ２７６０株を用いて構築され
る。この移動系に、プラスミドｐＴｉＢｏ５４２ ｖｉ
ｒＧ遺伝子挿入物を含むプラスミドｐＶＫ１０２を加え
た。この挿入物は、ｐＧＡ ４８２−Ｓａｍ−Ｋであ
れ、又はｐＢｌ １２１−ＡｄｏＭｅｔａｓｅであれ、
第３のプラスミド上に含まれるＴ−ＤＮＡ境界を含むＤ
ＮＡの移動を増強する。要約すると、同一のバクテリア
株中に全てが含まれる３つのプラスミドによって移動系
が得られる。第１のプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ境界を欠
いている点以外は、植物に遺伝子を移動するのに必要な
全ての遺伝情報を含む。第２のプラスミドは、移動工程
を増強するビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）遺伝子の
うちの１つの余分のコピーを含む。第３のプラスミド
は、２つのＴ−ＤＮＡ境界の間で操作された植物細胞に
与えられるべきＤＮＡを含む。この系は、広範囲の植物
種への効率よい移動を達成するために、３つのプラスミ
ドと、ビルレンス遺伝子産物（ｐＴｉＡ６ＮＣ及びｐＴ
ｉＢｏ５４２からのもの）を用いる点において文献既知
のものと異なる。
【００３３】本発明自体は、そのさらなる利点と特質と
共に、以下の発明の好ましい形態の詳細な説明によって
より容易にかつ完全に理解されるであろうが、かかる説
明は添付の図面を参照することによってなされる。
共に、以下の発明の好ましい形態の詳細な説明によって
より容易にかつ完全に理解されるであろうが、かかる説
明は添付の図面を参照することによってなされる。
【００３４】好ましい態様についての記載 植物ベクター系は以下のものからなる。ＡｄｏＭｅｔａ
ｓｅ遺伝子を植物中に伝達するには、アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の二元系ベクターを用いるの
が好ましい。「Ｔ−ＤＮＡのない」Ｔｉプラスミドと、
Ｔ−ＤＮＡ境界、植物プロモーターコントロール下にあ
る選択的な（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）カナマイシン遺伝
子、及び一方では植物プロモーターと隣り合っており、
他方ではポリＡシグナル配列と隣り合ってＡｄｏＭｅｔ
ａｓｅ遺伝子を含む広い宿主域プラスミドとを含むアグ
ロバクテリウム ＰＣ２７６０株を図２に示し、かつ以
下の実施例で記載するように構築する。
ｓｅ遺伝子を植物中に伝達するには、アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の二元系ベクターを用いるの
が好ましい。「Ｔ−ＤＮＡのない」Ｔｉプラスミドと、
Ｔ−ＤＮＡ境界、植物プロモーターコントロール下にあ
る選択的な（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）カナマイシン遺伝
子、及び一方では植物プロモーターと隣り合っており、
他方ではポリＡシグナル配列と隣り合ってＡｄｏＭｅｔ
ａｓｅ遺伝子を含む広い宿主域プラスミドとを含むアグ
ロバクテリウム ＰＣ２７６０株を図２に示し、かつ以
下の実施例で記載するように構築する。
【００３５】ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子が１以上のバク
テリオファージから単離できることが望ましい。異なる
バクテリオファージでは、それらのＤＮＡ配列において
異なるＡｄｏＭｅｔａｓｅ子を含んでいることが期待で
きる。更に、ＡｄｏＭｅｔａｓｅのアミノ酸配列を遺伝
子技術で修飾して、異なる生物活性を有する酵素を生産
することができる。生物活性が増加すれば、植物中にお
けるエチレン生合成をコントロールするのにより少量の
酵素を用いることができる。ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子
の配列の修飾は本発明の範囲内に含まれる。
テリオファージから単離できることが望ましい。異なる
バクテリオファージでは、それらのＤＮＡ配列において
異なるＡｄｏＭｅｔａｓｅ子を含んでいることが期待で
きる。更に、ＡｄｏＭｅｔａｓｅのアミノ酸配列を遺伝
子技術で修飾して、異なる生物活性を有する酵素を生産
することができる。生物活性が増加すれば、植物中にお
けるエチレン生合成をコントロールするのにより少量の
酵素を用いることができる。ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子
の配列の修飾は本発明の範囲内に含まれる。
【００３６】
【実施例】実施例１ ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子の原料を以下のようにして得
て、操作した。ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子は、精製Ｔ３
ＤＮＡからのＡｌｕ−ＨａｅＩＩＩ制限酵素断片上で
同定された（Ｊ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，
「クローン化コリファージＴ３ Ｓ−アデノシルメチオ
ニン遺伝子の発現が大腸菌におけるＤＮＡメチル化とポ
リアミン生合成を阻害する」、Ｊ．Ｂａｃｔ．， １６
９：３６２５−３６３２，１９８７）。バクテリオファ
ージＴ３はＡＴＣＣ Ｎｏ．１１３０３−Ｂ３のもとに
入手可能である。このＤＮＡ断片は最初バクテリオファ
ージＭ１３ ＭＰ８ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌ
ＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）中にク
ローニングされた。次いでＭａｅＩＩＩからＢａｍまで
の断片をｐＵＣ１９プラスミドベクター（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）中にサブクローニングして、ｐＵＣ１９−Ａｄ
ｏＭｅｔａｓｅ（ｐＵＣ１９−ＳＡＭａｓｅ）を作製
し、大腸菌に形質転換して、次の構築実験及びＤＮＡ配
列決定用のＤＮＡ源として使用した。ＭａｅＩＩＩ制限
部位はＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子の開始コドンから１０
塩基対だけ上流にあるので、これをＡｄｏＭｅｔａｓｅ
遺伝子断片の５’末端として用いる。図２に示したよう
に、ｐＵＣ１９−ＡｄｏＭｅｔａｓｅを以下に記載する
ように用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスに
挿入する。
て、操作した。ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子は、精製Ｔ３
ＤＮＡからのＡｌｕ−ＨａｅＩＩＩ制限酵素断片上で
同定された（Ｊ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，
「クローン化コリファージＴ３ Ｓ−アデノシルメチオ
ニン遺伝子の発現が大腸菌におけるＤＮＡメチル化とポ
リアミン生合成を阻害する」、Ｊ．Ｂａｃｔ．， １６
９：３６２５−３６３２，１９８７）。バクテリオファ
ージＴ３はＡＴＣＣ Ｎｏ．１１３０３−Ｂ３のもとに
入手可能である。このＤＮＡ断片は最初バクテリオファ
ージＭ１３ ＭＰ８ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌ
ＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）中にク
ローニングされた。次いでＭａｅＩＩＩからＢａｍまで
の断片をｐＵＣ１９プラスミドベクター（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）中にサブクローニングして、ｐＵＣ１９−Ａｄ
ｏＭｅｔａｓｅ（ｐＵＣ１９−ＳＡＭａｓｅ）を作製
し、大腸菌に形質転換して、次の構築実験及びＤＮＡ配
列決定用のＤＮＡ源として使用した。ＭａｅＩＩＩ制限
部位はＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子の開始コドンから１０
塩基対だけ上流にあるので、これをＡｄｏＭｅｔａｓｅ
遺伝子断片の５’末端として用いる。図２に示したよう
に、ｐＵＣ１９−ＡｄｏＭｅｔａｓｅを以下に記載する
ように用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスに
挿入する。
【００３７】親ベクターｐＢｌ１２１はＣｌｏｎｔｅｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入す
る。ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子配列の上流にある植物プ
ロモーターは、トランスジェニック植物中における組織
特異的発現、温度依存性発現、高又は低レベルの構成性
発現、ホルモン誘導性発現、或いは光依存性発現などの
目的によって異なるものを用いる。以下の実施例では、
プロモーターは構成性カリフラワーモザイクウィルス
（ＣａＭＶ）プロモーター（Ｐａｒｍａｃｉａ 製）で
ある。
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入す
る。ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子配列の上流にある植物プ
ロモーターは、トランスジェニック植物中における組織
特異的発現、温度依存性発現、高又は低レベルの構成性
発現、ホルモン誘導性発現、或いは光依存性発現などの
目的によって異なるものを用いる。以下の実施例では、
プロモーターは構成性カリフラワーモザイクウィルス
（ＣａＭＶ）プロモーター（Ｐａｒｍａｃｉａ 製）で
ある。
【００３８】実施例２ 以下に記載するのはＰＣ２７６０／ｐＢｌ１２１−Ａｄ
ｏＭｅｔａｓｅを用いる構築及び形質転換の実施例であ
る。ｐＵＣ１９−ＡｄｏＭｅｔａｓｅプラスミドをＸｂ
ａＩ及びＳａｃＩで消化して全ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝
子をコードする５２０ｂｐの断片を作製する。ＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動、次いで電気溶出（ｅｌｅ
ｃｔｒｏｌｕｔｉｏｎ）によって精製する。ベクターｐ
Ｂｌ１２１もまたＸｂａＩ及びＳａｃＩで消化して上記
と同じ方法によって精製する。この２つの断片を結合し
て、得られるプラスミドをｐＢｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔ
ａｓｅと命名する。ｐＢｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔａｓｅ
を直接形質転換法を用いてアグロバクテリウム中に導入
する。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＰＣ２７
６０は、メリーランド州ロックビルにあるアメリカンタ
イプカルチャーコレクションに寄託番号ＡＴＣＣ６８１
１１のもとに寄託されている。アグロバクテリウム・ツ
メファシエンスＰＣ２７６０株をＹＥＰ培地（１リット
ル当たりイーストエキス １０ｇ、ペプトン １０ｇ、
及びＮａＣｌ ５ｇ）中で対数中期まで成長させる。氷
上で冷却した後、この細胞５０ｍｌをペレットとし、氷
冷ＣａＣｌ ２０ｍＭ中に再懸濁し、１ｍｌずつに分け
る。それぞれにｐＢｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔａｓｅ １
μｇを加えて、氷上で３０分間インキュベーションし、
液体窒素中で凍結し、３７℃で５分間解かす。ＹＥＰ培
地１ｍｌを加えて、２８℃で２時間インキュベーション
する。細胞をペレットとし、ＹＥＰ５０μｌに再懸濁し
て、次いでカナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＹＥＰ寒
天上にまく。カナマイシン耐性の形質転換コロニーが２
日以内に出現する。
ｏＭｅｔａｓｅを用いる構築及び形質転換の実施例であ
る。ｐＵＣ１９−ＡｄｏＭｅｔａｓｅプラスミドをＸｂ
ａＩ及びＳａｃＩで消化して全ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝
子をコードする５２０ｂｐの断片を作製する。ＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動、次いで電気溶出（ｅｌｅ
ｃｔｒｏｌｕｔｉｏｎ）によって精製する。ベクターｐ
Ｂｌ１２１もまたＸｂａＩ及びＳａｃＩで消化して上記
と同じ方法によって精製する。この２つの断片を結合し
て、得られるプラスミドをｐＢｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔ
ａｓｅと命名する。ｐＢｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔａｓｅ
を直接形質転換法を用いてアグロバクテリウム中に導入
する。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＰＣ２７
６０は、メリーランド州ロックビルにあるアメリカンタ
イプカルチャーコレクションに寄託番号ＡＴＣＣ６８１
１１のもとに寄託されている。アグロバクテリウム・ツ
メファシエンスＰＣ２７６０株をＹＥＰ培地（１リット
ル当たりイーストエキス １０ｇ、ペプトン １０ｇ、
及びＮａＣｌ ５ｇ）中で対数中期まで成長させる。氷
上で冷却した後、この細胞５０ｍｌをペレットとし、氷
冷ＣａＣｌ ２０ｍＭ中に再懸濁し、１ｍｌずつに分け
る。それぞれにｐＢｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔａｓｅ １
μｇを加えて、氷上で３０分間インキュベーションし、
液体窒素中で凍結し、３７℃で５分間解かす。ＹＥＰ培
地１ｍｌを加えて、２８℃で２時間インキュベーション
する。細胞をペレットとし、ＹＥＰ５０μｌに再懸濁し
て、次いでカナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＹＥＰ寒
天上にまく。カナマイシン耐性の形質転換コロニーが２
日以内に出現する。
【００３９】これらのプラスミドを含むＰＣ２７６０ク
ローンをＰＣ２７６０／ｐＢｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔａ
ｓｅと命名し、以下の直接法でニコチアナ・タバカム
（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ） Ｌ．ｃｖ．
ウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から得た円形
の葉切片を形質転換するのに用いた。タバコの葉を９５
％エタノール中で１０秒間１回洗浄し、１０％ブリー
チ、０．１％トゥイン（Ｔｗｅｅｎ）−２０中で２０分
間１回洗浄し、水中で４回洗浄して、５ｍｍの円形切片
に切断し、最終的にＰＣ２７６０／ｐＢｌ１２１の一夜
培養物１０ｍｌ中に３０分間置く。次いで葉の円形切片
をムリシゲアンドスクーグ（Ｍｕｒｉｓｈｅｇｅｅ ａ
ｎｄ Ｓｃｋｏｏｇ）カルス形成培地上に１日置く。切
片を次いでセファトキサミン（ｃｅｆａｔｏｘａｍｉｎ
ｅ）５００μｇ／ｍｌ中に１時間浸けて、カルベニシリ
ン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）２００μｇ／ｍｌを
含むタバコカルス形成培地上に３日間置く。次いで切片
をカナマイシン１００μｇ／ｍｌを更に含む同じ培地に
移す。標準法を用いてカナマイシン耐性タバコカルスを
選択する。カルスからの植物の再生は公知の技術であ
る。実験方法は各植物種によって異なり、特定のパラメ
ーターは当業者によって容易に決定できる。このカルス
由来の植物組織がＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子を含むこと
を、ＤＮＡ−ドットプロット及びサザンブロットを用い
て示す。この遺伝子の翻訳は、葉組織からＲＮＡを抽出
し、ノーザンブロットを実施することによって証明す
る。サザンブロット及びノーザンブロットのいずれもｐ
ＵＣ１９−ＡｄｏＭｅｔａｓｅからの放射性標識Ａｄｏ
Ｍｅｔａｓｅ遺伝子断片でプローブする。ＡｄｏＭｅｔ
ａｓｅ酵素の存在は、葉組織からの粗抽出物を調製し、
前述した、図５で示したＡｄｏＭｅｔａｓｅアッセイ
（５’−メチルチオアデノシンのＳ−アデノシルメチオ
ニンに対する比に基づいて、トランスジェニック植物の
抽出物の酵素活性を分析する）を実施することによって
確認する。更に、培養４０時間後のタバコ葉円形切片中
におけるエチレンの発生という点から、対照組織に対す
るトランスジェニック植物組織上のナフタレン酢酸（Ｎ
ＡＡ）（エチレン生産を刺激する植物ホルモンである）
の影響を調べる。トランスジェニック組織はＮｔ−ＢＯ
Ｂと命名する。表１に示すように、トランスジェニック
植物には顕著なエチレン発生の減少が見られる。
ローンをＰＣ２７６０／ｐＢｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔａ
ｓｅと命名し、以下の直接法でニコチアナ・タバカム
（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ） Ｌ．ｃｖ．
ウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から得た円形
の葉切片を形質転換するのに用いた。タバコの葉を９５
％エタノール中で１０秒間１回洗浄し、１０％ブリー
チ、０．１％トゥイン（Ｔｗｅｅｎ）−２０中で２０分
間１回洗浄し、水中で４回洗浄して、５ｍｍの円形切片
に切断し、最終的にＰＣ２７６０／ｐＢｌ１２１の一夜
培養物１０ｍｌ中に３０分間置く。次いで葉の円形切片
をムリシゲアンドスクーグ（Ｍｕｒｉｓｈｅｇｅｅ ａ
ｎｄ Ｓｃｋｏｏｇ）カルス形成培地上に１日置く。切
片を次いでセファトキサミン（ｃｅｆａｔｏｘａｍｉｎ
ｅ）５００μｇ／ｍｌ中に１時間浸けて、カルベニシリ
ン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）２００μｇ／ｍｌを
含むタバコカルス形成培地上に３日間置く。次いで切片
をカナマイシン１００μｇ／ｍｌを更に含む同じ培地に
移す。標準法を用いてカナマイシン耐性タバコカルスを
選択する。カルスからの植物の再生は公知の技術であ
る。実験方法は各植物種によって異なり、特定のパラメ
ーターは当業者によって容易に決定できる。このカルス
由来の植物組織がＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子を含むこと
を、ＤＮＡ−ドットプロット及びサザンブロットを用い
て示す。この遺伝子の翻訳は、葉組織からＲＮＡを抽出
し、ノーザンブロットを実施することによって証明す
る。サザンブロット及びノーザンブロットのいずれもｐ
ＵＣ１９−ＡｄｏＭｅｔａｓｅからの放射性標識Ａｄｏ
Ｍｅｔａｓｅ遺伝子断片でプローブする。ＡｄｏＭｅｔ
ａｓｅ酵素の存在は、葉組織からの粗抽出物を調製し、
前述した、図５で示したＡｄｏＭｅｔａｓｅアッセイ
（５’−メチルチオアデノシンのＳ−アデノシルメチオ
ニンに対する比に基づいて、トランスジェニック植物の
抽出物の酵素活性を分析する）を実施することによって
確認する。更に、培養４０時間後のタバコ葉円形切片中
におけるエチレンの発生という点から、対照組織に対す
るトランスジェニック植物組織上のナフタレン酢酸（Ｎ
ＡＡ）（エチレン生産を刺激する植物ホルモンである）
の影響を調べる。トランスジェニック組織はＮｔ−ＢＯ
Ｂと命名する。表１に示すように、トランスジェニック
植物には顕著なエチレン発生の減少が見られる。
【００４０】
【表１】
【００４１】図１に見られるように、ＡＣＣの生成は植
物組織中におけるエチレン生産の律速段階である。Ｓ．
Ｆ．Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「高等植物におけるエチ
レン生合成及びその制御」、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌ
ａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３５：１５５−１８９，１
９８４を参照されたい。植物宿主の形質転換を容易にす
るには、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ
ｎ）、マイクロインジェクション、及びマイクロプロジ
ェクタイルボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃ
ｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）のような他の様々
な方法を使用することができる。これらの方法は当分野
ではよく知られたものであり、以下に記載する文献に詳
述されている。Ｔ．Ｍ．Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，
「粒子ボンバードメント法による、完全ニコチアナ細胞
の安定な遺伝子の形質転換」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ，Ｄ．Ｃ．： Ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｙ， Ｎｏ
ｖ． １９８８， Ｖｏｌ．８５， Ｉｓｓｕｅ ２
２， ８５０２−８５０５頁； ｂ．Ｌ．Ａ． Ｍｉｋ
ｉｅｔ ａｌ．，「マイクロインジェクション：植物細
胞を研究し、修飾するための実験的手段」、Ｐｌａｎｔ
ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ，Ｔ
ｈ． Ｈｏｈｎ及びＪ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｗｉｅｎ 編
集：Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ， ｃ１９８７，２４
９−２６５ 頁；Ｃ．Ｂｅｌｌｉｎｉ ｅｔａｌ．，
「プロトプラストの電気穿孔によって得られるレタス
（Ｌａｃｔｕｃａｓａｔｉｖａ）のトランスジェニック
植物」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ， ＮＹ： Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．，Ｍａｙ １９８９， Ｖｏｌ． ７， Ｉｓｓ
ｕｅ ５， ５０３−５０８頁。三分節系ベクターを構
成するＶｉｒＧ遺伝子を含む類似のＰＣ２７６０／ｐＢ
ｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔａｓｅクローンもまた、上記の
方法で葉切片を形質転換するのに用いることができる。
物組織中におけるエチレン生産の律速段階である。Ｓ．
Ｆ．Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「高等植物におけるエチ
レン生合成及びその制御」、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌ
ａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３５：１５５−１８９，１
９８４を参照されたい。植物宿主の形質転換を容易にす
るには、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ
ｎ）、マイクロインジェクション、及びマイクロプロジ
ェクタイルボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃ
ｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）のような他の様々
な方法を使用することができる。これらの方法は当分野
ではよく知られたものであり、以下に記載する文献に詳
述されている。Ｔ．Ｍ．Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，
「粒子ボンバードメント法による、完全ニコチアナ細胞
の安定な遺伝子の形質転換」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ，Ｄ．Ｃ．： Ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｙ， Ｎｏ
ｖ． １９８８， Ｖｏｌ．８５， Ｉｓｓｕｅ ２
２， ８５０２−８５０５頁； ｂ．Ｌ．Ａ． Ｍｉｋ
ｉｅｔ ａｌ．，「マイクロインジェクション：植物細
胞を研究し、修飾するための実験的手段」、Ｐｌａｎｔ
ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ，Ｔ
ｈ． Ｈｏｈｎ及びＪ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｗｉｅｎ 編
集：Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ， ｃ１９８７，２４
９−２６５ 頁；Ｃ．Ｂｅｌｌｉｎｉ ｅｔａｌ．，
「プロトプラストの電気穿孔によって得られるレタス
（Ｌａｃｔｕｃａｓａｔｉｖａ）のトランスジェニック
植物」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ， ＮＹ： Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．，Ｍａｙ １９８９， Ｖｏｌ． ７， Ｉｓｓ
ｕｅ ５， ５０３−５０８頁。三分節系ベクターを構
成するＶｉｒＧ遺伝子を含む類似のＰＣ２７６０／ｐＢ
ｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔａｓｅクローンもまた、上記の
方法で葉切片を形質転換するのに用いることができる。
【００４２】本発明の方法はあらゆる植物に適用でき
る、特に経済的に重要な食料作物や装飾品に用いる。以
下に列挙するものは本発明の方法を適用できる広範囲の
植物種の代表的なものであるが、これに何ら限定される
ものではない。食料作物 ： Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ （タマネギ） Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ （ニンニク） Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ （パイナップル） Ａｎａｎａｓ ｓａｔｉｖｕｓ（パイナップル） Ａｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ （セロリ） Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ （アス
パラガス） Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ （赤カブ及び砂糖大根） Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ （菜類） Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ （コショウ類） Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ （コショウ
類） Ｃａｒｉｃａ ｃａｎｄａｍａｒｃｅｎｓｉｓ （パパ
イヤ） Ｃａｒｉｃａ ｃａｕｌｉｆｌｏｒａ （パパイヤ） Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ （パパイヤ） Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｅｎｄｉｖｉａ （キクヂシャ） Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ （スイカ） Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｓｐ． （メロン類） Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ （スイカ類） Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ （カンタロープメロン） Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ （キュウリ） Ｃｙｎａｒａ ｓｃｏｌｙｍｕｓ （アーティチョー
ク） Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ （ニンジン） Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ （イチジク） Ｆｒａｇａｒｉａ ｓｐ． （イチゴ） Ｆｒａｇａｒｉａ Ｘ ａｎａｎａｓｓａ （イチゴ） Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ （レタス） Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
（トマト） Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ （リンゴ） Ｍａｌｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ （リンゴ） Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ （バナナ） Ｍｕｓａ ｃａｖｅｎｄｉｓｈｉｉ （バナナ） Ｍｕｓａ ｓｐ． （バナナ） Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ （オリーブ） Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ （トケイソウの
実） Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ （アボカド） Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ （ソラマメ） Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ （ナツメヤ
シ） Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ （エンドウ） Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ （チェリー） Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ （プラム） Ｐｒｕｎｕｓ ｉｎｓｔｉｔｉａ （プラム） Ｐｒｕｎｕｓ ｍａｒｉａｎａ （プルナス根茎：ｐｒ
ｕｎｕｓ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋ） Ｐｒｕｎｕｓ ｐａｎｄｏｒａ （チェリー） Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ （モモ） Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐ． （アプリコット、ネクタリン
類） Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ （ザクロ） Ｐｙｒｉｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ （ナシ） Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ （キイチゴ） Ｒｕｂｕｓ ｓｐ． （ケーンベリー類） Ｒｕｂｕｓ ｕｒｓｉｎｕｓ （キイチゴ） Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ （ナス） Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ （ジャガイモ） Ｓｐｉｎａｃｌａ ｏｌｅｒａｃｅａ （ホウレン草） Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｅｌｌｉｏｔｔｉｉ （コケモ
モ） Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ （ツル
コケモモ） Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｓｐ． （コケモモ） Ｖｉｔｉｓ ｌａｂｒｕｓｃａｎａ （コンコードブド
ウ） Ｖｉｔｉｓ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ （ブドウ） Ｖｉｔｉｓ ｓｐ． （ブドウ類） Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ （ワイン用ブドウ） Ｚｅａ ｍａｙｓ （トウモロコシ）装飾品 ： Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ （キンギョソ
ウ） Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ ｃａｒｄｉｎａｔｅ Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ ｅｌａｔｕｍ Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ ｎｕｄｉｃａｕｌｅ Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ （カー
ネーション） Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ （ポイ
ンセチア） Ｆｕｃｈｓｉａ ｈｙｂｒｉｄａ Ｇｅｒｂａｒａ ｊａｍｅｓｏｎｉｉ （ヒナギク） Ｇｌａｄｉｏｌｕｓ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｓ Ｇｌａｄｉｏｌｕｓ ｈｏｒｔｕｌａｎｓ Ｈｏｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ ｓｐ． （デイリリー：ｄ
ａｙ ｌｉｌｌｙ） Ｉｒｉｓ ｈｏｌｌａｎｄｉｃａ Ｉｒｉｓ ｓｐ． Ｌｉｌｉｕｍ ｓｐ． （ユリ） Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｓｐ． （ラッパスイセン／スイ
セン） Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｈｏｒｔｏｒｕｍ （ゼラニ
ウム） Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｐｅｌｔａｔｕｍ （ゼラニ
ウム） Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｚｏｎａｌｅ （ゼラニウ
ム） Ｐｅｔｕｎｉａ ａｘｉｌｌａｒｉｓ Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ Ｐｅｔｕｎｉａ ｉｎｆｌａｔａ Ｐｅｔｕｎｉａ ｐａｒｏｄｉｉ Ｐｅｔｕｎｉａ ｐａｒｖｉｆｌｏｒｅ Ｐｅｔｕｎｉａ ｓｐ． Ｐｅｔｕｎｉａ ｔｒｉｃｕｓｐｉｄａｔａ Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｉｍｓｉｉ （ツツジ） Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐ． Ｒｏｓａ ｃａｎｉｎａ Ｒｏｓａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎａ Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ Ｒｏｓａ ｍａｎｅｔｔｉ Ｒｏｓａ ｎｉｔｉｄａ Ｒｏｓａ ｍｕｌｔｉｆｌｏｌａ Ｒｏｓａ ｓｐ． Ｓａｉｎｔｐａｕｌｉａ ｉｏｎａｎｔｈａ （アフリ
カスミレ） Ｔｕｌｌｉｐａ ｇｅｓｎｅｒｉａｎａ （チューリッ
プ）蘭類 ： Ａｒａｃｈｎｉｓ ｓｐ． Ｃａｔｔｌｅｙａ ｓｐ． Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｓｐ． Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｓｐ． Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｕｍ ｓｐ． Ｖａｎｄａ ｓｐ．
る、特に経済的に重要な食料作物や装飾品に用いる。以
下に列挙するものは本発明の方法を適用できる広範囲の
植物種の代表的なものであるが、これに何ら限定される
ものではない。食料作物 ： Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ （タマネギ） Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ （ニンニク） Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ （パイナップル） Ａｎａｎａｓ ｓａｔｉｖｕｓ（パイナップル） Ａｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ （セロリ） Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ （アス
パラガス） Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ （赤カブ及び砂糖大根） Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ （菜類） Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ （コショウ類） Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ （コショウ
類） Ｃａｒｉｃａ ｃａｎｄａｍａｒｃｅｎｓｉｓ （パパ
イヤ） Ｃａｒｉｃａ ｃａｕｌｉｆｌｏｒａ （パパイヤ） Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ （パパイヤ） Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｅｎｄｉｖｉａ （キクヂシャ） Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ （スイカ） Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｓｐ． （メロン類） Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ （スイカ類） Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ （カンタロープメロン） Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ （キュウリ） Ｃｙｎａｒａ ｓｃｏｌｙｍｕｓ （アーティチョー
ク） Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ （ニンジン） Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ （イチジク） Ｆｒａｇａｒｉａ ｓｐ． （イチゴ） Ｆｒａｇａｒｉａ Ｘ ａｎａｎａｓｓａ （イチゴ） Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ （レタス） Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
（トマト） Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ （リンゴ） Ｍａｌｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ （リンゴ） Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ （バナナ） Ｍｕｓａ ｃａｖｅｎｄｉｓｈｉｉ （バナナ） Ｍｕｓａ ｓｐ． （バナナ） Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ （オリーブ） Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ （トケイソウの
実） Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ （アボカド） Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ （ソラマメ） Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ （ナツメヤ
シ） Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ （エンドウ） Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ （チェリー） Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ （プラム） Ｐｒｕｎｕｓ ｉｎｓｔｉｔｉａ （プラム） Ｐｒｕｎｕｓ ｍａｒｉａｎａ （プルナス根茎：ｐｒ
ｕｎｕｓ ｒｏｏｔｓｔｏｃｋ） Ｐｒｕｎｕｓ ｐａｎｄｏｒａ （チェリー） Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ （モモ） Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐ． （アプリコット、ネクタリン
類） Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ （ザクロ） Ｐｙｒｉｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ （ナシ） Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ （キイチゴ） Ｒｕｂｕｓ ｓｐ． （ケーンベリー類） Ｒｕｂｕｓ ｕｒｓｉｎｕｓ （キイチゴ） Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ （ナス） Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ （ジャガイモ） Ｓｐｉｎａｃｌａ ｏｌｅｒａｃｅａ （ホウレン草） Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｅｌｌｉｏｔｔｉｉ （コケモ
モ） Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ （ツル
コケモモ） Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｓｐ． （コケモモ） Ｖｉｔｉｓ ｌａｂｒｕｓｃａｎａ （コンコードブド
ウ） Ｖｉｔｉｓ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ （ブドウ） Ｖｉｔｉｓ ｓｐ． （ブドウ類） Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ （ワイン用ブドウ） Ｚｅａ ｍａｙｓ （トウモロコシ）装飾品 ： Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ （キンギョソ
ウ） Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ ｃａｒｄｉｎａｔｅ Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ ｅｌａｔｕｍ Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ ｎｕｄｉｃａｕｌｅ Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ （カー
ネーション） Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ （ポイ
ンセチア） Ｆｕｃｈｓｉａ ｈｙｂｒｉｄａ Ｇｅｒｂａｒａ ｊａｍｅｓｏｎｉｉ （ヒナギク） Ｇｌａｄｉｏｌｕｓ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｓ Ｇｌａｄｉｏｌｕｓ ｈｏｒｔｕｌａｎｓ Ｈｏｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ ｓｐ． （デイリリー：ｄ
ａｙ ｌｉｌｌｙ） Ｉｒｉｓ ｈｏｌｌａｎｄｉｃａ Ｉｒｉｓ ｓｐ． Ｌｉｌｉｕｍ ｓｐ． （ユリ） Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｓｐ． （ラッパスイセン／スイ
セン） Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｈｏｒｔｏｒｕｍ （ゼラニ
ウム） Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｐｅｌｔａｔｕｍ （ゼラニ
ウム） Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｓｐ． Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｚｏｎａｌｅ （ゼラニウ
ム） Ｐｅｔｕｎｉａ ａｘｉｌｌａｒｉｓ Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ Ｐｅｔｕｎｉａ ｉｎｆｌａｔａ Ｐｅｔｕｎｉａ ｐａｒｏｄｉｉ Ｐｅｔｕｎｉａ ｐａｒｖｉｆｌｏｒｅ Ｐｅｔｕｎｉａ ｓｐ． Ｐｅｔｕｎｉａ ｔｒｉｃｕｓｐｉｄａｔａ Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｉｍｓｉｉ （ツツジ） Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐ． Ｒｏｓａ ｃａｎｉｎａ Ｒｏｓａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎａ Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ Ｒｏｓａ ｍａｎｅｔｔｉ Ｒｏｓａ ｎｉｔｉｄａ Ｒｏｓａ ｍｕｌｔｉｆｌｏｌａ Ｒｏｓａ ｓｐ． Ｓａｉｎｔｐａｕｌｉａ ｉｏｎａｎｔｈａ （アフリ
カスミレ） Ｔｕｌｌｉｐａ ｇｅｓｎｅｒｉａｎａ （チューリッ
プ）蘭類 ： Ａｒａｃｈｎｉｓ ｓｐ． Ｃａｔｔｌｅｙａ ｓｐ． Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｓｐ． Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｓｐ． Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｕｍ ｓｐ． Ｖａｎｄａ ｓｐ．
【００４３】ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子は好ましい配列
を得るために更に遺伝的に操作される。ＡｄｏＭｅｔａ
ｓｅ遺伝子配列の分析は、遺伝子の開始コドンの周囲に
ある最適ＤＮＡ配列よりも劣っていることを示した。
Ｍ．Ｋｏｚａｋ 「ＡＵＧ開始コドンに先立つ少なくと
も６個のヌクレオチドが哺乳動物細胞における翻訳を増
強する」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．， １９６：９４７−
９５０，１９８７の研究によると、効率的な翻訳を可能
にする真核生物ｍＲＮＡ用のコンセンサス開始配列が存
在する。ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子を遺伝的に操作し
て、ＡｄｏＭｅｔａｓｅ開始配列をコンセンサスＫｏｚ
ａｋ配列に変える。ＤＮＡ配列に施した変更は図３に示
してあり、以下のようにして実施した。
を得るために更に遺伝的に操作される。ＡｄｏＭｅｔａ
ｓｅ遺伝子配列の分析は、遺伝子の開始コドンの周囲に
ある最適ＤＮＡ配列よりも劣っていることを示した。
Ｍ．Ｋｏｚａｋ 「ＡＵＧ開始コドンに先立つ少なくと
も６個のヌクレオチドが哺乳動物細胞における翻訳を増
強する」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．， １９６：９４７−
９５０，１９８７の研究によると、効率的な翻訳を可能
にする真核生物ｍＲＮＡ用のコンセンサス開始配列が存
在する。ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子を遺伝的に操作し
て、ＡｄｏＭｅｔａｓｅ開始配列をコンセンサスＫｏｚ
ａｋ配列に変える。ＤＮＡ配列に施した変更は図３に示
してあり、以下のようにして実施した。
【００４４】実施例３ プラスミドｐＵＣ１９−ＡｄｏＭｅｔａｓｅをＸｍｎＩ
及びＢａｍ ＨＩで消化して、１．９ｋｂと１．３ｋｂ
の断片を、アガロースゲル電気泳動に次いで電気溶出に
よって精製する。図３に示す配列を有する２本鎖合成オ
リゴヌクレオチドリンカーを１．９ｋｂの断片と結合し
て、過剰のリンカーを除去するためにこの結合ＤＮＡを
Ｘｍｎで消化する。次いで結合した１．９ｋｂの断片を
低融点アガロース上での電気泳動によって精製し、１．
３ｋｂの断片と結合してプラスミドｐＵＣ１９ ＳＡＭ
−Ｋを作成する。変更した遺伝子領域をＤＮＡ配列分析
に付すと、図６に示すように予期されたＤＮＡ配列を含
むことが示された。この遺伝子をＳＡＭ−Ｋと命名し、
他の植物発現ベクターを構築するのに用いる。ｐＢｌ１
２１−ＳＡＭ−Ｋ（ＰＣ２７６０／ｐＢｌ１２１−ＳＡ
Ｍ−Ｋ）構築物を作成し、上記実施例１で記載した方法
を用いてタバコに導入する。このプラスミドＤＮＡは、
電気穿孔、マイクロインジェクション、又はマイクロブ
ロジェクタイルボンバードメントにより植物宿主を直接
形質転換するのに用いられる。
及びＢａｍ ＨＩで消化して、１．９ｋｂと１．３ｋｂ
の断片を、アガロースゲル電気泳動に次いで電気溶出に
よって精製する。図３に示す配列を有する２本鎖合成オ
リゴヌクレオチドリンカーを１．９ｋｂの断片と結合し
て、過剰のリンカーを除去するためにこの結合ＤＮＡを
Ｘｍｎで消化する。次いで結合した１．９ｋｂの断片を
低融点アガロース上での電気泳動によって精製し、１．
３ｋｂの断片と結合してプラスミドｐＵＣ１９ ＳＡＭ
−Ｋを作成する。変更した遺伝子領域をＤＮＡ配列分析
に付すと、図６に示すように予期されたＤＮＡ配列を含
むことが示された。この遺伝子をＳＡＭ−Ｋと命名し、
他の植物発現ベクターを構築するのに用いる。ｐＢｌ１
２１−ＳＡＭ−Ｋ（ＰＣ２７６０／ｐＢｌ１２１−ＳＡ
Ｍ−Ｋ）構築物を作成し、上記実施例１で記載した方法
を用いてタバコに導入する。このプラスミドＤＮＡは、
電気穿孔、マイクロインジェクション、又はマイクロブ
ロジェクタイルボンバードメントにより植物宿主を直接
形質転換するのに用いられる。
【００４５】実施例４ 以下の実施例は別の構築を開示する。図４は、上記ｐＢ
ｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔａｓｅ又はｐＢｌ１２１−ＳＡ
Ｍ−Ｋの類似体であるベクターｐＧＡ４８２−ＮＯＳ−
ＳＡＭの構築を説明するものである。この構築において
は、異なる親プラスミドと共に、異なるプロモーターを
使用する。親プラスミドはＰｈａｒｍａｃｉａ社から購
入したｐＧＡ４８２及びｐＮＣＮである。使用したプロ
モーターは、構成性ノパリン合成酵素プロモーター（Ｎ
ＯＳ−ｐｒｏ及びＮＯＳ−ｔｅｒｍ）である。
ｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔａｓｅ又はｐＢｌ１２１−ＳＡ
Ｍ−Ｋの類似体であるベクターｐＧＡ４８２−ＮＯＳ−
ＳＡＭの構築を説明するものである。この構築において
は、異なる親プラスミドと共に、異なるプロモーターを
使用する。親プラスミドはＰｈａｒｍａｃｉａ社から購
入したｐＧＡ４８２及びｐＮＣＮである。使用したプロ
モーターは、構成性ノパリン合成酵素プロモーター（Ｎ
ＯＳ−ｐｒｏ及びＮＯＳ−ｔｅｒｍ）である。
【００４６】標準法を用いて、ＤＮＡ断片ＮＯＳ−ｐｒ
ｏ及びＮＯＳ−ｔｅｒｍをｐＮＣＮから単離し、改変し
た酵素をコードするＳＡＭａｓｅ断片をｐＵＳ−ＳＡＭ
−Ｋから単離する。２つの断片を、図に示すように、適
当な制限部位でｐＧＡ４８２中に結合し、ＮＯＳ−ｐｒ
ｏ及びＮＯＳ−ｔｅｒｍ配列がＳＡＭａｓｅ断片と隣接
するようにする。プラスミドＧＡ４８２−ＮＯＳ−ＳＡ
Ｍをアクロバクテリウム・ツメファシエンス（ＰＣ２７
６０／ＧＡ４８２−ＮＯＳ−ＳＡＭ）に導入して、上記
のように植物を形質転換するのに使用する。
ｏ及びＮＯＳ−ｔｅｒｍをｐＮＣＮから単離し、改変し
た酵素をコードするＳＡＭａｓｅ断片をｐＵＳ−ＳＡＭ
−Ｋから単離する。２つの断片を、図に示すように、適
当な制限部位でｐＧＡ４８２中に結合し、ＮＯＳ−ｐｒ
ｏ及びＮＯＳ−ｔｅｒｍ配列がＳＡＭａｓｅ断片と隣接
するようにする。プラスミドＧＡ４８２−ＮＯＳ−ＳＡ
Ｍをアクロバクテリウム・ツメファシエンス（ＰＣ２７
６０／ＧＡ４８２−ＮＯＳ−ＳＡＭ）に導入して、上記
のように植物を形質転換するのに使用する。
【００４７】本発明の好ましい態様を示して説明した
が、本発明はこれらに限定されることなく、以下に記載
する請求の範囲内で多様に態様化され、実施されること
が容易に理解できるであろう。
が、本発明はこれらに限定されることなく、以下に記載
する請求の範囲内で多様に態様化され、実施されること
が容易に理解できるであろう。
【００４８】植物プロモーターのコントロール下にある
選択遺伝子と、ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有し、かつ一
方で植物プロモーターと隣り合っており、他方でポリＡ
シグナル配列と隣り合っている機能性異種ポリペプチド
のためのコドンからなるＤＮＡ挿入物とを含むベクター
を提供し；そして該ベクターで植物宿主を形質転換し、
これによって形質転換された植物宿主はコントロール領
域のコントロール下にＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する
異種ポリＡを発現することができる、ことからなる植物
中におけるエチレン生合成をコントロールする方法。
選択遺伝子と、ＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有し、かつ一
方で植物プロモーターと隣り合っており、他方でポリＡ
シグナル配列と隣り合っている機能性異種ポリペプチド
のためのコドンからなるＤＮＡ挿入物とを含むベクター
を提供し；そして該ベクターで植物宿主を形質転換し、
これによって形質転換された植物宿主はコントロール領
域のコントロール下にＡｄｏＭｅｔａｓｅ活性を有する
異種ポリＡを発現することができる、ことからなる植物
中におけるエチレン生合成をコントロールする方法。
【００４９】
【発明の効果】トランスジェニック植物中におけるＡｄ
ｏＭｅｔａｓｅの存在及び発現は、ＡｄｏＭｅｔレベル
を低くし、ＡＣＣ合成の阻害剤を生じ、これによって対
応するエチレン生合成と前駆体供給能を減少させる。Ｔ
３ ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子のコピーを含むトランス
ジェニック植物の構築はエチレン生合成をコントロール
する植物の構築を可能とし、果実、野菜、及び花の貯蔵
寿命と品質保存を改良した。
ｏＭｅｔａｓｅの存在及び発現は、ＡｄｏＭｅｔレベル
を低くし、ＡＣＣ合成の阻害剤を生じ、これによって対
応するエチレン生合成と前駆体供給能を減少させる。Ｔ
３ ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子のコピーを含むトランス
ジェニック植物の構築はエチレン生合成をコントロール
する植物の構築を可能とし、果実、野菜、及び花の貯蔵
寿命と品質保存を改良した。
【００５０】
SEQUENCE LISTING <110> Agritope, Inc. <120> Genetic control of ethylene biosynthesis in
plants <130> F1-9874F50 <150> JP P1991-501610 <151> 1990-12-12 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 152 <212> PRT <213> Bacteriophage T3 <400> 1 Met Val Phe Thr Lys Glu Pro Ala Asn Val Phe Tyr Val Leu Val Ser 1 5 10 15 Ala Phe Arg Ser Asn Leu Cys Asp Glu Val Asn Met Ser Arg His Arg 20 25 30 His Met Val Ser Thr Leu Arg Ala Ala Pro Gly Leu Tyr Gly Ser Val 35 40 45 Glu Ser Thr Asp Leu Thr Gly Cys Tyr Arg Glu Ala Ile Ser Ser Ala 50 55 60 Pro Thr Glu Glu Lys Thr Val Arg Val Arg Tyr Lys Asp Lys Ala Gln 65 70 75 80 Ala Leu Asn Val Ala Arg Leu Ala Cys Asn Glu Trp Glu Gln Asp Cys 85 90 95 Val Leu Val Tyr Lys Ser Gln Thr His Thr Ala Gly Leu Val Tyr Ala 100 105 110 Lys Gly Ile Asp Gly Tyr Lys Ala Glu Arg Leu Pro Gly Ser Phe Gln 115 120 125 Glu Val Pro Lys Gly Ala Pro Leu Gln Gly Cys Phe Thr Ile Asp Glu 130 135 140 Phe Gly Arg Arg Trp Gln Val Gln 145 150
plants <130> F1-9874F50 <150> JP P1991-501610 <151> 1990-12-12 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 152 <212> PRT <213> Bacteriophage T3 <400> 1 Met Val Phe Thr Lys Glu Pro Ala Asn Val Phe Tyr Val Leu Val Ser 1 5 10 15 Ala Phe Arg Ser Asn Leu Cys Asp Glu Val Asn Met Ser Arg His Arg 20 25 30 His Met Val Ser Thr Leu Arg Ala Ala Pro Gly Leu Tyr Gly Ser Val 35 40 45 Glu Ser Thr Asp Leu Thr Gly Cys Tyr Arg Glu Ala Ile Ser Ser Ala 50 55 60 Pro Thr Glu Glu Lys Thr Val Arg Val Arg Tyr Lys Asp Lys Ala Gln 65 70 75 80 Ala Leu Asn Val Ala Arg Leu Ala Cys Asn Glu Trp Glu Gln Asp Cys 85 90 95 Val Leu Val Tyr Lys Ser Gln Thr His Thr Ala Gly Leu Val Tyr Ala 100 105 110 Lys Gly Ile Asp Gly Tyr Lys Ala Glu Arg Leu Pro Gly Ser Phe Gln 115 120 125 Glu Val Pro Lys Gly Ala Pro Leu Gln Gly Cys Phe Thr Ile Asp Glu 130 135 140 Phe Gly Arg Arg Trp Gln Val Gln 145 150
【図１ａ】図１ａは、植物組織におけるエチレン生合成
経路を模式的に表す図である。
経路を模式的に表す図である。
【図１ｂ】図１ｂは、ＡｄｏＭｅｔａｓｅを有するエチ
レン生合成経路を模式的に表す図である。
レン生合成経路を模式的に表す図である。
【図１ｃ】図１ｃは、メチオニン再循環経路を模式的に
表す図である。
表す図である。
【図２】図２は、ｐＢｌ１２１−ＡｄｏＭｅｔａｓｅの
構築を模式的に表す図である。
構築を模式的に表す図である。
【図３】図３は、ＡｄｏＭｅｔａｓｅ遺伝子の遺伝子操
作を模式的に表す図である。
作を模式的に表す図である。
【図４】図４は、ｐＧＡ４８２−ＮＯＳ−ＳＡＭの別の
構築を模式的に表す図である。
構築を模式的に表す図である。
【図５】図５は、トランスジェニック植物におけるＳＡ
Ｍａｓｅ活性を示す図である。
Ｍａｓｅ活性を示す図である。
【図６ａ】図６ａは、修飾５’末端を有するＡｄｏＭｅ
ｔａｓｅ遺伝子をコードするｐＵＣ１９ＳＡＭ−Ｋのヌ
クレオチド配列の一部を示す図である。
ｔａｓｅ遺伝子をコードするｐＵＣ１９ＳＡＭ−Ｋのヌ
クレオチド配列の一部を示す図である。
【図６ｂ】図６ｂは、図６ａの続きである。
フロントページの続き (71)出願人 598146506 8505 Ｓ．Ｗ． Ｃｒｅｅｋｓｉｄｅ Ｐ ｌａｃｅ， Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，Ｏｒｅ ｇｏｎ 97005，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ ｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 リチャード ケー ベストウィック アメリカ合衆国、オレゴン州 97223、ポ ートランド、エス．ダブリュ．キャンビー 6680 (72)発明者 リイル アール ブラウン アメリカ合衆国、オレゴン州 97330、コ ーバリース、エヌ．ダブリュ．ノーウッド プレイス 3137
Claims (20)
- 【請求項１】 （ｉｉａ）Ｓ−アデノシルメチオニンを
ホモセリン及び５’−メチルチオアデノシンに加水分解
する、配列番号１のアミノ酸配列で示されるタンパク質
であるＳ−アデノシルメチオニン加水分解酵素をコード
し、発現するか、または（ｉｉｂ）Ｓ−アデノシルメチ
オニン加水分解酵素を示す配列番号１のアミノ酸配列に
おいて、１または複数のアミノ酸が付加、欠失および／
または他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有し、
かつ、配列番号１のアミノ酸配列で示されるＳ−アデノ
シルメチオニン加水分解酵素と実質的に同等の酵素機能
を有するタンパク質をコードし、発現するＤＮＡ配列を
含むトランスジェニック植物細胞を含む、トランスジェ
ニック植物。 - 【請求項２】 植物宿主を形質転換するのに有用なベク
ターによって植物細胞を形質転換して得られるトランス
ジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物であ
って：このベクターは、植物細胞中の遺伝子選択のため
に有用な遺伝子を含有し、植物宿主におけるその発現に
効果的な制御因子と隣りあっている第一のＤＮＡ配列；
及び更に（ｉ）植物宿主におけるその発現に効果的な制
御因子と隣りあっており、（ｉｉａ）Ｓ−アデノシルメ
チオニンをホモセリン及び５’−メチルチオアデノシン
に加水分解する、配列番号１のアミノ酸配列で示される
タンパク質であるＳ−アデノシルメチオニン加水分解酵
素をコードするか、または（ｉｉｂ）Ｓ−アデノシルメ
チオニン加水分解酵素を示す配列番号１のアミノ酸配列
において、１または複数のアミノ酸が付加、欠失および
／または他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有す
るタンパク質をコードし、該タンパク質は配列番号１の
アミノ酸配列で示されるＳ−アデノシルメチオニン加水
分解酵素と実質的に同等の酵素機能を有する第二のＤＮ
Ａ配列を含む、トランスジェニック植物。 - 【請求項３】 第二のＤＮＡ配列と隣りあっている制御
因子が植物プロモーターを含有しており、この植物プロ
モーターが第二のＤＮＡ配列の組織特異的、温度依存性
又は光依存性の発現を与える、請求項２に記載のトラン
スジェニック植物。 - 【請求項４】 第二のＤＮＡ配列が配列番号１のアミノ
酸配列で示されるタンパク質をコードする、請求項２又
は３に記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項５】 Ｓ−アデノシルメチオニン加水分解酵素
が大腸菌バクテリオファージＴ３、コリファージＢＡ１
４、クレブシエラファージＫ１１及びセラチアファージ
ＩＶからなる群から選択されるバクテリオファージに由
来するものである、請求項２又は３に記載のトランスジ
ェニック植物。 - 【請求項６】 植物細胞中の遺伝子選択に有用な遺伝子
がカナマイシン耐性を授与する遺伝子である、請求項２
〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項７】 第二のＤＮＡ配列と隣りあっている制御
因子が植物プロモーターを含有しており、この植物プロ
モーターが構成性ノパリン合成酵素プロモーターであ
る、請求項２〜６のいずれか１項に記載のトランスジェ
ニック植物。 - 【請求項８】 第二のＤＮＡ配列と隣りあっている制御
因子が植物プロモーターを含有しており、この植物プロ
モーターが構成性発現プロモーターである、請求項２〜
６のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項９】 構成性発現プロモーターがカリフラワー
モザイクウイルスプロモーターである、請求項８に記載
のトランスジェニック植物。 - 【請求項１０】 植物細胞が果実、野菜または花を生産
する植物から得られる、請求項１〜９のいずれか１項に
記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項１１】 タバコ植物又はトマト植物である、請
求項１〜１０のいずれか１項に記載の植物。 - 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載
の植物の種。 - 【請求項１３】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載
の植物の果実。 - 【請求項１４】 請求項１〜１０のいずれか１項に記載
の植物の野菜部分。 - 【請求項１５】 請求項１〜１０のいずれか１項に記載
の植物の花。 - 【請求項１６】 トランスジェニック植物の生産方法で
あって：植物宿主を形質転換するのに有用なベクターを
提供し、ここで、このベクターは、植物細胞中の遺伝子
選択のために有用な遺伝子を含有し、植物宿主における
その発現に効果的な制御因子と隣りあっている第一のＤ
ＮＡ配列；及び更に（ｉ）植物宿主におけるその発現に
効果的な制御因子と隣りあっており、（ｉｉａ）Ｓ−ア
デノシルメチオニンをホモセリン及び５’−メチルチオ
アデノシンに加水分解する、配列番号１のアミノ酸配列
で示されるタンパク質であるＳ−アデノシルメチオニン
加水分解酵素をコードするか、または（ｉｉｂ）Ｓ−ア
デノシルメチオニン加水分解酵素を示す配列番号１のア
ミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が付加、
欠失および／または他のアミノ酸で置換されたアミノ酸
配列を有するタンパク質をコードし、該タンパク質は配
列番号１のアミノ酸配列で示されるＳ−アデノシルメチ
オニン加水分解酵素と実質的に同等の酵素機能を有する
第二のＤＮＡ配列を含み；該ベクターによって植物宿主
細胞を形質転換し、植物宿主細胞がＳ−アデノシルメチ
オニン加水分解酵素を発現しうるように形質転換された
植物宿主細胞を生産し；そしてその形質転換された細胞
からのトランスジェニック植物の再生を促進する条件下
で形質転換された植物宿主細胞を培養する；ことを含
む、トランスジェニック植物の生産方法。 - 【請求項１７】 トランスジェニック果実の生産方法で
あって：植物宿主を形質転換するのに有用なベクターを
提供し、ここで、このベクターは、植物細胞中の遺伝子
選択のために有用な遺伝子を含有し、植物宿主における
その発現に効果的な制御因子と隣りあっている第一のＤ
ＮＡ配列；及び更に（ｉ）植物宿主におけるその発現に
効果的な制御因子と隣りあっており、（ｉｉａ）Ｓ−ア
デノシルメチオニンをホモセリン及び５’−メチルチオ
アデノシンに加水分解する、配列番号１のアミノ酸配列
で示されるタンパク質であるＳ−アデノシルメチオニン
加水分解酵素をコードするか、または（ｉｉｂ）Ｓ−ア
デノシルメチオニン加水分解酵素を示す配列番号１のア
ミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が付加、
欠失および／または他のアミノ酸で置換されたアミノ酸
配列を有するタンパク質をコードし、該タンパク質は配
列番号１のアミノ酸配列で示されるＳ−アデノシルメチ
オニン加水分解酵素と実質的に同等の酵素機能を有する
第二のＤＮＡ配列を含み；該ベクターによって果実収穫
植物由来の植物宿主細胞を形質転換し、植物宿主細胞が
Ｓ−アデノシルメチオニン加水分解酵素を発現しうるよ
うに形質転換された植物宿主細胞を生産し；その形質転
換された細胞からのトランスジェニック植物の再生を促
進する条件下で形質転換された植物宿主細胞を培養し；
そしてそのトランスジェニック植物を育成してトランス
ジェニック果実を生産する；ことを含む、トランスジェ
ニック果実の生産方法。 - 【請求項１８】 トランスジェニック野菜の生産方法で
あって：植物宿主を形質転換するのに有用なベクターを
提供し、ここで、このベクターは、植物細胞中の遺伝子
選択のために有用な遺伝子を含有し、植物宿主における
その発現に効果的な制御因子と隣りあっている第一のＤ
ＮＡ配列；及び更に（ｉ）植物宿主におけるその発現に
効果的な制御因子と隣りあっており、（ｉｉａ）Ｓ−ア
デノシルメチオニンをホモセリン及び５’−メチルチオ
アデノシンに加水分解する、配列番号１のアミノ酸配列
で示されるタンパク質であるＳ−アデノシルメチオニン
加水分解酵素をコードするか、または（ｉｉｂ）Ｓ−ア
デノシルメチオニン加水分解酵素を示す配列番号１のア
ミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が付加、
欠失および／または他のアミノ酸で置換されたアミノ酸
配列を有するタンパク質をコードし、該タンパク質は配
列番号１のアミノ酸配列で示されるＳ−アデノシルメチ
オニン加水分解酵素と実質的に同等の酵素機能を有する
第二のＤＮＡ配列を含み；該ベクターによって野菜収穫
植物由来の植物宿主細胞を形質転換し、植物宿主細胞が
Ｓ−アデノシルメチオニン加水分解酵素を発現しうるよ
うに形質転換された植物宿主細胞を生産し；その形質転
換された細胞からのトランスジェニック植物の再生を促
進する条件下で形質転換された植物宿主細胞を培養し；
そしてそのトランスジェニック植物を育成してトランス
ジェニック野菜を生産する；ことを含む、トランスジェ
ニック野菜の生産方法。 - 【請求項１９】 トランスジェニック花の生産方法であ
って：植物宿主を形質転換するのに有用なベクターを提
供し、ここで、このベクターは、植物細胞中の遺伝子選
択のために有用な遺伝子を含有し、植物宿主におけるそ
の発現に効果的な制御因子と隣りあっている第一のＤＮ
Ａ配列；及び更に（ｉ）植物宿主におけるその発現に効
果的な制御因子と隣りあっており、（ｉｉａ）Ｓ−アデ
ノシルメチオニンをホモセリン及び５’−メチルチオア
デノシンに加水分解する、配列番号１のアミノ酸配列で
示されるタンパク質であるＳ−アデノシルメチオニン加
水分解酵素をコードするか、または（ｉｉｂ）Ｓ−アデ
ノシルメチオニン加水分解酵素を示す配列番号１のアミ
ノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が付加、欠
失および／または他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配
列を有するタンパク質をコードし、該タンパク質は配列
番号１のアミノ酸配列で示されるＳ−アデノシルメチオ
ニン加水分解酵素と実質的に同等の酵素機能を有する第
二のＤＮＡ配列を含み；該ベクターによって花収穫植物
由来の植物宿主細胞を形質転換し、植物宿主細胞がＳ−
アデノシルメチオニン加水分解酵素を発現しうるように
形質転換された植物宿主細胞を生産し；その形質転換さ
れた細胞からのトランスジェニック植物の再生を促進す
る条件下で形質転換された植物宿主細胞を培養し；そし
てそのトランスジェニック植物を育成してトランスジェ
ニック花を生産する；ことを含む、トランスジェニック
花の生産方法。 - 【請求項２０】 トランスジェニック種の生産方法であ
って：植物宿主を形質転換するのに有用なベクターを提
供し、ここで、このベクターは、植物細胞中の遺伝子選
択のために有用な遺伝子を含有し、植物宿主におけるそ
の発現に効果的な制御因子と隣りあっている第一のＤＮ
Ａ配列；及び更に（ｉ）植物宿主におけるその発現に効
果的な制御因子と隣りあっており、（ｉｉａ）Ｓ−アデ
ノシルメチオニンをホモセリン及び５’−メチルチオア
デノシンに加水分解する、配列番号１のアミノ酸配列で
示されるタンパク質であるＳ−アデノシルメチオニン加
水分解酵素をコードするか、または（ｉｉｂ）Ｓ−アデ
ノシルメチオニン加水分解酵素を示す配列番号１のアミ
ノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が付加、欠
失および／または他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配
列を有するタンパク質をコードし、該タンパク質は配列
番号１のアミノ酸配列で示されるＳ−アデノシルメチオ
ニン加水分解酵素と実質的に同等の酵素機能を有する第
二のＤＮＡ配列を含み；該ベクターによって種収穫植物
由来の植物宿主細胞を形質転換し、植物宿主細胞がＳ−
アデノシルメチオニン加水分解酵素を発現しうるように
形質転換された植物宿主細胞を生産し；その形質転換さ
れた細胞からのトランスジェニック植物の再生を促進す
る条件下で形質転換された植物宿主細胞を培養し；そし
てそのトランスジェニック植物を育成してトランスジェ
ニック種を生産する；ことを含む、トランスジェニック
種の生産方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44809589A | 1989-12-12 | 1989-12-12 | |
| US448.095 | 1989-12-12 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3501610A Division JP2972779B2 (ja) | 1989-12-12 | 1990-12-12 | 植物におけるエチレン生合成の遺伝子制御 |
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|---|---|
| JPH11243799A true JPH11243799A (ja) | 1999-09-14 |
Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3501610A Expired - Fee Related JP2972779B2 (ja) | 1989-12-12 | 1990-12-12 | 植物におけるエチレン生合成の遺伝子制御 |
| JP10303075A Pending JPH11243799A (ja) | 1989-12-12 | 1998-10-23 | 植物におけるエチレン生合成の遺伝子制御 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3501610A Expired - Fee Related JP2972779B2 (ja) | 1989-12-12 | 1990-12-12 | 植物におけるエチレン生合成の遺伝子制御 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (2) | JP2972779B2 (ja) |
| KR (1) | KR100199225B1 (ja) |
| AT (1) | ATE168716T1 (ja) |
| AU (1) | AU655408B2 (ja) |
| CA (1) | CA2068644C (ja) |
| DE (1) | DE69032503T2 (ja) |
| DK (1) | DK0505440T3 (ja) |
| ES (1) | ES2120957T3 (ja) |
| WO (1) | WO1991009112A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5859330A (en) * | 1989-12-12 | 1999-01-12 | Epitope, Inc. | Regulated expression of heterologous genes in plants and transgenic fruit with a modified ripening phenotype |
| ATE181964T1 (de) * | 1990-04-26 | 1999-07-15 | Calgene Llc | Methoden und reagentien um das ethylenniveau in pflanzen zu modulieren |
| FR2665176B1 (fr) * | 1990-07-27 | 1994-09-16 | Bio Obtention Sc | Nouveau complexe genique utile notamment pour la modification des vegetaux tels que cucumis melo incorporant ce complexe genique. |
| BR9107191A (pt) * | 1990-12-26 | 1994-06-14 | Monsanto Co | Controle de amadurecimento de frutos e senescência em plantas |
| AU661350B2 (en) * | 1991-10-18 | 1995-07-20 | Valent Biosciences Corporation | Method of accelerating and prolonging flowering in plants |
| US5744693A (en) * | 1992-10-02 | 1998-04-28 | California Institute Of Technology | Plants having altered floral development |
| US6054635A (en) * | 1994-06-17 | 2000-04-25 | Agritope, Inc. | Raspberry promoter and methods for expression of transgenes in plants |
| US5750870A (en) * | 1994-06-17 | 1998-05-12 | Agritope, Inc. | Plant genetic transformation methods and transgenic plants |
| IL115414A (en) | 1994-09-26 | 2001-04-30 | Novartis Ag | Method of obtaining plants which exhibit delayed or inhibited fruit ripening and/or senescence |
| DE4444708A1 (de) * | 1994-12-15 | 1996-06-20 | Basf Ag | Verwendung von Herbiziden vom Auxin-Typ zur Behandlung von transgenen Kulturpflanzen |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
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