JPH11243965A - 高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片 - Google Patents
高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片Info
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- JPH11243965A JPH11243965A JP10066114A JP6611498A JPH11243965A JP H11243965 A JPH11243965 A JP H11243965A JP 10066114 A JP10066114 A JP 10066114A JP 6611498 A JP6611498 A JP 6611498A JP H11243965 A JPH11243965 A JP H11243965A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 Aspergillus oryzaeのグルコアミラーゼ
Ｂ遺伝子（ｇｌａＢ）の５′側上流２１３ｂｐより更に
上流３５０ｂｐまで、あるいは、同じく２５４ｂｐより
更に上流３５０ｂｐまで、あるいは、同じく３２４ｂｐ
より更に上流３５０ｂｐまでの非翻訳領域からなるＤＮ
Ａ断片。 【効果】 本ＤＮＡ断片は、ｇｌａＢプロモーターの中
心部分をなすものであって、同種及び／又は異種遺伝子
の効率的発現に利用できる。
Ｂ遺伝子（ｇｌａＢ）の５′側上流２１３ｂｐより更に
上流３５０ｂｐまで、あるいは、同じく２５４ｂｐより
更に上流３５０ｂｐまで、あるいは、同じく３２４ｂｐ
より更に上流３５０ｂｐまでの非翻訳領域からなるＤＮ
Ａ断片。 【効果】 本ＤＮＡ断片は、ｇｌａＢプロモーターの中
心部分をなすものであって、同種及び／又は異種遺伝子
の効率的発現に利用できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、麹菌のグルコアミ
ラーゼ遺伝子Ｂ（ｇｌａＢ）のプロモーター領域及びこ
れを利用した同種又は異種遺伝子発現システムに関す
る。更に詳細には、本発明は、麹菌（Aspergillus oryz
ae）の固体培養で特に多量に発現しているｇｌａＢ遺伝
子のプロモーター領域を利用し、同種又は異種遺伝子を
麹菌で効率的に発現させるシステムの構築に関するもの
であって、有用タンパク質の高生産を可能にするもので
ある。
ラーゼ遺伝子Ｂ（ｇｌａＢ）のプロモーター領域及びこ
れを利用した同種又は異種遺伝子発現システムに関す
る。更に詳細には、本発明は、麹菌（Aspergillus oryz
ae）の固体培養で特に多量に発現しているｇｌａＢ遺伝
子のプロモーター領域を利用し、同種又は異種遺伝子を
麹菌で効率的に発現させるシステムの構築に関するもの
であって、有用タンパク質の高生産を可能にするもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子組換え技術の発展ととも
に、ヒトの有用タンパク質が大腸菌や酵母を用いて生産
することが可能となってきた。しかし大腸菌を宿主とし
てヒトなどの真核生物由来の遺伝子を発現させた場合、
正常なプロセッシングが行われない、糖鎖が付着しない
などの問題点が指摘されている。また、酵母によって異
種タンパクの分泌生産を行う場合は、糖鎖結合はされる
ものの、その分泌量が非常に少ないという欠点を有す
る。そこで高いタンパク分泌能を持つ糸状菌が、真核生
物のタンパク発現の宿主として注目されてきた。なかで
も黄麹菌Aspergillusoryzaeは、清酒や味噌など醸造産
業上で長く使用された実績から、異種遺伝子発現への応
用に積極的に利用されている。既に、Mucor mieneiの酸
性プロテアーゼが麹菌（A. oryzae）を宿主として工業
生産されている。
に、ヒトの有用タンパク質が大腸菌や酵母を用いて生産
することが可能となってきた。しかし大腸菌を宿主とし
てヒトなどの真核生物由来の遺伝子を発現させた場合、
正常なプロセッシングが行われない、糖鎖が付着しない
などの問題点が指摘されている。また、酵母によって異
種タンパクの分泌生産を行う場合は、糖鎖結合はされる
ものの、その分泌量が非常に少ないという欠点を有す
る。そこで高いタンパク分泌能を持つ糸状菌が、真核生
物のタンパク発現の宿主として注目されてきた。なかで
も黄麹菌Aspergillusoryzaeは、清酒や味噌など醸造産
業上で長く使用された実績から、異種遺伝子発現への応
用に積極的に利用されている。既に、Mucor mieneiの酸
性プロテアーゼが麹菌（A. oryzae）を宿主として工業
生産されている。
【０００３】異種タンパクを効率よく生産させるために
は、まず高い発現能力を有するプロモーターを検索する
必要がある。現在までにA. oryzaeから単離されたプロ
モーターでは、αアミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ
遺伝子、αグルコシダーゼ遺伝子などが挙げられる。こ
れらのプロモーターを利用した異種タンパク生産につい
ても研究されているが、その培養方法は液体培養で行わ
れることがほとんどであった。
は、まず高い発現能力を有するプロモーターを検索する
必要がある。現在までにA. oryzaeから単離されたプロ
モーターでは、αアミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ
遺伝子、αグルコシダーゼ遺伝子などが挙げられる。こ
れらのプロモーターを利用した異種タンパク生産につい
ても研究されているが、その培養方法は液体培養で行わ
れることがほとんどであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、本来麹菌は、
液体培養に比べて固体培養の方がはるかに多量のタンパ
ク質を分泌するため、固体培養での物質生産を行った方
が高い生産性が期待できる。さらに固体培養で高発現す
るプロモーターが検索できれば、より一層生産量が上昇
すると考えられる。このような観点から、本発明は麹菌
における各種遺伝子の高発現システムを新たに開発する
目的でなされたものである。
液体培養に比べて固体培養の方がはるかに多量のタンパ
ク質を分泌するため、固体培養での物質生産を行った方
が高い生産性が期待できる。さらに固体培養で高発現す
るプロモーターが検索できれば、より一層生産量が上昇
すると考えられる。このような観点から、本発明は麹菌
における各種遺伝子の高発現システムを新たに開発する
目的でなされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、固体培養
において特異的に大量発現する新しいグルコアミラーゼ
遺伝子ｇｌａＢを発見し、そのプロモーター及び蛋白質
コード領域の塩基配列を決定するのに成功し、既に特許
出願を行った（特願平８−２６７７０１）。
において特異的に大量発現する新しいグルコアミラーゼ
遺伝子ｇｌａＢを発見し、そのプロモーター及び蛋白質
コード領域の塩基配列を決定するのに成功し、既に特許
出願を行った（特願平８−２６７７０１）。
【０００６】このグルコアミラーゼＢ遺伝子ｇｌａＢ
は、既にA. oryzaeからクローニングされているグルコ
アミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）とは異なる新規遺伝子で
あって、レポーター遺伝子を用いたプロモーター解析の
結果から、この新規ｇｌａＢ遺伝子のプロモーターは既
知のｇｌａＡ遺伝子のプロモーターに比べて、固体培養
において２００倍も強い発現能力を有することも発見
し、この新知見についても、本発明者らは既に特許出願
を行った（平成１０年２月２０日付「麹菌の培養方法」
に関する特許出願）。
は、既にA. oryzaeからクローニングされているグルコ
アミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）とは異なる新規遺伝子で
あって、レポーター遺伝子を用いたプロモーター解析の
結果から、この新規ｇｌａＢ遺伝子のプロモーターは既
知のｇｌａＡ遺伝子のプロモーターに比べて、固体培養
において２００倍も強い発現能力を有することも発見
し、この新知見についても、本発明者らは既に特許出願
を行った（平成１０年２月２０日付「麹菌の培養方法」
に関する特許出願）。
【０００７】本発明者らは、このｇｌａＢ遺伝子が固体
培養で高発現するためには、この遺伝子のプロモーター
領域に高発現に必要な領域が存在すると考え、この観点
から、上記した本発明の目的を達成するためには、上記
領域をつきとめる必要を認めた。そこで本発明者らは、
ｇｌａＢ遺伝子のプロモーター領域を種々の方法にて解
析した結果、固体培養での高発現に必要な領域を特定す
るのに成功し、更に研究の結果、本発明の完成に至った
ものである。
培養で高発現するためには、この遺伝子のプロモーター
領域に高発現に必要な領域が存在すると考え、この観点
から、上記した本発明の目的を達成するためには、上記
領域をつきとめる必要を認めた。そこで本発明者らは、
ｇｌａＢ遺伝子のプロモーター領域を種々の方法にて解
析した結果、固体培養での高発現に必要な領域を特定す
るのに成功し、更に研究の結果、本発明の完成に至った
ものである。
【０００８】この領域は、固体培養において発現を誘導
する正の転写因子と考えられ、この領域を利用すれば以
下のことが可能となる。この領域を他の遺伝子のプロ
モーター領域に挿入することにより、プロモーター活性
（特に固体培養での）を上昇させることができる。こ
の領域を複数連結してｇｌａＢプロモーターに挿入する
ことにより、ｇｌａＢプロモーターの発現量をさらに上
昇させることができる。以下、本発明について詳述す
る。
する正の転写因子と考えられ、この領域を利用すれば以
下のことが可能となる。この領域を他の遺伝子のプロ
モーター領域に挿入することにより、プロモーター活性
（特に固体培養での）を上昇させることができる。こ
の領域を複数連結してｇｌａＢプロモーターに挿入する
ことにより、ｇｌａＢプロモーターの発現量をさらに上
昇させることができる。以下、本発明について詳述す
る。
【０００９】まず、プロモーター解析を行うについて
は、ｇｌａＢ遺伝子プロモーターの下流域にレポーター
遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子産物の活性をプ
ロモーター発現の指標とする方法を採用した。
は、ｇｌａＢ遺伝子プロモーターの下流域にレポーター
遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子産物の活性をプ
ロモーター発現の指標とする方法を採用した。
【００１０】具体的には、図１に示すような、形質転換
用マーカーであるA. oryzae（硝酸還元酵素欠損変異
株）のｎｉａＤ遺伝子（S. Unklesら、Mol. Gen. Gene
t., 218,p.99-104, 1989）と、レポーター遺伝子である
大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする
ｕｉｄＡ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Aca
d. Sci., p.8447-8451, 1986）を含むベクターｐＮＧＵ
Ｓを作製した。そして、ｕｉｄＡ遺伝子の上流域に、ｇ
ｌａＢ遺伝子のプロモーター領域あるいはその一部分を
挿入して、プロモーター解析用プラスミドを構築した。
用マーカーであるA. oryzae（硝酸還元酵素欠損変異
株）のｎｉａＤ遺伝子（S. Unklesら、Mol. Gen. Gene
t., 218,p.99-104, 1989）と、レポーター遺伝子である
大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする
ｕｉｄＡ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Aca
d. Sci., p.8447-8451, 1986）を含むベクターｐＮＧＵ
Ｓを作製した。そして、ｕｉｄＡ遺伝子の上流域に、ｇ
ｌａＢ遺伝子のプロモーター領域あるいはその一部分を
挿入して、プロモーター解析用プラスミドを構築した。
【００１１】このプラスミドによりA. oryzae（Aspergi
llus oryzae GLB-01 : 本菌株は、工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８２６として寄託
されている）のｎｉａＤ変異株（亜硝酸を資化できない
変異株：Nitrate Reductase欠損株）を形質転換し、導
入プラスミドが宿主染色体のｎｉａＤ ｌｏｃｉでｌコ
ピーだけ導入された形質転換体を選択した。
llus oryzae GLB-01 : 本菌株は、工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８２６として寄託
されている）のｎｉａＤ変異株（亜硝酸を資化できない
変異株：Nitrate Reductase欠損株）を形質転換し、導
入プラスミドが宿主染色体のｎｉａＤ ｌｏｃｉでｌコ
ピーだけ導入された形質転換体を選択した。
【００１２】これらの形質転換体のＧＵＳ活性を測定す
ることにより、プロモーター活性の指標とした。まずプ
ロモーター領域の上流から順次欠失したＤＮＡ断片を調
製し、固体培養と液体培養でプロモーター活性を比較し
た。その結果、−３５６まで欠失しても、固体培養での
高いプロモーター活性は変化がないが、さらに−２１３
まで欠失させるとその活性は急激に低下した。したがっ
てこの−３５５から−２１３の間に、固体培養での高発
現に重要な領域が含まれていると考えられた。次にこの
領域をｇｌａＡプロモーターに挿入し固体培養でのプロ
モーター活性を検討した。その結果、本来固体培養では
ほとんど発現しないｇｌａＡプロモーターが、この領域
を挿入することにより固体培養でｇｌａＢとほとんど同
程度の発現量をしめすようになった。
ることにより、プロモーター活性の指標とした。まずプ
ロモーター領域の上流から順次欠失したＤＮＡ断片を調
製し、固体培養と液体培養でプロモーター活性を比較し
た。その結果、−３５６まで欠失しても、固体培養での
高いプロモーター活性は変化がないが、さらに−２１３
まで欠失させるとその活性は急激に低下した。したがっ
てこの−３５５から−２１３の間に、固体培養での高発
現に重要な領域が含まれていると考えられた。次にこの
領域をｇｌａＡプロモーターに挿入し固体培養でのプロ
モーター活性を検討した。その結果、本来固体培養では
ほとんど発現しないｇｌａＡプロモーターが、この領域
を挿入することにより固体培養でｇｌａＢとほとんど同
程度の発現量をしめすようになった。
【００１３】そこで、さらにこの−３５５から−２１３
の領域の中で、高発現に必要な領域の限定を試みた。そ
の結果、−３５０から−３２４の２７塩基対の欠失だけ
でも固体培養での発現が大きく低下することが明らかと
なった。また、この領域を含む−３５０から−２５４の
９７塩基対及び−３５０から−２１３の１３８塩基対を
ｇｌａＡプロモーター領域に挿入した場合、いずれにお
いても、固体培養での発現能力を飛躍的に上昇させるこ
とができた。したがって、上記２７塩基対はｇｌａＢプ
ロモーターのコアサイトまたは少なくともコアサイト関
連領域と認められ、このコアサイト領域を含む９７塩基
対も高発現に関与する重要な領域と認められた。
の領域の中で、高発現に必要な領域の限定を試みた。そ
の結果、−３５０から−３２４の２７塩基対の欠失だけ
でも固体培養での発現が大きく低下することが明らかと
なった。また、この領域を含む−３５０から−２５４の
９７塩基対及び−３５０から−２１３の１３８塩基対を
ｇｌａＡプロモーター領域に挿入した場合、いずれにお
いても、固体培養での発現能力を飛躍的に上昇させるこ
とができた。したがって、上記２７塩基対はｇｌａＢプ
ロモーターのコアサイトまたは少なくともコアサイト関
連領域と認められ、このコアサイト領域を含む９７塩基
対も高発現に関与する重要な領域と認められた。
【００１４】以上のとおり、本発明者らは、ｇｌａＢプ
ロモーター領域の中で、固体培養での高発現に重要な領
域を限定することに成功した。この領域は麹菌での転写
誘導を活性する因子であると考えられ、この領域を用い
ることにより高発現プロモーター構築が可能である。例
えば、ｇｌａＡプロモーターにこの領域を挿入すること
により、固体培養での発現能を１００倍以上に増加する
ことができる。また、この領域をｇｌａＢプロモーター
に挿入することにより、固体培養での発現能がさらに上
昇する。したがって、このような改変プロモーターを利
用することにより、A. oryzaeにおいて異種遺伝子タン
パク（酵素、その他生理活性物質）を高生産させること
ができる。
ロモーター領域の中で、固体培養での高発現に重要な領
域を限定することに成功した。この領域は麹菌での転写
誘導を活性する因子であると考えられ、この領域を用い
ることにより高発現プロモーター構築が可能である。例
えば、ｇｌａＡプロモーターにこの領域を挿入すること
により、固体培養での発現能を１００倍以上に増加する
ことができる。また、この領域をｇｌａＢプロモーター
に挿入することにより、固体培養での発現能がさらに上
昇する。したがって、このような改変プロモーターを利
用することにより、A. oryzaeにおいて異種遺伝子タン
パク（酵素、その他生理活性物質）を高生産させること
ができる。
【００１５】このように、このｇｌａＢプロモーター内
の転写活性を誘導する領域は、麹菌での高発現プロモー
ターの構築に有用で、広く外来遺伝子の発現に活用され
うるものである。なお、本発明に係るコアサイト、この
領域を含む９７塩基対及び１３８塩基対からなる重要領
域は、実際の製麹に使用される野生株であるAspergillu
s oryzaeが有するｇｌａＢ遺伝子（特願平８−２６７７
０１：その塩基配列を図５に示す）に含まれているの
で、そこから切り出して使用してもよいし（野生株の１
例としては、A. oryzae GLB-01（FERM P-15826）が例示
される）、常法にしたがって合成してもよい。また、該
コアサイト及び／又は重要領域は、そのＤＮＡ塩基配列
の一部について、塩基の置換、削除、挿入、転移等を行
ってもよく、このようにして得られた各種の高発現ベク
タープラスミド用ＤＮＡ断片も本発明に広く包含される
ものである。
の転写活性を誘導する領域は、麹菌での高発現プロモー
ターの構築に有用で、広く外来遺伝子の発現に活用され
うるものである。なお、本発明に係るコアサイト、この
領域を含む９７塩基対及び１３８塩基対からなる重要領
域は、実際の製麹に使用される野生株であるAspergillu
s oryzaeが有するｇｌａＢ遺伝子（特願平８−２６７７
０１：その塩基配列を図５に示す）に含まれているの
で、そこから切り出して使用してもよいし（野生株の１
例としては、A. oryzae GLB-01（FERM P-15826）が例示
される）、常法にしたがって合成してもよい。また、該
コアサイト及び／又は重要領域は、そのＤＮＡ塩基配列
の一部について、塩基の置換、削除、挿入、転移等を行
ってもよく、このようにして得られた各種の高発現ベク
タープラスミド用ＤＮＡ断片も本発明に広く包含される
ものである。
【００１６】
【実施例１】ｇｌａＢ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）か
ら５′上流の非翻訳領域の１１２８塩基対を、プロモー
ター解析用プラスミドｐＮＧＵＳ（図１）のＰｓｔＩ、
Ｓａ１Ｉサイトに挿入した。次に、この１１２８塩基対
の５′上流側から、順次欠失したＤＮＡ断片を調製し、
それぞれ同様にｐＮＧＵＳに挿入した。得られたプラス
ミドにてA. oryzaeを形質転換後、導入したプラスミド
が宿主染色体上で単一コピーで相同組換えした形質転換
体を選択した。これらの形質転換体を、デンプンを炭素
源としたツァペック−ドックス培地による液体培養と７
０％精白米を用いた固体培養（米麹培養）を行い、生産
されるＧＵＳ活性を測定した（図２）。その結果、１１
２８塩基対すべてを含むものと比べて、５′側上流３５
６塩基対まで欠失させても、固体培養でのＧＵＳ活性は
ほとんど低下しなかった。しかし、−２７２まで欠失し
たものでは、固体培養でのＧＵＳ活性が大きく減少し
た。したがって、この−３５５から−２７２の間に、固
体培養での高発現に関与する領域が存在すると考えられ
た。
ら５′上流の非翻訳領域の１１２８塩基対を、プロモー
ター解析用プラスミドｐＮＧＵＳ（図１）のＰｓｔＩ、
Ｓａ１Ｉサイトに挿入した。次に、この１１２８塩基対
の５′上流側から、順次欠失したＤＮＡ断片を調製し、
それぞれ同様にｐＮＧＵＳに挿入した。得られたプラス
ミドにてA. oryzaeを形質転換後、導入したプラスミド
が宿主染色体上で単一コピーで相同組換えした形質転換
体を選択した。これらの形質転換体を、デンプンを炭素
源としたツァペック−ドックス培地による液体培養と７
０％精白米を用いた固体培養（米麹培養）を行い、生産
されるＧＵＳ活性を測定した（図２）。その結果、１１
２８塩基対すべてを含むものと比べて、５′側上流３５
６塩基対まで欠失させても、固体培養でのＧＵＳ活性は
ほとんど低下しなかった。しかし、−２７２まで欠失し
たものでは、固体培養でのＧＵＳ活性が大きく減少し
た。したがって、この−３５５から−２７２の間に、固
体培養での高発現に関与する領域が存在すると考えられ
た。
【００１７】
【実施例２】ｇｌａＢプロモーターの中で−３５５〜２
７２ｂｐ付近に、固体培養での高発現に必要な領域があ
ることを確認するため、さらに、部位特異的欠失プロモ
ーターでの解析を行った。ｇｌａＢプロモーター領域
（１１２８塩基対）のなかから、ある一定の領域だけを
欠失した変異プロモーターを調製し、液体培養と固体培
養での発現能を検討した（図３）。ｇｌａＢプロモータ
ーの中で、−９３４〜−７０５の領域、−７０４〜−５
７２の領域、−５７１〜３５６の領域、いずれの領域を
欠失させても、固体培養での発現能は低下しなかった。
ところが−３５５〜２１３の領域を欠失させると、固体
培養での発現がほとんど確認することができなかった。
以上の結果より、この−３５５〜−２１３の領域に固体
培養での高発現に必要な領域が存在することが確認され
た。
７２ｂｐ付近に、固体培養での高発現に必要な領域があ
ることを確認するため、さらに、部位特異的欠失プロモ
ーターでの解析を行った。ｇｌａＢプロモーター領域
（１１２８塩基対）のなかから、ある一定の領域だけを
欠失した変異プロモーターを調製し、液体培養と固体培
養での発現能を検討した（図３）。ｇｌａＢプロモータ
ーの中で、−９３４〜−７０５の領域、−７０４〜−５
７２の領域、−５７１〜３５６の領域、いずれの領域を
欠失させても、固体培養での発現能は低下しなかった。
ところが−３５５〜２１３の領域を欠失させると、固体
培養での発現がほとんど確認することができなかった。
以上の結果より、この−３５５〜−２１３の領域に固体
培養での高発現に必要な領域が存在することが確認され
た。
【００１８】
【実施例３】次に−３５０から−２５４の領域をｇｌａ
Ａプロモーターに挿入し、その固体培養での発現能を検
討した（表１）。ｇｌａＡのプロモーターの−２０５の
５′末端側に、ＰＣＲ法にて調製したｇｌａＢプロモー
ター（−３５０〜−２５４）領域を挿入し、キメラプロ
モーターを調整後、ｇｌａＡおよびｇｌａＢプロモータ
ーとその発現能を比較した。ｇｌａＡプロモーターは固
体培養でほとんどプロモーター活性が検出されないが、
先のｇｌａＢプロモーター領域（−３５０−２５４）を
挿入することで、固体培養での活性が４０倍に上昇し
た。このようにこのプロモーター領域（−３５０〜−２
５４）は、プロモーターから欠失させると転写誘導活性
が低下させるだけでなく、この領域の付加により固体培
養での転写誘導活性を付与することも可能であることが
判明した。したがって、−３５０〜−２５４の領域（９
７ｂｐ）は重要領域ということができる。その配列を配
列番号２に示す。また、この領域を包含する−３５０〜
−２１３の領域（１３８ｂｐ）も重要領域であり、その
配列を配列番号３に示す。
Ａプロモーターに挿入し、その固体培養での発現能を検
討した（表１）。ｇｌａＡのプロモーターの−２０５の
５′末端側に、ＰＣＲ法にて調製したｇｌａＢプロモー
ター（−３５０〜−２５４）領域を挿入し、キメラプロ
モーターを調整後、ｇｌａＡおよびｇｌａＢプロモータ
ーとその発現能を比較した。ｇｌａＡプロモーターは固
体培養でほとんどプロモーター活性が検出されないが、
先のｇｌａＢプロモーター領域（−３５０−２５４）を
挿入することで、固体培養での活性が４０倍に上昇し
た。このようにこのプロモーター領域（−３５０〜−２
５４）は、プロモーターから欠失させると転写誘導活性
が低下させるだけでなく、この領域の付加により固体培
養での転写誘導活性を付与することも可能であることが
判明した。したがって、−３５０〜−２５４の領域（９
７ｂｐ）は重要領域ということができる。その配列を配
列番号２に示す。また、この領域を包含する−３５０〜
−２１３の領域（１３８ｂｐ）も重要領域であり、その
配列を配列番号３に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【実施例４】ｇｌａＢプロモーター中の固体培養での高
発現に関与する領域をさらに限定させるため、（−３５
０〜−２１３）に対してさらに詳細な欠失変異プロモー
ターを作成した。その結果、−３５０から−３２４のわ
ずか２７塩基対の欠失で、固体培養での発現が大きく低
下することが明らかとなった（図４）。したがって、こ
の２７塩基対の配列およびその近傍に、転写活性因子が
存在すると考えられた。
発現に関与する領域をさらに限定させるため、（−３５
０〜−２１３）に対してさらに詳細な欠失変異プロモー
ターを作成した。その結果、−３５０から−３２４のわ
ずか２７塩基対の欠失で、固体培養での発現が大きく低
下することが明らかとなった（図４）。したがって、こ
の２７塩基対の配列およびその近傍に、転写活性因子が
存在すると考えられた。
【００２１】このｇｌａＢプロモーターのコアサイトと
認められる２７ｂｐの塩基配列は、配列番号１に示さ
れ、次のとおりである。 ＧＡＧＡＡＣＴＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧ
ＧＣ
認められる２７ｂｐの塩基配列は、配列番号１に示さ
れ、次のとおりである。 ＧＡＧＡＡＣＴＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧ
ＧＣ
【００２２】
【実施例５】上記−３５０〜−３２４の領域（２７ｂ
ｐ）をｇｌａＢプロモーターに挿入し、この領域のコピ
ー数が増加した変異プロモーターを作成した。ｇｌａＢ
プロモーターの−３５０の５′側に、この２７塩基対の
ＤＮＡ断片を挿入した変異プロモーターの、プロモータ
ー活性を比較した（表２）。挿入しないプロモーターに
対して、２７塩基対を挿入した変異プロモーターは固体
培養での発現能が１．５倍に上昇した。このようにこの
２７塩基対の領域を利用することにより、強力なプロモ
ーターを構築できることが確認された。
ｐ）をｇｌａＢプロモーターに挿入し、この領域のコピ
ー数が増加した変異プロモーターを作成した。ｇｌａＢ
プロモーターの−３５０の５′側に、この２７塩基対の
ＤＮＡ断片を挿入した変異プロモーターの、プロモータ
ー活性を比較した（表２）。挿入しないプロモーターに
対して、２７塩基対を挿入した変異プロモーターは固体
培養での発現能が１．５倍に上昇した。このようにこの
２７塩基対の領域を利用することにより、強力なプロモ
ーターを構築できることが確認された。
【００２３】
【表２】
【００２４】
【発明の効果】本発明により、麹菌のｇｌａＢプロモー
ター由来のＤＮＡを利用することにより、同種遺伝子は
もとより異種遺伝子のきわめて効率的な発現システムが
構築された。
ター由来のＤＮＡを利用することにより、同種遺伝子は
もとより異種遺伝子のきわめて効率的な発現システムが
構築された。
【００２５】
【配列表】アスペルギルス・オリゼー由来の新規グルコ
アミラーゼ遺伝子（ｇｌａＢ）のｇｌａＢプロモーター
由来の２７塩基対の塩基配列を配列番号１に示し、それ
を包含する９７塩基対及び１３８塩基対の塩基配列を配
列番号２及び３に示す。下記表３〜５に、配列番号１〜
３で示される各配列を示す。
アミラーゼ遺伝子（ｇｌａＢ）のｇｌａＢプロモーター
由来の２７塩基対の塩基配列を配列番号１に示し、それ
を包含する９７塩基対及び１３８塩基対の塩基配列を配
列番号２及び３に示す。下記表３〜５に、配列番号１〜
３で示される各配列を示す。
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
【表５】
【図１】プラスミドｐＮＧＵＳの制限酵素地図を示す。
【図２】実施例１におけるＧＵＳ活性測定結果を示す。
【図３】実施例２におけるＧＵＳ活性測定結果を示す。
【図４】実施例４におけるＧＵＳ活性測定結果を示す。
【図５】アスペルギルス・オリゼーの新規グルコアミラ
ーゼ遺伝子（ｇｌａＢ）の塩基配列を示す。
ーゼ遺伝子（ｇｌａＢ）の塩基配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 杉並 孝二 京都府城陽市寺田宮の谷５−52 (72)発明者 今安 聰 京都市伏見区桃山筑前台町６
Claims (9)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示すＤＮＡ。
- 【請求項２】 配列表の配列番号２に示すＤＮＡ。
- 【請求項３】 配列表の配列番号３に示すＤＮＡ。
- 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡの塩基配列の一部を塩基の置換、削除、挿入、転移
等を行うことにより得られるＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡを含んでなること、を特徴とする麹菌（Aspergillu
s oryzae）発現プラスミド。 - 【請求項６】 請求項５に記載のプラスミドを麹菌に移
入してなる形質転換体。 - 【請求項７】 Aspergillus oryzae GLB-01(FERM P-158
26）。 - 【請求項８】 請求項１〜４のいずれか１項に記載する
ＤＮＡを少なくとも含むＤＮＡをプロモーターとして利
用し、麹菌において同種又は異種遺伝子を発現せしめる
方法。 - 【請求項９】 麹菌を固体培養すること、を特徴とする
請求項８に記載の発現方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06611498A JP3877861B2 (ja) | 1998-03-03 | 1998-03-03 | 高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06611498A JP3877861B2 (ja) | 1998-03-03 | 1998-03-03 | 高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11243965A true JPH11243965A (ja) | 1999-09-14 |
| JP3877861B2 JP3877861B2 (ja) | 2007-02-07 |
Family
ID=13306544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06611498A Expired - Lifetime JP3877861B2 (ja) | 1998-03-03 | 1998-03-03 | 高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3877861B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009254349A (ja) * | 2008-03-19 | 2009-11-05 | Gekkeikan Sake Co Ltd | 糸状菌由来プロモーターのエンハンサーおよびその利用 |
-
1998
- 1998-03-03 JP JP06611498A patent/JP3877861B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009254349A (ja) * | 2008-03-19 | 2009-11-05 | Gekkeikan Sake Co Ltd | 糸状菌由来プロモーターのエンハンサーおよびその利用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3877861B2 (ja) | 2007-02-07 |
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