JPH11243996A

JPH11243996A - ベロ毒素遺伝子に生じた外来ｄｎａ断片の挿入を検出する方法

Info

Publication number: JPH11243996A
Application number: JP10047677A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Kusumoto; 楠本　　正博; Yoshiaki Nishiya; 西矢　　芳昭; Yoshihisa Kawamura; 川村　　良久; Kunihiro Shinagawa; 邦汎品川
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 1999-09-14

Abstract

(57)【要約】【課題】ベロ毒素産生性大腸菌のベロ毒素遺伝子または
その変異型遺伝子を特異的に検出すると同時に、該遺伝
子への外来ＤＮＡ断片の挿入によって、ベロ毒素に引き
起こされた挿入変異を、増幅ＤＮＡ断片の鎖長より簡便
かつ迅速に検出する。【解決手段】ベロ毒素産生大腸菌の産生するベロ毒素１
型をコードする遺伝子（配列番号１）またはベロ毒素２
型をコードする遺伝子（配列番号２）から選択された、
少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有す
る、少なくとも２種のＤＮＡ断片であるベロ毒素遺伝子
を増幅するためのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレ
オチドを増幅プライマーとして使用するベロ毒素遺伝子
の増幅方法、増幅用試薬およびベロ毒素に生じた外来Ｄ
ＮＡ断片の挿入を検出する方法ならびにその検出用試
薬。【効果】外来ＤＮＡ断片の転移によるＶＴ遺伝子の不活
性化を検出することが可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ベロ毒素産生性大
腸菌（Verotoxin-producing Escherichia coli、ＶＴＥ
Ｃと略称する）のベロ毒素（Verotoxin 、ＶＴと略称す
る）とその変異型遺伝子を特異的に増幅することが可能
なオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを使用す
るベロ毒素遺伝子（ＶＴ遺伝子と略称する）の増幅用試
薬、該増幅方法、ならびにＶＴ遺伝子に挿入された外来
ＤＮＡ断片を検出する方法ならびにその試薬に関する。
本発明は外来ＤＮＡ断片（ＩＳ）の転移によるＶＴ遺伝
子の不活性化を検出することが可能となる。

【０００２】

【従来の技術】ＶＴＥＣは、腸管出血性大腸菌（Entero
hemorrhagic Escherichia coli、ＥＨＥＣと略称する）
とも呼ばれ、病原性因子としてＶＴを産生することを特
徴とする病原性大腸菌である。現在、該毒素に関して同
一の毒素が発見の経緯により、ＶＴまたは志賀様毒素
（Shiga-like toxin、ＳＬＴと略称する）など複数の名
称で呼ばれており、そこで生じる混乱を避ける目的で毒
素名を志賀毒素（Shiga toxin、ＳＴＸと略称する）
へ、これに伴い、該毒素産生菌のカテゴリー名をＶＴＥ
ＣまたはＥＨＥＣから志賀毒素産生性大腸菌（Shiga to
xin-producing Escherichia coli、ＳＴＥＣと略称す
る）へ統一すべきという提案が示されている。しかし、
これらの名称の統一は未だ世界的な合意に達していない
ため、本発明では毒素名としてＶＴを、また該毒素産生
菌のカテゴリー名としてＶＴＥＣを使用する。したがっ
て、本発明における用語、ＶＴおよびＶＴＥＣには、こ
れらと同一の意味で使用され得るすべての名称が包含さ
れる。

【０００３】ＶＴＥＣによる感染症の主な症状は、出血
性大腸炎に代表される食中毒症状であるが、場合によ
り、溶血性尿毒症症候群(Hemolytic Uremic Syndrome、
ＨＵＳと略称する）へと重症化し、最悪の場合には死に
至ることが知られている。

【０００４】ＶＴは、これら一連の症状を引き起こす病
原性因子であり、志賀赤痢菌の産生する志賀毒素と同一
構造のベロ毒素１型（ＶＴ１と略称する）、および生物
学的性状はＶＴ１と類似しているが、免疫学的性状が大
きく異なるベロ毒素２型（ＶＴ２と略称する）が存在
し、それぞれについて一部抗原性およびアミノ酸配列の
異なるバリアントが知られている。なお、ＶＴ１につい
ては、T.Takao et al.,Microb. Pathog., 5, 357-369,
1988 に記載され、ＶＴ２については、M.P.Jackson et
al., FEMS Microbio.,Lett., 44, 109-114, 1987 に記
載されている。

【０００５】現在、あらゆる生物の糞便または食品また
は環境中に存在するＶＴＥＣのＶＴ遺伝子を、ＰＣＲ
（polymerase chain reaction)法を用いて増幅する方法
が注目されている。ＰＣＲ法は迅速かつ簡便に、病原性
因子であるＶＴを検出できる点で非常に有効であるが、
遺伝子を検出対象とするＰＣＲ法特有の問題点として、
ＶＴ遺伝子を保有するが、ＶＴを産生しないＶＴＥＣが
存在する可能性が指摘されてきた。

【０００６】本発明者らは、ＶＴＥＣのＶＴ遺伝子とそ
の変異型遺伝子に関して、鋭意検討を重ねた結果、ＶＴ
１遺伝子およびＶＴ２遺伝子を保有し、ＶＴ１を産生す
るが、ＶＴ２を産生しないＶＴＥＣ菌株を発見した。該
菌株に関する詳細な検討の結果、ＶＴ２遺伝子に外来Ｄ
ＮＡ断片が挿入されることによって、該菌株のＶＴ２産
生能が消失、すなわちＶＴ２遺伝子が不活性化されてお
り、外来ＤＮＡ断片とは本来ＶＴ遺伝子の上に存在しな
いＤＮＡ断片であり、さらに、該外来ＤＮＡ断片は、転
移性遺伝要素の１種である挿入配列（insertion sequen
ce、ＩＳと略称する）であることが判明した。

【０００７】挿入配列（ＩＳ）は、通常、染色体、プラ
スミド、ファージＤＮＡなど種々のレプリコンの間を移
動する転移性遺伝要素の１つであり、大腸菌においては
数種類の存在が知られている。したがって、該菌株以外
のＶＴＥＣにおいても、保有するＶＴ遺伝子の種類に関
わらず、ＩＳの転移によるＶＴ遺伝子の不活性化は十分
に起こり得ると考えられる。また、挿入されたＩＳがさ
らなる転移により完全に除去された場合、機能を有する
蛋白質が再度、合成されるようになり、野生型に復帰す
ることが知られている。すなわち、ＩＳの挿入によって
不活性化されたＶＴ遺伝子を保有する大腸菌は、該分子
の除去により、ＶＴ産生能が復活する可能性を有してお
り、各種の毒素産生試験によりＶＴ陰性と判断された菌
株であっても、潜在的にＶＴを産生する能力を有する可
能性が考えられる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＶＴ
ＥＣのＶＴ遺伝子へ外来ＤＮＡ断片、すなわち転移性遺
伝要素の１種であるＩＳが挿入したか否かをを検出する
方法ならびにその試薬を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＩＳの挿
入によって不活性化されたＶＴ遺伝子を発見し、該遺伝
子に関して、鋭意検討を重ねた結果、ＩＳの挿入部位の
上流および下流の核酸配列を見出し、それらを用いた遺
伝子増幅法を確立し、本発明を完成させるに至った。

【００１０】本発明者らは、また、大腸菌に存在する数
種類のＩＳが転移して、ＶＴ遺伝子のあらゆる領域に挿
入される可能性を考慮し、鋭意検討を重ねた結果、ＶＴ
１遺伝子とその変異型遺伝子にほぼ特異的な核酸配列、
およびＶＴ２遺伝子とその変異型遺伝子にほぼ特異的な
核酸配列を見出し、それらを用いてＶＴ遺伝子のほぼ全
体を増幅する方法を確立し、本発明を完成させるに至っ
た。

【００１１】すなわち、本発明はベロ毒素産生大腸菌の
産生するベロ毒素、具体的にはベロ毒素１型またはベロ
毒素２型をコードする遺伝子（配列番号１または２）か
ら選択された少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸
配列を含有する、少なくとも２種のＤＮＡ断片であるベ
ロ毒素遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドであ
る。

【００１２】また、本発明は少なくとも２種のプライマ
ーとして、上記ベロ毒素１型またはベロ毒素２型遺伝子
を増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、一方の
プライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された
場合に、他方のプライマーの鋳型となるオリゴヌクレオ
チドを使用することを特徴とするベロ毒素遺伝子の増幅
方法である。

【００１３】さらに、本発明は少なくとも２種のプライ
マーが、上記ベロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒素
１型またはベロ毒素２型遺伝子を増幅するためのオリゴ
ヌクレオチドであって、一方のプライマーの伸長生成物
が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマ
ーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするベロ
毒素遺伝子増幅用試薬である。

【００１４】また、本発明は上記増幅方法で得られた増
幅遺伝子断片の鎖長より、ベロ毒素遺伝子への外来ＤＮ
Ａ断片の挿入を検出することを特徴とする、ベロ毒素遺
伝子に生じた外来ＤＮＡ断片の挿入を検出する方法であ
る。

【００１５】さらに、本発明は少なくとも２種のプライ
マーが、ベロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒素１型
またはベロ毒素２型遺伝子を増幅するためのオリゴヌク
レオチドであって、一方のプライマーの伸長生成物が、
その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの
鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、
ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするベロ毒素
遺伝子に生じた外来ＤＮＡ断片の挿入を検出する試薬で
ある。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明のオリゴヌクレオチドは、
ベロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒素をコードする
遺伝子、ＶＴ１遺伝子（配列番号１）から選択された、
少なくとも２種のＤＮＡ断片、またはＶＴ２遺伝子（配
列番号２）から選択された、少なくとも２種のＤＮＡ断
片であって、少なくとも連続した１５塩基、好ましくは
２０〜３５塩基よりなる核酸配列を含有する。該オリゴ
ヌクレオチドは、ベロ毒素産生性大腸菌（ＶＴＥＣ）の
産生するベロ毒素遺伝子（ＶＴ遺伝子）、具体的にはＶ
Ｔ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子を増幅する。該オリゴヌ
クレオチドの少なくとも１種は、外来ＤＮＡ断片の挿入
部位の上流に位置し、他方はその下流に位置する。

【００１７】本発明のオリゴヌクレオチドは、具体的に
は、配列番号３〜６、配列番号７〜１０に示される核酸
配列（ただし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグア
ニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラ
シル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の少なくとも連
続した１５塩基、好ましくは２０〜３５塩基よりなる核
酸配列を含有する。

【００１８】本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマ
ーとして使用されるが、特に遺伝子増幅用のプライマー
として使用され得る。その際、少なくとも２種のオリゴ
ヌクレオチドが使用され、２種のプライマーは増幅しよ
うとする核酸配列の両端を規定し、一方のプライマーの
伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方
のプライマーの鋳型となるように、その塩基配列が選択
される。

【００１９】また、本発明のオリゴヌクレオチドはシー
クエンス解析を行う場合のプライマーとしても使用され
得る。さらには、検出用プローブとしても使用可能であ
る。

【００２０】本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号
３〜１０に示される塩基配列またはそれらの相補配列の
全域を使用する必要はない。配列表の塩基配列およびそ
の相補配列に由来する適度な長さの配列が、ＰＣＲ反応
条件などに合わせて、解離温度（Ｔｍ値）などを計算す
ることにより決定され得る。しかし、プライマーに十分
な特異性を持たせるためには、少なくとも連続した１５
塩基、さらに望ましくは、２０〜３５塩基の長さが必要
である。

【００２１】プライマーが十分な特異性を有するために
は、３’末端の塩基は配列表の核酸配列に示される３’
末端の塩基を用いることが望ましい。使用する条件、目
的などに応じて、オリゴヌクレオチド中にある程度の置
換を行ってもよい。また、プライマーの特異性に影響を
及ぼさない程度に、ＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子ま
たはＶＴ２遺伝子とその変異型遺伝子の塩基配列に従っ
て、プライマーの５’末端側をさらに延長して使用して
もよい。

【００２２】本発明の配列番号３および４に示されるオ
リゴヌクレオチドは、ＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子
において、該オリゴヌクレオチドに相当する部分（プラ
ス鎖）に対して高い相同性を有するが、この部分を除い
たＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子全長に対しては増幅
可能な程度の相同性はみられない。さらに、該オリゴヌ
クレオチドはＶＴ２遺伝子とその変異型遺伝子全長に対
しても、増幅可能な程度の相同性はみられない。

【００２３】また、配列番号５および６に示されるオリ
ゴヌクレオチドは、ＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子に
おいて、該オリゴヌクレオチドに相補する部分（プラス
鎖）に対して高い相同性を有するが、この部分を除いた
ＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子全長に対しては、増幅
可能な程度の相同性はみられない。さらに、該オリゴヌ
クレオチドはＶＴ２遺伝子とその変異型遺伝子全長に対
しても、増幅可能な程度の相同性はみられない。

【００２４】これらのことは、配列番号３および５に示
されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる増
幅により、ＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子およびＶＴ
２遺伝子とその変異型遺伝子が同時に存在する場合にお
いても、ＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子に由来する唯
一の増幅ＤＮＡ断片（１，２２６ｂｐ）を生じ得ること
を意味している。配列番号４および６に示されるオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いると、増幅ＤＮＡ
断片（１，２７６ｂｐ）を生じ得る。

【００２５】配列番号７および８に示されるオリゴヌク
レオチドは、ＶＴ２遺伝子とその変異型遺伝子におい
て、該オリゴヌクレオチドに相当する部分（プラス鎖）
に対して高い相同性を有するが、この部分を除いたＶＴ
２遺伝子とその変異型遺伝子全長に対しては、増幅可能
な程度の相同性はみられない。さらに、該オリゴヌクレ
オチドはＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子全長に対して
も、増幅可能な程度の相同性はみられない。

【００２６】また、配列番号８および１０に示されるオ
リゴヌクレオチドは、ＶＴ２遺伝子とその変異型遺伝子
において該オリゴヌクレオチドに相補する部分（プラス
鎖）に対して高い相同性を有するが、この部分を除いた
ＶＴ２遺伝子とその変異型遺伝子全長に対しては、増幅
可能な程度の相同性はみられない。さらに、該オリゴヌ
クレオチドはＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子全長に対
しても、増幅可能な程度の相同性はみられない。

【００２７】これらのことは、配列番号７および９に示
されるオリゴヌクレオチドを用いる増幅により、ＶＴ１
遺伝子とその変異型遺伝子およびＶＴ２遺伝子とその変
異型遺伝子が同時に存在する場合においても、ＶＴ２遺
伝子とその変異型遺伝子に由来する唯一の増幅ＤＮＡ断
片（１，２３１ｂｐ）を生じ得ることを意味している。
配列番号８および１０に示されるオリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いると、増幅ＤＮＡ断片（１，２９
１ｂｐ）を生じ得る。

【００２８】本発明のオリゴヌクレオチドは、具体的に
は、配列番号３〜６に示される核酸配列または該配列に
相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基
よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチド、また
は配列番号７〜１０に示される核酸配列または該配列に
相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基
よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであ
る。

【００２９】本発明では、上記少なくとも２種のオリゴ
ヌクレオチドを増幅用プライマーとして使用し、一方の
プライマーの伸長生成物は、その相補体から分離された
場合、他方のプライマーの鋳型となるように配列を選択
する必要がある。

【００３０】遺伝子増幅に用いるプライマーとしては、
上述のすべてのオリゴヌクレオチドが挙げられる。この
遺伝子増幅には、一般的にＰＣＲ（polymerase chain r
eaction)法が用いられる。

【００３１】上述したように、各種試料からのＶＴ１遺
伝子とその変異型遺伝子の増幅には、配列番号３〜６に
それぞれ示されるオリゴヌクレオチドの組み合わせが好
適に用いられ得る。しかし、配列番号３〜６にそれぞれ
示されるオリゴヌクレオチドよりも外側のプライマーに
より増幅されたＤＮＡを、さらに配列番号３〜６にそれ
ぞれ示されるオリゴヌクレオチドを用いて再増幅するこ
とによって、より高感度の増幅が可能となることが予想
される。このとき使用する外側のプライマーは、ＶＴ１
遺伝子とその変異型遺伝子に特異的であることが望まし
いが、特異性の低いプライマーも使用し得る。

【００３２】また、各種試料からのＶＴ２遺伝子とその
変異型遺伝子の増幅には、配列番号７〜１０にそれぞれ
示されるオリゴヌクレオチドの組み合わせが好適に用い
られ得る。しかし、配列番号７〜１０にそれぞれ示され
るオリゴヌクレオチドよりも外側のプライマーにより増
幅されたＤＮＡを、さらに配列番号７〜１０にそれぞれ
示されるオリゴヌクレオチドを用いて再増幅することに
よって、より高感度の増幅が可能となる。このとき使用
する外側のプライマーは、ＶＴ２遺伝子とその変異型遺
伝子に特異的であることが望ましいが、特異性の低いプ
ライマーも使用し得る。

【００３３】ＶＴ１遺伝子とその変異型遺伝子の増幅に
おいて、配列番号３〜６にそれぞれ示されるオリゴヌク
レオチドの組み合わせを用いることが必要である。ま
た、ＶＴ２遺伝子とその変異型遺伝子の増幅において、
配列番号７〜１０にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチ
ドの組み合わせを用いることが必要である。これらのこ
とは、増幅反応における特異性には、使用する２つのオ
リゴヌクレオチドの相乗効果が重要であることによる。
また、さらに特異性を高めるためには、増幅に使用する
プライマーの濃度をできるだけ低く抑えることも重要で
ある。

【００３４】本発明のＶＴ１遺伝子増幅用試薬は、具体
的には、少なくとも２種のプライマーが、配列番号３〜
６に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列
のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列
を含有する、ベロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒素
１型の遺伝子（ＶＴ１遺伝子）を増幅するためのオリゴ
ヌクレオチドであって、一方のプライマーの伸長生成物
が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマ
ーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む。

【００３５】また、本発明のＶＴ２遺伝子増幅用試薬
は、少なくとも２種のプライマーが、配列番号７〜１０
に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列の
うち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を
含有する、ベロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒素２
型の遺伝子（ＶＴ２遺伝子）を増幅するためのオリゴヌ
クレオチドであって、一方のプライマーの伸長生成物
が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマ
ーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む。

【００３６】プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼ、ｄＮＴＰは当該増幅工程を十分に行い得る量が含ま
れるが、例えばＤＮＡポリメラーゼは１〜２００Ｕ／ｍ
ｌ、ｄＮＴＰは５０〜５００μＭ、プライマーは１〜１
０００ｎＭ程度が含められる。

【００３７】さらに本発明の試薬には、ＶＴ１遺伝子、
ＶＴ２遺伝子を単離するための工程に適した緩衝液およ
び当該遺伝子を増幅するに適した緩衝液を併せて含めて
もよい。さらに増幅した遺伝子を検出するための試薬
も、検出法に併せて各種組み合わせておくこともでき
る。

【００３８】さらには、本発明では上記増幅方法で得ら
れた増幅遺伝子断片の鎖長より、ＶＴ遺伝子への外来Ｄ
ＮＡ断片の挿入を検出し、ＶＴに生じた挿入変異を検出
することが可能となる。

【００３９】具体的には、本発明のＶＴ１に生じた挿入
変異の検出法は、上記増幅方法で得られた増幅遺伝子断
片の鎖長より、ＶＴ１遺伝子への外来ＤＮＡ断片の挿入
を検出することを特徴とする。配列番号３〜６に示され
る塩基配列を有するプライマーを使用して増幅したＤＮ
Ａ断片が、１，２２６ｂｐ（配列番号３と５）、１，２
７６ｂｐ（配列番号４と６）、１，２５２ｂｐ（配列番
号３と６）または１，２５０ｂｐ（配列番号４と５）よ
り大きいと、外来ＤＮＡ断片が挿入されたこととなる。

【００４０】また、本発明のＶＴ２に生じた挿入変異の
検出法は、上記増幅方法で得られた増幅遺伝子断片の鎖
長より、ＶＴ２遺伝子への外来ＤＮＡ断片の挿入を検出
することを特徴とする。配列番号７〜１０に示される塩
基配列を有するプライマーを使用して増幅したＤＮＡ断
片が、１，２３２ｂｐ（配列番号７と９）、１，２９１
ｂｐ（配列番号８と１０）、１，２６６ｂｐ（配列番号
７と１０）、１，２５６ｂｐ（配列番号８と９）より大
きいと、外来ＤＮＡ断片が挿入されたこととなる。

【００４１】さらには、この増幅方法で得られた増幅Ｄ
ＮＡ断片の鎖長より、該ＤＮＡ断片が、ＶＴ１遺伝子ま
たはＶＴ２遺伝子または外来ＤＮＡ断片の挿入されたＶ
Ｔ１遺伝子または外来ＤＮＡ断片の挿入されたＶＴ２遺
伝子のうちの何れに該当するかを判断することが可能で
ある。

【００４２】本発明において、増幅する遺伝子はあらゆ
る生物の糞便または食品または環境中に存在するＶＴＥ
Ｃ由来の遺伝子であるが、単離培養された菌体の遺伝子
を増幅することも含まれる。また、本発明における試料
には、上記の各種材料や培養菌体の他、これらより単離
および精製された核酸なども含まれる。

【００４３】すなわち、本発明における試料としては、
上記の各種材料を直接、用いる場合の他に、上記の各種
材料の培養液、またはそこから祖抽出または精製された
核酸などが用いられ得る。さらに、上記の各種材料から
単離された寒天培地上の菌体またはその培養液、または
そこから粗抽出または精製された核酸なども試料として
用いられ得る。

【００４４】

【実施例】以下に、本発明を実施例を用いて、具体的に
説明する。実施例１（１）オリゴヌクレオチドの合成ＶＴ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ社ＤＮ
Ａシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト
法にて、配列番号３、５、７および９にそれぞれ示され
る核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー
１：配列番号３のうち、１〜３３番目、プライマー２：
配列番号５のうち、１〜２７番目、プライマー３：配列
番号７のうち、１〜３１番目、プライマー４：配列番号
９のうち、１〜３２番目）を合成することにより得た。
手法はＡＢＩ社のマニュアルに従い、各種オリゴヌクレ
オチドの脱保護はアンモニア水で５５℃にて一夜実施し
た。精製はＨＰＬＣ（ベックマン製）を用い、逆相クロ
マトカラム（ナカライテスク製）にて実施した。

【００４５】（２）試料の調製ＶＴ１遺伝子を保有するＶＴＥＣ菌株、ＶＴ２遺伝子を
保有するＶＴＥＣ菌株、ＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺伝
子を保有するＶＴＥＣ菌株、ＶＴ１遺伝子およびＩＳの
挿入されたＶＴ２遺伝子を保有するＶＴＥＣ菌株の４種
の菌体コロニーをそれぞれ直接、ＰＣＲの試料として使
用した（表１参照）。寒天培地上のＶＴＥＣコロニー
（１白金耳）を水１００μｌに懸濁し、そのうちの１μ
ｌをＰＣＲに使用した。

【００４６】（３）ＰＣＲ配列番号３および５に示されるオリゴヌクレオチド（プ
ライマー１および２）、または配列番号７および９に示
されるオリゴヌクレオチド（プライマー３および４）
を、それぞれＰＣＲのプライマーとして用いた（表１参
照）。

【００４７】反応液組成は、プライマー１および２、ま
たはプライマー３および４をそれぞれ０．２μＭ、ｄＡ
ＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを各
０．２ｍＭ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤＤ
ａｓｈ：東洋紡製）２５単位／ｍｌ、および１倍濃度の
増幅用緩衝液（東洋紡製）である。実際の使用にあたっ
ては、反応液に試料溶液（ＶＴＥＣコロニー懸濁液）１
μｌを添加し、反応液量を１００μｌとして、以下の反
応に供した。反応条件は以下の通りである：熱変性：９４℃、２０秒アニーリング：６５℃、２秒伸長反応：７４℃、９０秒上記熱変性、アニーリングおよび伸長反応を３０回繰り
返した。これらの操作はパーキンエルマー社のＤＮＡサ
ーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ２４００）を用いて
行った。

【００４８】（４）検出増幅反応後の反応液１０μｌを１％アガロースゲルにて
電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線
照射下での蛍光を検出した。電気泳動の条件は、定電圧
１００Ｖ、３０分間にて行った。操作方法ならびに他の
条件は、マニアティス（Maniatis）らのモレキュラー・
クローニング(Molecular Cloning)(1982年) に記載の技
法に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動
し、相対泳動度の比較により、検出されたＤＮＡ断片の
長さを算出した。

【００４９】（５）結果プライマー１および２を用いたＰＣＲにより増幅される
ＤＮＡ断片の長さは、通常、１，２２６ｂｐである。ま
た、プライマー３および４を用いたＰＣＲにより増幅さ
れるＤＮＡ断片の長さは、通常、１，２３１ｂｐであ
る。増幅ＤＮＡ断片の検出に用いたアガロースゲル電気
泳動を図１に示す。

【００５０】

【表１】

【００５１】図１から明らかなように、プライマー１お
よび２（レーン１、３、５、７、および９）は、ＶＴ１
遺伝子を保有する菌株の遺伝子のみを増幅し、ＶＴ１遺
伝子を保有しない菌株の遺伝子とは全く反応しなかっ
た。すなわち、該プライマー１および２がＶＴ１遺伝子
を特異的に増幅し、ＶＴ１遺伝子を保有するＶＴＥＣを
正確に検出できることを示している。

【００５２】また、図１から明らかなように、プライマ
ー３および４（レーン２、４、６、８、１０）は、ＶＴ
２遺伝子を保有する菌株の遺伝子のみを増幅し、ＶＴ２
遺伝子を保有しない菌株の遺伝子とは全く反応しなかっ
た。すなわち、該オリゴヌクレオチドがＶＴ２遺伝子を
特異的に増幅し、ＶＴ２遺伝子を保有するＶＴＥＣを正
確に検出できることを示している。

【００５３】さらに、図１から明らかなように、ＩＳの
挿入されていないＶＴ１遺伝子を保有する菌株からは、
プライマー１および２により、１，２２６ｂｐの長さの
ＤＮＡ断片が増幅され（レーン１、５、７）、ＩＳの挿
入されていないＶＴ２遺伝子を保有する菌株からは、プ
ライマー３および４により、１，２３１ｂｐの長さのＤ
ＮＡ断片が増幅された（レーン４、６）。一方、ＩＳの
挿入されたＶＴ２遺伝子を保有する菌株（レーン８）か
らは、プライマー３および４により、約２，５００ｂｐ
の長さのＤＮＡ断片が増幅された。すなわち、本発明の
方法により、外来ＤＮＡ断片の挿入されたＶＴ遺伝子を
保有するＶＴＥＣを正確に検出できることを示してい
る。

【００５４】

【発明の効果】本発明により、多くの生物の糞便または
食品または環境中から簡便、迅速、かつ特異的にＶＴＥ
ＣのＶＴ遺伝子を増幅し得る。また、本発明により、Ｖ
ＴＥＣの保有するＶＴ遺伝子の検出と同時に、該遺伝子
への外来ＤＮＡ断片の挿入によってＶＴに引き起こされ
た挿入変異の検出を、増幅ＤＮＡ断片の鎖長より簡便か
つ迅速に行うことができる。

【００５５】本発明では、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺
伝子に外来ＤＮＡ断片が挿入されることによって、該菌
株のＶＴ１またはＶＴ２産生能が消失、すなわち、ＶＴ
１遺伝子またはＶＴ２遺伝子が不活性化されたことが検
出でき、出血性大腸炎に代表される食中毒症状の診断に
有効に応用できる。

【００５６】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：1369 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノムＤＮＡ配列の特徴起源: ＶＴ１を産生する Verotoxin-producing Escheri
chia coli 配列 TATCGTATGG TGCTCAAGGA GTATTGTGTA ATATGAAAAT AATTATTTTT AGAGTGCTAA 60 CTTTTTTCTT TGTTATCTTT TCAGTTAATG TGGTGGCGAA GGAATTTACC TTAGACTTCT 120 CGACTGCAAA GACGTATGTA GATTCGCTGA ATGTCATTCG CTCTGCAATA GGTACTCCAT 180 TACAGACTAT TTCATCAGGA GGTACGTCTT TACTGATGAT TGATAGTGGC ACAGGGGATA 240 ATTTGTTTGC AGTTGATGTC AGAGGGATAG ATCCAGAGGA AGGGCGGTTT AATAATCTAC 300 GGCTTATTGT TGAACGAAAT AATTTATATG TGACAGGATT TGTTAACAGG ACAAATAATG 360 TTTTTTATCG CTTTGCTGAT TTTTCACATG TTACCTTTCC AGGTACAACA GCGGTTACAT 420 TGTCTGGTGA CAGTAGCTAT ACCACGTTAC AGCGTGTTGC AGGGATCAGT CGTACGGGGA 480 TGCAGATAAA TCGCCATTCG TTGACTACTT CTTATCTGGA TTTAATGTCG CATAGTGGAA 540 CCTCACTGAC GCAGTCTGTG GCAAGAGCGA TGTTACGGTT TGTTACTGTG ACAGCTGAAG 600 CTTTACGTTT TCGGCAAATA CAGAGGGGAT TTCGTACAAC ACTGGATGAT CTCAGTGGGC 660 GTTCTTATGT AATGACTGCT GAAGATGTTG ATCTTACATT GAACTGGGGA AGGTTGAGTA 720 GCGTCCTGCC TGACTATCAT GGACAAGACT CTGTTCGTGT AGGAAGAATT TCTTTTGGAA 780 GCATTAATGC AATTCTGGGA AGCGTGGCAT TAATACTGAA TTGTCATCAT CATGCATCGC 840 GAGTTGCCAG AATGGCATCT GATGAGTTTC CTTCTATGTG TCCGGCAGAT GGAAGAGTCC 900 GTGGGATTAC GCACAATAAA ATATTGTGGG ATTCATCCAC TCTGGGGGCA ATTCTGATGC 960 GCAGAACTAT TAGCAGTTGA GGGGGTAAAA TGAAAAAAAC ATTATTAATA GCTGCATCGC 1020 TTTCATTTTT TTCAGCAAGT GCGCTGGCGA CGCCTGATTG TGTAACTGGA AAGGTGGAGT 1080 ATACAAAATA TAATGATGAC GATACCTTTA CAGTTAAAGT GGGTGATAAA GAATTATTTA 1140 CCAACAGATG GAATCTTCAG TCTCTTCTTC TCAGTGCGCA AATTACGGGG ATGACTGTAA 1200 CCATTAAAAC TAATGCCTGT CATAATGGAG GGGGATTCAG CGAAGTTATT TTTCGTTGAC 1260 TCAGAATAGC TCAGTGAAAA TAGCAGGCGG AGATTCATAA ATGTTAAATA CATCTCAATT 1320 CAGTCAGTTG TTGCCGGTTC TGATAATAGA TGTGTTAGAA AATTCTTGC 1369

【００５７】配列番号：2 配列の長さ：1664 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノムＤＮＡ配列の特徴起源: ＶＴ２を産生する Verotoxin-producing Escheri
chia coli 配列 ATCGCATAGC TCATCGGAAC AAGCTCAAGC GGTCTCCGGT CGAGTCCTCA TGCGTCCATT 60 ATCTGCATTA TGCGTTGTTA GCTCAGCCGG ACAGAGCAAT TGCCTTCTGA GCAATCGGTC 120 ACTGGTTCGA ATCCAGTACA ACGCGCCATA TTTATTTACC AGGCTCGCTT TTGCGGGCCT 180 TTTTTATATC TGCGCCGGGT CTGGTGCTGA TTACTTCAGC CAAAAGGAAC ACCTGTATAT 240 GAAGTGTATA TTATTTAAAT GGGTACTGTG CCTGTTACTG GGTTTTTCTT CGGTATCCTA 300 TTCCCGGGAG TTTACGATAG ACTTTTCGAC CCAACAAAGT TATGTCTCTT CGTTAAATAG 360 TATACGGACA GAGATATCGA CCCCTCTTGA ACATATATCT CAGGGGACCA CATCGGTGTC 420 TGTTATTAAC CACACCCCAC CGGGCAGTTA TTTTGCTGTG GATATACGAG GGCTTGATGT 480 CTATCAGGCG CGTTTTGACC ATCTTCGTCT GATTATTGAG CAAAATAATT TATATGTGGC 540 CGGGTTCGTT AATACGGCAA CAAATACTTT CTACCGTTTT TCAGATTTTA CACATATATC 600 AGTGCCCGGT GTGACAACGG TTTCCATGAC AACGGACAGC AGTTATACCA CTCTGCAACG 660 TGTCGCAGCG CTGGAACGTT CCGGAATGCA AATCAGTCGT CACTCACTGG TTTCATCATA 720 TCTGGCGTTA ATGGAGTTCA GTGGTAATAC AATGACCAGA GATGCATCCA GAGCAGTTCT 780 GCGTTTTGTC ACTGTCACAG CAGAAGCCTT ACGCTTCAGG CAGATACAGA GAGAATTTCG 840 TCAGGCACTG TCTGAAACTG CTCCTGTGTA TACGATGACG CCGGGAGACG TGGACCTCAC 900 TCTGAACTGG GGGCGAATCA GCAATGTGCT TCCGGAGTAT CGGGGAGAGG ATGGTGTCAG 960 AGTGGGGAGA ATATCCTTTA ATAATATATC AGCGATACTG GGGACTGTGG CCGTTATACT 1020 GAATTGCCAT CATCAGGGGG CGCGTTCTGT TCGCGCCGTG AATGAAGAGA GTCAACCAGA 1080 ATGTCAGATA ACTGGCGACA GGCCTGTTAT AAAAATAAAC AATACATTAT GGGAAAGTAA 1140 TACAGCTGCA GCGTTTCTGA ACAGAAAGTC ACAGTTTTTA TATACAACGG GTAAATAAAG 1200 GAGTTAAGCA TGAAGAAGAT GTTTATGGCG GTTTTATTTG CATTAGCTTC TGTTAATGCA 1260 ATGGCGGCGG ATTGTGCTAA AGGTAAAATT GAGTTTTCCA AGTATAATGA GGATGACACA 1320 TTTACAGTGA AGGTTGACGG GAAAGAATAC TGGACCAGTC GCTGGAATCT GCAACCGTTA 1380 CTGCAAAGTG CTCAGTTGAC AGGAATGACT GTCACAATCA AATCCAGTAC CTGTGAATCA 1440 GGCTCCGGAT TTGCTGAAGT GCAGTTTAAT AATGACTGAG GCATAACCTG ATTCGTGGTA 1500 TGTGGGTAAC AAGTGTAATC TGTGTCACAA TTCAGTCAGT TTGACAGTTG CCTGTCAGAC 1560 TGAGCATTTG TTAAAAAAAT TTCGCATGGT GAATCCCCCT GTGTGGGGCG ACTGGTGAAA 1620 AATCCTTGCT TGTGATTCAT TATCGACACG GGTTCGGTGG TACC 1664

【００５８】配列番号：３配列の長さ：33 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴存在位置：１．．３３特徴を決定した方法：Ｓ他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ１遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。配列 ATGAAAATAA TTATTTTTA GAGTGCTAAC TTT 33

【００５９】配列番号：４配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴存在位置：１．．２７特徴を決定した方法：Ｓ他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ１遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。配列 GGTGCTCAAG GAGTATTGTG TAATATG 27

【００６０】配列番号：５配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴存在位置：１．．２７特徴を決定した方法：Ｓ他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ１遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。配列 CAACGAAAAA TAACTTCGCT GAATCCC 27

【００６１】配列番号：６配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴存在位置：１．．２８特徴を決定した方法：Ｓ他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ１遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。配列 GCTATTTTCA CTGAGCTATT CTGAGTCA 28

【００６２】配列番号：７配列の長さ：31 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴存在位置：１．．３１特徴を決定した方法：Ｓ他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ２遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。配列 ATGAAGTGTA TATTATTTAA ATGGGTACTG T 31

【００６３】配列番号：８配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴存在位置：１．．２８特徴を決定した方法：Ｓ他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ２遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。配列 CTTCAGCCAA AAGGAACACC TGTATATG 28

【００６４】配列番号：９配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴存在位置：１．．３２特徴を決定した方法：Ｓ他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ２遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。配列 TTAAACTGCA CTTCAGCAAA TCCGGAGCCT GA 32

【００６５】配列番号：１０配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴存在位置：１．．２８特徴を決定した方法：Ｓ他の特徴：ＶＴＥＣの産生するＶＴ２遺伝子の配列と相
補的な配列を有する。配列 CACATACCAC GAATCAGGTT ATGCCTCA 28

【図面の簡単な説明】

【図１】各種菌ＶＴＥＣ菌株の菌体コロニー中の遺伝
子を増幅した結果を示す図面に代わる電気泳動写真であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ベロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒
素をコードする遺伝子（配列番号１または２）から選択
された、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列
を含有する、少なくとも２種のＤＮＡ断片であるベロ毒
素遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項２】少なくとも２種のＤＮＡ断片がベロ毒素
遺伝子における外来ＤＮＡ断片の挿入部位よりも上流側
および下流側から、それぞれ少なくとも１種選択される
請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】ベロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒
素１型をコードする遺伝子（配列番号１）から選択され
た、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含
有する、少なくとも２種のＤＮＡ断片であるベロ毒素１
型遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項４】少なくとも２種のＤＮＡ断片がベロ毒素
遺伝子における外来ＤＮＡ断片の挿入部位よりも上流側
および下流側から、それぞれ少なくとも１種選択される
請求項３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】ベロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒
素２型をコードする遺伝子（配列番号２）から選択され
た、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含
有する、少なくとも２種のＤＮＡ断片であるベロ毒素２
型遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項６】少なくとも２種のＤＮＡ断片がベロ毒素
遺伝子における外来ＤＮＡ断片の挿入部位よりも上流側
および下流側から、それぞれ少なくとも１種選択される
請求項５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】少なくとも２種のプライマーとして、請
求項１〜６のいずれか１項に記載されるベロ毒素遺伝子
を増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、一方の
プライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された
場合に、他方のプライマーの鋳型となるオリゴヌクレオ
チドを使用することを特徴とするベロ毒素遺伝子の増幅
方法。
【請求項８】少なくとも２種のプライマーが、請求項
１〜６記載のベロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒素
遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、
一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離
された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマ
ー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝
液を含むことを特徴とするベロ毒素遺伝子増幅用試薬。
【請求項９】請求項７記載の増幅方法で得られた増幅
遺伝子断片の鎖長より、ベロ毒素遺伝子への外来ＤＮＡ
断片の挿入を検出することを特徴とするベロ毒素遺伝子
に生じた外来ＤＮＡ断片の挿入を検出する方法。
【請求項１０】少なくとも２種のプライマーが、請求
項１〜６記載のベロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒
素遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドであっ
て、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から
分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプラ
イマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび
緩衝液を含むことを特徴とするベロ毒素遺伝子に生じた
外来ＤＮＡ断片の挿入を検出する試薬。
【請求項１１】配列番号３〜６に示される核酸配列ま
たは該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続
した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴と
するオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】配列番号７〜１０に示される核酸配列
または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連
続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴
とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】少なくとも２種のプライマーとして、
配列番号３〜６に示される核酸配列または該配列に相補
的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基より
なる核酸配列を含有する、ベロ毒素１型遺伝子を増幅す
るためのオリゴヌクレオチドであって、一方のプライマ
ーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、
他方のプライマーの鋳型となるオリゴヌクレオチドを使
用することを特徴とするベロ毒素１型遺伝子の増幅方
法。
【請求項１４】少なくとも２種のプライマーとして、
配列番号７〜１０に示される核酸配列または該配列に相
補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よ
りなる核酸配列を含有する、ベロ毒素２型遺伝子を増幅
するためのオリゴヌクレオチドであって、一方のプライ
マーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合
に、他方のプライマーの鋳型となるオリゴヌクレオチド
を使用することを特徴とするベロ毒素２型遺伝子の増幅
方法。
【請求項１５】少なくとも２種のプライマーが、配列
番号３〜６に示される核酸配列または該配列に相補的な
核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる
核酸配列を含有する、ベロ毒素産生性大腸菌の産生する
ベロ毒素１型遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチ
ドであって、一方のプライマーの伸長生成物が、その相
補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型と
なるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴ
Ｐおよび緩衝液を含むことを特徴とするベロ毒素１型遺
伝子増幅用試薬。
【請求項１６】少なくとも２種のプライマーが、配列
番号７〜１０に示される核酸配列または該配列に相補的
な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりな
る核酸配列を含有する、ベロ毒素産生性大腸菌の産生す
るベロ毒素２型遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオ
チドであって、一方のプライマーの伸長生成物が、その
相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型
となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮ
ＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするベロ毒素２型
遺伝子増幅用試薬。
【請求項１７】請求項１３記載の増幅方法で得られた
増幅遺伝子断片の鎖長より、ベロ毒素１型遺伝子への外
来ＤＮＡ断片の挿入を検出することを特徴とするベロ毒
素１型遺伝子に生じた外来遺伝子の挿入を検出する方
法。
【請求項１８】請求項１４記載の増幅方法で得られた
増幅遺伝子断片の鎖長より、ベロ毒素２型遺伝子への外
来ＤＮＡ断片の挿入を検出することを特徴とするベロ毒
素２型遺伝子に生じた外来遺伝子の挿入を検出する方
法。
【請求項１９】少なくとも２種のプライマーが、配列
番号３〜６に示される核酸配列または該配列に相補的な
核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる
核酸配列を含有する、ベロ毒素産生性大腸菌の産生する
ベロ毒素１型遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチ
ドであって、一方のプライマーの伸長生成物が、その相
補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型と
なるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴ
Ｐおよび緩衝液を含むことを特徴とするベロ毒素１型遺
伝子に生じた外来遺伝子の挿入を検出する試薬。
【請求項２０】少なくとも２種のプライマーが、配列
番号７〜１０に示される核酸配列または該配列に相補的
な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりな
る核酸配列を含有する、ベロ毒素産生性大腸菌の産生す
るベロ毒素２型遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオ
チドであって、一方のプライマーの伸長生成物が、その
相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型
となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮ
ＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするベロ毒素２型
遺伝子に生じた外来遺伝子の挿入を検出する試薬。