JPH11253198A - 酵素分析法 - Google Patents
酵素分析法Info
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- JPH11253198A JPH11253198A JP10080496A JP8049698A JPH11253198A JP H11253198 A JPH11253198 A JP H11253198A JP 10080496 A JP10080496 A JP 10080496A JP 8049698 A JP8049698 A JP 8049698A JP H11253198 A JPH11253198 A JP H11253198A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 幅広い基質濃度を測定できる酵素分析法を提
供することを目的とする。 【解決手段】 同じ基質を認識し、かつKm値の異なる複
数の酵素を用いることによって上記の課題を解決した。
供することを目的とする。 【解決手段】 同じ基質を認識し、かつKm値の異なる複
数の酵素を用いることによって上記の課題を解決した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵素を用いる糖、
アルコール、有機酸、アミノ酸などの化学物質の定量方
法に関する。より詳細には臨床検査や食品分析などの分
野で利用される。
アルコール、有機酸、アミノ酸などの化学物質の定量方
法に関する。より詳細には臨床検査や食品分析などの分
野で利用される。
【０００２】
【従来の技術】酵素を用いる糖、アルコール、有機酸、
アミノ酸などの化学物質の定量方法、いわゆる酵素分析
法は、酵素が有する優れた基質特異性ならびに反応特異
性に着目し、臨床検査や食品分析などに応用されてい
る。酵素分析法では通常、特定の1種の化合物を認識す
るための分子認識を行なう酵素、すなわち目的化合物を
認識する酵素（第1酵素）ひとつが定められる。例え
ば、グルコースの測定においてはグルコースを特異的に
認識し、これを酸化するグルコースオキシダーゼ、ある
いはグルコースを特異的に認識して、これをリン酸化す
るグルコカイネースが第1酵素として用いられる。グル
コースオキシダーゼを用いる場合、生成する過酸化水素
を定量することをメルクマークにすることから、さらに
過酸化水素を基質とする酵素としてパーオキシダーゼと
発色性の色素とをくみあわせることにより、分析キット
を構築する。後者の場合は反応生成物であるグルコース
6リン酸を特異的に認識して酸化するグルコース６リン
酸脱水素酵素と組み合わすことにより、グルコース分析
キットを調製する。このように、測定の際に生成、消費
する化合物を直接あるいは間接的に計測することによっ
て、目的化合物の濃度を測定するが、いずれの場合にお
いても、目的化合物を認識する酵素には1種類の酵素が
用いられてきた。これは、酵素を分子認識素子に用いて
化合物濃度を計測する酵素センサーの原理にも用いられ
ており、やはり、目的化合物を認識する酵素は1種であ
る。したがって、これらの酵素を用いた分析法において
その測定限界等を限定する要因は主に第１酵素の基質と
の親和性等の酵素学的な性質によって支配されている。
アミノ酸などの化学物質の定量方法、いわゆる酵素分析
法は、酵素が有する優れた基質特異性ならびに反応特異
性に着目し、臨床検査や食品分析などに応用されてい
る。酵素分析法では通常、特定の1種の化合物を認識す
るための分子認識を行なう酵素、すなわち目的化合物を
認識する酵素（第1酵素）ひとつが定められる。例え
ば、グルコースの測定においてはグルコースを特異的に
認識し、これを酸化するグルコースオキシダーゼ、ある
いはグルコースを特異的に認識して、これをリン酸化す
るグルコカイネースが第1酵素として用いられる。グル
コースオキシダーゼを用いる場合、生成する過酸化水素
を定量することをメルクマークにすることから、さらに
過酸化水素を基質とする酵素としてパーオキシダーゼと
発色性の色素とをくみあわせることにより、分析キット
を構築する。後者の場合は反応生成物であるグルコース
6リン酸を特異的に認識して酸化するグルコース６リン
酸脱水素酵素と組み合わすことにより、グルコース分析
キットを調製する。このように、測定の際に生成、消費
する化合物を直接あるいは間接的に計測することによっ
て、目的化合物の濃度を測定するが、いずれの場合にお
いても、目的化合物を認識する酵素には1種類の酵素が
用いられてきた。これは、酵素を分子認識素子に用いて
化合物濃度を計測する酵素センサーの原理にも用いられ
ており、やはり、目的化合物を認識する酵素は1種であ
る。したがって、これらの酵素を用いた分析法において
その測定限界等を限定する要因は主に第１酵素の基質と
の親和性等の酵素学的な性質によって支配されている。
【０００３】
【発明が解決しようとしている課題】酵素分析法におい
て第1酵素の基質に対する親和性が測定系を支配する大
きな要因となる。つまり、酵素分析法においては、観測
値と目的物質濃度との間に直線関係が成立することが望
ましいが、通常酵素はMichaelis Menten型の飽和曲線を
描くことから、極く限られた基質濃度範囲においての
み、直線関係が成立する。したがって、酵素分析キット
を調製する場合には第１酵素のKm値に基づき、適宜、試
料を調製しなければ測定に信頼性は得られない。したが
って、幅広い基質濃度をカバーするためには、試料をあ
らかじめ希釈するなどの前処理を行なわなければならな
い。
て第1酵素の基質に対する親和性が測定系を支配する大
きな要因となる。つまり、酵素分析法においては、観測
値と目的物質濃度との間に直線関係が成立することが望
ましいが、通常酵素はMichaelis Menten型の飽和曲線を
描くことから、極く限られた基質濃度範囲においての
み、直線関係が成立する。したがって、酵素分析キット
を調製する場合には第１酵素のKm値に基づき、適宜、試
料を調製しなければ測定に信頼性は得られない。したが
って、幅広い基質濃度をカバーするためには、試料をあ
らかじめ希釈するなどの前処理を行なわなければならな
い。
【０００４】
【発明の目的】本発明は従来技術における欠点を解決
し、幅広いダイナミックレンジを有する酵素分析法を提
供しようというものである。本発明は酵素を用いる糖、
アルコール、有機酸、アミノ酸などの化学物質の定量方
法に関するものであり、臨床検査や食品分析などの極め
て広い分野での応用が可能である。
し、幅広いダイナミックレンジを有する酵素分析法を提
供しようというものである。本発明は酵素を用いる糖、
アルコール、有機酸、アミノ酸などの化学物質の定量方
法に関するものであり、臨床検査や食品分析などの極め
て広い分野での応用が可能である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】このような酵素分析法の
実状を考慮して、本発明者は従来の酵素分析法を改良し
て幅広いダイナミックレンジを有する酵素分析法を開発
することに鋭意研究を行なった。その結果、同じ基質を
認識し、かつKm値の異なる複数の酵素を第１酵素として
用いることによって目的基質の定量範囲を大幅に拡大す
ることを見いだした。詳細には同じ基質を認識し、かつ
Km値が10倍程度異なる２種以上の酵素を第１酵素として
目的化合物の分析キットを作成することにより、1000倍
のダイナミックレンジを有する酵素分析キットならびに
酵素センサーが構築できることを見いだした。
実状を考慮して、本発明者は従来の酵素分析法を改良し
て幅広いダイナミックレンジを有する酵素分析法を開発
することに鋭意研究を行なった。その結果、同じ基質を
認識し、かつKm値の異なる複数の酵素を第１酵素として
用いることによって目的基質の定量範囲を大幅に拡大す
ることを見いだした。詳細には同じ基質を認識し、かつ
Km値が10倍程度異なる２種以上の酵素を第１酵素として
目的化合物の分析キットを作成することにより、1000倍
のダイナミックレンジを有する酵素分析キットならびに
酵素センサーが構築できることを見いだした。
【０００６】上記課題を解決するためには同じ基質を認
識し、かつKm値が10倍程度異なる２種以上の酵素を第１
酵素としてもちいればよい。このような酵素の組み合わ
せとしては既に報告されている天然型の2種以上の酵
素、例えば、アルコールの測定にはアルコールオキシダ
ーゼとPQQ依存性アルコール脱水素酵素、コレステロー
ルの測定には放線菌由来のコレステロールオキシダーゼ
と微生物由来のコレステロールオキシダーゼ、グルコー
スの測定にはグルコースオキシダーゼとPQQ依存性グル
コース脱水素酵素、リンゴ酸の定量にはブタ心臓由来の
リンゴ酸脱水素酵素と微生物由来のリンゴ酸脱水素酵
素、グリセロールの定量には大腸菌由来NAD+依存型のグ
リセロール脱水素酵素とウサギ骨格由来のNADP+依存型
のグリセロール脱水素酵素などがあげられるが、これら
に限定されるものではない。さらには、後述する実施例
に示すように、蛋白質工学的手法により、天然の酵素の
アミノ酸配列を改変し、構築した基質認識能力の異なる
改変型酵素同士あるいは天然型の酵素との組み合わせる
ことによっても達成される。
識し、かつKm値が10倍程度異なる２種以上の酵素を第１
酵素としてもちいればよい。このような酵素の組み合わ
せとしては既に報告されている天然型の2種以上の酵
素、例えば、アルコールの測定にはアルコールオキシダ
ーゼとPQQ依存性アルコール脱水素酵素、コレステロー
ルの測定には放線菌由来のコレステロールオキシダーゼ
と微生物由来のコレステロールオキシダーゼ、グルコー
スの測定にはグルコースオキシダーゼとPQQ依存性グル
コース脱水素酵素、リンゴ酸の定量にはブタ心臓由来の
リンゴ酸脱水素酵素と微生物由来のリンゴ酸脱水素酵
素、グリセロールの定量には大腸菌由来NAD+依存型のグ
リセロール脱水素酵素とウサギ骨格由来のNADP+依存型
のグリセロール脱水素酵素などがあげられるが、これら
に限定されるものではない。さらには、後述する実施例
に示すように、蛋白質工学的手法により、天然の酵素の
アミノ酸配列を改変し、構築した基質認識能力の異なる
改変型酵素同士あるいは天然型の酵素との組み合わせる
ことによっても達成される。
【０００７】さらにこれらの酵素を用いて、公知の種々
分析方法に基づき、基質の定量が可能である。たとえば
酸化還元酵素であれば、フェナジンメトサルフェート、
１−メトキシフェナジンメトサルフェート、ジクロロフ
エノールインドフェノール、フェリシアン化化合物、フ
ェロセン、フエロセン誘導体、ベンゾキノン、ニトロブ
ルーテトラゾリウムクロライドなどの電子メディエータ
ーを用いて、これらを比色法を用いて定量してもよい。
また反応生成物を直接もしくは反応生成物を基質とする
酵素と発色性の色素を組み合わせて、分光光度計、示差
屈折計、蛍光光度計等を用いて定量しても良い。
分析方法に基づき、基質の定量が可能である。たとえば
酸化還元酵素であれば、フェナジンメトサルフェート、
１−メトキシフェナジンメトサルフェート、ジクロロフ
エノールインドフェノール、フェリシアン化化合物、フ
ェロセン、フエロセン誘導体、ベンゾキノン、ニトロブ
ルーテトラゾリウムクロライドなどの電子メディエータ
ーを用いて、これらを比色法を用いて定量してもよい。
また反応生成物を直接もしくは反応生成物を基質とする
酵素と発色性の色素を組み合わせて、分光光度計、示差
屈折計、蛍光光度計等を用いて定量しても良い。
【０００８】またこれらの酵素を用いて幅広いダイナミ
ックレンジを有するバイオセンサーを構築することがで
きる。本発明で用いることのできるバイオセンサーは公
知の方法に基づき構築できる。たとえば、金電極、グラ
ッシーカーボン電極、白金電極、カーボンペースト電極
などに一般的に行われている酵素固定化方法たとえば吸
着法、架橋法、共有結合法などによりこれらの酵素を固
定化し、この電極を用いてバイオセンサーを構築しても
よい。
ックレンジを有するバイオセンサーを構築することがで
きる。本発明で用いることのできるバイオセンサーは公
知の方法に基づき構築できる。たとえば、金電極、グラ
ッシーカーボン電極、白金電極、カーボンペースト電極
などに一般的に行われている酵素固定化方法たとえば吸
着法、架橋法、共有結合法などによりこれらの酵素を固
定化し、この電極を用いてバイオセンサーを構築しても
よい。
【０００９】グルコースの定量ではグルコースを特異的
に認識し、かつKm値が10倍程度異なる２種以上の酵素を
第１酵素としてもちいればよい。たとえば、グルコース
を酸化するグルコースオキシダーゼ、グルコース脱水素
酵素、あるいはグルコースを特異的に認識して、これを
リン酸化するグルコカイネースにおいて、Km値が10倍程
度異なる２種以上の酵素をもちいればよい。これらのKm
値が10倍程度異なる２種以上の酵素を第一酵素として、
公知の分析方法に基づき、グルコースの定量が可能であ
る。たとえば、グルコース脱水素酵素を用いる場合、公
知の電子受容体と組み合わせることにより、電子受容体
の還元体の定量を公知の分析法、たとえば比色定量方法
と組み合わせてグルコース分析法を構築することができ
る。
に認識し、かつKm値が10倍程度異なる２種以上の酵素を
第１酵素としてもちいればよい。たとえば、グルコース
を酸化するグルコースオキシダーゼ、グルコース脱水素
酵素、あるいはグルコースを特異的に認識して、これを
リン酸化するグルコカイネースにおいて、Km値が10倍程
度異なる２種以上の酵素をもちいればよい。これらのKm
値が10倍程度異なる２種以上の酵素を第一酵素として、
公知の分析方法に基づき、グルコースの定量が可能であ
る。たとえば、グルコース脱水素酵素を用いる場合、公
知の電子受容体と組み合わせることにより、電子受容体
の還元体の定量を公知の分析法、たとえば比色定量方法
と組み合わせてグルコース分析法を構築することができ
る。
【００１０】また、グルコースの定量にはセンサーを用
いることができる。たとえば、グルコース脱水素酵素を
用いる場合、電子受容体とグルコース脱水素酵素を、試
料液中に溶解あるいは分散したり、膜などに吸着法、架
橋法、共有結合法などの公知の固定化方法において固定
化し、グラシーカーボン電極などの表面に装着した型の
もの、グラッシーカーボン電極表面などに吸着法、架橋
法、共有結合法などの公知の固定化方法において固定化
した型のものなどが挙げられ、グルコース脱水素酵素や
電子受容体の種類などに応じて適宜選択し、また、構築
すればよい。そして、ここに例示したものがアンペロメ
トリ型グルコースセンサーであり、該センサーによれ
ば、反応に伴う電子授受を電極表面で直接的にとらえる
ことができる。すなわち上記の如きグルコース脱水素酵
素を働かせて、電子受容体の還元体を電気化学的に定量
する。あるいは、反応に伴う電子授受を直接的に定量す
る。
いることができる。たとえば、グルコース脱水素酵素を
用いる場合、電子受容体とグルコース脱水素酵素を、試
料液中に溶解あるいは分散したり、膜などに吸着法、架
橋法、共有結合法などの公知の固定化方法において固定
化し、グラシーカーボン電極などの表面に装着した型の
もの、グラッシーカーボン電極表面などに吸着法、架橋
法、共有結合法などの公知の固定化方法において固定化
した型のものなどが挙げられ、グルコース脱水素酵素や
電子受容体の種類などに応じて適宜選択し、また、構築
すればよい。そして、ここに例示したものがアンペロメ
トリ型グルコースセンサーであり、該センサーによれ
ば、反応に伴う電子授受を電極表面で直接的にとらえる
ことができる。すなわち上記の如きグルコース脱水素酵
素を働かせて、電子受容体の還元体を電気化学的に定量
する。あるいは、反応に伴う電子授受を直接的に定量す
る。
【００１１】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
するが、本発明は これらの実施例に限定されるもので
はない。
するが、本発明は これらの実施例に限定されるもので
はない。
【００１２】実施例１ グルコースを認識する酵素としてピロロキノリンキノン
（PQQ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（PQQGDH)
を用い、さらにこれを蛋白質工学的手法によりグルコー
スに対する親和性を改変した改変型PQQGDH、H775Dと組
み合わせることにより、幅広いダイナミックレンジを有
するグルコース分析キットを作成した。H775DはEscheri
chia coli膜結合性PQQGDHの775番目のヒスチジン残基を
アスパラギン酸残基に部位特異的変異法により改変され
た酵素であり、グルコースを特異的に酸化し、かつグル
コースに対するKm値が約20mMと野生型PQQGDHの約20倍で
ある(Biotechnol. Lett., 1997 K.Sode , K.Kojima)。
（PQQ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（PQQGDH)
を用い、さらにこれを蛋白質工学的手法によりグルコー
スに対する親和性を改変した改変型PQQGDH、H775Dと組
み合わせることにより、幅広いダイナミックレンジを有
するグルコース分析キットを作成した。H775DはEscheri
chia coli膜結合性PQQGDHの775番目のヒスチジン残基を
アスパラギン酸残基に部位特異的変異法により改変され
た酵素であり、グルコースを特異的に酸化し、かつグル
コースに対するKm値が約20mMと野生型PQQGDHの約20倍で
ある(Biotechnol. Lett., 1997 K.Sode , K.Kojima)。
【００１３】野生型酵素をグルコース濃度20ｍM、およ
びH775D改変型酵素を グルコース濃度500mMで反応させ
たときに同じ活性値を示すように酵素量を調製した。こ
れをPMS1mM、DCIP 0.1mM、pH7.0, 10mMリン酸カリウム
緩衝液存在下でDCIPの600nmにおける退色を指標にグル
コース濃度の測定を試みた。その結果を図１に示す。そ
れぞれの酵素単独ではKm値の約１／１０〜10倍に相当す
るグルコース濃度の計測が行なえるが、それ以上の範囲
においては計測値に信頼性がない。これに対して、野生
型酵素とH775Dを混合して作成した分析キットではグル
コース濃度約0.1mM〜100mMまでの1000倍のグルコース濃
度範囲において計測が可能であった。
びH775D改変型酵素を グルコース濃度500mMで反応させ
たときに同じ活性値を示すように酵素量を調製した。こ
れをPMS1mM、DCIP 0.1mM、pH7.0, 10mMリン酸カリウム
緩衝液存在下でDCIPの600nmにおける退色を指標にグル
コース濃度の測定を試みた。その結果を図１に示す。そ
れぞれの酵素単独ではKm値の約１／１０〜10倍に相当す
るグルコース濃度の計測が行なえるが、それ以上の範囲
においては計測値に信頼性がない。これに対して、野生
型酵素とH775Dを混合して作成した分析キットではグル
コース濃度約0.1mM〜100mMまでの1000倍のグルコース濃
度範囲において計測が可能であった。
【００１４】実施例２ グルコースを認識する酵素としてピロロキノリンキノン
（PQQ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（PQQGDH)
を用い、さらにこれを蛋白質工学的手法によりグルコー
スに対する親和性を改変した改変型PQQGDH、H775Dと組
み合わせることにより、幅広いダイナミックレンジを有
するグルコース定量用アンペロメトリ型バイオセンサー
を作成した。
（PQQ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（PQQGDH)
を用い、さらにこれを蛋白質工学的手法によりグルコー
スに対する親和性を改変した改変型PQQGDH、H775Dと組
み合わせることにより、幅広いダイナミックレンジを有
するグルコース定量用アンペロメトリ型バイオセンサー
を作成した。
【００１５】野生型酵素をグルコース濃度20ｍM、およ
びH775D改変型酵素を グルコース濃度500mMで反応させ
たときに活性値が5unit/mlを示すように酵素濃度を調製
した。カーボンペースト100mgと塩基性担体であるTSK g
el DEAEートヨパール 650M（東ソー（株）製）10mgを混
合し、充填した内径3mmのカーボンペースト電極（BAS
（株）製）を調製した酵素溶液 1mlに30秒浸し、酵素を
電極に固定した。その後、このカーボンペースト電極を
10mMリン酸カリウム緩衝液 pH7.0中に浸し、撹拌する
ことで、カーボンペースト電極表面から界面活性剤トラ
イトン Xー100を取り除いた。以上の操作によりグルコ
ース脱水素酵素固定化電極を作成した。
びH775D改変型酵素を グルコース濃度500mMで反応させ
たときに活性値が5unit/mlを示すように酵素濃度を調製
した。カーボンペースト100mgと塩基性担体であるTSK g
el DEAEートヨパール 650M（東ソー（株）製）10mgを混
合し、充填した内径3mmのカーボンペースト電極（BAS
（株）製）を調製した酵素溶液 1mlに30秒浸し、酵素を
電極に固定した。その後、このカーボンペースト電極を
10mMリン酸カリウム緩衝液 pH7.0中に浸し、撹拌する
ことで、カーボンペースト電極表面から界面活性剤トラ
イトン Xー100を取り除いた。以上の操作によりグルコ
ース脱水素酵素固定化電極を作成した。
【００１６】上記の方法で作成したグルコース脱水素酵
素固定化電極を作用電極とし、参照電極には銀／塩化
銀、対極には白金を用いた。電子受容体にはメトキシフ
ェナジンメトサルフェートを用い、終濃度1mMのメトキ
シフェナジンメトサルフェートを含む10mlの10mMリン酸
カリウム綬衝液 pH7.0中に作用電極、参照電極、対極
を浸した。グルコースの定量は+10mV vs Ag/AgClの電位
を作用電極と対極間に印加し、グルコースの添加によっ
て発生する電流値を電流計で測定し、記録計に記録させ
た。
素固定化電極を作用電極とし、参照電極には銀／塩化
銀、対極には白金を用いた。電子受容体にはメトキシフ
ェナジンメトサルフェートを用い、終濃度1mMのメトキ
シフェナジンメトサルフェートを含む10mlの10mMリン酸
カリウム綬衝液 pH7.0中に作用電極、参照電極、対極
を浸した。グルコースの定量は+10mV vs Ag/AgClの電位
を作用電極と対極間に印加し、グルコースの添加によっ
て発生する電流値を電流計で測定し、記録計に記録させ
た。
【００１７】結果を図２に示す。それぞれの酵素単独で
は野生型酵素では0.1mMから1mM、H775D改変型酵素では1
mMから10mMのグルコースの計測が行なえるが、それ以上
の範囲においては計測値に信頼性がない。野生型酵素お
よびH775D変異酵素の両者を固定した酵素電極では0.1mM
〜10mM程度のグルコースの直接計測が可能であった。
は野生型酵素では0.1mMから1mM、H775D改変型酵素では1
mMから10mMのグルコースの計測が行なえるが、それ以上
の範囲においては計測値に信頼性がない。野生型酵素お
よびH775D変異酵素の両者を固定した酵素電極では0.1mM
〜10mM程度のグルコースの直接計測が可能であった。
【００１８】
【発明の効果】本発明は以上のように構成され、機能す
るので、幅広いダイナミックレンジで目的物質を定量す
ることが可能となる。すなわち、試料を希釈、濃縮する
といった試料調製の操作なしに、信頼性のある測定が可
能である。本発明における酵素分析法は極めて広い分野
での利用が可能である。
るので、幅広いダイナミックレンジで目的物質を定量す
ることが可能となる。すなわち、試料を希釈、濃縮する
といった試料調製の操作なしに、信頼性のある測定が可
能である。本発明における酵素分析法は極めて広い分野
での利用が可能である。
【図１】本発明の一実施例における検量線を示す図。
【図２】本発明の別の一実施例における検量線を示す
図。
図。
Claims (4)
- 【請求項１】 同じ基質を認識し、異なったKm値を有す
る２種以上の酵素を主成分とすることを特徴とする酵素
分析法 - 【請求項２】 請求項１に基づき構築されるバイオセン
サー - 【請求項３】 測定対象がグルコースである請求項１記
載の酵素分析法 - 【請求項４】 測定対象がグルコースである請求項２記
載のバイオセンサー
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10080496A JPH11253198A (ja) | 1998-03-13 | 1998-03-13 | 酵素分析法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10080496A JPH11253198A (ja) | 1998-03-13 | 1998-03-13 | 酵素分析法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11253198A true JPH11253198A (ja) | 1999-09-21 |
Family
ID=13719925
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10080496A Pending JPH11253198A (ja) | 1998-03-13 | 1998-03-13 | 酵素分析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11253198A (ja) |
-
1998
- 1998-03-13 JP JP10080496A patent/JPH11253198A/ja active Pending
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